I describe procedures for the introduction of Borrelia burgdorferi, the spirochetal agent of Lyme disease, into larval and nymphal stage of the tick vector, Ixodes ricinus. The goal of this Mgr. Thesis is to find an optima system, that would reliably and reproducibly allow the infection of large numbers of ticks with the Lyme disease spirochete.

Tick-borne encephalitis virus (strain Hypr) was serially subcultured in PS cells and tick cell line IRE/CTVM19, producing four different viral variants. Biological properties of these new variants were investigated in mouse model. Possible determinants of virulence were found by full-genome sequencing. The role of glycosylation for tick-borne encephalitis virus was evaluated.

A resistência aos acaricidas é um dos maiores desafios para o controle adequado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entender os mecanismos de resistência aos acaricidas pode ser fundamental para prolongar sua eficiência no controle desse parasita. Transportadores ABC são reconhecidos em um grande número de organismos, pela sua participação na destoxificação de drogas. Eles são proteínas transmembrana, responsáveis por remover da célula compostos tóxicos, endógenos ou exógenos. Desta forma, protegem os organismos e são associados à resistência a drogas em vários nematódeos, artrópodes parasitas e células cancerígenas. No presente trabalho, determinamos a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos tóxicos, com ênfase ao acaricida ivermectina, no carrapato R. microplus. O tratamento com inibidores de transportadores ABC aumentou a toxicidade da ivermectina em larvas e fêmeas adultas de populações de campo resistentes a este acaricida. Inibidores de transportadores ABC também aumentaram a toxicidade de abamectina, moxidectina e clorpirifós, em uma população multirresistente a acaricidas, indicando que estes transportadores são responsáveis pela destoxificação de um grande número de acaricidas estruturalmente não relacionados. Níveis de transcrição significativamente maiores do gene RmABCB10 foram identificados no intestino de fêmeas de populações resistentes à ivermectina e amitraz, comparado à população suscetível, importante indicativo da participação deste transportador ABC na resistência a acaricidas. A toxicidade da ivermectina foi também significativamente aumentada, em uma população de células embrionárias de carrapato resistentes a este acaricida, quando estas foram co-incubadas com um inibidor de transportadores ABC. Além disso, os níveis de transcrição do gene RmABCB10, foram também induzidos nesta mesma população, comparado às células parentais suscetíveis à ivermectina, indicando que mecanismos semelhantes são selecionados in vivo e in vitro, e confirmando a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina. Mostramos ainda, que transportadores ABC responsáveis pelo sequestro e, consequente, destoxificação da molécula heme para o interior dos hemossomos, presentes no intestino do carrapato, são importantes na destoxificação de acaricidas para o interior desta mesma organela. Sugerindo ser este um importante mecanismo de defesa contra os acaricidas no carrapato. O silenciamento gênico do RmABCB10 por RNAi reduziu a destoxificação do heme nos hemossomos e aumentou a toxicidade da ivermectina em uma população resistente, indicando que o mesmo transportador usado para destoxificar heme é responsável pela destoxificação de acaricidas no intestino. Em conjunto, estes resultados revelam a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos endógenos e exógenos no carrapato e sua implicação como um mecanismo de resistência à ivermectina e outros acaricidas. Os dados aqui apresentados representam uma via de destoxificação de acaricidas até então desconhecida. E podem servir como alvo para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico e monitoramento da resistência e para o desenvolvimento de drogas e vacinas, contribuindo para o controle do carrapato. / Acaricide resistance is one of the biggest challenges in the control of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Understanding the mechanisms of drug resistance in the cattle tick is critical to prolong the efficacy of acaricides to control this parasite. ABC transporters are recognized