As colectinas pulmonares SP-A e SP-D são marcadores específicos de doenças pulmonares. A determinação destas proteínas por ensaios imunoenzimáticos permite aos clínicos correlacionarem seu papel funcional durante o desenvolvimento do processo patológico baseado nas anormalidades de suas concentrações. Como o lavado broncoalveolar (BAL) é uma amostra que permite estudar as proteínas secretadas pelo epitélio pulmonar em quaisquer circunstâncias, foi proposto o desenvolvimento de um ELISA indireto capaz de detectar SP-A no BAL humano usando um anti-soro policlonal contra SP-A suína produzido em coelho. SP-A suína foi purificada por protocolo que acopla precipitação ácida do extrato pulmonar suíno e cromatografia de afinidade. O anti-soro reagiu com as duas espécies de SP-A testadas: humana e suína. A curva padrão foi otimizada utilizando como calibrador a SP-A purificada de pacientes com artrite reumatóide. A faixa selecionada da curva de calibração foi de 0,312 to 5,0 mg/mL usando a diluição 1:1000 do anticorpo. O limite de detecção da curva foi de 0,625 mg/mL. / The lung collectins SP-A and SP-D are specific markers for lung diseases. Determination of amounts of these proteins using polyclonal and monoclonal antibodies on ELISA assays enabled clinicians to predict their role in the course of the lung disease process based on abnormalities on their concentrations. As the bronchoalveolar lavage (BAL) is a sample that permits to study the proteins secreted by the lung epithelium at any conditions, we proposed to develop an indirect ELISA able to detect SP-A in the BAL using polyclonal rabbit antiserum, raised against porcine SP-A. Porcine SP-A was purified by a protocol that includes an acid precipitation of the porcine pulmonary extract before affinity chromatography. The antiserum reacted with the two tested species porcine and human. The calibration curve were optimized, using human SP-A purified from patients with rheumatoid arthritis as human antigen calibrator. The selected calibration curve range was 0.312 to 5.0 mg/mL using the antiboby dilution 1:1.000. The detection limit of the standard curve was 0.625 mg/mL.

INTRODUÇÃO: A Urticária Crônica é caracterizada pelo aparecimento de pápulas eritematosas, pruriginosas recorrentes e transitórias que duram por mais de seis semanas. Na maioria dos pacientes a causa é indeterminada, definida como idiopática (UCI), entretanto, um sub-grupo apresentam autoanticorpos contra a cadeia alfa do receptor de alta afinidade para IgE (FceRI), que são expressos na superfície de mastócitos e basófilos, tornando-os células alvo nesta doença. OBJETIVOS: Avaliar em pacientes com UCI, submetidos ao teste intradérmico de soro autólogo (ASST), o perfil de ativação dos basófilos, pela intensidade de expressão de marcadores de ativação/desgranulação e pela capacidade dos basófilos em responder aos estímulo com a IL-3 e anticorpo anti-IgE. Além disto, a presença de fator liberador de histamina foi avaliado nos soros dos pacientes. METODOLOGIA: Pacientes com UCI (n= 37) foram selecionados no Ambulatório de Urticária do Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP e submetidos ao ASST. O grupo controle foi constituído por indivíduos saudáveis (n=38). A análise da expressão de FceRI, CD63, CD123 e CD203c em basófilos de sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. No ensaio in vitro de estimulação dos basófilos com anti-IgE, as células foram previamente incubadas com IL-3. O ensaio de liberação de histamina mediada por soros de pacientes com UCI foi realizado com três diferentes doadores de leucócitos e a histamina liberada dosada por ELISA de competição. RESULTADOS: Há um baixo número de basófilos no sangue periférico nos pacientes com UCI, coincidente com o baixo nível sérico de histamina. Os escassos basófilos no sangue periférico mostram elevada expressão de FceRI e uma regulação positiva da expressão de CD203c e CD63, independentemente do ASST. A análise funcional dos basófilos, mostra que somente a incubação com IL-3 recombinante já induz aumento significante da expressão de CD203c e da liberação de histamina dos basófilos de pacientes com UCI, que são intensificados com o estímulo por anticorpos anti-IgE após 15 e 40 minutos em relação ao grupo controle. Já