La phase de l'épithélialisation de la réparation cutanée se déroule en impliquant plusieurs processus dynamiques et interactifs pendant lesquels les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différentient afin de reconstruire la fonction de la barrière. La migration des kératinocytes est l'événement qui détermine l'efficacité du processus entier. Le comportement migratoire est contrôlé au même temps au niveau extracellulaire et intracellulaire et dépend d'interactions dynamiques entre les cellules et leur environnement extracellulaire, des facteurs de croissance et des cytokines. Parmi les protéines de la matrice extracellulaire, la laminine 332 est un substrat d'adhésion majeur des kératinocytes qui joue un rôle important au cours de la migration des kératinocytes, travers son domaine LG4/5 localisé à l'extrémité carboxy-terminale de sa chaine a. Des études récentes ont rapporté que l'induction de la migration des kératinocytes par LG4/5 est dépendante des Métalloprotéinases Matricielles pro-migratoires (MMP)-9 et -1 qui jouent des rôles essentiels au cours de la cicatrisation et surtout pendant la ré-épithélialisation. Etant donné que des travaux antérieurs du laboratoire ont montré que le domaine LG4/5 participe à la dynamique du cytosquelette et à la motilité cellulaire au travers de liaisons avec les récepteurs de type de protéoglycanes à heparane sulfate, syndécan-1 et -4 on a regardé l'implication potentielle de ces récepteurs au processus. Afin d'analyser la participation possible des syndecans dans ce processus, nous avons développé une approche de mutagénèse dirigée dans la protéine LG4/5 recombinante pour altérer les sites de liaison aux syndécan-1 ou -4. Notre analyse PCR et nos résultats de zymographie ont révélé une différence du profile d'activation des MMPs en fonction de la mutation produite et donc de la capacité de la protéine à recruter le syndécan-1 ou le syndécan-4, ainsi que le syndécan-1, et pas la syndécan-4, est impliqué dans l'activation de la production de la MMP-9 par LG4/5. Nous avons ensuite confirmé ces résultats en réduisant l'expression du syndécan-1 dans des kératinocytes et on a pu aussi montrer que le traitement avec des cytokines telles que TNFalpha et IL-1beta, connues pour leur capacité d'induire l'activation de la MMP-9, a produit le même résultat dans ce systéme. L'addition de l'héparine dans nos experiences a inhibé l'activation de l'expression de MMP-9 suggerant que les heparanes sulfates dans syndecan-1 sont impliqué au mécanisme. Pour confirmer ces résultats des experiences avec des séries de syndecan-1 mutés sont en cours. Pour conclure, nos résultats montrent pour la première fois un rôle important de syndecan-1 à l'expression de MMP-9 suggérant que sa re-distribution au front des kératinocytes migratoires puisse éventuellement être liée au clivage ou à la dégradation des protéines de la matrice extracellulaire. En plus, nos résultats proposent que le domain LG4/5 de la laminin 332 libéré soit capable d'affecter la balance de l'expression de la MMP-9 lors de la migration des kératinocytes en leur permettant de traverser le caillot de fibrine / During skin repair, the epithelialization phase occurs by an orderly series of events whereby keratinocytes migrate, proliferate, and differentiate to restore the barrier function. Keratinocyte migration determines the efficiency of the overall wound repair process. The migratory behaviour is governed at both the extracellular and intracellular levels and depends on the carefully balanced dynamic interactions of the cells with ECM components, growth factors and cytokines. Among extracellular matrix proteins, laminin 332, known as a major adhesion substrate for keratinocytes was shown to contribute to skin reepithelialization through its a3 chain C-terminal domains LG45. Recent studies have reported that LG45 induces keratinocyte migration, an event that relies on the involvement of the pro-migratory matrix metalloproteinases-1 and -9, two MMPs known to play a role in the reepithelialization phase of wound healing. As findings from our laboratory have reported that LG45 domains participate in cytoskeleton dynamic and cell movement through binding of the heparan sulphate proteoglycans syndecan-1 and -4, we analyzed the potential involvement of these receptors in this process. To that end, we have developed a site-directed mutagenesis approach within a recombinant LG45 protein to alter either the syndecan-1 or syndecan-4 binding site. Our PCR analysis and zymography results revealed that depending on the mutants, syndecan-1 or syndecan-4 recruitment induced different MMP activation profile and suggested that syndecan-1 plays a role in LG45 induced MMP-9 expression and activation. We confirmed these results by down regulating syndecans expression in keratinocytes and revealed that this phenomenon also occurred when cells were treated with TNFalpha or IL1beta, two cytokines known to up-regulate MMP-9 expression. Addition of heparin in these experiments abolished MMP-9 expression activation suggesting that syndecan-1 heparan sulfate moieties are involved in this mechanism. Confirming experiments using a series of mutated syndecan-1 in their ectodomain (lacking glycosaminoglycan chains) or in their cytoplasmic tail are ongoing in the lab. Taken together, our data demonstrate for the first time that syndecan-1 plays a pivotal role in MMP-9 expression, suggesting that its re-distribution at the front edge of migrating keratinocyte may have a role to play in the cleavage or degradation of extracellular matrix proteins. Our results further suggest that the released laminin 332 LG45 domain has the ability to impact the MMP9 expression balance during keratinocyte migration therefore facilitating their path through the fibrin clot

