Der maschinengestützte Pflanzenmassesensor "Pendulum-Meter" kann online die teilflächenspezifischen Differenzierung der Bestandesfrischmassen und -trockenmassen der meisten Wachstumsstadien von Winterweizen, Winterroggen und Naßreis bestimmen. Das Pendulum-Meter ist in Weizen und Roggen sehr gut geeignet für die Stadien BBCH 39 bis 69, und mit geringerer Genauigkeit auch für die Stadien BBCH 32 bis 34. In Naßreis wurde die Biomasse in allen getesteten Wachstumsstadien von BBCH 25 bis BBCH 65 gut erfaßt. In früheren Wachstumsstadien ist eine Messung nicht möglich. Die Kraft-Winkel-Beziehung des Sensors ist nicht linear. Der wichtigste Faktor für diese Kontaktmessung ist der Biegewiderstand der Getreidehalme. Zur Reduzierung der Rohdaten zu repräsentativen Werten für die Parzellen sind sowohl der Mittelwert des Auslenkungswinkels und der Mittelwert des Vektors, als auch der Median des Auslenkungswinkels geeignet. Die Ergebnisse der Optimierungsversuche in bezug auf die Wiederholgenauigkeit der Meßwerte und die Abbildungsgenauigkeit der Pflanzenmasse zeigten eine große Bandbreite von geeigneten Einstellungsparametern und keine einzelnen optimalen Parameter. Trotzdem sollte die Pendelmasse mP niedrig sein, um eine Zerstörung einiger Pflanzen zu vermeiden. Die Höhe des Zylinderkörpers hA0 sollte die Halme berühren, um den Biegekontakt sicherzustellen. Und die Drehpunkthöhe hP sollte in Bestandeshöhe sein, um eine größtmögliche Bandbreite an Auslenkwinkeln für eine gegebene Biomasse zu erhalten. Die optimalen Einstellungen für hP, hA0, und mP sind in jedem Wachstumsstadium anders, aber eine einzige Pendeleinstellung für alle Wachstumsstadien ist möglich, jedoch läßt sie in vielen Wachstumsstadien eine gute Genauigkeit der Biomassebestimmung vermissen. Ohne Kalibrierung ermittelt das "Pendelum-Meter" immer noch gut die relative Verteilung der teilflächenspezifischen Biomasse, also der Heterogenität des Feldes. Wenn nur die Bestandesheterogenität von Interesse ist, können alle Pendeleinstellungen ohne Kalibrierung benutzt werden. Die Meßwiederholungen mit derselben Parametereinstellung zeigte eine Standardabweichung der Parzellenmittelwerte von weniger als 1°, in den meisten Fällen geringer als 0.3° für die meisten Wachstumsstadien. Der Variationskoeffizient ist für die meisten Einstellungsparameter geringer als 5 %, oft kleiner als 2 %, und er ist größer je kleiner die Bandbreite des gemessenen Winkels ist. Die Genauigkeit der Pflanzenmassebestimmung durch das Pendulum-Meter ist durch Bestimmtheitsmaße von 0.90 oder höher gekennzeichnet. Die lineare Abbildung zeigte dabei geringfügig niedrigere R2 als die quadratische, außer in Roggen, wo in den späteren Wachstumsstadien die Pflanzenmasse wesentlich besser quadratisch darstellt wurde. Auch zeigten die geplotteten Residuen dieser Regression allein im Roggen eine Verfälschung durch einen quadratischen Einfluß. Die Standardfehler dieser Regressionen zur Abbildung der Biomasse waren in der Regel geringer als 2 in Naßreis, geringer als 3 in Winterweizen, und geringer als 4 in Winterroggen, und mit dem Bestandeswachstum zunehmend. Die multiple und einfache Regression der Abhängigkeit der Meßwerte von den Parametereinstellungen des Sensors wurde stark von der Pflanzenmasse der Parzellen beeinflußt, weshalb eine Kalibrierung notwendig ist, wenn die Einstellungsparameter geändert werden. Die Geländeneigung lenkt das Pendel aus, ohne einen Getreidebestand zu messen, und benötigt eine Korrektur durch einen Neigungssensor. Die Fahrgeschwindigkeit muß konstant gehalten werden, da der gemessene Auslenkwinkel eine starke Abhängigkeit von der Geschwindigkeit zeigt, aber gleichzeitig auch von der Menge der Pflanzenmasse. Der Biomassesensor kann die Bestandesdichte bestimmen, wenn die Bestandeshöhe homogen ist, und bestimmt die Bestandeshöhe, wenn die Bestandesdichte konstant ist. Wind mit niedriger Geschwindigkeit ist verfälscht die Biomassemeßwerte nicht meßbar, aber bei höheren Windgeschwindigkeiten wird der Fehler größer. Weitere verfälschende Faktoren sind Unkräuter, das tägliche Pflanzenwachstum, die Neigung des Halmes, Vertiefungen der Fahrgasse, verschiedene Sorten, die eine Eichung des Biomassesensors unter den meisten Umständen notwendig machen. Die Genauigkeit des Meßprinzips wurde mit einem Geräteträger ermittelt, der seine Ausrichtung gegenüber dem Erdboden nicht veränderte, aber ein Traktor kann die Messungen durch seine Eigenbewegung verfälschen. Die Messungen des Biomassesensors können als Entscheidungsbasis zur teilflächenspezifischen Applikation von Wachstumsregeln und Fungiziden dienen, wenn auch die Entscheidungskriterien noch erarbeitet werden müssen. Teilflächenspezifische Applikationen von Wachstumsreglern und Fungiziden nach den Messungen des Pendulum-Meters, also nach der Pflanzenmasse, sind erfolgreich durchgeführt worden. Die Messungen des Pendulum-Meters können dabei als Entscheidungsbasis für die teilflächenspezifische Applikation von Wachstumsreglern und Fungiziden benutzt werden, obwohl die Beziehung zwischen Lager und Pflanzenmasse, und zwischen den meisten Schadpilzen und der Biomasse weitere Untersuchungen erfordert, genauso wie die Ermittlung der notwendigen Aufwandmenge an Wachstumsreglern und Fungiziden je nach