a expressão de CD63 em basófilos após estímulo com anti-IgE, aumentou somente nos basófilos de indivíduos sadios, uma vez que os níveis de expressão basal estavam previamente aumentados. A presença de autoanticorpos liberadores de histamina foi analisada nos soros de pacientes com UCI. Três experimentos independentes foram realizados, evidenciando a ocorrência de 17% de positividade. CONCLUSÕES: Os resultados mostram que na UCI, os basófilos são sensibilizados in vivo, por fatores além dos autoanticorpos anti-FceRI e que funcionalmente, estão hiper-reativos a estímulos imunológicos. A presença de fatores séricos liberadores de histamina, independente do ASST, enfatiza que o teste intradérmico é sugestivo de autorreatividade e não de autoimunidade na UC / INTRODUCTION: Chronic Urticaria is characterized by recurrent, transitory, pruritic and erythematous wheals present for at least six weeks. In most patients the cause is unknown, defined as idiopathic (CIU), however, a sub-group has autoantibodies against the alfa chain of the high affinity IgE receptor (FceRIa) expressed on mast cells and basophils surface making it the target cells in this disease. OBJECTIVES: To evaluate in CIU patients, undergone autologous serum skin test (ASST), the activation profile of the basophils assessed by the expression of activation/degranulation markers and by the ability to release histamine in response to IL-3 priming and cross-linking with anti-IgE antibodies. Furthermore, the presence of histamine releasing factor in sera of patients was evaluated. METHODS: CIU patients (n = 37) were selected from the Dermatological Outpatient Clinic of the Hospital das Clínicas de São Paulo (HC-FMUSP) and submitted to the ASST. The control group consisted of healthy subjects (n=38). The analysis of the expression of FceRI, CD63, CD123 and CD203c on basophils from peripheral blood was assessed by flow cytometry. For the in vitro stimulation with anti-IgE antibodies, the cells were previously primed with human recombinant IL-3. The histamine release assay mediated by sera from patients with CIU was performed with three different donors of leukocytes and released histamine measured by competition ELISA. RESULTS: There is a low number of basophils in peripheral blood of patients with CIU, reflecting a low serum levels of histamine. The scarce basophils in peripheral blood show high expression of FceRI and an up-regulation of CD203c and CD63 marker expression, independently of the ASST. The functional analysis of basophils, revealed that recombinant IL-3 per se induces a significant increase in CD203c expression and the histamine release from basophils of patients with CIU, which are enhanced followed for 15 and 40 minutes of anti-IgE estimulation. The expression of CD63 in basophils upon anti-IgE stimulation, increased only in basophils of healthy individuals, since the baseline levels of CD63 expression on basophils of patients was already up-regulated. The presence of histamine release factors was examined in sera from CIU patients. Three independent experiments were performed, showing the occurrence of 17% of positivity. CONCLUSION: The results show that in CIU, the basophils are primed in vivo due to factor other than autoantibodies anti-FceRI and they have an hyperactive status to the immunological stimuli. The presence of serum histamine releasing factors, independent of the ASST, emphasizes that the intradermal test is suggestive of autorreactivity and not for autoimmunity in UC

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-05-27T13:36:58Z No. of bitstreams: 1 WELLITA AZEVEDO SILVA - DISSERTAÇÃO PPGSA PROFISSIONAL 2016..pdf: 926244 bytes, checksum: 946f67df6eaaba95c1860cca785b956f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-27T13:36:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WELLITA AZEVEDO SILVA - DISSERTAÇÃO PPGSA PROFISSIONAL 2016..pdf: 926244 bytes, checksum: 946f67df6eaaba95c1860cca785b956f (MD5) Previous issue date: 2016 / O sorvete é produto alimentício muito apreciado pelos consumidores em todo o mundo, entretanto apresenta em sua composição convencional, elevado teor de gorduras, o quê tem despertado o mercador produtor para a necessidade de desenvolver produtos light ou diets. Sendo