Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que parasitam vertebrados e transmitem uma grande variedade de agentes infecciosos para o homem e animais domésticos. Cobaias, diferentemente de cães e camundongos, são capazes de desenvolver resistência a carrapatos Rhipicephalus sanguineus após sucessivas infestações. Ao comparar o tipo de resposta imune desenvolvida por cobaias e cães frente a carrapatos observou-se que cobaias re-infestadas desenvolvem uma pequena reação de hipersensibilidade imediata e uma forte reação de hipersensibilidade tardia à inoculação cutânea com antígenos de carrapatos. Já em cães e camundongos, é notada somente uma forte reação de hipersensibilidade imediata. Também foi verificado que células dos linfonodos de cobaias infestadas três vezes com carrapatos (resistentes) proliferam intensamente na presença de saliva de carrapatos, diferentemente do que ocorre com células de cães e camundongos re-infestados (suscetíveis) que não proliferam. Esses achados sugerem o envolvimento de um padrão Th1 de resposta imune na aquisição de resistência, no entanto essa hipótese ainda não foi confirmada. Assim sendo, no atual trabalho procurou-se verificar a expressão de mRNA de citocinas na pele e linfonodos de cobaias infestadas e re-infestadas com carrapatos. Para tal foram delineados primers e padronizadas reações de PCR para detectar a expressão de mensagem das citocinas IL-12p40, IFN-gama e TNF-alfa, pertencentes a um padrão Th1, e IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-beta, pertencentes a um padrão Th2 de resposta imune. Os resultados obtidos demonstraram que cobaias sucessivamente infestadas apresentaram um aumento significativo na intensidade de mensagem para IL-12p40 nos linfonodos, tanto comparado com animais uma vez infestados (aumento de 2,6 vezes), quanto comparado com os controles (aumento de 13 vezes). Embora a análise estatística não tenha apontado uma diferença significativa houve elevação consistente na intensidade de mRNA para IFN-gama nos linfonodos de cobaias re-infestadas comparadas às infestadas apenas uma vez (aumento de 2,4 vezes). Também foi observado um aumento significativo na intensidade da mensagem para IL-5 nos linfonodos de cobaias infestadas uma vez quando comparadas aos controles (aumento de 5 vezes). Não foi detectada expressão de mensagem para IL-4 e IL-10 nas amostras analisadas. Já a expressão de mensagem para TGF-beta foi observada em todos os animais (experimentais ou controles), sugerindo que essa citocina possa ter uma expressão constitutiva em cobaias. Tomados em conjunto, os resultados sugerem o envolvimento predominante de um perfil de citocinas de padrão Th1 na aquisição de resistência em cobaias a carrapatos. Nossos resultados poderão auxiliar o desenvolvimento de novas abordagens para o controle de carrapatos, como, por exemplo, sugerir adjuvantes mais adequados a serem utilizados em vacinas anti-carrapatos. O conhecimento gerado não se restringe à indução de proteção contra carrapatos como também a possibilidade de aumentar a resistência de hospedeiros a patógenos transmitidos por carrapatos que poderiam ser controlados por uma resposta tipo Th1. / Ticks are hematophagous arthropods of cosmopolitan distribution and are significant vectors of several diseases for humans and animals. Guinea pigs, unlike dogs and mice, develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks after successive infestations. When the immune reaction between tick-infested guinea pigs and dogs/mice are compared, guinea pigs develop both immediate and strong delayed type hypersensitivity reactions while dogs and mice develop only a strong immediate reaction. Additionally was shown that lymph node cells from tick-infested guinea pigs (resistant hosts) proliferate intensely when cultured with tick saliva, differently to what is observed with cells from tick-infested dogs and mice (susceptible hosts). These findings propose the contribution of a Th1 cytokine pattern on the acquired immune response to ticks; however this hypothesis still has to be tested. This being so, in this study we investigated the expression profile of genes coding for selected cytokines on R. sanguineus infested guinea-pigs. Messenger RNA for IL-12-p40, IFN-gamma and TNF-alfa (Th1 cytokine pattern) and IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-beta (Th1 cytokine pattern) was measured in skin and lymph nodes biopsies from tick-infested guinea pigs. Our results demonstrated that repeatedly tick-infested guinea pigs presented a significant increase on the intensity of message for IL-12p40 in the lymph nodes compared to both, one time tick-infested guinea pigs (raise of 2.6 times) or controls (raise of 13 times). Although the statistical analysis did not point out differences, there was a consistent increase on the mRNA intensity for IFN-gamma on the lymph nodes from re-infested guinea pigs compared to one time tick-infested animals (raise of 2.4 times). In addition, a significant enhance on the intensity of message for IL-5 on the lymph nodes from one time tick-infested guinea pigs compared to the controls (raise of 5 times). No message for IL-4 and IL-10 was detected on the analyzed tissues. In contrast, TGF-beta was detected on tissues collected from all animals (experimental or controls), suggesting a spontaneous production of this cytokine in guinea pigs. Taken together, these data suggest that a T helper 1-type pattern of cytokine production might be associated with the resistance expressed by guinea-pigs to ticks. Moreover, our results can provide new approaches to control ticks, i.e. suggest adjuvants to be added to anti-tick vaccines that preferably induce a Th1-type of response.