in a large number of organisms. They are membrane-integrated proteins responsible for pumping toxic compounds, either exogenous or endogenous, out of the cells, protecting these. In this sense, ABC transporters have been associated with drug resistance in several nematodes, parasitic arthropods and cancer cells. The present study reports on the participation of ABC transporters in the detoxification of toxic compounds, particularly ivermectin, in the tick R. microplus. ABC transporter inhibitors increased ivermectin toxicity in larvae and females of ivermectin-resistant populations. ABC transporter inhibitors also increased the toxicity of abamectin, moxidectin and chlorpyriphos in a multidrug resistant population, suggesting that ABC transporters are responsible for the detoxification of a large number of structurally unrelated acaricides. Increased transcription levels of RmABCB10 found in midgut of females from ivermectinand amitraz-resistant populations, compared to a susceptible tick population, indicated the participation of this ABC transporter in acaricide resistance. Increased ivermectin toxicity in a tick cell line resistant to this acaricide was observed when the cells were co-incubated with an ABC transporter inhibitor. Moreover, transcription levels of RmABCB10 were also increased in this cell line, compared to the parental susceptible cell line, suggesting that similar mechanisms are selected in vivo and in vitro and confirming the participation of ABC transporters in ivermectin resistance. We even showed that ABC transporters responsible for the sequestration and hence detoxification of the heme into the hemosomes present in the midgut of the tick, were also important for the detoxification of acaricides in the same organelle, suggesting this is an important defense mechanisms of the tick against acaricide. The down-regulation of RmABCB10 by RNAi reduced heme detoxification in the hemosomes and increased ivermectin toxicity in resistant females, showing that the same ABC transporter is used to detoxify heme and acaricides in the midgut. Together, these results provide evidence of the participation of ABC transporters in the detoxification of endogenous and exogenous compounds in the tick, and indicate the role of these transporters as a mechanism of resistance to ivermectin and other acaricides. The data reported herein shed light on a new acaricide detoxification mechanism that may be useful in the development of assays to monitor drug resistance and design new anti-tick drugs and vaccines, contributing to the development of novel cattle tick control strategies.

A eficácia do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae para controle de carrapatos foi evidenciada em vários experimentos in vitro, entretanto, há poucos relatos de ensaios em condições de campo para demonstrar a real aplicação do controle biológico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia de M. anisopliae no controle de Rhipicephalus microplus em condições de laboratório e de campo associado ou não a acaricidas químicos, utilizando bovinos. Inicialmente, foi avaliada a compatibilidade de M. anisopliae (cepa E6) em ensaio in vitro com cinco produtos comerciais contendo: amitraz, cipermetrina, clorpirifós e duas associações de piretróides sintéticos e organofosforados (PS+OF). Em geral os acaricidas apresentaram pouco efeito na viabilidade do fungo. Quando M. anisopliae foi associado ao amitraz e a clorpirifós, ocorreu diminuição na viabilidade em aproximadamente 63% e 67% a 48 e 96 horas após a mistura, respectivamente. A eficácia de M. anisopliae (cepa E6) também foi avaliada sobre uma cepa de R. microplus multiresistente a acaricidas. Foram realizados experimentos in vitro e em condições de campo, utilizando o fungo isoladamente ou em associação com um acaricida comercial de pulverização em bovinos infestados com a cepa Jaguar (de R. microplus resistente a carrapaticidas). Para os ensaios a campo, vinte bovinos foram divididos em quatro grupos (n = 5): (i) o grupo tratado com acaricida; (ii) o grupo tratado com o fungo, (iii) o grupo tratado com a associação de fungo + acaricida, e (iv) o grupo controle (não tratado). Os animais foram separados em piquetes com animais naturalmente infestados e