assim, o estudo objetivou desenvolver formulações de sorvete com substituição parcial da gordura proveniente do soro de leite em pó. Realizaram-se as análises físico-químicas, microbiológicas e sensoriais de cinco formulações de sorvete com redução de gordura denominadas de F0, F1, F2, F3 e F4. A formulação F0, foi considerada como referência, formula padrão, em virtude deter apresentado redução de gordura, enquanto as demais amostras com presença de concentrações distintas de soro de leite em pó nas formulações apresentaram redução de gordura. Os resultados das análises microbiológicas, correspondente as formulações desenvolvidas obedeceram aos limites permitidos pela legislação vigente. No que concerne aos parâmetros físico-químicos, foi observado que as amostras em questão diferiram significativamente entre si, numa variação de 61,18 a 62,93%para a umidade. Já os valores de cinzas, proteínas e acidez titulável das amostras não diferiram entre si. Para os lipídeos, as amostras diferiram entre si, variando de 2,51 a 7,43%, conforme já esperado tendo em vista a redução da gordura. O sorvete com teor reduzido de gordura e substituição por soro apresentou como uma interessante proposta para o mercado de laticínios, pois apresenta características sensoriais agradáveis. / Ice cream is a food product widely appreciated by consumers all around the world. However, in its conventional composition, it has high fat content, what has awakened the producer merchant to the need of developing light products or diets. Thus, the study aimed to develop ice cream formulations with partial substitution of fat from whey powder. The physico-chemical, microbiological and sensorial analyzes of five fat reduction ice cream formulations named F0, F1, F2, F3 and F4 were carried out. The formulation F0 was considered a reference, standard formula, because it presented fat reduction, while the other samples with different concentrations of whey powder in the formulations presented fat reduction. The results of the microbiological analyzes, corresponding to the developed formulations, obeyed the limits allowed by the current legislation. Regarding the physical-chemical parameters, it was observed that the samples in question differed significantly among themselves, in a range from 61.18 to 62.93% for moisture. However, the values of ash, proteins and titratable acidity of the samples did not differ. For the lipids, the samples differed from one another, varying from 2.51 to 7.43%, as already expected in view of fat reduction. The reduced-fat and serum-substituted ice cream presented as an interesting proposal for the dairy market, since it has pleasant sensory characteristics.

INTRODUÇÃO: A Urticária Crônica é caracterizada pelo aparecimento de pápulas eritematosas, pruriginosas recorrentes e transitórias que duram por mais de seis semanas. Na maioria dos pacientes a causa é indeterminada, definida como idiopática (UCI), entretanto, um sub-grupo apresentam autoanticorpos contra a cadeia alfa do receptor de alta afinidade para IgE (FceRI), que são expressos na superfície de mastócitos e basófilos, tornando-os células alvo nesta doença. OBJETIVOS: Avaliar em pacientes com UCI, submetidos ao teste intradérmico de soro autólogo (ASST), o perfil de ativação dos basófilos, pela intensidade de expressão de marcadores de ativação/desgranulação e pela capacidade dos basófilos em responder aos estímulo com a IL-3 e anticorpo anti-IgE. Além disto, a presença de fator liberador de histamina foi avaliado nos soros dos pacientes. METODOLOGIA: Pacientes com UCI (n= 37) foram selecionados no Ambulatório de Urticária do Departamento de Dermatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP e submetidos ao ASST. O grupo controle foi constituído por indivíduos saudáveis (n=38). A análise da expressão de FceRI, CD63, CD123 e CD203c em basófilos de sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. No ensaio in vitro de estimulação dos basófilos com anti-IgE, as células foram previamente incubadas com IL-3. O ensaio de liberação de histamina mediada por soros de pacientes com UCI foi realizado com três diferentes doadores de leucócitos e a histamina liberada dosada por ELISA de competição. RESULTADOS: Há um baixo número de basófilos no sangue