L’interaction du récepteur syndecan-1 de la famille des héparanes sulfates protéoglycanes avec le fragment carboxy-terminal alpha3LG4/5 de la protéine d’adhérence matricielle, la laminine 332, induit une réorganisation du cytosquelette de la cellule conduisant à la formation de filopodes et de microspicules, caractéristiques de la migration cellulaire. Notre laboratoire a mis en évidence que l’adhésion cellulaire syndecan-1 dépendante implique les chaînes d’héparanes sulfates et chondroïtine sulfate. Afin d’identifier le (les) zone(s) impliquée(s) dans l’interaction domaine LG4/5-syndécan-1, une approche de mutagenèse dirigée a été mise en place sur le fragment LG4/5 recombinant. Les résidus conservés parmi les laminines, identifiés dans la littérature comme liant l’héparine, aussi bien que des résidus basiques spécifiques à la chaine α3 identifiés par des approches prédictives, ont été remplacés par le résidu neutre glutamine. Toutes les protéines couplées avec l’étiquette 6-Histidine ont été produites dans des cellules de mammifère, purifiées par chromatographie d'affinité et caractérisées biochimiquement et par dichroïsme circulaire. L’évaluation de l’affinité des protéines produites pour l’héparine nous a permis d’identifier un site d’interaction majeur avec les glycosaminoglycanes dans le domaine LG4/5, entouré par des résidus à mineur affinité. La technique de résonance plasmonique de surface et des tests d’adhérence cellulaire nous ont permis de confirmer ce résultat puisque l’absence du site d’interaction majeur avec l’héparine a produit une inhibition totale de l’adhérence. Des expériences de pull-down nous ont montré que ce site est aussi impliqué dans l’interaction avec le syndecan-4, indiquant que cette séquence pourrait ainsi jouer un rôle dans différents processus cellulaires. Une collaboration avec des bio-informaticiens nous a permis de proposer un modèle structural du domaine LG4/5 et de montrer que la zone identifiée est localisée dans une boucle exposée à l’extérieure du module LG4, entourée par des résidus à plus faible affinité / The HSPG receptor syndecan-1 interacts with the carboxy-terminal LG4/5 domain in laminin 332 to participate in keratinocyte migration by inducing formation of cytoskeleton related protrusive structures. We have shown that syndecan-1 mediated cell adhesion occurs in heparan sulphate and chondroitin sulphate dependent manner and that these two glycosaminoglycan (GAG) chains bind independently to LG4/5 with different affinities. To identify residues involved in the interaction of the LG4/5 domain with syndecan-1 and to apprehend the molecular basis of the GAGs interaction specificity, we have used a site-directed mutagenesis approach of the recombinant LG4/5 fragment. The residues identified as conserved heparin binding residues throughout laminins, as well as “candidate” basic residues identified through predictive approaches, have been replaced by the neutral residue glutamine. All LG4/5 proteins carrying a hexa-histidine tag at their C-terminal end were expressed in mammalian cells. The produced proteins were purified and characterized biochemically. Circular dichroism studies performed on all mutagenised proteins showed that the overall structure of each mutant is comparable to that of the wild type protein. Heparin affinity chromatography analysis allowed us to identify a major heparin binding site in the LG4/5 domain surrounded by several minor GAG binding sites. Surface plasmon resonance analysis of mutated LG4/5 proteins-heparan sulphate interaction confirmed these results. These findings were well correlated with our in cellulo syndecan-1 mediated cell adhesion as the lack of this major heparin binding site totally abrogated cell adhesion. Pull down experiments allowed us to show that this heparin binding site sequence is responsible not only for the interaction of the receptors syndecan-1 but also for syndecan-4 suggesting that additional cellular functions may be carried by this sequence. Our structural predictions suggest that the LG4/5 in laminin 332 encompasses a major GAG binding site surrounded by a track of converging positively charged residues

Ce travail de thèse a eu pour thème principal le protéoglycane syndecan-1 au cours du myélome multiple, une hémopathie maligne caractérisée par la présence d'un clone de plasmocytes tumoraux au sein de la moelle osseuse. Syndecan-1 est un élément majeur de la physiopathologie du myélome multiple, ce protéoglycane étant au coeur d'un réseau complexe d'interactions moléculaires conditionnant le devenir des cellules plasmocytaires tumorales.Les chaînes de glycosaminoglycanes présentes sur le core protéique de syndecan-1sont responsables d'une grande partie de son activité. Nous avons ainsi caractérisé, par une approche transcriptomique, 100 gènes codant les protéines impliquées dans la synthèse et la modification de ces chaînes. Nous avons de cette manière identifié des cibles moléculairesen vue de moduler, voire d'inhiber leur activité.Dans le but d'identifier les métalloprotéinases des familles ADAM et ADAMTS susceptibles d'interagir avec syndecan-1, nous avons réalisé l'étude du profil d'expression des gènes codant ces reprolysines et leurs inhibiteurs dans les cellules de la différentiation lymphocytaire B, les cellules plasmocytaires normales et tumorales ainsi que dans l'environnement médullaire.Dans une dernière partie, nous avons évalué l'efficacité d'une approche d'inhibitiondes chaînes héparanes sulfates via l'utilisation de l'héparine. Nous observons que certaines lignées myélomateuses sont inhibées par l'héparine