também com infestação experimental com a cepa Jaguar. Em cada infestação foram utilizadas 20.000 larvas de R. microplus, aplicadas em três semanas a -21, -14 e -7 dias antes do primeiro tratamento e uma semana depois de cada tratamento. Os animais dos grupos tratados foram pulverizados com o fungo na concentração de 108 conídios/mL com intervalo de 21 a 28 dias sendo realizados sete tratamentos. Desde o primeiro tratamento até o final do experimento, os três grupos tratados, apresentaram nas contagens, número de carrapatos inferior ao grupo controle (P <0,05). Os grupos tratados com a suspensão de esporos de fungo ou com acaricida isoladamente apresentaram um controle semelhante, com um mínimo de 50% de eficácia e média de 75%. Mais significativo foi o tratamento com associação do fungo com o acaricida que resultou em eficácia de 91,7%, após o primeiro tratamento e acima de 98% após os outros seis tratamentos. Assim, fica aqui demonstrada a real aplicabilidade do uso do fungo M. anisopliae (Cepa E6) para controle de R. microplus resistentes a acaricida, em especial a sua associação com acaricidas. / The of the fungus Metarhizium anisopliae to control ticks has been shown in several in vitro experiments. However, there have been few reports of assays in field conditions in order to demonstrate the real applicability of the biological control. Thus aim of the present study was to evaluate the efficacy of M. anisopliae to control Rhipicephalus microplus under laboratory and field conditions. Firstly the compatibility of M. anisopliae (strain E6) to acaricides was tested in vitro using five commercial acaricides: amitraz, cypermethrin, chlorpyriphos and two associations of synthetic pyrethroid and organophosphate (SP+OP). In general, the acaricides only displayed mild effects on fungus viability. The lower fungal viability was with amitraz and chlorpyriphos, approximately 63% of fungus viability at 48 hours post-mixture and 67% at 96 hours, respectively. Secondly, the efficacy of M. anisopliae (strain E6) to control a multiacaricide-resistant strain of R. microplus (Jaguar) was evaluated, in vitro and under field conditions in tick infested bovines, using the fungus alone or in association with a commercial acaricide by manual spraying. The field experiment was conducted with twenty bovines divided into four groups (n = 5); (i) acaricide-treated group, (ii) fungus-treated group, (iii) fungus+acaricide group, and (iv) control non-treated group. Animals were allocated into highly infested paddocks and were also experimentally infested with 20.000 larvae of R. microplus in three weeks -21, -14, and -7 days before the first treatment and one week after each treatment. Animals in the treated groups were sprayed with M. anisopliae at a concentration of 108 conidia/mL at 21 or 28 days intervals (seven treatments). From the first treatment to the end of the experiment, the treated groups had lower tick infestation (P < 0.05). Groups treated with fungus suspension and acaricide alone, presented a similar efficacy, with minimal of 50% and 75% average. Importantly, the association of fungus and acaricide promoted a minimal percent of 91.7% tick-control after the first treatment and over 98% tick-control in the other six treatments. Thus in this work we demonstrate the real applicability of the use of M. anisopliae (strain E6) to control acaricide resistant ticks R. microplus in particular using the association of fungal spores and acaricides.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

As infestações por Rhipicephalus microplus, conhecido como o carrapato do boi, causam enormes prejuízos econômicos na produção de gado na região tropical e países subtropicais em todo o mundo. O método atual de controle do ectoparasito depende exclusivamente de produtos tóxicos como os acaricidas, que deixam resíduos no meio ambiente e seu uso contínuo tem provocado o aparecimento de carrapatos resistentes, sendo, portanto, de pouca eficácia. O grupo de pesquisa em carrapatos da FMRP-USP tria antígenos candidatos que foram testados em vacinação experimental feita em bovinos, utilizando formulação antigênica multicomponente. Baseando-se nos resultados do transcriptoma de leucócitos do sangue periférico de bovinos vacinados, que