Pflanzenmasse. Der Biomassesensor Pendulum-Meter ist für Kontrolle der mittleren und späten Applikationen von Wachstumsreglern und Fungiziden geeignet, hier die Stadien BBCH 32 - 59, aber nicht für die frühen Applikationen, hier die Stadien BBCH 25 - 31, wegen der fehlenden Eignung den Sensor in niedrigem Pflanzenbestand zu benutzen. In der Fungizidapplikation kann der Sensor ähnlich den LAI-Meßgeräten benutzt werden, und in der Ausbringung von Wachstumsreglern hat der Sensor eine große Gemeinsamkeit mit dem Widerstand gegen das Lagern. / The machine-based biomass sensor pendulum-meter can determine on-line the site-specific differentiation of cereal crop fresh masses and dry masses for the most growth-stages in winter wheat, winter rye, and irrigated rice. The pendulum-meter is well suited in wheat and rye for the growth-stages BBCH 39 to BBCH 69, and to a lesser degree for BBCH 34 and 32. Irrigated rice crop biomass was well sensed by the pendulum-meter at all tested growth-stages BBCH 25 to BBCH 65. Earlier growth-stages were not possible to measure. The angle-force relation of the pendulum-meter is non-linear. The most important factor for this contact measurement was found in the bending moment of resistance of the stems. For the reduction of the original data to representative plot values, the average of the angle, the average of the vector, and the median of the angle were suitable. The results of the optimisation trials, in terms of repeatability of the measurement and the accuracy of biomass determination, showed a wide range of suitable parameter settings and not a single optimal parameter. Nevertheless, the mass of the pendulum mP should be low to avoid destruction of the plants, the height of the cylindrical body hA0 should touch the stems to ensure bending contact, and the height of the pivot point hP should be at crop height to get a wide range of angles of deviation for a given range of biomass. For every growth-stage, the optimum hP, hA0, and mP are different, and although a single pendulum-meter setting for all growth-stages is possible, but lacking good accuracy of biomass determination in many growth-stages. Without calibration the pendulum-meter still senses well the relative distribution of the site-specific biomass, hence the field heterogeneity. When only the crop's heterogeneity is of interest, all pendulum settings can be used without calibration. The replicates with the same pendulum parameter settings show a standard deviation of the plot average of less than 1°, mostly less than 0.3° for the most growth-stages. The coefficient of variation is mostly less than 5 %, often less than 2 %, and it is higher the smaller the range of measured angles is. The accuracy of biomass determination of the pendulum-meter showed mostly R2 of 0.90 or higher. The linear regression performed with slightly lower R2 than the square, except for rye, where the square regression was much better for the late growth-stages. Solely in rye the plotted residuals showed a square bias. The standard errors of the regressions were less than 2 in rice, less than 3 in wheat, and less than 4 in rye, increasing during crop growth. The multiple and simple regression for the dependency of the measured angle on the parameter settings of the pendulum was strongly influenced by the biomass thus causing a re-calibration when changing the pendulum parameters. The slope of the terrain is deviating the pendulum-meter without crop and needed a correction by a slope sensor. The carrier speed has to be constant, and the angle of deviation is highly dependent on the carrier speed, but simultaneously dependent on the amount of biomass. The biomass sensor senses the tiller density, when the plant height is homogeneous, and the plant height when the tiller density is constant. Wind at low speeds is not a biasing factor, but at high wind speeds the bias will increase. Further biasing factors can be weeds, daily plant growth, stem inclination, tramline depth, and variety, thus requiring a re-calibration of the biomass sensor under most conditions. The accuracy of the measurement principle was determined with a carrier that was not changing its orientation towards the soil surface, but a tractor might bias the measurements because of its own movement. Site-specific application of growth-regulators and fungicides according to the measurements of the pendulum-meter, and hence the biomass, has been successfully conducted. The measurements of the pendulum-meter can be used as a decision base for the site-specific application of growth-regulators and fungicides, although the relationship between lodging and biomass, and between most fungi and biomass needs further examination, as well as determining the necessary amount of growth-regulators and fungicides according to biomass. The biomass sensor pendulum-meter is suitable for controlling the intermediate and late applications of growth-regulators and fungicides, here BBCH 32 - 59, but not for the early applications, here BBCH 25 - 31, due to impossibility of using the sensor in low plants. In fungicide application, the sensor can be used similar to LAI, and in growth-regulators sprayings, the sensor has in principle a high similarity with lodging resistance.