et ses dérivés et que ces mêmes lignées sont stimulées par l'antidote de l'héparine, le sulfate de protamine. Les mécanismes mis enjeu sont en relation avec la modulation de la biodisponibilité des facteurs permettant la croissance des cellules. / Multiple myeloma is a hematological malignancy characterized by the expansion of aclone of malignant plasma cells in the bone marrow compartment. Syndecan-1 is a majorproteoglycan involved in a complex network of molecular interactions in multiple myelomaphysiopathology. As heparan sulfate and chondroitin sulfate chains are the bioactive components ofsyndecan-1, we first analysed the signature of genes encoding 100 proteins involved in thesynthesis of these chains, from precursor uptake to post-translational modifications, usingAffymetrix microarrays.In order to identify the metalloproteinases belonging to ADAM and ADAMTS familiespotentially implicated in the interactions with syndecan-1, we performed a gene expressionprofile focused on the genes encoding these reprolysines and their inhibitors.In a last part, we evaluated the efficacy of an inhibitory approach based on theutilization of heparin in human myeloma cell lines in vitro, inhibitory effects being in relationwith a modulation of the biodisponibility of heparin-binding factors.This work led us to identify targets of interest in relation with syndecan-1 biology inmultiple myeloma. They could be used to design new therapeutic strategies.

Le cancer colorectal (CCR) est un problème majeur de santé publique. Les nouvelles stratégies thérapeutiques incluant les anticorps anti-EGFR ou anti-VEGF en association avec les chimiothérapies ont amélioré la survie des patients présentant un CCR métastatique. Nous avons évalué le rôle de nouveaux biomarqueurs pour individualiser les patients porteurs d’un CCR métastatique qui peuvent bénéficier d’un traitement par thérapies ciblées. Dans la première partie, nous avons démontré pour la première fois la valeur de pSTAT3 (STAT3 phosphorylé) comme biomarqueur prédictif pour sélectionner les populations porteuses d’un CCR métastatique qui pourraient bénéficier d’un traitement par anti-EGFR. Dans ce cadre nous avons publié les résultats de la valeur prédictive et pronostique de pSTAT3 chez 94 patients porteurs d’un CCR métastatique traités par cétuximab en 2ème ligne de traitement (Dobi et al, 2012).La probabilité d’avoir une réponse objective était de 13% chez les patients avec l’expression de STAT3 comparé à 41% chez les patients pSTAT3 négatif (p=0.02). Nous avons montré également l’impact négatif de pSTAT3 sur la durée de la survie sans progression (PFS) et de la survie globale (OS) des patients présentant un CCR métastatique. Ce résultat montre l’intérêt de STAT3 comme biomarqueur prédictif de traitement par anti-EGFR. Dans la deuxième partie, nous avons évalué l’impact en survie des facteurs d’angiogenèse complexe comme angiopoetin-2, syndecan-1 (CD138), FGL2. Dans ce cadre nous avons étudié une cohorte exploratoire à Besançon de patients porteurs d’un CCR métastatique, traitée par chimiothérapie cytotoxique et bévacizumab (anti-VEGF). Après la détermination des seuils de valeurs de chaque biomarqueurs dans le sérum de patients utilisant les courbes ROC, nous avons évalué l’impact négatif de score élevé d’angiopoetin-2 et CD138 en survie de ces patients. Nous avons également démontré l’impact négatif de la combinaison de 3 marqueurs combinés en termes d’OS et de PFS dans une cohorte de validation incluant 244 patients de Besançon, Tours et Dijon. / Despite the progress made in the management of metastatic colorectal cancer (mCRC), this disease remains a major health problem. Targeted therapies (anti-EGFR and anti-VEGF therapies) have improved the clinical outcomes achieved by conventional chemotherapy regimens. Half of the patients with K-RAS wild type colo-rectal cancer doen’t benefit from adding anti-EGFR to standard chemotherapy regimen. We decided to assess the clinical outcomes of anti-EGFR containing chemotherapy regimens in 94 patients with mCRC according to phosphorylated STAT3 (pSTAT) status. The probability of achieving an objective reponse was 13% among patients with positive nuclear expression of pSTAT3 compared with 41% for patients displaying pSTAT3 négative tumors (p=0.02). In a multivariate logistic regression model, high-grade skin rash, wild-type K-RAS status, and negative pSTAT3 status significantly improved time to progression (TTP) and overal survival (OS). These results underscore the impact of pSTAT3 on the clinical efficacy of anti-EGFR-containing chemotherapy regimens and support the prospective assessment of this biomarker. Inhibition of pSTAT3 in mCRCs might be a promising strategy to target chemotherapy-resistant cancer cells and should be assessed in association with anti-EGFR monoclonal antibodies. The second goal of our study was the identification of angiopoetin-2, syndecan1 (CD 138) and FGL2 as prognostic biomarquers of metastatic colorectal cancer patients. Plasma angiopoetin-2, FGL2 et CD 138 levels were mesured in 10 healthy volunteers, 13 patients with locally advanced CRC et 51 mCRC, received bevacizumab containing chemotherapy. Angiopoetin-2 and CD138 levels were significantly elevated in patients with mCRC compared with healthy controls. Amongst patients with mCRC, low pre-therapeutic plasma angiopoetin-2 and CD 138 levels were associated with a prolonged median progression-free survival (PFS) (p<0.01 and p=0.03 respectively), and overall survival (p<0.01 and p=0.02 respectively). PFS and OS was prolonged in patients with out or with only one detectable biomarker compared with patients with two or three high biomarker levels (p<0.01).