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que têm grande importância médica e veterinária devido ao efeito deletério direto causado por se fixarem e sugarem seus hospedeiros, como também por serem importantes vetores de doenças para o homem e para os animais domésticos. Sabendo que carrapatos permanecem fixos em seus hospedeiros por longos períodos de tempo sem serem rejeitados, é possível inferir que esses ácaros possuam um arsenal de mecanismos que atuem no controle da resposta imune do hospedeiro. De fato, diversos trabalhos têm demonstrado que carrapatos são capazes de modular a resposta imune de seus hospedeiros através de componentes presentes na saliva, que são inoculados durante o repasto sangüíneo. Assim, este trabalho procurou investigar se carrapatos exercem a modulação da resposta imune do hospedeiro através do recrutamento de células T regulatórias CD4+CD25+ (Tregs), com a intenção de conter uma resposta inflamatória / imune prejudicial à sua alimentação. Para isso, células isoladas de amostras de pele e linfonodos de camundongos BALB/c infestados com carrapatos Rhipicephalus sanguineus foram analisadas quanto à expressão das moléculas de superfície CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR e CD103 (fenótipo de células Tregs), por citometria de fluxo. Adicionalmente, as células obtidas dos linfonodos foram avaliadas quanto à expressão de mensagem para o fator de transcrição Foxp3 (característico da função regulatória), por PCR quantitativo. Paralelamente, saliva de R. sanguineus foi inoculada na orelha de animais da mesma linhagem, a fim de se comparar o infiltrado celular com o obtido na pele dos camundongos infestados com carrapatos. Os resultados mostraram que as infestações não alteraram a percentagem de células T CD4+CD25+ nem a expressão de moléculas associadas ao fenótipo de células Tregs nas células infiltradas na lesão de fixação dos carrapatos ou nos linfonodos em comparação a camundongos controles. Também não se verificou aumento da expressão do gene para Foxp3 nos linfonodos em nenhum dos grupos analisados. Por outro lado, a inoculação de saliva na orelha de camundongos induziu um aumento significativo da população de células T CD4+, porém estas também não apresentavam fenótipo regulatório, sugerindo que o mecanismo de imunomodulação exercido pelos carrapatos sobre seus hospedeiros não é mediado por essas células. Resultados adicionais mostraram que a saliva de carrapatos reduziu significativamente a percentagem de células dendríticas nas orelhas dos camundongos, sugerindo que carrapatos podem estar modulando a resposta imune de seus hospedeiros por diminuírem o repovoamento da pele com células dendríticas, as quais são essenciais na vigilância imune dos tecidos periféricos. / Ticks are bloodsucking arthropods that feed on vertebrates and are responsible for serious global economic losses both through the effects of blood sucking and as vectors of pathogens. A tick?s bloodmeal lasts for several days, during which it remains fixed to the host and avoids rejection by local inflammatory and immunological reactions. This status is achieved by the escape mechanisms ticks have evolved. In fact, many studies have demonstrated that ticks modulate the host immune response through salivary compounds inoculated during their bloodmeals. This study investigated if during bloodfeeding ticks can recruit regulatory T cells in an attempt to modulate the host immune response and to control inflammatory responses that could be harmful to tick feeding. BALB/c mice were infested with Rhipicephalus sanguineus, the skin at feeding sites and the regional lymph nodes were collected, and the cells forming the local infiltrates were analyzed by flow cytometry for simultaneous expression of CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR and CD103 molecules. Additionally, expression of mRNA for Foxp3 was measured in the lymph node cells. Tick saliva was also inoculated into the ears of BALB/c mice in order to compare the local cellular infiltrate with that elicited by artificial infestation. Control animals were sham infested. The results show that, relative to sham-infested tissues, tick infestations did not alter the percentage of CD4+CD25+ T cells present at the site of their attachment or in draining lymph nodes. Infestations also did not increase the expression of Foxp3 in skin and lymph nodes. On the other hand, saliva inoculated into the ear induced a significant increase in the number of CD4+ T lymphocytes recruited to the site of inoculation, although these cells did not express a regulatory phenotype. These results suggest that the modulation of the host immune response by ticks does not involve CD4+CD25+ T cells. Additional results showed that tick saliva reduced the percentage of dendritic cells in the skin of infested mice. This finding indicates that ticks may modulate the host immune response by diminishing the repopulation of skin with dendritic cells, which are essential for maintaining surveillance of peripheral tissues for incoming antigens.