identificou genes diferencialmente expressos, cuja expressão é afetada pelas infestações e a partir do transcriptoma da pele de bovinos da raça Nelore e Holandês, o presente estudo tem objetivo avaliar, através da técnica Nanostring, genes que possam ser empregados em testes para identificar bovinos geneticamente resistentes ao carrapato e comparar com os dados já obtidos dos transcriptomas de sangue periférico e de pele. Foi analisada a expressão gênica de leucócitos de sangue periférico de vacas da raça holandesa pouco e muito infestada, e da raça nelore durante períodos de baixa e alta infestação natural por carrapatos. Os dados obtidos mostraram que a infestação modulou um número maior de genes nos holandeses muito infestados do que nas outras raças. De acordo com a análise funcional realizada dos genes diferencialmente expressos (DEGs) encontrados pode-se observar uma possível relação do perfil de expressão gênica dos holandeses com a imunidade inata, ao passo que o perfil de expressão gênica encontrado na raça nelore pode estar relacionado tanto com a imunidade inata quanto a imunidade adaptativa. Dessa forma, avaliando o perfil de resistência e suscetibilidade, este trabalho sugere que os genes CXCL6, S100A8 (Calgranulina A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 e CEBPE, podem ser possíveis assinaturas gênicas relacionadas a resistência ou suscetibilidade / Infestations with the cattle tick, Rhipicephalus microplus, cause huge economic losses in cattle production in tropical and subtropical countries worldwide. Control of ticks and tick-borne diseases of livestock depends almost exclusively of chemical control, such as use of acaricides, which leads to environmental concerns and due to their continued use, has generated resistance mechanisms in ticks, presenting steadily decreasing efficiency in controlling tick infestations. The research group of ticks of FMRP-USP selects new antigens that were tested in an experimental immunization, using a multicomponent antigen formulation. Based on the transcriptome results from peripheral blood leukocytes from vaccinated cattle, which identified genes whose expression is affected by infestations, and from the skin transcriptome of Nelore and Holstein bovine, the aim of this project is evaluate, by Nanostring technology, genes that may be used in tests to identify genetically resistant cattle to bovine tick and compare with the data already obtained from peripheral blood transcriptome and skin transcriptome. Gene expression was analyzed in peripheral blood of Holstein (much infested or less infested), and Nelore during periods of low and high natural infestation of ticks. The results showed that a greater number of genes were modulated in Holstein than the other breeds. According to the functional analysis of differentially expressed genes (DEGs) it can be observed a possible correlation from Holsteins profile with innate immunity, while the gene expression profile found in Nelore can be related both with the innate and adaptive immunity. Thus, evaluating the resistance and susceptibility profile, this work suggests that genes CXCL6, S100A8 (Calgranulin A) TYRP1, IgM, ELANE, CCL19, PDGFRL, VCAM1, NOX1 and CEBPE may be possible gene signatures related to resistance or susceptibility.

Rickettsia rickettsii é uma bactéria Gram-negativa, intra-celular obrigatória, causadora de uma grave riquetsiose em humanos, chamada no Brasil de Febre Maculosa Brasileira (FMB). Os carrapatos vetores de R. rickettsii para humanos, conhecidos até o momento no Brasil são Amblyomma cajennense e Amblyomma aureolatum. O presente estudo avaliou o tempo mínimo de parasitismo de A. aureolatum (ninfas não-alimentadas, machos adultos em jejum e pré-alimentados), infectadas por R. rickettsii, para que ocorra a transmissão da bactéria para o hospedeiro vertebrado. Para a produção de ninfas infectadas, foi mantida uma colônia de carrapatos em laboratório, infectados por R. rickettsii através de infestação em cobaias (Cavia porcellus) inoculadas por essa bactéria (Cepa Taiaçu). Para os experimentos com as ninfas de A. aureolatum, dividiram-se as cobaias em dez grupos de duas, sendo essas infestadas com dez ninfas cada uma. Após 2 horas da infestação (fixação da primeira