Inflammation is an integral part of the body defense mechanism that occurs in vascularized tissue in response to harmful stimuli that is perceived as being a threat to tissue homeostasis. It is a complex physiological host response that is designed to neutralize and eliminate harmful agents, initiate tissue healing, and orchestrate a return to tissue homeostasis. While inflammation is designed to be an acute event that resolves following the elimination of harmful stimuli and tissue healing, there are instances where inflammation fails to resolve and instead evolves into chronic inflammation. It is now well understood that ongoing inflammation can serve as the underlying cause of many chronic inflammatory diseases, including atherosclerosis. In fact, one of the most pressing issues that is currently faced in the field of inflammation research, one that has also become the focus of numerous ongoing investigations, is how to turn this excessive, unwarranted and undesirable inflammation response off. Once thought to be a passive and simple process, resolution is now understood to be an active and complex process that is orchestrated by various inflammatory mediators, signaling pathways and biophysical processes. The discovery of novel biosynthetic pathways that turn on the pro-resolution signals has lead to a surge in research aimed at taking a closer look at processes that can stimulate the resolution of inflammation. While major advances in the field have resulted in a better understanding of the proactive nature of resolution, many of the mechanisms involved are still unknown. To date, the repertoire of chemokine receptors that participate in macrophage clearance during resolution, for the most part, remain unidentified. Overall, there is a growing appreciation that the discovery of mechanisms involved in the resolution responses can lead to the development of novel therapeutic approaches to resolve many chronic inflammatory diseases. Syndecan-1 (Sdc-1), a member of a family of cell surface proteoglycans, has been previously shown to regulate events relevant to tissue repair and chronic injury responses. Macrophage Sdc-1 expression during inflammation has been reported to be protective in various inflammatory models. Given these observations, we hypothesize that Sdc-1 expression on macrophages is a critical component of an anti-inflammatory, pro resolution program necessary for the successful resolution of inflammatory response. In this dissertation, we report the presence of a unique population of macrophages expressing Sdc-1 that are present within the vascular wall of mice undergoing atherosclerosis. Consistent with previous publications, the presence of Sdc-1 expressing macrophages was found to limit atherosclerosis progression. In addition, Sdc-1 expression on macrophages was associated with anti-inflammatory M2 polarization state and high intrinsic motility. Macrophage Sdc-1 expression was also linked with efferocytosis and enhanced macrophage egress from the site of inflammation to the draining lymphatic network. Moreover, we discovered that the chemokine receptor CXCR4, which was found on Sdc-1 expressing macrophages, was also involved in macrophage egress during inflammation resolution. In summary, while the overall mechanism regulating resolution processes is still unknown, our work has managed to identify two components that are involved in the process: macrophage Sdc-1 and CXCR4. Collectively, these results reinforce the physiological significance of macrophage efferocytosis and macrophage motility as endogenous modulators of the inflammatory response.