periférico nos pacientes com UCI, coincidente com o baixo nível sérico de histamina. Os escassos basófilos no sangue periférico mostram elevada expressão de FceRI e uma regulação positiva da expressão de CD203c e CD63, independentemente do ASST. A análise funcional dos basófilos, mostra que somente a incubação com IL-3 recombinante já induz aumento significante da expressão de CD203c e da liberação de histamina dos basófilos de pacientes com UCI, que são intensificados com o estímulo por anticorpos anti-IgE após 15 e 40 minutos em relação ao grupo controle. Já a expressão de CD63 em basófilos após estímulo com anti-IgE, aumentou somente nos basófilos de indivíduos sadios, uma vez que os níveis de expressão basal estavam previamente aumentados. A presença de autoanticorpos liberadores de histamina foi analisada nos soros de pacientes com UCI. Três experimentos independentes foram realizados, evidenciando a ocorrência de 17% de positividade. CONCLUSÕES: Os resultados mostram que na UCI, os basófilos são sensibilizados in vivo, por fatores além dos autoanticorpos anti-FceRI e que funcionalmente, estão hiper-reativos a estímulos imunológicos. A presença de fatores séricos liberadores de histamina, independente do ASST, enfatiza que o teste intradérmico é sugestivo de autorreatividade e não de autoimunidade na UC / INTRODUCTION: Chronic Urticaria is characterized by recurrent, transitory, pruritic and erythematous wheals present for at least six weeks. In most patients the cause is unknown, defined as idiopathic (CIU), however, a sub-group has autoantibodies against the alfa chain of the high affinity IgE receptor (FceRIa) expressed on mast cells and basophils surface making it the target cells in this disease. OBJECTIVES: To evaluate in CIU patients, undergone autologous serum skin test (ASST), the activation profile of the basophils assessed by the expression of activation/degranulation markers and by the ability to release histamine in response to IL-3 priming and cross-linking with anti-IgE antibodies. Furthermore, the presence of histamine releasing factor in sera of patients was evaluated. METHODS: CIU patients (n = 37) were selected from the Dermatological Outpatient Clinic of the Hospital das Clínicas de São Paulo (HC-FMUSP) and submitted to the ASST. The control group consisted of healthy subjects (n=38). The analysis of the expression of FceRI, CD63, CD123 and CD203c on basophils from peripheral blood was assessed by flow cytometry. For the in vitro stimulation with anti-IgE antibodies, the cells were previously primed with human recombinant IL-3. The histamine release assay mediated by sera from patients with CIU was performed with three different donors of leukocytes and released histamine measured by competition ELISA. RESULTS: There is a low number of basophils in peripheral blood of patients with CIU, reflecting a low serum levels of histamine. The scarce basophils in peripheral blood show high expression of FceRI and an up-regulation of CD203c and CD63 marker expression, independently of the ASST. The functional analysis of basophils, revealed that recombinant IL-3 per se induces a significant increase in CD203c expression and the histamine release from basophils of patients with CIU, which are enhanced followed for 15 and 40 minutes of anti-IgE estimulation. The expression of CD63 in basophils upon anti-IgE stimulation, increased only in basophils of healthy individuals, since the baseline levels of CD63 expression on basophils of patients was already up-regulated. The presence of histamine release factors was examined in sera from CIU patients. Three independent experiments were performed, showing the occurrence of 17% of positivity. CONCLUSION: The results show that in CIU, the basophils are primed in vivo due to factor other than autoantibodies anti-FceRI and they have an hyperactive status to the immunological stimuli. The presence of serum histamine releasing factors, independent of the ASST, emphasizes that the intradermal test is suggestive of autorreactivity and not for autoimmunity in UC