ninfa), o primeiro grupo (G1) teve todas suas ninfas removidas. Após 4 horas de infestação, um segundo grupo (G2) de cobaias teve todas suas ninfas removidas de forma semelhante. Este procedimento foi repetido com os demais grupos, cada um em um determinado número de horas após a infestação: após 6 (G3), 8 (G4), 12 (G5), 18 (G6), 24 (G7), 36 (G8) e 48 (G9) horas. Para um último grupo (G10), as ninfas foram deixadas em parasitismo até seu desprendimento natural (cerca de 10 dias). Os experimentos realizados com carrapatos machos adultos em jejum seguiram os mesmos períodos utilizados para as ninfas, para fixação e retirada de carrapatos, assim como o número de cobaias. Nos experimentos com carrapatos machos adultos previamente alimentados - 48 horas em coelhos (Oryctolagus cuniculus), utilizaram-se os períodos de fixação e retirada de carrapatos idênticos aos experimentos anteriores, e além desses foi necessária a utilização de períodos menores de fixação de A. aureolatum, variando entre um minuto e uma hora. As cobaias foram avaliadas clinicamente todos os dias, e sacrificadas 21 dias após a infestação. Amostras de sangue foram colhidas e testadas para presença de anticorpos anti-R. rickettsii. Carrapatos retirados das cobaias de todos os grupos foram testados por PCR, a fim de se certificar que estavam infectados por R. rickettsii. De acordo com os resultados obtidos, ninfas não alimentadas de carrapatos A. aureolatum, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 12 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; carrapatos adultos não alimentados, infectados por R. rickettsii, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 horas, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado; e carrapatos adultos infectados por R. rickettsii e pré-alimentados em coelhos por 48 horas, necessitam realizar o repasto sanguíneo por um período mínimo de 10 minutos, para que ocorra a transmissão da bactéria ao hospedeiro vertebrado, utilizando-se cobaias como modelo experimental. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of the most severe rickettsiosis, known in Brazil as Brazilian Spotted Fever (BSF). Tick vectors of R. rickettsii to humans in Brazil are Amblyomma cajennense and Amblyomma aureolatum. The present study determined the minimum feeding period required for A. aureolatum-infected unfed nymphs, unfed adults, and fed adults to transmit infective forms of R. rickettsii to naïve guinea pigs. For this purpose, we used nymphs and adults of a laboratory colony of A. aureolatum, previously shown to be 100% infected by R. rickettsii strain Taiaçu. Infected nymphs were allowed to infest 10 groups of hosts, each containing 2 guinea pigs, with each individual guinea pig receiving 10 infected. After two hours of parasitism (counting from the moment when the first infected nymph attached to the skin), this group had all infected nymphs manually removed and saved for further molecular analysis. After 4 hours of infection, guinea pigs of a second group had all their nymphs similarly removed. This procedure was repeated with the other groups, each at a given number of hours after infestation: 6, 8, 12, 18, 24, 36, and 48h. For an additional group, nymphs were allowed to complete feeding period (96-120h). In another experiment, this whole procedure was performed with adult ticks, being one infected male tick per naïve guinea pig. In a third experiment, adult male ticks were pre-fed on rabbits for 48h before allowing to feed on naive guinea pigs for 1, 3, 5, 10, 20, 40 or 60 minutes, and then for 2 to >48h. Clinical signs and rectal temperature were evaluated daily in each guinea. Blood samples were collected at 21 days after infestation, and tested for presence of anti-R. rickettsii antibodies. All removed ticks in all groups showed to contain rickettsial DNA by PCR. According to the results, unfed nymphs of R. rickettsii-infected A. aureolatum ticks must feed for a minimum of 12 hours to transmit the bacterium to the vertebrate host; unfed R. rickettsii-infected adult ticks must feed for a minimum of 10 hours for transmission to occur, while previously fed adult ticks must feed for a minimum of 10 minutes to transmit R. rickettsii to vertebrate hosts, using guinea pigs as experimental model.