Orientador: Rebeca de Souza Azevedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-20T01:17:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dutra_SabrinaNogueira_M.pdf: 2889311 bytes, checksum: 3530f20f2b5d10e200ba02ec5d6d58b2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O ameloblastoma (AME) é um dos tumores odontogênicos (TO) mais comuns e, apesar de ser uma lesão benigna, pode apresentar comportamento clínico agressivo, localmente destrutivo e invasivo, enquanto o tumor odontogênico cístico calcificante (TOCC) é um TO benigno cístico que apresenta similaridades microscópicas com o AME, mas, geralmente, exibe comportamento clínico de menor agressividade. A via de sinalização Wnt/ß-catenina está envolvida no desenvolvimento e progressão tumoral de neoplasias benignas e malignas, e a expressão alterada de suas proteínas já foi identificada em alguns TO, provavelmente contribuindo para suas biologias tumorais. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a expressão imunoistoquímica de marcadores associados a via de sinalização Wnt/ß-catenina - Wnt1, Wnt5a, ß--catenina e syndecan-1(SDC-1) - em 17 casos de AME sólido e de 6 casos de TOCC. Os resultados revelaram que nos AME, a maioria dos casos foram focalmente positivos para Wnt1 e Wnt5a, a ß--catenina foi positiva no citoplasma isoladamente ou em associação a positividade de membrana, e SDC-1 exibiu positividade epitelial em 100% dos casos e positividade estromal em 40% dos casos. Nos casos de TOCC, a positividade para Wnt1 e Wnt5a foi de 100% e incluiu também as células fantasmas. A ß--catenina foi positiva no citoplasma e no núcleo das células epiteliais da maioria dos casos, e SDC-1 exibiu positividade epitelial em 100% dos casos e positividade estromal em 16,7% dos casos. Em conclusão, este estudo evidenciou que a expressão de Wnt1 e Wnt5a é mais proeminente nos casos de TOCC, a expressão de ß--catenina em AME é citoplasmática e em TOCC é nuclear, e que a expressão estromal de SDC-1 é mais proeminente nos casos de AME, reforçando, assim, o papel de Wnt1 e Wnt5 no desenvolvimento do TOCC, de ß--catenina no desenvolvimento do TOCC e do AME, e de SDC-1 estromal no fenótipo invasivo do AME. Além disso, a expressão de Wnt1 e de Wnt5a nas células fantasmas do TOCC pode contribuir para esta histogênese. Por conseguinte, a via de sinalização Wnt/ß--catenina parece contribuir para o desenvolvimento das lesões de AME sólido e de TOCC / Abstract: Ameloblastoma (SMA) is one of the most common odontogenic tumors (OT), and although benign, it may have aggressive clinical behavior, be locally destructive and invasive, while calcifying cystic odontogenic tumor (CCOT) is a benign cystic OT that presents microscopic similarities with AME, but, in general, it has a less aggressive clinical behavior. Wnt/ß--catenin signaling pathway is involved in benign and malignant tumor development and progression, and changes in expression of its proteins have been identified in some OT, probably contributing to their tumoral biologies. Thus, the aim of this study was to evaluate and compare the immunohistochemical expression of markers associated with Wnt/ß--catenin signaling pathway - Wnt1, Wnt5a, ß--catenin and syndecan-1 (SDC-1) - in 17 cases of solid SMA and 6 cases of CCOT. The results showed that in AME, most fo the cases were focally positive for Wnt1 and Wnt5a, ß--catenin was positive in the cytoplasm only or in association with membrane positivity, and SDC-1 had epithelial positivity in 100% of the cases and stromal positivity in 40% of the cases. In CCOT cases, Wnt1 and Wnt5a was of 100% and