INTRODUÇÃO: A elevada frequência e morbimortalidade das infecções do trato respiratório inferior (ITRI) pelo vírus sincicial respiratório (VSR) na infância, além da ausência de estudos no Brasil que correlacionam evolutivamente a resposta inflamatória no epitélio respiratório e no sangue periférico à gravidade da doença respiratória pelo VSR, estimularam a realização desta pesquisa. OBJETIVOS: Avaliar se as concentrações dos mediadores inflamatórios (MI) (RANTES, sICAM-1, TNF-,IL -6 e IL-10) e suas razões na secreção nasofaríngea e no sangue de crianças com idade inferior a 3 meses e ITRI pelo VSR correlacionam-se à gravidade da doença; determinar a frequência dos grupos A e B do VSR nas crianças internadas na Unidade de Cuidados Intensivos Neonatal (UCINE) do Instituto da Criança do HCFMUSP; avaliar se há diferença na gravidade da doença respiratória pelo VSR entre as crianças internadas na UCINE e infectadas pelos grupos A e B do vírus; comparar as concentrações dos MI na secreção nasofaríngea e no sangue à admissão hospitalar ou por ocasião do diagnóstico de ITRI pelo VSR adquirida durante a internação, no terceiro e sétimo dias de evolução ou à alta (se antes do sétimo dia); comparar as concentrações dos MI na secreção nasofaríngea e no sangue dos pacientes à admissão, de acordo com grupos A e B do VSR; e descrever a evolução das concentrações de RANTES, sICAM-1, TNF-, IL-6 e IL-10 na secreção nasofaríngea e no sangue durante a doença pelo VSR. MÉTODOS: Foram incluídas no estudo prospectivo, de coorte, observacional, de julho de 2004 a dezembro de 2005, 30 crianças com idade inferior a três meses portadoras de ITRI pelo VSR internadas na UCINE. Foram medidas as concentrações dos MI na secreção nasofaríngea e no soro de todas as crianças à admissão no estudo, no terceiro e sétimo dias de evolução ou à alta hospitalar (se antes do sétimo dia) através da técnica ELISA sanduíche. Utilizamos para avaliar a gravidade da doença respiratória os seguintes marcadores clínicos: sistema de escore clínico modificado de De Boeck et al. (1997), tempos de oxigenoterapia e de ventilação mecânica e duração da internação. RESULTADOS: Houve correlação positiva significante entre a gravidade da doença pelo sistema de escore clínico modificado à admissão hospitalar e as concentrações na secreção nasofaríngea de sICAM-1 (r=0,401, p=0,028) e IL-10 (r=0,412, p=0,024) e de IL-6 no soro (r=0,469, p=0,009). Houve também correlação positiva significante entre as concentrações de IL-6 no soro e o tempo de oxigenoterapia (r=0,445, p=0,023) e a duração da internação (r=0,572, p=0,001). Das razões dos MI estudadas, a IL-10/IL-6 (primeiras amostras de soro), a IL-6/TNF- e a IL -6/IL-10 (segundas amostras de soro) foram associadas de forma mais consistente (p<0,001) à gravidade da ITRI pelo VSR. Não ocorreram óbitos entre as crianças envolvidas neste estudo. Os dois grupos de VSR causaram ITRI nas crianças internadas na UCINE, sendo que o grupo A foi o mais frequente (57%). No entanto, foram as crianças infectadas pelo grupo B do VSR as que evoluíram com maior morbidade (p<0,001). As medianas das concentrações de RANTES, sICAM-1 e IL-10 foram maiores nas três amostras de soro (p<0,001); enquanto as medianas das concentrações de IL-6 predominaram nas três amostras de secreção nasofaríngea (p<0,001). A mediana das concentrações de TNF- foi maior apenas nas primeiras amostras de secreção nasofaríngea (p<0,001). Houve diferença estatisticamente significante entre os dois grupos do VSR apenas em relação à mediana das concentrações de IL-10 na secreção nasofaríngea à admissão hospitalar, que foi mais elevada nas crianças com infecção pelo grupo B (p=0,039). As concentrações de RANTES, sICAM-1, IL-6 e IL-10 na secreção nasofaríngea e de TNF-,IL -6 e IL-10 no soro variaram, de forma significante, durante a evolução da ITRI pelo VSR. Os demais níveis de MI na secreção nasofaríngea e no soro mantiveram-se estáveis durante o período de estudo. CONCLUSÕES: Níveis de RANTES, sICAM-1, TNF-,IL -6 e IL-10 foram detectados em todas as amostras de secreção nasofaríngea e de soro das crianças com ITRI pelo VSR internadas na UCINE, confirmando o papel destes MI na patogênese da doença. Nossos resultados sugerem que as concentrações de sICAM-1 e IL-10 na secreção nasofaríngea e IL-6 no soro à admissão, bem como as razões IL-10/IL-6 (primeiras amostras de soro), IL-6/TNF- e IL -6/IL-10 (segundas amostras de soro), poderiam ser usadas como marcadores de gravidade da doença respiratória pelo VSR. Os níveis de IL-6 determinados no soro admissão também poderiam ser usados para predizer tempo de oxigenoterapia e duração da internação mais prolongados. Os grupos A e B do VSR cocircularam durante o período do estudo, com o grupo