For the first time the transcriptional reprogramming of distinct root cortex cells during the arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis was investigated by combining Laser Capture Mirodissection and Affymetrix GeneChip® Medicago genome array hybridization. The establishment of cryosections facilitated the isolation of high quality RNA in sufficient amounts from three different cortical cell types. The transcript profiles of arbuscule-containing cells (arb cells), non-arbuscule-containing cells (nac cells) of Rhizophagus irregularis inoculated Medicago truncatula roots and cortex cells of non-inoculated roots (cor) were successfully explored. The data gave new insights in the symbiosis-related cellular reorganization processes and indicated that already nac cells seem to be prepared for the upcoming fungal colonization. The mycorrhizal- and phosphate-dependent transcription of a GRAS TF family member (MtGras8) was detected in arb cells and mycorrhizal roots. MtGRAS shares a high sequence similarity to a GRAS TF suggested to be involved in the fungal colonization processes (MtRAM1). The function of MtGras8 was unraveled upon RNA interference- (RNAi-) mediated gene silencing. An AM symbiosis-dependent expression of a RNAi construct (MtPt4pro::gras8-RNAi) revealed a successful gene silencing of MtGras8 leading to a reduced arbuscule abundance and a higher proportion of deformed arbuscules in root with reduced transcript levels. Accordingly, MtGras8 might control the arbuscule development and life-time. The targeting of MtGras8 by the phosphate-dependent regulated miRNA5204* was discovered previously (Devers et al., 2011). Since miRNA5204* is known to be affected by phosphate, the posttranscriptional regulation might represent a link between phosphate signaling and arbuscule development. In this work, the posttranscriptional regulation was confirmed by mis-expression of miRNA5204* in M. truncatula roots. The miRNA-mediated gene silencing affects the MtGras8 transcript abundance only in the first two weeks of the AM symbiosis and the mis-expression lines seem to mimic the phenotype of MtGras8-RNAi lines. Additionally, MtGRAS8 seems to form heterodimers with NSP2 and RAM1, which are known to be key regulators of the fungal colonization process (Hirsch et al., 2009; Gobbato et al., 2012). These data indicate that MtGras8 and miRNA5204* are linked to the sym pathway and regulate the arbuscule development in phosphate-dependent manner. / Die Leguminose Medicago truncatula (gehört zur Gattung des Schneckenklees) ist in der Lage sowohl eine Symbiose mit stickstofffixierenden Bakterien (Rhizobien), als auch mit Mykorrhiza-Pilzen einzugehen. Der Mykorrhiza-Pilz Rhizophagus irregularis dringt in die Wurzelrindenzellen ein und bildet Strukturen aus, die als Arbuskeln bezeichnet werden. Diese ermöglichen den Transfer von Nährstoffen, wie Phosphat in die Wurzelzellen. Die Pflanze liefert hingegen bis zu 20 % ihrer Photosyntheseprodukte an den Pilz. Da die Lebenszeit der Arbuskeln nur wenige Tage beträgt, können Wurzelrindenzellen mehrere Arbuskeln nacheinander beherbergen. Somit können neben arbuskelhaltigen, auch nicht-arbuskelhaltige Zellen in kolonisierten Wurzeln auftreten. Die nicht-arbuskelhaltigen Zellen beeinträchtigen die Sensitivität von Genregulationsanalysen, wenn die Genregulation während der Mykorrhiza-Symbiose anhand von ganzen kolonisierten Wurzeln untersucht wird. In dieser Arbeit konnte eine Zelltyp-spezifische Analyse der Genregulation von arbuskelhaltigen und nicht-arbuskelhaltigen Zellen durchgeführt, und eine Erhöhung der Sensitivität erreicht werden. Mittels Laser Capture Microdissection wurden Zellen aus Gefrierschnitten von Wurzeln isoliert. Aus den so gewonnen Zellen konnte RNA von ausreichender Qualität und Quantität extrahiert werden, um das Transkriptom der beiden Zelltypen mittels Mikroarrayhybridisierung zu untersuchen. Transkriptionsfaktoren (TFs) spielen wahrscheinlich eine Schlüsselrolle in der Umprogrammierung von Wurzelzellen während der Mykorrhiza-Symbiose. Daher wurde die Genregulation von TF-Genen in den zwei Zelltypen gezielt untersucht. Anhand von quantitativer RT-PCR und Promoter-Reporter-Fusionen wurde die differentielle Expression von mehreren TF-Transkripten in den verschiedenen Zelltypen bestätigt. Die Charakterisierung eines potentiellen GRAS TF (MtGRAS8) konnte eine stark Symbiose- und Phosphat-abhängige Induktion von Transkripten bestätigt werden. Mutanten mit verringerter MtGras8 Transkriptmenge wiesen eine verringerte Arbuskelzahl und deformierte Arbuskeln auf. MtGras8 scheint daher an der Arbuskelentwicklung beteiligt zu sein. Vorherige Experimente zeigten, dass MtGras8 Transkripte, von der Phosphat-regulierten MikroRNA5204* geschnitten werden (Devers et al., 2011). Dies konnte durch Überexpression der MikroRNA5204* in vivo bestätigt werden. Weiterhin konnten Protein-Protein-Interaktionen von MtGras8 mit bekannten GRAS TFs (NSP1, NSP2, RAM1) nachgewiesen und daraus eine Verbindung zu bekannten Symbiose-induzierten Signalkaskaden geschlossen werden. In dieser Arbeit wurde erstmals die Umprogrammierung von nicht-arbuskelhaltigen Zellen untersucht und neue Regulationselemente für die Kontrolle der Arbuskelentwicklung, wie MtGRAS8 und MikroRNA5204*, charakterisiert.