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-07-25T13:32:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-26T12:05:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T12:05:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2002-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The main function of the most superficial layer of the epidermis, the Stratum Corneum (SC), is to provide a physical barrier that controls the transepidermal water loss as well as the permeation of another substances in both directions across the skin. The SC is formed by anabolically dead cells, the terminally differentiated corneocyte, and its function is essentially accomplished by forming a highly insoluble protein structure on the surface of the corneocytes, termed the cornified cell envelope, and by impeding water diffusion across the SC by mortaring the corneocytes together by layers of skin-specific lipids, essentially ceramide, cholesterol and fatty acid. In this work the cell envelope of the SC was spin labeled with a sulfhydryl-specific nitroxide reagent to investigate the water content effects upon the protein dynamics directly in the intact tissue. A two-state model for the nitroxide side chain described the coexistence of two spectral components in the electron paramagnetic resonance (EPR) spectra. The so-called strongly immobilized component, S, is associated with the EPR signal of a motionally restricted nitroxide fraction having its N-O group hydrogen bonded to protein (rigid structure) while the weakly immobilized component, W, corresponds to the signal provided by the spin labels with higher mobility (~10 times greater) exposed to the aqueous environment. The relative populations between these two mobility states, S and W, are in thermodynamic equilibrium. The standard Gibbs free energy, enthalpy and entropy changes for transferring the nitroxide side chain from the state contacting the solvent, W, to the one contacting protein, S, indicated that the reduction of the SC water content to below ~h 0.69, g H2O per g dry SC, stabilizes the protein interacting state, S. Upon decreasing the SC hydration level below ~h 0.69 the segmental motion of the polypeptide chains and the rotational motion of the spin-labeled side chain were also constrained. To test our methodology in a pure and very well known protein, we also studied the effects of two types of detergents on the bovine serum albumin (BSA). Both detergents, the anionic sodium dodecyl sulfate (SDS) and the zwitterionic N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonate (HPS) increase the mobility of the protein backbone and of the nitroxide side chain. The thermodynamic parameters indicated that these detergents destabilize the protein favoring less compact conformations. This work can also be useful to improve the spectral analysis of site-directed spin labeling, especially for a more quantitative description in terms of thermodynamic parameters. / A camada mais superficial da epiderme, o Estrato Córneo (EC), tem como função principal a formação de uma barreira física que controla a perda de água do corpo bem como a permeação de outras substâncias em ambas as direções da pele. O EC é formado por células anabolicamente mortas, os corneócitos, os quais sofreram diferenciação celular terminal, e sua função é realizada formando uma estrutura de proteínas altamente insolúveis na superfície do corneócito, chamada de envelope celular, e também uma matriz lipídica, essencialmente ceramídios, colesterol e ácidos graxos, que dificultam a difusão da água. Neste trabalho, o EC foi marcado com marcadores de spin específicos para reagir com os grupos sulfidrilas das proteínas, para investigar os efeitos do conteúdo de água na dinâmica de proteínas diretamente no tecido intacto. Um modelo de dois estados para a cadeia lateral do nitróxido descreveu a coexistência de duas componentes espectrais de ressonância paramagnética eletrônica (RPE). A componente denominada fortemente imobilizada (S), surge de uma fração de marcadores com o átomo de oxigênio do nitróxido ligado à proteína (estrutura rígida) enquanto a componente fracamente imobilizada é gerada pelos marcadores com mobilidade mais alta (~10 vezes maior) e expostos ao ambiente aquoso. As populações relativas entre estes dois estados de mobilidade, S e W, estão em equilíbrio termodinâmico. Os parâmetros da termodinâmica: energia livre padrão de Gibbs, entalpia e entropia, envolvidos