A sendo dominante nestes pacientes. Entretanto, foram as crianças infectadas com o grupo B do vírus que evoluíram com maior morbidade. As concentrações de IL-10 na secreção nasofaríngea à admissão hospitalar foram significantemente maiores nos pacientes com ITRI pelo grupo B do VSR. O tempo de evolução da doença pelo VSR foi significante para os níveis de RANTES, sICAM-1, IL-6 e IL-10 na secreção nasofaríngea e de TNF-,IL -6 e IL-10 no soro destas crianças. / INTRODUCTION: The high frequency and morbimortality of respiratory syncytial virus (RSV) lower respiratory tract infections (LRTI) in children, besides the lack of studies in Brazil that evolutionally correlate the inflammatory response in respiratory epithelium and in peripheral blood with RSV respiratory disease severity, have stimulated this research. OBJECTIVES: To assess whether the concentrations of inflammatory mediators (IM) (RANTES, sICAM-1, TNF- , IL-6 and IL-10) and their ratios in nasopharyngeal secretion and in blood of children less than 3 months of age and RSV LRTI correlate with disease severity; to determine the frequency of RSV groups A and B in children admitted to Unidade de Cuidados Intensivos Neonatal (UCINE) do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo; to assess whether there is difference in RSV respiratory disease severity, according to RSV groups A and B; to compare the concentrations of IM in nasopharyngeal secretion and in blood at the time of hospital admission or by occasion of a diagnosis of RSV LRTI acquired during the stay, on third and seventh days of evolution or at the hospital discharge (should it had happened before the seventh day); to compare the concentrations of IM in nasopharyngeal secretion and in blood of patients at the hospital admission, according to RSV groups A and B; to describe the evolution of RANTES, sICAM-1, TNF-, IL-6 and IL-10 concentrations in nasopharyngeal secretion and in blood. METHODS: Thirty children less than 3 months of age with RSV LRTI admitted to UCINE were included in the prospective cohort observational study, from July 2004 to December 2005. The concentrations of IM were measured through the sandwich ELISA technique in nasopharyngeal secretion and in serum of all children at the hospital admission, and on the third and seventh days of evolution or at the hospital discharge (if before the seventh day). We used the following markers to assess the severity of respiratory illness: the modified clinical scoring system by De Boeck et al. (1997), the days of oxygen supplementation and of mechanical ventilation and duration of hospitalization. RESULTS: There was a significant positive correlation between severity of disease by modified clinical scoring system at the time of hospital admission and nasopharyngeal secretion sICAM-1 (r=0.401, p=0.028) and IL-10 concentrations (r=0.412, p=0.024) and serum IL-6 concentrations (r=0.469, p=0.009). There was also a significant positive correlation between serum IL-6 concentrations and the days of oxygen supplementation (r=0.572, p=0.001), as well as the days of hospital stay (r=0.572, p=0.001). Of IM ratios studied, IL-10/ IL-6 (first samples of serum), IL-6/TNF- and IL-6/IL-10 (second samples of serum) were associated to severity of RSV LRTI with greatest consistency (p<0.001). No fatal cases occurred among the children enrolled in this study. The two groups of RSV caused LRTI in 30 children less than 3 months of age hospitalized in UCINE, being group A the most frequent (57%). However, the children infected by RSV group B were the ones that evolved with a greater need of mechanical ventilation (p<0.001). Medians RANTES, sICAM-1 and IL-10 concentrations were greater in all the three serum samples (p<0.001); whereas medians IL-6 concentrations were predominant in the three nasopharyngeal secretion samples (p<0.001). Median TNF- concentration was greater only in the first nasopharyngeal secretion samples (p<0.001). There was a statistically significant difference between the two groups of RSV only relative to the median IL-10 concentrations on first nasopharyngeal secretion samples, which was more elevated in children infected by RSV group B (p=0.039). The nasopharyngeal secretion RANTES, sICAM-1, IL-6 and IL-10 and serum TNF- , IL-6 and IL-10 concentrations varied significantly during the evolution of RSV LRTI. The other nasopharyngeal secretion and serum IM levels remained stable during the period of study. CONCLUSIONS: Levels of RANTES, sICAM-1, TNF- , IL-6 and IL-10 were detected in all nasopharyngeal secretion and serum samples of children with RSV LRTI admitted to UCINE, therefore confirming the role of these IM in pathogenesis of illness. Our results suggest that nasopharyngeal secretion sICAM-1 