Mit durchflusszytometrischen und molekularbiologischen Verfahren wurden verschiedene Subpopulationen peripherer T-Lymphozyten bei gesunden Spendern und Nierentransplantatempfängern phänotypisch und funktionell untersucht. Wir fanden, dass eine T-Zell-Population, welche unter anderem die Oberflächenmarker LFA-1 und CD57 exprimierte, nicht aber CD28, terminale Effektorzellen enthielt. Wegen der bekannten Assoziation der Expansion CD57-positiver CD8-positiver T-Zellen mit einer Infektion mit dem Zytomegalievirus (CMV), wollten wir untersuchen, ob auch CMV-spezifische Effektorzellen darin enthalten waren. Um diesen möglichen Zusammenhang zwischen Phänotyp und Spezifität zu untersuchen, wurde ein bekanntes durchflusszytometrisches Verfahren zur Erfassung antigen-spezifischer CD4-T-Zellen so modifiziert, dass damit auch antigen-spezifische CD8-T-Zellen erfasst werden konnten. Dazu wurden frisch isolierte periphere mononukleäre Zellen in vitro mit löslichen Peptiden oder Peptidgemischen inkubiert (anstelle von Erregerlysaten oder Proteinantigenen wie im bekannten Verfahren), so dass durch direkte externe Beladung von MHC-I- und MHC-II- Molekülen nicht nur CD4- sondern auch CD8-T-Zellen stimuliert wurden. Anschließend konnten CD4 - und/oder CD8-positive T-Zellen nachgewiesen werden, in welchen es zur Synthese von Interferon-gamma gekommen war (intrazelluläre Färbung), wodurch diese Zellen als antigen-spezifisch identifiziert wurden. Diese Zellen konnten dann weiter phänotypisch analysiert werden. Unter Verwendung bekannter CD8-T-Zellen-stimulierender CMV-Peptide konnte der Phänotyp CMV-spezifischer CD8-T-Zellen untersucht werden, wobei sich zeigte, dass das CD57-positive Subset tatsächlich den gößeren Teil der CMV-spezifischen CD8 T-Zellen enthielt. Andererseits konnte das neue Verfahren verwendet werden, um weitere Peptide zu identifizieren, welche eine T-Zellstimulation bewirkten (Epitopkartierung). In zwei von uns untersuchten Proteinen des CMV (pp65 und IE-1) wurden so mehrere neue CD4- und CD8-T-Zellepitope beschrieben. Die Vewendung komplexer Peptidgemische erlaubte darüber hinaus die Untersuchung der T-Zellantwort gegen ganze Proteine (repräsentiert durch die Gesamtheit aller denkbaren Epitope), was insbesondere für die Untersuchung von CD8-T-Zellen eine große Bereicherung darstellte und vom MHC-Typ unabhängig war. Wir verwendeten dieses neue Verfahren bisher zur Analyse und zum Monitoring der T-Zellantwort gegen bestimmte Erregerproteine oder -peptide (z.B. aus CMV oder HIV). Es eignet sich darüber hinaus auch zur Untersuchung der Immunantwort gegen Impfstoffe, welche zur Induktion von T-Zellen führen sollen. / Using flow-cytometric and molecular-biology methods subpopulations of peripheral blood T-lymphocytes were examined in healthy donors and renal transplant recipients with respect to phenotype and function. We found that a T-cell population that expressed the surface markers LFA-1 and CD57 (among others), but not CD28, contained terminal effector cells. Because of the known association of an expansion of CD57-positive CD8-positive T-cells with an infection with Cytomegalovirus (CMV), we wanted to examine if CMV-specific effector cells were also contained in this subset. In order to investigate this association between phenotype and specificity, we modified a known flow-cytometric method for the detection of antigen-specific CD4 T-cells in such a way that antigen-specific CD8 T-cells could also be detected. For this purpose freshly isolated mononuclear cells were incubated in vitro with soluble peptides or peptide mixes (instead of pathogen lysates or protein antigens as used in the original method) so that following direct external loading of MHC-I and MHC-II molecules not only CD4 T-cells but also CD8-T-cells were stimulated. Subsequently, CD4 and/or CD8 T-cells that had synthesized Interferon-gamma (intracellular staining), which identified them as being antigen-specific, could be detected. These cells could then be analyzed with regard to phenotype. Using known CD8-T-cell stimulating CMV-peptides, the phenotype of CMV-specific CD8 T-cells could be analyzed. Thus it was demonstrated that the majority of CMV-specific CD8 T-cells was indeed contained in the CD57-positive subset. On the other hand, this new approach allowed the identification of additional peptides that stimulated T-cells (epitope mapping). In two CMV-proteins that we examined (pp65 and IE-1) several new CD4 and CD8-T-cell epitopes were described. The use of complex peptide mixes in this approach allowed the analysis of T-cell responses to complete proteins (represented by the entirety of all possible epitopes), which was a great benefit to the analysis of CD8 T-cells and independent of MHC-type. Until now, we have used this new method for the analysis and the monitoring of the T-cell response to specific pathogen proteins or peptides (e.g. from CMV or HIV). It is suitable, moreover, for the analysis of the immune response to vaccinations that aim at the induction of T-cells.

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Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.