also included ghost cells. ß--catenin was positive in the cytoplasm and in the nucleus of epithelial cells in most of the cases, and SDC-1 had epithelial positivity in 100% of the cases and stromal positivity in 16.7% of the cases. In conclusion, this study highlighted that Wnt1 and Wnt5a expression was most prominent in CCOT, ß--catenin expression was cytoplasmatic in AME and nuclear in CCOT, and that stromal expression of SDC-1 was most prominent in AME, so, reinforcing Wnt1 and Wnt5 role in CCOT development, ß--catenin role in CCOT and AME development, and stromal SDC-1 role in the AME invasive phenotype. In addition, Wnt1 and Wnt5a expression in ghost cells of CCOT may contribute to this histogenesis. Therefore, Wnt/ß--catenin signaling pathway seems to contribute to solid AME and CCOT development / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme. Sa croissance et sa progression sont dépendantes de signaux hormonaux, tels que les œstrogènes, et de l’interaction des cellules cancéreuses avec le microenvironnement matriciel. La perte d’expression du récepteur aux estrogènes ERα est un marqueur de mauvais pronostic et de non réponse à l’hormonothérapie. Dans ces tumeurs agressives, l’expression du SDC-1, un protéoglycane transmembranaire impliqué dans l’angiogenèse, la prolifération et l’invasion, est augmentée suggérant un antagonisme entre la signalisation œstrogénique et le SDC-1 dans ces tumeurs. En utilisant les cellules de carcinome mammaire ER(+) MCF7, nous avons montré que les œstrogènes via le récepteur ERα sont capables d’inhiber l’expression du SDC 1 par un mécanisme nécessitant une néosynthèse protéique et la phosphorylation d’ERα par la kinase IKK. Parallèlement, nos résultats montrent que la dérégulation de l’expression du SDC-1 affecte la réponse proliférative des œstrogènes dans les cellules MCF7 en modifiant la localisation subcellulaire d’ERα. Nos résultats montrent à la fois l’inhibition tonique et E2-induite de l’expression du SDC-1 par ERα dans les cellules MCF7 et la potentialité du SDC-1 à réduire la réponse œstrogénique de ces cellules. Ainsi, ces résultats sont autant d’arguments qui renforcent l'hypothèse d'un antagonisme entre la signalisation médiée par ERα et le SDC-1 lequel influencerait l'orientation phénotypique des cellules de carcinome mammaire. / Breast cancer is the most common cancer in women. Its growth and progression depend on hormone signals, such as estrogens, and on interactions with the matrix microenvironment. The loss of the estrogen receptor ERα expression is a poor prognosis marker and predicts a resistance to antihormonal therapies. In these aggressive tumors, SDC-1 expression, a transmembrane proteoglycan involved in angiogenesis, proliferation and invasiveness is increased suggesting an antagonism between estrogenic signaling and SDC-1 in breast tumors. Using ER (+) MCF7 mammary carcinoma cells, we have shown that estrogens via the ERα are able to inhibit the expression of SDC-1 by a mechanism requiring protein synthesis and phosphorylation of ERα by the IKK kinase. Additionally, our results show that dysregulation of SDC-1 expression affects the proliferative response to estrogens in MCF7 cells by altering the subcellular localization of ERα. Our results show both a tonic and E2-induced inhibition of SDC-1 expression by ERα in MCF7 cells and the potentiality of SDC-1 to reduce the estrogenic response of these cells. Thus, these results support the hypothesis that an antagonism between ERα signaling and SDC-1 which could influence the phenotypic orientation of mammary carcinoma cells.