and IL-10 and serum IL-6 concentrations determined at hospital admission, as well as the ratios IL-10/IL-6 (first samples of serum), IL-6/TNF- and IL-6/IL-10 (second samples of serum), could be used as markers of RSV respiratory disease severity. The levels of IL-6 found in serum at the time of hospital admission could also be used to predict prolonged oxygen supplementation and hospital stay. RSV groups A and B co-circulated during the period of the study, with group A being dominant in these patients. However, the children infected by RSV group B were the ones that evolved with a greater morbidity. Nasopharyngeal secretion IL-10 concentrations at admission were significantly greater in patients with RSV group B LRTI. The duration of RSV disease evolution was significant to nasopharyngeal secretion RANTES, sICAM-1, IL-6, IL-10 levels and to serum TNF- , IL-6 and IL-10 concentrations of these children.

A glicação é uma reação não enzimática que ocorre entre proteínas e açúcares redutores e, é responsável pela formação de adultos e de ligações cruzadas entre proteínas, como por exemplo: a pentosidina, produto final de glicação avançada que se acumula em vários tecidos ao longo do tempo. A glicação é deletéria para o organismo e está associada a modificações estruturais em proteínas e alterações de suas funções específicas, tais como: atividade enzimática, capacidade de ligação e tempo de vida de proteínas, além de ser responsável pela produção de espécies reativas de oxigênio (EROS). O mecanismo de formação da pentosidina envolve reações oxidativas e, uma das estratégias para minimizá-Ia é o aumento da atividade antioxidante nos tecidos. A pariparoba (Pothomorphe umbellata (L.) Miq) demonstrou atividade antioxidante in vitro e in vivo quando aplicada sobre a pele. Essa atividade foi atribuída ao 4-nerolidilcatecol (4-NC), que se mostrou 10 vezes mais potente que o &#945;-tocoferol. Os extratos de pariparoba também inibiram a lipoperoxidação espontânea da pele em camundongos sem pelo. Neste trabalho empregou-se o modelo de glicação de albumina de soro bovino (BSA) frente à D-ribose, com avaliação da fluorescência produzida pela pentosidina formada na reação. Avaliou-se igualmente a atividade do 4-NC em diferentes concentrações sobre a reação de glicação da BSA em presença de D-ribose após 24 horas, empregando-se a aminoguanidina como controle positivo. Nas condições experimentais o 4-NC não foi capaz de inibir a reação de glicação, ao contrário da aminoguanidina. Foi também utilizado modelo para avaliação da propriedade contrátil de fibroblastos em matriz tridimensional de gel de colágeno, glicado e não glicado com D-ribose. O 4-NC na concentração de 100 &#181;M permitiu a manutenção da propriedade contrátil de fibroblastos em gel colágeno glicado. Estudos de glicação em maiores períodos de tempo devem ser realizados visando a confirmar a possível atividade anti-glicação deste composto. / Glycation is a non enzymatic reaction which occurs between proteins and reductor sugars, responsible for the formation of adducts and crosslinkers between proteins, such as, pentosidine, an advanced glycation end-product (AGE) which accumulates in many tissues during aging. AGEs accumulation is deleterious to the body and is associated with structural modifications in proteins and imbalance in their specific functions, such as: enzymatic activity, binding capacity, protein turnover and also responsible for the production of reactive oxygen species (ROS). The mechanism of pentosidine formation involves oxidative reactions. One of the strategies to reduce pentosidine formation is by increasing antioxidant activity in tissues. Pariparoba (Pothomorphe umbellata (L.) Miq. has showed antioxidant activity in vitro and in vivo when applied on the skin. This activity was attributed to 4-nerolydilcatechol (4-NC), which is 10 times more potent than &#945;-tocopherol. Extracts of Pariparoba also inhibited the spontaneous lipid peroxidation in the skin of hairless mice. In this work, the bovine serum albumin (BSA) model for glycation with D-ribose, evaluated by pentosidine fluorescence spectroscopy was employed. The activity of 4¬NC was evaluated in different concentrations in this model after 24 hours. Aminoguanidine was used as positive control. In this experimental condition, 4-NC was not capable to inhibit the BSA glycation. We also evaluated the contractile properties of fibroblasts on tridimensional matriz of collagen gel glycated or not with D-ribose. 4-NC (100 &#181;M) was able to keep the contractile capacity of fibroblasts in glycated collagen. Studies of glycation in longer periods of time should be made in order to further evaluate the possible anti-glycation activity of this compound.