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Background Regulatory T cells (Treg) are a subpopulation of CD4+ T cells that play an important role in the peripheral tolerance mechanisms of the immune system. Their suppressive function on autoreactive T cells can prevent autoimmunity. In type 1 diabetes (T1D), Treg have been inconsistently reported to be impaired in their capability to suppress autoreactive T cells (Tan, et al., 2014; Zhang, et al., 2012). Treg can be thymus derived (tTreg) or generated from naïve CD4+ CD25- T cells in the periphery (pTreg), which exhibit similar suppressive qualities as tTreg. They have also been reported to be actively induced (iTreg) under tolerogenic conditions (Kleijwegt, et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Although several Treg subpopulations have been described, the archetypical Treg express the major markers CD4, CD25 and FOXP3, while CD127 is heavily downregulated. However, activated conventional T cells (Tconv) show a similar phenotype, at least transiently (Miyara, et al., 2009). Since Treg and Tconv have opposing functions and therapeutic indications, it is important to obtain markers that confidently identify bona fide Treg. Scientific aim The aim of my thesis is to define the heterogeneity of human T cells with a specific emphasis to identify bona fide Treg. I examined heterogeneity of this population in healthy controls and T1D patients, as my model disease, and examined how T cells that are exposed to antigen can be defined as Treg or Tconv. Material and Methods For marker phenotyping I used samples from new onset T1D patients (age 7-11 years), autoantibody positive (Aab+) patients and age-matched healthy controls, which were tested by flow cytometry with an array of Treg-associated markers. Separately, freshly isolated CD4+CD25+CD127lo Treg and CD+CD25- Tconv were used for transcriptomic analysis, which was done by RNAseq on isolated whole RNA. For functional analysis of antigen specific gene expression patterns I developed a multi-dye proliferation assay. Treg (CD4+CD25+CD127lo) and Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) were sorted from isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC). I recombined the sorted and proliferation dye stained subsets with CD4- cells to simulate whole PBMC assays and stimulated them with tetanus-, influenza- or auto-antigens (GAD65, proinsulin). Cells were incubated for 5 days and responding proliferating cells as well as non-responding cells were single cell sorted and analyzed by multiplex qPCR. In investigating therapeutic approaches to expand or generate Treg, I examined in vitro approaches for de novo induction of Tregs with tolerogenic dendritic cells (tDCs). The tDCs were differentiated from monocytes either in the presence of 1α,25-OH(2)Vitamin D3 and/or Dexamethasone and matured with lipopolysaccharide. In a multistep assay, naïve T cells were incubated with DCs for two rounds and functional suppression assays were performed. The resultant T cells were analyzed at the DNA, protein, and functional level. Results Substantial phenotypic heterogeneity of peripheral blood CD4+ T cells was observed and documented for three major populations: resting Tconv (CD25-CD127+/lo), activated Tconv (CD25+CD127+) and Treg (CD25+CD127lo) in healthy controls. Despite this, I observed no differences between the Treg subpopulations from new onset T1D patients, Aab+ patients and healthy controls. In addition, there were no differences in the Treg transcriptome of T1D patients and healthy controls by RNAseq. I was, however, able to identify a small set of differentially expressed genes was discovered in Tconv suggesting a role of neutrophils in the onset of T1D. Heterogeneity of antigen-responsive Tconv and Treg was identified by gene expression profiling. I was able to define Treg specific as well as activation specific profiles, and found different expression profiles if T cells are foreign antigen or autoantigen activated and if the responding cells are Treg or Tconv. Genes that define the specific profiles include FOXP3, CD127, several cytokines, transcription factors and activation markers. The manipulation of naïve CD4+CD25- T cells by tDCs led to an unstable CD25+CD127loFOXP3+ phenotype of the generated cells. However, none of the subsequently performed functional assays could confirm that the resultant cells were iTreg or exhausted activated Tconv. In particular, methylation status of the Treg-specific demethylated region (TSDR) was inconsistent with stable Treg, suggesting that so-called tolerogenic protocols may not lead to a long-lived Treg phenotype. Conclusion CD4+CD25+ T cells are heterogeneous. I defined marker combinations that will help distinguish Treg from ex vivo and in vitro activated Tconv cells. With these tools, I was able to show that healthy controls and patients with type 1 diabetes cannot be distinguished by Treg phenotype. Comprehensive single cell analysis of antigen activated T cells provided the most promising avenue for identifying antigen-specific Treg and opens new possibilities to analyze immune therapeutic approaches, particularly when Treg expansion is the therapeutic objective. The findings will be used for monitoring children participating in antigen-based prevention studies in children at risk for T1D. / Hintergrund Regulatorische T Zellen (Treg) sind eine Subpopulation der CD4+ T Zellen, welche eine wichtige Rolle in den peripheren Toleranzmechanismen des Immunsystems spielen. Ihre suppressive Funktion auf autoreaktive T Zellen kann Autoimmunität