na transferência da cadeia lateral do nitróxido do estado W, contatando ao solvente, para o estado S, contatando a proteína, indicaram que a redução do conteúdo de água para abaixo de ~0.69g de H2O por g de EC seco, estabiliza o estado S (cadeia lateral do nitróxido dobrada sobre a cadeia principal da proteína). Ao diminuir o nível de hidratação para abaixo de ~ h 0.69 (g H2o/g EC seco) o movimento local da cadeia polipeptídica e o movimento rotacional da cadeia lateral do marcador de spin foram ambos reduzidos. Para testar nossa metodologia em uma proteína pura e bem conhecida, estudamos os efeitos de dois tipos de detergentes sobre a albumina do soro bovino (BSA). Ambos os detergentes, o aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS) e o ziteriônico N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanosulfonato (HPS) aumentaram a mobilidade da cadeia principal da proteína e da cadeia lateral do nitróxido. Os parâmetros termodinâmicos indicaram que estes detergentes desestabilizam a proteína favorecendo conformações menos compactas. Os resultados do presente trabalho também podem contribuir para aprimorar a

Células de mamíferos são os hospedeiros mais frequentemente utilizados para a fabricação de proteínas biofarmacêuticas e para a produção de vacinas virais, A qualidade é um elemento-chave para o estabelecimento de um processo de bioconversão eficiente. No presente trabalho utilizamos a linhagem de células BHK- 21C13(Baby Hamster Kidney) adaptadas para cultivo em suspensão. O uso de Soro Fetal Bovino (SFB) é tradicionalmente utilizado, sendo considerado um suplemento universal, pois permite o crescimento em várias linhagens de células de mamíferos; porém, uso de SFB apresenta risco de infecção por prions, variabilidade entre lotes e aumento no custo em etapa de purificação (Downstream processing). O objetivo do presente trabalho foi comparar o cultivo de células BHK-21 C13 entre dois meios suplementados com SFB e sem SFB, através do estudo cinético para cultivo em suspensão estático e agitado com frascoT, frasco spinner e biorreator, respectivamente. Os parâmetros; Xmáx e µmáx, não foram significativamente influenciados pelo meio de cultura em cultivo estático, em cultivo com agitação em frasco spinner e também no cultivo em biorreator. O tempo de duplicação ficou próximo para todas as condições testadas. A produtividade alcançada foi: 0,032x106 cel/mL.h-1 para o meio com SFB e 0,031 X106 cel/mL.h-1 para o meio sem SFB. Ao final do processo foi possível obter uma concentração celular em torno de 4,7x106 cel/mL, tanto para o cultivo com SFB quanto para o cultivo sem SFB. Dessa forma, o uso de meio de cultivo sem SFB não alterou os principais parâmetros cinéticos, não apresentando as desvantagens do uso do SFB. / Mammalian cells are the most frequently used hosts for the production of biopharmaceutical proteins and viral vaccines. Quality is a key element for the establishment of an efficient bioconversion process. In this work, we used the cell line Baby Hamster Kidney C13 (BHK-21 C13) adapted to suspension culture was used. Fetal Bovine Serum (FBS) is traditionally used and it is considered a universal insert due to its power to increase cell growth in this kind of animal cells. However, the utilization of FBS introduces risks of infection from prions, variability between batches and increase in cost associated to purification stages (downstream processing). This work aimed to compare the kinetic behaviors of BHK-21 C13 cells in two media supplemented with FBS and without FBS using both one static and two suspension systems, T-flask, spinner flask and bioreactor respectively. The parameters; Xmax and µmax were not significantly influenced by the culture medium in T- flask culture static, in spinner flask cultivation and were neither significantly influenced by growing in culture media stirred bioreactor. The doubling time was close to all conditions tested. At the end of the growth phase it was possible to obtain a nearby cell concentration of 4.7 x 106 cells / ml, both for cultivation with FBS as for FBS without cultivation. Thus, the use of culture medium without FBS did not affect the main kinetic parameters. Besides, it does not show the disadvantages of culture media using FBS.