Um estudo sistemático a respeito da utilização de padrão interno em determinações multielementares por espectrometria de absorção atômica (ETAAS) foi desenvolvido. O objetivo principal do presente trabalho foi verificar a possibilidade de melhorar a precisão e a exatidão dos resultados analíticos, que são obtidos na análise de fluidos biológicos. O pré-tratamento dessas amostras foi simplificado e reduzido a uma única etapa de diluição com surfactante (Triton X-100) e ácido (HNO3). Conseqüentemente, a complexidade da solução diluída de amostra, a ser introduzida no tubo de grafite, apresenta uma elevada quantidade de concomitantes que podem provocar interferências químicas. A seleção preliminar dos elementos a serem testados como padrão interno considerou a semelhança de parâmetros físico-químicos relacionados com o processo de atomização. Desta forma, Ag, Bi, In e Tl foram testados como padrão interno para a determinação simultânea de Cd/Pb em sangue e urina, enquanto Bi, Ge, In, Sb, Sn e Te foram os elementos selecionados para a determinação de Mn/Ni/Se em soro sangüíneo. A melhoria da qualidade dos resultados analíticos obtidos na determinação simultânea de Cd e Pb em sangue foi observada quando Ag foi utilizada como padrão interno, na presença de NH4H2PO4 como modificador químico. Verificou-se uma melhoria na exatidão dos resultados obtidos para Cd e Pb, após a correção com padrão interno. Por outro lado, os resultados obtidos na análise de urina não foram corrigidos por nenhum dos elementos testados. Os melhores resultados para a determinação simultânea de Mn, Ni e Se foram obtidos com a utilização de Bi, Sn e Te como padrão interno. Entretanto, verificou-se que a correção de todos os resultados não seria viável com o uso de um único padrão interno. O melhor desempenho nos testes realizados na presença de soro sangüíneo foi obtido com Bi, que melhorou discretamente a precisão dos resultados obtidos para Se. Desta forma, a padronização interna visando a determinação simultânea de Mn, Ni e Se não foi eficiente. A padronização interna em ETAAS, com a finalidade de melhorar a precisão e a exatidão dos resultados analíticos, é uma estratégia tão complexa, quanto os efeitos interferentes que se pretende corrigir: são necessários mais estudos para compreender melhor como a utilização de uma condição de compromisso afeta os processos de atomização, bem como mais informações a respeito das interferências físicas e químicas causadas por amostras complexas, analisadas por ETAAS após uma simples etapa de diluição. Deve-se considerar com especial atenção o modificador químico e as temperaturas das etapas de pirólise e de atomização empregadas, que são parâmetros críticos para o desempenho de um elemento como padrão interno. / A systematic study involving the use of internal standard for multielement determinations by electrothermal atomic absorption spectrometry was developed. The main objective of this work was evaluate the possibility of improving precision and accuracy of the analytical results for biological fluids. The sample pre-treatment was reduced to a single dilution step with surfactant (Triton X-100) and acid (HNO3), increasing the amount of concomitant introduced into the atomizer. The preliminary selection of the elements to be tested as internal standard considered the resemblance of physico-chemical parameters related with the atomization process. Thus, Ag, Bi, In and Tl were tested as internal standard for the simultaneous determination of Cd/Pb in blood and urine, and Bi, Ge, In, Sb, Sn and Te were the selected elements for the determination of Mn/Ni/Se in blood serum. The correction of the results obtained for the simultaneous determination of Cd and Pb in blood was achieved when Ag was used as internal standard, in presence of NH4H2PO4 as chemical modifier. An improvement for the accuracy of the results was observed for both analytes after their correction with the internal standard. On the other hand, the results obtained for the urine analysis were not corrected by using the tested elements. The best results for the simultaneous determination of Mn, Ni and Se were observed when Bi, Sn and Te were used as internal standard. However, the correction for the results for all analytes was not possible by using only one internal standard. The best performance in presence of the serum was obtained for Bi, which improves slightly the precision for the Se results. Thus, the internal standardization for the simultaneous determination of Mn, Ni and Se was not efficient. The internal standardization in ETAAS, aiming the improvement of precision and accuracy of the analytical results, is a strategy as complex as the interference effects to be corrected: more studies are required in order to better understand how the adoption of a compromised condition disturbs the atomization processes, as well as to get more information about the physical and chemical interference caused by complex samples, analyzed by ETAAS after a single dilution step. The chemical modifier and the selected temperatures for the pyrolysis and atomization steps are critical parameters for the performace of an internal standard and they should be carefully considered.