verhindern. Verschiedene Studien berichteten widersprüchlich, dass Treg in Typ 1 Diabetes (T1D) in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt sind autoreaktive T Zellen zu supprimieren (Tan et al., 2014; Zhang et al., 2012). Treg können im Thymus differenzieren (tTreg) oder aus peripheren naïven CD4+CD25- T Zellen generiert werden (pTreg), welche ähnliche suppressive Eigenschaften wie tTreg besitzen. Es wurde außerdem berichtet, dass Treg aktiv unter tolerisierenden Konditionen induziert werden können (iTreg) (Kleijwegt et al., 2010; Yuan and Malek, 2012). Obwohl verschiedene Treg Subpopulationen beschrieben wurden, exprimieren die archetypischen humanen Treg die Hauptmarker CD4, CD25 und FOXP3 exprimieren, während CD127 herunterreguliert ist. Jedoch zeigen auch aktivierte konventionelle T Zellen (Tconv) diesen Phänotyp (Miyara et al., 2009). Da Treg und Tconv gegensätzliche Funktionen und therapeutische Indikationen aufweisen, ist es wichtig Marker zu erhalten, die sicher bona fide Treg identifizieren. Fragestellung Das Ziel meiner Arbeit ist es, die Heterogenität von humanen T Zellen zu definieren mit einen spezifischen Fokus bona fide Treg zu identifizieren. Dafür untersuchte ich die Heterogenität dieser Zellpopulation in gesunden Individuen und T1D Patienten, als Krankheitsmodell, und wie T Zellen als Treg oder Tconv definiert werden können wenn sie einem Antigen ausgesetzt sind. Material und Methoden Für das Phänotypisieren habe ich Proben von Patienten mit beginnendem T1D (Alter 7-11 Jahre), Autoantikörper positiven Patienten (Aab+) und gesunden Individuen mittels Durchflusszytometrie auf eine Reihe von Treg-assoziierten Markern getestet. Des Weiteren wurden frisch isolierte CD4+CD25+CD127lo Treg und CD+CD25- Tconv für die Transkriptomanalyse (RNAseq) genutzt, welche mit der Gesamt-RNA durchgeführt wurden. Für die funktionelle Analyse von Antigen-spezifischen Genexpressionsmustern habe ich ein Multifarbenproliferationstest entwickelt. Treg (CD4+CD25+CD127lo) und Tconv (CD4+CD25-CD127+/lo) wurden aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) sortiert. Ich habe die sortierten und gefärbten Zellen mit CD4- Zellen zusammengefügt, um einen Gesamt-PBMC-Test zu simulieren und habe die Zellen mit Tetanus-, Influenza- oder Auto-antigen (GAD65, Proinsulin) stimuliert. Die Zellen wurden für 5 Tage inkubiert und die Antigen-reagierenden und -proliferierenden Zellen sowie die nicht-reagierenden Zellen Einzelzell sortiert und mittels Multiplex qPCR analysiert. Um therapeutische Ansätze zum Expandieren oder Generieren von Treg zu untersuchen, habe ich in vitro Ansätze für die de novo Induktion von Treg durch die Nutzung von tolerisierenden dendritischen Zellen (tDCs) untersucht. Die tDCs wurden von Monozyten in Anwesenheit von 1α,25-OH(2)Vitamin D3 und/oder Dexamethason differenziert und mit Lipoploysaccharid maturiert. Naïve T Zellen wurden in einem Mehrschrittverfahren mit DCs inkubiert. Die resultierenden T Zellen wurden auf DNA, Protein und funktioneller Ebene analysiert. Ergebnisse Substantielle phänotypische Heterogenität von peripheren Blut CD4+ T Zellen wurde in drei Hauptpopulationen in gesunden Individuen beobachtet und dokumentiert: ruhende Tconv (CD25-CD127+/lo), aktivierte Tconv (CD25+CD127+) und Treg (CD25+CD127lo). Weiterführend ergab der phänotypische Vergleich von Patienten mit beginnender T1D, Aab+ Patienten und gesunden Individuen keine Unterschiede in den Treg Subpopulationen. Außerdem zeigten sich keine Unterschiede in den durch RNAseq gemessenen Treg Transkriptomen von T1D Patienten und gesunden Individuen. Jedoch wurde ein kleine Gruppe von differentiell exprimierten Genen in Tconv entdeckt, welche eine mögliche Rolle von Neutrophilen in T1D andeuten. Heterogenität von Antigen-spezifischen Tconv und Treg Antworten wurde durch Genexpressionsanalysen identifiziert. Ich konnte Treg- sowie Aktivierungs-spezifische Muster definieren und verschiedene Expressionsprofile finden, wenn T Zellen durch Fremd- oder Autoantigen aktiviert wurden und ob sie die reagierenden Zellen Treg oder Tconv sind. Folgende Gene waren hauptsächlich in die Profilbildung involviert: FOXP3, CD127, mehrere Zytokine, Transkriptionsfaktoren und Aktivierungsmarker. Die Manipulation von naïven CD4+CD25- T Zellen durch tDCs führte zu einem instabilen CD25+CD127loFOXP3+ Phänotyp der generierten Zellen. Jedoch konnte keiner der weiterführenden funktionellen Analysen unterscheiden, ob die resultierenden Zellen iTreg oder aktivierte erschöpfte T Zellen waren. Insbesondere war der Methylierungsstatus der Treg-spezifisch demethylierten Region (TSDR) nicht konsistent mit einen stabilen Treg Phänotyp, was darauf hinweist, dass sogenannte tolerisiernde Protokolle nicht zu einem langlebigen Treg Phänotyp führen. Schlussfolgerungen CD4+CD25+ T Zellen sind heterogen. Ich habe Markerkombinationen definiert die helfen werden Treg von ex vivo und in vitro aktivierten Tconv Zellen zu unterscheiden. Mit diesen Mitteln war ich in der Lage zu zeigen, dass gesunde Individuen und Patienten mit Typ 1 Diabetes nicht anhand ihres Treg Phänotyps unterschieden werden können. Umfassende Einzelzell-Analysen von Antigen aktivierten T Zellen lieferten den vielversprechendsten Ansatz für die Identifizierung von Antigen-spezifischen Treg und eröffnen neue Möglichkeiten um immuntherapeutische Ansätze zu analysieren, insbesondere wenn Treg Expansion das therapeutische Ziel ist. Diese Erkenntnisse werden zukünftig für das Monitoring von Kindern, mit einem hohen T1D Risiko, genutzt die an Antigen-basierten Präventionsstudien teilnehmen.