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This thesis focuses on the effects of the human papillomavirus (HPV) in tonsillar cancer, mobile tongue cancer, and recurrent respiratory papillomatosis (RRP). The purpose was to characterize patients with RRP in northern Sweden in order to identify more care-intensive RRP patients and to describe the voice and quality of life aspects that follow RRP. Further aims were to confirm the expected increase of HPV-positive tonsillar cancer cases in northern Sweden, and to study the correlation between HPV, its surrogate marker p16 and HPV receptor syndecan-1 in both tonsillar cancer and mobile tongue cancer. A total of 27 consecutive patients with RRP were evaluated at 3 months postoperatively using the voice handicap index (VHI) and SF-36 questionnaires to assess the impact on life and voice in a RRP population. The values were compared to normative data. This report was further extended by examining consecutive data from 21 new patients in order to characterize RRP patients in northern Sweden. In order to study HPV DNA in tonsillar (n= 65) and mobile tongue cancer (n=109), HPV DNA was extracted from paraffin-embedded biopsies and detected by polymerase chain reaction using general primers Gp5+/6+ and CpI/IIG. Expression of HPV surrogate marker p16 and the HPV receptor syndecan-1 was analysed by immunohistochemistry. Patients that underwent more than one RRP surgery per year were younger than those treated less frequently and they had significantly impaired voice quality as compared to normal subjects. Females, patients with frequent surgical treatment sessions, and patients with the high-risk HPV subtypes scored significantly lower in several domains of the quality of life assessment as compared with normal subjects. Forty-eight RRP patients had a median age of 44.5 years; 71% were men and 29% females, preferentially infected with HPV6. Patients with high surgical treatment frequency/year showed more widespread RRP in the larynx compared to the patients treated less frequently. A total of 214 tonsillar cancer cases were identified. The vast majority were men. They had a median age of 58 years at diagnosis and expressed HPV as well as p16. The incidence of tonsillar cancer revealed a 2,7-fold increase in men between the years 1990 and 2013. The study demonstrates a strong association between p16 and HPV infection in tonsillar malignancies. These findings are in contrast to the mobile tongue cancer cases, where no evidence of HPV DNA could be detected although one-third showed p16 staining. This demonstrated a poor correlation between HPV and p16 in mobile tongue cancer. There was no difference in the expression of the primary HPV receptor, syndecan-1, between tonsillar and mobile tongue cancer. In conclusion, the frequency of RRP operations, age at onset, gender and subtype of the HPV may be used as factors to predict voice disability. RRP patients with high surgical treatment frequency were significantly younger and had a more widespread laryngeal disease compared to the low-frequency treated group. This study confirms the existence of a clinical RRP group, not primarily related to HPV subtype, but to a more care-intensive RRP population. Our findings identify a 2,7-fold increase in the incidence of tonsillar cancer, HPV and p16 in men between 1990-2013. We can use p16 to detect HPV in tonsillar cancer but not in tongue cancer. The introduction of vaccination against HPV may have a role in the prevention of specific HPV-subtype positive head and neck malignancies and recurrent respiratory papillomatosis since the current vaccine protects against HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 and 58. Males will definitely benefit indirectly from vaccination of females, though males will still remain at risk of cancers associated with HPV. This highlights the need for sex-neutral vaccination strategy. Our intention is that this thesis will provide scientific data to support a gender-neutral vaccination and to develop simple tools to detect HPV in tonsillar cancer. / Syftet med avhandlingen är att beskriva effekterna av humant papillomvirus (HPV) vid cancer i halsmandlarna, cancer i tungan och vid luftvägspapillom. Totalt 27 patienter med luftvägspapillom (RRP) under åren 2004-2012 utvärderades 3 månader efter operationen med röst handikapp index (VHI) och livskvalitetformuläret SF-36. Resultaten jämfördes med normal data. Studiematerialet utökades med 21 patienter till totalt 48 RRP patienter i syfte att karakterisera patientgruppen i norra Sverige. För att studera HPV-DNA i tonsillcancer (n = 65) och i cancer i mobil del av tungan (n = 109) extraherades HPV-DNA från paraffininbäddade provbitar som sedan analyserades med PCR teknik och GP5 + / 6 + och CPI/IIG primer. Uttryck av surrogatmarkör p16 och HPV-receptorn syndekan -1 analyserades med immunhistokemi. RRP patienter hade en medianålder på 44,5 år; 71% var män och 29% kvinnor, företrädesvis infekterade med HPV6. Patienter som opererades mer än en gång per år var yngre än de som behandlats mindre ofta och hade en statistiskt sämre röstkvalitet än friska kontroller. Kvinnor, patienter med täta kirurgiska behandlingsintervall och högrisk-HPV hade signifikant sämre livskvalitet jämfört med friska kontroller. Patienter med hög kirurgisk behandlingsfrekvens per år var signifikant yngre och hade mer utbredd RRP sjukdom i luftstrupen, jämfört med gruppen med låg behandlingsfrekvens. Sammanlagt, 214 fall av halsmandelscancer identifierades i norra Sverige under åren 1990-2013; majoriteten var män, med en medianålder på 58 år och positiva för både HPV och p16. Andelen halsmandelscancer fall ökade med 2,7 gånger bland männen på 23 år. Vi fann ett starkt samband mellan uttryck av p16 och HPV infektion i halsmandelscancer men inte i HPV-negativ, delvis p16-positiv (33%) mobil tungcancer. Det fanns ingen skillnad i uttrycket av den primära HPV-receptorn, syndekan -1, jämförande tung-, och halsmandelscancer. Antalet RRP operationer, ålder vid insjuknandet, kön och genetisk variant av HPV kan användas som indikatorer för att förutsäga grad av röststörning. RRP patienter med hög kirurgisk behandlingsfrekvens var signifikant yngre och hade en mer utbredd luftvägssjukdom jämfört med RRP patienter som behandlas mindre ofta. Vi har identifierat en undergrupp av RRP patienter som inte primärt karakteriseras efter HPV virusets genetik utan av ett mer vårdintensivt förlopp. Den aktuella avhandlingen har identifierat en 2,7-faldig ökning av antalet halsmandelscancer hos män och ett starkt samband mellan p16 och HPV infektion i halsmandlar men inte i HPV-negativ tungcancer som inte korrelerar till p16 uttryck. Vi kan använda p16 för att påvisa HPV i tonsillcancer men inte i cancer i mobil tunga. Idag ingår HPV vaccination i det allmänna vaccinationsprogrammet för flickor. Vi förväntar oss en tydlig profylaktisk effekt avseende insjuknande i HPV-relaterad huvud- och hals cancer samt luftvägspapillom eftersom vaccinet skyddar mot HPV bl.a. 6, 11, 16 och 18. Män kommer definitivt att gynnas indirekt genom vaccination av kvinnor men kommer att ha fortsatt högre risk än kvinnor att insjukna i HPV relaterad cancer vilket understryker behovet av könsneutral vaccination. Vår avsikt med avhandlingen är att ge vetenskapligt stöd för könsneutralt vaccination och enkla metoder att påvisa halsmandelscancer.