O carrapato do boi Rhipicephalus microplus é um ectoparasita de bovinos de grande importância sanitária e econômica, que produz grandes prejuízos na bovinocultura do Brasil. O uso de ivermectina como meio de controle químico, ao longo dos anos, levou à seleção de linhagens de R. microplus resistentes a ivermectina. A consequência desse processo é a perda da eficácia do acaricida. Este trabalho teve por objetivo determinar as bases moleculares da resistência a ivermectina. Para o estudo dos mecanismos envolvidos na resistência a ivermectina de R. microplus foram utilizadas duas cepas de referência: a cepa Mozo, suscetível a ivermectina, e a cepa Juarez, resistente, e duas abordagens experimentais complementares: ensaios enzimáticos com sinergistas e estudos de expressão gênica por meio de sequenciamento massivo em paralelo do RNA ou RNA-Seq. Os resultados deste trabalho permitem afirmar que o mecanismo de desintoxicação metabólica de maior importância é mediado por transportadores ABC, seguido de esterases, glutation-S-transferases e citocromo-oxidases. As diferenças de expressão gênica observadas entre as cepas, e dentro das cepas a diferentes concentrações de ivermectina, confirmam os resultados e permitem concluir que R. microplus apresenta uma resposta poligênica à ivermectina / The cattle tick Rhipicephalus microplus is one of the most important ectoparasites with great sanitary and economic importance for cattle rearing in Brazil. Ivermectin is a drug used in the chemical control of R. microplus. The utilization of ivermectin in the last 30 years has led to the selction of resistant populations of R. microplus, and thus, the loss of efficacy in the cattle tick control. To study the molecular basis of ivermectin resistance in R. microplus, two strains of ticks were used: the susceptible strain Mozo, and the resistant strain Juarez. Two complementary approaches were carried out: enzimatic assays using sinergists and gene expression studies using massive parallel sequencing of RNA or RNA-Seq. The results of this work indicate the involvement of various mechanisms of metabolic resistance. Detoxification mechanisms mediated by ABC transporters are probably the most important. Esterases, gluthathion-S-transferases and citochrome-oxidases play a less important role in detoxification. Differences in gene expression were observed between strains and among samples of the same strain exposed to different concentrations of ivermectin, confirming the result with the assays. Hence, the response of R. microplus to ivermectin is, probably, complex and poligenic

A resistência aos acaricidas é um dos maiores desafios para o controle adequado do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Entender os mecanismos de resistência aos acaricidas pode ser fundamental para prolongar sua eficiência no controle desse parasita. Transportadores ABC são reconhecidos em um grande número de organismos, pela sua participação na destoxificação de drogas. Eles são proteínas transmembrana, responsáveis por remover da célula compostos tóxicos, endógenos ou exógenos. Desta forma, protegem os organismos e são associados à resistência a drogas em vários nematódeos, artrópodes parasitas e células cancerígenas. No presente trabalho, determinamos a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos tóxicos, com ênfase ao acaricida ivermectina, no carrapato R. microplus. O tratamento com inibidores de transportadores ABC aumentou a toxicidade da ivermectina em larvas e fêmeas adultas de populações de campo resistentes a este acaricida. Inibidores de transportadores ABC também aumentaram a toxicidade de abamectina, moxidectina e clorpirifós, em uma população multirresistente a acaricidas, indicando que estes transportadores são responsáveis pela destoxificação de um grande número de acaricidas estruturalmente não relacionados. Níveis de transcrição significativamente maiores do gene RmABCB10 foram identificados no intestino de fêmeas de populações resistentes à ivermectina e amitraz, comparado à população suscetível, importante indicativo da participação deste transportador ABC na resistência a acaricidas. A toxicidade da ivermectina foi também significativamente aumentada, em uma população de células embrionárias de carrapato resistentes a este acaricida, quando estas foram co-incubadas com um inibidor de transportadores ABC. Além disso, os níveis