In the present study the results of investigations on polycrystalline MgB2 and on single crystals of YNi2B2C and HoNi2B2C are presented. In particular, measurementes of specific electrical resistance, thermal conductivity, thermoelectric power, and of the linear thermal expansion coefficient were performed. Moreover, the specific heat of polycristalline borocarbide samples was evaluated. From the measured data, the temperature dependencies of the Lorenz number and of the Grueneisen parameter can be determined, also the pressure dependence of the superconducting transition temperature using the Ehrenfest relation. At low temperatures a characteristic deviation of the resistivity from the Bloch-Grueneisen law in the normal state for all investigated substances was observed. A reentrant behaviour in resistivity and thermoelectric power occurs at the antiferromagnetic phase transition of HoNi2B2C. The thermal conductivity of MgB2 below 7 K is dominated by the scattering of phonons at grain boundaries. The absence of both, a maximum of thermal conductivity in the superconducting state, and the change of its slope at the superconducting transition temperature points to the validity of the two-band model that also describes the temperature dependence of specific heat. Measurements of thermoelectric power confirm the different normal-state character of the charge carriers of the investigated superconductors. Diffusion thermopower and phonon drag describe the measured data of all investigated compounds ov a wide range of temperature. The thermal expansion of HoNi2B2C below 10 K is dominated by the magnetic contribution. For all investigated substances the Grueneisen parameter features very large values in selected temperature ranges. In the case of MgB2, its temperature dependence is evidently connected with the properties of the relevant phonon mode. For the borocarbides, the electrical resistance depends very weakly on the crystallographic direction, but in contrast the thermal conductivity does in a quite strong manner. Despite of the antiferromagnetic phase transition in the case of HoNi2B2C, thermoelectric power and thermal expansion show minor anisotropy. / In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse von Untersuchungen an polykristallinem MgB2 sowie an YNi2B2C- und HoNi2B2C-Einkristallen analysiert. Dafür erfolgten Messungen des spezifischen elektrischen Widerstands, der Wärmeleitfähigkeit, der Thermokraft und des linearen thermischen Ausdehnungskoeffizienten. Zudem wurde die spezifische Wärmekapazität polykristalliner Borkarbide bestimmt und aus den erhaltenen Daten die Temperaturabhängigkeit der Lorenz-Zahl und des Grüneisen-Parameters sowie mittels der Ehrenfest-Relation die Druckabhängigkeit der Sprungtemperatur ermittelt. Bei tiefen Temperaturen findet man im normalleitenden Zustand für alle betrachteten Substanzen ein charakteristisches Abweichen des Widerstands vom Bloch-Grüneisen-Gesetz. Bei HoNi2B2C tritt beim antiferromagnetischen Phasenübergang im Widerstand und in der Thermokraft ein reentrant-Verhalten auf. Die thermische Leitfähigkeit von MgB2 wird unterhalb von 7 K durch die Streuung der Phononen an Korngrenzen bestimmt. Das Fehlen eines Maximums in der Wärmeleitfähigkeit im supraleitenden Zustand und einer Anstiegsänderung bei der Sprungtemperatur liefert einen Hinweis auf die Gültigkeit des Zweibandmodells, mit welchem auch der Temperaturverlauf der Wärmekapazität erklärt werden kann. Messungen der Thermokraft bestätigen den unterschiedlichen Charakter der Ladungsträger im normalleitenden Zustand der untersuchten Supraleiter, wobei Elektronendiffusion und Phonon Drag die Messdaten aller betrachteten Verbindungen in weiten Temperaturbereichen beschreiben. Für HoNi2B2C wird die thermische Ausdehnung unterhalb von 10 K durch den Beitrag der magnetischen Ordnung bestimmt. Der Grüneisen-Parameter weist für alle untersuchten Substanzen in Teilbereichen sehr große Beträge auf. Sein Temperaturverlauf hängt bei MgB2 offenbar mit Eigenschaften der maßgeblichen Phononenmode zusammen. Für die Borkarbide ist die Richtungsabhängigkeit des elektrischen Widerstandes sehr schwach, in der Wärmeleitfähigkeit hingegen recht stark ausgeprägt. Abgesehen vom antiferromagnetischen Phasenübergang bei HoNi2B2C weisen Thermokraft und Ausdehnungskoeffizient eine geringe Anisotropie auf.

In the present study the results of investigations on polycrystalline MgB2 and on single crystals of YNi2B2C and HoNi2B2C are presented. In particular, measurementes of specific electrical resistance, thermal conductivity, thermoelectric power, and of the linear thermal expansion coefficient were performed. Moreover, the specific heat of polycristalline borocarbide samples was evaluated. From the measured data, the temperature dependencies of the Lorenz number and of the Grueneisen parameter can be determined, also the pressure dependence of the superconducting transition temperature using the Ehrenfest relation. At low temperatures a characteristic deviation of the resistivity from the Bloch-Grueneisen law in the normal state for all investigated substances was observed. A reentrant behaviour in resistivity and thermoelectric power occurs at the antiferromagnetic phase transition of HoNi2B2C. The thermal conductivity of MgB2 below 7 K is dominated by the scattering of phonons at grain boundaries. The absence of both, a maximum of thermal conductivity in the superconducting state, and the change of its slope at the superconducting transition temperature points to the validity of the two-band model that also describes the temperature dependence of specific heat. Measurements of thermoelectric power confirm the different normal-state character of the charge carriers of the investigated superconductors. Diffusion thermopower and phonon drag describe the measured data of all investigated compounds ov a wide range of temperature. The thermal expansion of HoNi2B2C below 10 K is dominated by the magnetic contribution. For all investigated substances the Grueneisen parameter features very large values in selected temperature ranges. In the case of MgB2, its temperature dependence is evidently connected with the properties of the relevant phonon mode. For the borocarbides, the electrical resistance depends very weakly on the crystallographic direction, but in contrast the thermal conductivity does in a quite strong manner. Despite of the antiferromagnetic phase transition in the case of HoNi2B2C, thermoelectric power and thermal expansion show minor anisotropy. / In der vorliegenden Arbeit werden Ergebnisse von Untersuchungen an polykristallinem MgB2 sowie an YNi2B2C- und HoNi2B2C-Einkristallen analysiert. Dafür erfolgten Messungen des spezifischen elektrischen Widerstands, der Wärmeleitfähigkeit, der Thermokraft und des linearen thermischen Ausdehnungskoeffizienten. Zudem wurde die spezifische Wärmekapazität polykristalliner Borkarbide bestimmt und aus den erhaltenen Daten die Temperaturabhängigkeit der Lorenz-Zahl und des Grüneisen-Parameters sowie mittels der Ehrenfest-Relation die Druckabhängigkeit der Sprungtemperatur ermittelt. Bei tiefen Temperaturen findet man im normalleitenden Zustand für alle betrachteten Substanzen ein charakteristisches Abweichen des Widerstands vom Bloch-Grüneisen-Gesetz. Bei HoNi2B2C tritt beim antiferromagnetischen Phasenübergang im Widerstand und in der Thermokraft ein reentrant-Verhalten auf. Die thermische Leitfähigkeit von MgB2 wird unterhalb von 7 K durch die Streuung der Phononen an Korngrenzen bestimmt. Das Fehlen eines Maximums in der Wärmeleitfähigkeit im supraleitenden Zustand und einer Anstiegsänderung bei der Sprungtemperatur liefert einen Hinweis auf die Gültigkeit des Zweibandmodells, mit welchem auch der Temperaturverlauf der Wärmekapazität erklärt werden kann. Messungen der Thermokraft bestätigen den unterschiedlichen Charakter der Ladungsträger im normalleitenden Zustand der untersuchten Supraleiter, wobei Elektronendiffusion und Phonon Drag die Messdaten aller betrachteten Verbindungen in weiten Temperaturbereichen beschreiben. Für HoNi2B2C wird die thermische Ausdehnung unterhalb von 10 K durch den Beitrag der magnetischen Ordnung bestimmt. Der Grüneisen-Parameter weist für alle untersuchten Substanzen in Teilbereichen sehr große Beträge auf. Sein Temperaturverlauf hängt bei MgB2 offenbar mit Eigenschaften der maßgeblichen Phononenmode zusammen. Für die Borkarbide ist die Richtungsabhängigkeit des elektrischen Widerstandes sehr schwach, in der Wärmeleitfähigkeit hingegen recht stark ausgeprägt. Abgesehen vom antiferromagnetischen Phasenübergang bei HoNi2B2C weisen Thermokraft und Ausdehnungskoeffizient eine geringe Anisotropie auf.