[pt] No presente trabalho foram desenvolvidas duas metodologias analíticas para a determinação de talidomida, um composto de reconhecida importância farmacológica. As metodologias espectrofluorimétrica e voltamétrica desenvolvidas foram comparadas em termos de desempenho analítico.As características fluorescentes e eletroquímicas da talidomida foram estudadas para que se encontrassem condições experimentais que fornecessem máximo sinal fluorescente do analito em solução na temperatura ambiente e possibilidade de pré-concentração do analito no eletrodo de mercúrio.Nas condições experimentais otimizadas para a talidomida, limites de detecção compreendidos entre 10-6 e 10-9 g L-1 foram obtidos para o método espectrofluorimétrico e voltamétrico, respectivamente. Faixas lineares dinâmicas entre 2 e 4 ordens de grandeza foram alcançadas dependendo do método e do interferente presente na amostra. Esses parâmetros de mérito se mostraram adequados para o problema proposto. O possível efeito interferente de substâncias geralmente usadas em associação com o analito foi estudado, e estratégias para minimização das interferências foram desenvolvidas. Enquanto a tetraciclina não interferiu no método espectrofluorimétrico, o uso combinado de meio ácido e irradiação UV da amostra foi necessária para permitir a quantificação do analito em presença de sulfanilamida. Na voltametria, as interferências da tetraciclina e da sulfanilamida puderam ser compensadas pelo uso da quantificação pelo método de adição do analito. Nas determinações dos fluídos biológicos, o uso da extração em coluna de sílica C18 mostrou-se bastante eficiente na separação do analito dos interferentes da matriz para o método espectrofluorimétrico e para o voltamétrico, no caso do soro sangüíneo. Para a urina, apenas a clarificação da amostra com sulfato de amônio foi suficiente no caso da determinação voltamétrica.Os métodos desenvolvidos foram testados na dosagem de talidomida presente em uma formulação comercial e em amostras de urina e soro sangüíneo enriquecidas com o analito. Para tal, utilizaram-se os procedimentos de curva de calibração (espectrofluorimetria) e método da adição do analito (voltametria). Em todos os casos, as recuperações obtidas estiveram compreendidas na faixa de 96,5 a 107,6 %, dentro da faixa de recuperação estabelecida pela Farmacopéia dos Estados Unidos da América. / [en] In the present work two analytical methodologies were developed aiming the determination of thalidomide, an important pharmacological compound. The developed spectrofluorimetric and the voltammetric based analytical methodologies were compared in terms of analytical performance. The thalidomide fluorescent and the electrochemical characteristics were studied in order to find experimental conditions for maximum fluorescence in solution and at room temperature and to allow analyte pre- concentration on the mercury electrode. Using the optimized experimental conditions, limits of detection between 10-6 to 10-9 g L-1 were achieved respectively for the spectrofluorimetric method and for the voltammetric method. Dynamic linear ranges between 2 and 4 orders of magnitude were obtained depending on the method utilized and the interferent substances present in the sample. Those parameters of merit were suitable for this proposed analytical problem. The potential interference effect from substances usually used in association with thalidomide, were studied and strategies for the minimization of such interferences were developed. While no interference in the spectrofluorimetric method was observed for tetracycline, the combined use of acidic medium and UV irradiation of the samples was necessary to allow the analyte determination in the presence of sulfanilamide. For the voltammetric method, interferences from tetracycline and sulfanilamide could be compensated by quantifying thalidomide using the analyte addition method. For the determination in biological fluids, the use a solid-liquid extraction on a C18 column was found to be very effective for the analyte separation and elimination of matrix interferences for the spectrofluorimetric method and for the voltammetric method developed for blood serum. For urine samples, a clean-up step using ammonium sulfate was found to be sufficient for the voltammetric determination of thalidomide. The developed methodologies were tested by determining the thalidomide content in a commercial pharmaceutical formulation and in analyte spiked biological fluids using calibration curves (spectrofluorimetric) and analyte addition method (voltammetric). In all cases, the recoveries were between the 96,5 and 107,6 %, within the recovery range considered adequate according to the United States Pharmacopoeia.