Linhagens celulares humanas têm atraído grande interesse devido a sua capacidade de glicosilar proteínas de maneira mais semelhante às proteínas nativas humanas, reduzindo o potencial de respostas imunológicas contra epítopos não humanos. No entanto, por se tratar de uma aplicação recente, essas células ainda não foram extensamente caracterizadas e cultivadas em condições reprodutíveis da escala industrial, ou seja, em suspensão e em meios de cultura livres de soro fetal bovino (SFB). Em função disso, o objetivo principal deste trabalho foi estabelecer culturas livres de SFB e em suspensão para as linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HepG2 e HKB-11, que têm despertado grande interesse devido ao potencial de produção de proteínas recombinantes. Para isso, quatro formulações comerciais livres de SFB foram avaliadas. As células que apresentaram bons resultados na adaptação aos meios realizada em garrafas estáticas foram então adaptadas para crescimento em suspensão. Foi possível realizar a adaptação satisfatória da célula HKB-11 ao meio FreeStyle e da célula SK-Hep-1 ao meio SFMII bem como a criopreservação das mesmas também em condições livres de SFB. A caracterização cinética das células adaptadas mostrou que a célula HKB-11 apresentou concentração celular quatro vezes superior a da célula SK-Hep-1 (8,6x106 e 1,9x106 células/mL, respectivamente) e apresentou crescimento celular durante 18 dias em cultura. A velocidade específica de crescimento máxima (?max) foi semelhante nas duas células (0,0159 h-1 para a HKB-11 e 0,0186 h-1 para SK-Hep-1). A limitação do crescimento das células adaptadas não parece estar associada à exaustão de glicose e glutamina, tampouco à formação de lactato em concentrações inibitórias. Todavia, para ambos os casos, foi observada produção de amônia em concentrações consideradas inibitórias (2 - 5 mM). De maneira geral, foi possível estabelecer culturas celulares em condições compatíveis com o desenvolvimento de um bioprocesso reprodutível, seguro e em concordância com as boas práticas de fabricação. / Human cell lines have attracted great interest since they are capable of producing glycosylated proteins in a more similar way to native human proteins, reducing the potential for immune responses against non-human epitopes. However, these human cell lines have not been extensively characterized and cultured in large scale and in serum-free suspension conditions. As a result, the main objective of this work was to adapt three human cell lines: SK-Hep-1, HepG2 and HKB-11 to serum-free suspension cultures, since they are promising systems of recombinant protein expression. For this task, four commercial serum-free media were tested. Adapted cell lines in T-flasks were further adapted to suspension cultures. Results showed that both HKB-11 and SK-Hep-1 were adapted to serum-free suspension cultures in FreeStyle and SFMII, respectively and were cryopreservated in serum-free formulations. Kinetic characterization showed that HKB-11 cell concentration was four times higher than SK-Hep-1 cell (8,6x106 and 1,9x106 cells/ml, respectively) and showed cell growth in culture over 18 days. The maximum specific growth rate (?max) was similar for both cell lines (0,0159 h-1 to HKB-11 and 0,0186h-1 to SK-Hep-1). Growth limitation of adapted human cell lines does not seem to be associated with depletion of glucose and glutamine, nor with the formation of lactate in inhibitory concentrations. However, in both cases, ammonia production achieved inhibitory concentrations (2 - 5 mM). In general, it was possible to establish human cell cultures that are compatible with reproducible and safe bioprocess conditions and in compliance with good manufacturing practices.