Plasmodien spp. sind obligat intrazellulär lebende Parasiten, welche einen evolutionär konservierten aktinabhängigen molekularen Motor für die Fortbewegung und den Wirtszellein- und -austritt nutzen. In dieser Arbeit werden die Aktinregulatoren Adenylyl- Zyklase- assoziierte Protein (C-CAP), Profilin sowie die Aktin depolymerizierenden Faktoren 1 und 2 (ADF1, ADF2) in Plasmodium berghei charakterisiert. Die Geninaktivierung von C-CAP besitzt keinen Einfluss auf die Entwicklung von pathogenen Blutstadien. C-cap(-) Ookineten bewegen sich jedoch deutlich langsamer, sind aber in der Lage den invertebraten Wirt zu infizieren. Defekte treten während der extrazellulären Replikationsphase im Mosquito auf und führen zu Abbruch des Lebenszykluses. Die erfolgreiche Komplementierung der Defekte mit dem orthologen Gen aus Cryptosporidium parvum CpC-CAP bestätigt die funktionale Redundanz zwischen beiden Proteinen. Profilin, als ein weiteres G-Aktin bindendes Protein, ist hingegen nicht in der Lage die Defekte des c-cap(-) Parasiten auszugleichen. Mittels transgener Parasiten welche ein C-CAPmCherry Fusionsprotein exprimieren, wird das C-CAP Protein im Zytoplasma lokalisiert. Erstmals wird mit dieser Arbeit ein G-Aktin bindendes Protein, C-CAP beschrieben, welches eine essentielle Funktion während der Oozystenreifung in Plasmodium berghei besitzt. Die Transkription der Aktinregulatoren Profilin, ADF1 und ADF2 wird in Sporozoiten drastisch herunterreguliert und Profilin kann als Protein nicht mehr nachgewiesen werden. Um die Funktion von C-CAP und Profilin zu überprüfen, wurden beide Proteine spezifisch in Sporozoiten überexprimiert. Diese Parasiten sind nicht in der Lage die Speicheldrüsen des Wirtes zu besiedeln, was zum Abbruch des Lebenszykluses führt. Anhand dieser Ergebnisse entwickele ich ein „minimalistisches“ Model zur Beschreibung der Aktinregulation in Sporozoiten in welchem das ADF1 als regulatorisches Protein im Mittelpunkt steht. / Plasmodium spp. are obligate intracellular parasites, which employ an conserved actin-dependent molecular motor machinery that facilitates their motility, host cell invasion and egress. In this work I report implications of the actin-regulators adenylyl cyclase-associated protein (C-CAP), profilin and actin depolymerization factor 1 and 2 (ADF1, ADF2) in distinct and previously unanticipated cellular processes during the life cycle of in the rodent malarial parasite Plasmodium berghei. Fluorescent tagging of the endogenous C-CAP genetic locus with mCherry revealed cytosolic distribution of the protein. Gene deletion demonstrates that the G-actin binding protein C-CAP is entirely dispensable for the pathogenic blood stages. Ookinetes show reduced motility, but are competent infecting the mosquito host. Defects emerging in the extracellular replication phase, leading to attenuation of oocyst maturation. Successful trans-species complementation with the C. parvum C-CAP ortholog, rescues the c-cap(-) phenotype and proves functional redundancy. The actin regulator profilin fails to rescue the defects of c-cap(-) parasites, despite sharing its actin sequestering activity with C-CAP. Taken together, C-CAP is the first G-actin sequestering protein of Plasmodium species that is not required for motility but performs essential functions during oocyst maturation. Characterization of the actin regulators profilin, ADF1 and ADF2 revealed dramatic transcriptional down-regulation and the absence of the profilin protein in sporozoites. To test whether G-actin binding proteins interfere with sporozoite functions, I ectopically overexpressed of profilin and C-CAP stage-specifically in sporozoites. This conducted to abolishment of salivary gland invasion and lifecycle arrest. Based on these unexpected findings and the available literature data, I developed a “minimalistic model” for actin regulation in sporozoites that predicts ADF1 as the main actin-turnover regulating factor.