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Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 µL do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 µl of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.

A tecnologia de fabricação de bebidas lácteas envolve a mistura de leite e soro, podendo ser fermentada por bactérias do iogurte ou probióticas e adicionada de polpa de fruta e outros aditivos permitidos. O produto final deve conter bactérias lácticas viáveis em número adequado. Os objetivos deste trabalho foram desenvolver bebidas lácteas probióticas a partir das misturas leite-soro e estudar sua vida-de-prateleira. O efeito da composição da cultura probiótica (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. rhamnosus e Bifidobacterium animalis subsp. lactis em co-cultura com Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) e o efeito do pH final da fermentação na cinética de acidificação, pós-acidificação e contagem de bactérias probióticas foram estudados em soro de queijo Minas frescal e em diferentes misturas leite-soro. Bebidas lácteas probióticas foram desenvolvidas a partir das diferentes misturas leite-soro e a vida-de-prateleira foi determinada ao longo de 28 dias de armazenamento do produto a 4°C. As características dos produtos foram seguidas pelas determinações físico-químicas, microbiológicas e sensoriais. O soro apresentou efeito positivo sobre a velocidade máxima das co-culturas estudadas, bem como as diferentes composições das co-culturas influenciaram o parâmetro estudado. Todas as culturas apresentaram contagens maiores em pH final de fermentação 4,5, quando comparadas às obtidas em pH 5,5. A co-cultura StLb foi a mais rápida a fermentar os diferentes meios estudados e, a StLr, a mais lenta. Com a adição de açúcar e de estabilizante, os parâmetros cinéticos mostraram comportamento diferenciado daqueles obtidos em misturas leite-soro. Nas bebidas lácteas, as contagens de B. lactis mantiveram-se acima do limite exigido pela legislação até 28 dias de armazenamento do produto refrigerado. A pós-acidificação, cor e reologia variaram durante o período de armazenamento, influenciando a análise sensorial, cujos atributos obtiveram maior aceitação em bebidas elaboradas com 10% de sólidos lácteos. Os resultados indicaram que a bebida láctea elaborada com a co-cultura StBl foi a melhor alternativa para desenvolvimento de uma bebida funcional com boas características sensoriais. / The technology of production of lactic beverages involves the mixture of milk fermented by yoghurt or probiotic bacteria and whey in appropriate proportions, and the addition of fruit pulp and other allowed additives. The final product should contain viable lactic bacteria in appropriate counts. The objective of this work was to develop a probiotic lactic beverage from milk-whey mixtures and to study its shelf-life. The effect of the composition of the probiotic culture (Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. acidophilus, L. rhamnosus and Bifidobacterium animalis ssp. lactis in co-culture with Streptococcus salivarius subsp. thermophilus) and the effect of the pH of the end of fermentation in the acidification kinetics, post-acidification and counts of probiotic bacteria were studied in Minas frescal cheese whey and in different mixtures milk-whey. Probiotic lactic beverages were developed from different milk-whey mixtures and the shelf-life was determined along 28 days of storage of the product at 4°C. The characteristics of the products were followed by determination of post-acidification, total acidity, color, rheology, probiotic viability and sensorial analysis. Whey presented positive effect on maximum acidification rates of the studied co-cultures, as well as the different compositions of the co-cultures influenced the studied parameter. All cultures presented higher counts when fermentation was stopped at pH 4.5, when compared to pH 5.5. The co-culture StLb presented the fast acidification performance while StLr, the slowest. The addition of sucrose and stabilizer affected the acidification kinetic parameters. In probiotic lactic beverages, counts of B. lactis were higher than the limit required by the legislation until 28 days of cool storage of the product. The post-acidification, color and rheological parameters varied during shelf-life, influencing the sensorial analysis, whose attributes obtained higher acceptance in the elaborated beverage with 10% of total solids. The results indicated that the lactic beverage elaborated with the co-culture StBl was the best alternative for development of a functional lactic beverage with good sensorial characteristics.