Au cours de la réparation cutanée, l’étape de réépithélialisation est essentielle car son objectif est de restaurer la fonction barrière de la peau. Elle consiste en une série d’étapes coordonnées où les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différencient jusqu’à restauration complète de l’épiderme. Régulée de façon simultanée au niveau intracellulaire mais également extracellulaire, elle dépend de la production de facteurs de croissance, de métalloprotéases matricielles (MMPs) et de protéines de la matrice extracellulaire sur lesquelles les kératinocytes adhèrent et migrent par l’intermédiaire de récepteurs de la famille des intégrines ou des syndécans. Parmi les ligands matriciels, la laminine 332 (LN332), qui est connue comme étant la protéine d’adhésion majeure des kératinocytes de l’épiderme, s’avère être également impliquée au cours de la réépithélialisation et jouer un rôle important dans les processus d’adhésion et de migration des kératinocytes, notamment par le biais de son domaine globulaire LG4/5 localisé à l’extrémité C-term de sa chaine 3. De récentes études ont montré que ce domaine LG4/5 induit la migration des kératinocytes normaux humains (NHK), impliquant des MMPs pro-migratoires MMP-1 et MMP-9. Puisque les domaines LG4/5 ont été montrés comme participant à la dynamique du cytosquelette et au mouvement cellulaire par le biais des récepteurs syndécan-1 et -4, mon laboratoire d’accueil a décidé d’étudier l’implication du récepteur syndécan-1 dans ce processus d’expression de la MMP-9. Les analyses PCR et les résultats de zymographie obtenus ont révélé que le syndécan-1 joue un rôle dans l’expression et l’activation de la MMP-9 induite par le domaine LG4/5. De plus, la déplétion de l’expression du syndécan-1 dans les NHK a confirmé ces résultats. De précédents résultats de mon laboratoire d’accueil ont montré que le domaine LG4/5 induit la formation de filopodes médiée par le syndécan-1 au niveau du front de migration des kératinocytes. De ce fait, nous avons effectué des zymographies de gélatine in situ chez des NHK en migration afin d’observer la localisation de la MMP-9 et de savoir si cette dernière était trouvée au niveau de ces structures d’adhésion protrusives. Nous avons observé des zones de digestion de gélatine sous les NHK ressemblant à des points de contact d’adhésion. Leur nombre est augmenté chez des NHK traités avec le domaine LG4/5 de la LN332. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des gélatinases et de la MMP-9 ont révélé que cette dernière est responsable de la formation de ces zones de digestion de gélatine. Parce que ces structures évoquent des podosomes, nous avons décidé de révéler leurs constituants majoritaires, à savoir la cortactine, la vinculine, l’-actinine, VASP, WASP ou encore Arp2/3. Dans le même temps nous avons également révélé le syndécan-1 afin de voir si ce dernier était présent dans ces structures. Nos résultats ont montré que tous les marqueurs des podosomes étaient localisés soit sous la forme d’un point à l’intérieur des zones de digestion pour les protéines régulatrices de l’actine, soit sous la forme d’un anneau entourant les zones de digestion pour les protéines d’adhésion et de signalisation associées à la membrane, confirmant donc que les structures observées sont bien des podosomes. Le syndécan-1 apparaît également sous une forme d’anneau, entourant les protéines régulatrices de l’actine et les zones de digestion laissant penser que le syndécan-1 serait impliqué dans ces structures. La diminution de l’expression du syndécan-1, en utilisant l’approche des petits ARN interférents dans des NHK, a montré que l’absence de syndécan-1 diminue de façon drastique le nombre et la surface des zones digérées. L’ensemble de nos résultats montre que le syndécan-1 serait un constituant des podosomes des kératinocytes, participant à leur formation et jouant un rôle dans le contrôle de l’expression de la MMP-9 / During skin repair, the reepithelialization step is essential to restore the skin barrier function. lt occurs by an orderly series of events whereby keratinocyte migrate, proliferate and differentiate until complete epidermal restoration. Keratinocyte migration determines the efficiency of the overall wound repair process. The keratinocyte's migratory behavior depends on the production of growth factors, matrix metalloproteinases (MMP) and on the dynamic interactions of the cells with extracellular components. Laminin 332 (LN332), known as a major adhesion substrate for keratinocytes, was shown to contribute to skin reepithelialization through its a3 chain C-terminal domains LG4/5. Recent studies have reported that LG4/5 induces keratinocyte migration, an event that relies on the involvement of the pro-migratory MMP-1 and MMP-9. As LG4/5 domains were shown to participate in cytoskeleton dynamic and cell movement through binding of the heparan sulfate proteoglycans syndecan-1 and -4, we analyzed the potential involvement of these receptors in this process. The PCR analysis and zymography results revealed that syndecan-1 plays a role in LG4/5 induced MMP-9 expression and activation. Down regulating or overexpressing syndecan-1 expression in cells confirmed these findings. As LG4/5 was shown to induce the formation of syndecan-1-mediated filopodia at the front of migrating cells, we performed in situ zymography experiments in migrating keratinocyte to analyze whether MMP-9 is found in these protrusive adhesion structures. Very interestingly, we found areas of digested gelatin resembling adhesion contacts underneath keratinocytes. Their number was increased in LG45-treated keratinocytes, a result in line with our previous data. The use of specific MMP inhibitors revealed that MMP-9 is responsible for the formation of these digested gelatin clusters. Further confocal microscope analysis revealed, at the cellular level, the presence of actin located within the digested areas, suggesting that an adhesion receptor would be involved in this process. Because these structures resemble podosomes, we revealed major podosome components, such as cortactin, vinculin, -actinin, VASP, WASP, Arp2/3 or dynamin and integrin. Our results showed all the podosome markers either within the digested areas (regulatory actin proteins) or organized as ring encircling the digested areas (signaling and adhesion proteins associated with plasma membrane), confirming that these structures are podosomes. Syndecan-1 also appears as a ring around the digested areas and encircling the regulatory actin proteins, suggesting that this receptor could be involved in these structures. The syndecan-1 depletion in normal human keratinocytes with specific siRNAs drastically decreased the digested areas surface. Taken together, our data demonstrate that syndecan-1 is a podosome components, participating in their formation and playing a role in MMP-9 expression and deposition. These results suggest that its re-distribution at the front edge of migrating keratinocyte may have a role to play in the cleavage or degradation of extracellular matrix proteins therefore facilitating their path through the fibrin clot