de transcrição do gene RmABCB10, foram também induzidos nesta mesma população, comparado às células parentais suscetíveis à ivermectina, indicando que mecanismos semelhantes são selecionados in vivo e in vitro, e confirmando a participação de transportadores ABC na resistência à ivermectina. Mostramos ainda, que transportadores ABC responsáveis pelo sequestro e, consequente, destoxificação da molécula heme para o interior dos hemossomos, presentes no intestino do carrapato, são importantes na destoxificação de acaricidas para o interior desta mesma organela. Sugerindo ser este um importante mecanismo de defesa contra os acaricidas no carrapato. O silenciamento gênico do RmABCB10 por RNAi reduziu a destoxificação do heme nos hemossomos e aumentou a toxicidade da ivermectina em uma população resistente, indicando que o mesmo transportador usado para destoxificar heme é responsável pela destoxificação de acaricidas no intestino. Em conjunto, estes resultados revelam a participação de transportadores ABC na destoxificação de compostos endógenos e exógenos no carrapato e sua implicação como um mecanismo de resistência à ivermectina e outros acaricidas. Os dados aqui apresentados representam uma via de destoxificação de acaricidas até então desconhecida. E podem servir como alvo para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico e monitoramento da resistência e para o desenvolvimento de drogas e vacinas, contribuindo para o controle do carrapato. / Acaricide resistance is one of the biggest challenges in the control of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Understanding the mechanisms of drug resistance in the cattle tick is critical to prolong the efficacy of acaricides to control this parasite. ABC transporters are recognized in a large number of organisms. They are membrane-integrated proteins responsible for pumping toxic compounds, either exogenous or endogenous, out of the cells, protecting these. In this sense, ABC transporters have been associated with drug resistance in several nematodes, parasitic arthropods and cancer cells. The present study reports on the participation of ABC transporters in the detoxification of toxic compounds, particularly ivermectin, in the tick R. microplus. ABC transporter inhibitors increased ivermectin toxicity in larvae and females of ivermectin-resistant populations. ABC transporter inhibitors also increased the toxicity of abamectin, moxidectin and chlorpyriphos in a multidrug resistant population, suggesting that ABC transporters are responsible for the detoxification of a large number of structurally unrelated acaricides. Increased transcription levels of RmABCB10 found in midgut of females from ivermectinand amitraz-resistant populations, compared to a susceptible tick population, indicated the participation of this ABC transporter in acaricide resistance. Increased ivermectin toxicity in a tick cell line resistant to this acaricide was observed when the cells were co-incubated with an ABC transporter inhibitor. Moreover, transcription levels of RmABCB10 were also increased in this cell line, compared to the parental susceptible cell line, suggesting that similar mechanisms are selected in vivo and in vitro and confirming the participation of ABC transporters in ivermectin resistance. We even showed that ABC transporters responsible for the sequestration and hence detoxification of the heme into the hemosomes present in the midgut of the tick, were also important for the detoxification of acaricides in the same organelle, suggesting this is an important defense mechanisms of the tick against acaricide. The down-regulation of RmABCB10 by RNAi reduced heme detoxification in the hemosomes and increased ivermectin toxicity in resistant females, showing that the same ABC transporter is used to detoxify heme and acaricides in the midgut. Together, these results provide evidence of the participation of ABC transporters in the detoxification of endogenous and exogenous compounds in the tick, and indicate the role of these transporters as a mechanism of resistance to ivermectin and other acaricides. The data reported herein shed light on a new acaricide detoxification mechanism that may be useful in the development of assays to monitor drug resistance and design new anti-tick drugs and vaccines, contributing to the development of novel cattle tick control strategies.

A eficácia do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae para controle de carrapatos foi evidenciada em vários experimentos in vitro, entretanto, há poucos relatos de ensaios em condições de campo para demonstrar a real aplicação do controle biológico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia de M. anisopliae no controle de Rhipicephalus microplus em condições de laboratório e de campo associado ou não a acaricidas químicos, utilizando bovinos. Inicialmente, foi avaliada a compatibilidade de M. anisopliae (cepa E6) em ensaio in vitro com cinco produtos comerciais contendo: amitraz, cipermetrina, clorpirifós e duas associações de piretróides sintéticos e organofosforados (PS+OF). Em geral os acaricidas apresentaram pouco efeito na viabilidade do fungo. Quando M. anisopliae foi associado ao amitraz e a clorpirifós, ocorreu diminuição na viabilidade em aproximadamente 63% e 67% a 48 e 96 horas após a mistura, respectivamente. A eficácia de M. anisopliae (cepa E6) também foi avaliada sobre uma cepa de R. microplus multiresistente a acaricidas. Foram realizados experimentos in vitro e em condições de campo, utilizando o fungo isoladamente ou em associação com um acaricida comercial de pulverização em bovinos infestados com a cepa Jaguar (de R. microplus resistente a carrapaticidas). Para os ensaios a campo, vinte bovinos foram divididos em quatro grupos (n = 5): (i) o grupo tratado com acaricida; (ii) o grupo tratado com o fungo, (iii) o grupo tratado com a associação de fungo + acaricida, e (iv) o grupo controle (não tratado). Os animais foram separados em piquetes com animais naturalmente infestados e também com infestação experimental com a cepa Jaguar. Em cada infestação foram utilizadas 20.000 larvas de R. microplus, aplicadas em três semanas a -21, -14 e -7 dias antes do primeiro tratamento e uma semana depois de cada tratamento. Os animais dos grupos tratados foram pulverizados com o fungo na concentração de 108 conídios/mL com intervalo de 21 a 28 dias sendo realizados sete tratamentos. Desde o primeiro tratamento até o final do experimento, os três grupos tratados, apresentaram nas contagens, número de carrapatos inferior ao grupo controle (P <0,05). Os grupos tratados com a suspensão de esporos de fungo ou com acaricida isoladamente apresentaram um controle semelhante, com um mínimo de 50% de eficácia e média de 75%. Mais significativo foi o tratamento com associação do fungo com o acaricida que resultou em eficácia de 91,7%, após o primeiro tratamento e acima de 98% após os outros seis tratamentos. Assim, fica aqui demonstrada a real aplicabilidade do uso do fungo M. anisopliae (Cepa E6) para controle de R. microplus resistentes a acaricida, em especial a sua associação com acaricidas. / The of the fungus Metarhizium anisopliae to control ticks has been shown in several in vitro experiments. However, there have been few reports of assays in field conditions in order to demonstrate the real applicability of the biological control. Thus aim of the present study was to evaluate the efficacy of M. anisopliae to control Rhipicephalus microplus under laboratory and field conditions. Firstly the compatibility of M. anisopliae (strain E6) to acaricides was tested in vitro using five commercial acaricides: amitraz, cypermethrin, chlorpyriphos and two associations of synthetic pyrethroid and organophosphate (SP+OP). In general, the acaricides only displayed mild effects on fungus viability. The lower fungal viability was with amitraz and chlorpyriphos, approximately 63% of fungus viability at 48 hours post-mixture and 67% at 96 hours, respectively. Secondly, the efficacy of M. anisopliae (strain E6) to control a multiacaricide-resistant strain of R. microplus (Jaguar) was evaluated, in vitro and under field conditions in tick infested bovines, using the fungus alone or in association with a commercial acaricide by manual spraying. The field experiment was conducted with twenty bovines divided into four groups (n = 5); (i) acaricide-treated group, (ii) fungus-treated group, (iii) fungus+acaricide group, and (iv) control non-treated group. Animals were allocated into highly infested paddocks and were also experimentally infested with 20.000 larvae of R. microplus in three weeks -21, -14, and -7 days before the first treatment and one week after each treatment. Animals in the treated groups were sprayed with M. anisopliae at a concentration of 108 conidia/mL at 21 or 28 days intervals (seven treatments). From the first treatment to the end of the experiment, the treated groups had lower tick infestation (P < 0.05). Groups treated with fungus suspension and acaricide alone, presented a similar efficacy, with minimal of 50% and 75% average. Importantly, the association of fungus and acaricide promoted a minimal percent of 91.7% tick-control after the first treatment and over 98% tick-control in the other six treatments. Thus in this work we demonstrate the real applicability of the use of M. anisopliae (strain E6) to control acaricide resistant ticks R. microplus in particular using the association of fungal spores and acaricides.