Em 2005 o primeiro caso de Febre Maculosa Brasileira (FMB) foi reconhecido no estado do Rio Grande do Sul (RS), Brasil. Desde então até abril de 2016 doze casos foram confirmados, sendo que quatro destes são autóctones do município de Cerro Largo, área considerada endêmica para a enfermidade riquetsial. Neste mesmo período o RS também notificou 58 casos suspeitos ao Ministério da Saúde. No RS são encontrados dois biomas, Mata Atlântica e Pampa, este último não ocorrendo em outras unidades federativa do país. Até o momento, inexistem estudos relatando a infecção por riquétsias na ixodofauna gaúcha. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo pesquisar a infecção de riquétsias do Grupo da Febre Maculosa (GFM) em cães, pequenos mamíferos e carrapatos; através da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), qPCR e tentativa de isolamento de riquétsias em cultivo celular dos ixodídeos coletados em área endêmica (Cerro Largo) e áreas não endêmicas nos biomas Pampa e Mata Atlântica no RS. Na sorologia (RIFI), 33,5 % (55/164), 2,9% (1/33), 40% (16/40) dos pequenos mamíferos e 8,3% (3/36), 13,9% (5/36) e 20,4 (28/137) dos cães coletados na Mata Atlântica, Pampa e área endêmica para FMB, respectivamente, foram sororreagentes para pelo menos um dos seis antígenos de riquétsias testados. Oito espécies de carrapatos foram coletadas no local de Mata Atlântica, sendo: Amblyomma aureolatum, Amblyomma brasiliense, Amblyomma incisum, Amblyomma ovale, Haemaphysalis juxtakochi, Ixodes loricatus, Rhipicephalus microplus e Amblyomma yucumense com destaque para esta última que foi descrita como uma espécie nova. Já para o fragmento de Pampa quatro espécies foram encontradas (A. aureolatum, A. ovale, Amblyomma tigrinum e Rhipicephalus sanguineus) e na área endêmica para FMB no RS, coletamos cinco espécies de carrapatos, Amblyomma dubitatum, Amblyomma longirostre, A. ovale, I. loricatus e R. microplus. Detectamos molecularmente pela primeira vez no RS, Candidatus Rickettsia amblyommii em A. longirostre e A. brasiliense, Candidatus Rickettsia andeanae em A. aureolatum e A. tigrinum, Rickettsia bellii em I. loricatus, Rickettsia rhipicephali em A. yucumense e H. juxtakochi, Candidatus Rickettsia asemboensis em pulgas no Brasil e de extrema importância para o conhecimento da epidemiologia da FMB no RS, detectamos Rickettsia sp. cepa Mata Atlântica em A. ovale oriundos de Cerro Largo (área endêmica para FMB no RS). Como primeiros isolamentos de riquétsia para o estado do RS, isolamos R. bellii de I. loricatus coletados na Mata Atlântica e área endêmica para FMB no RS. O presente estudo é pioneiro em relação a investigação comparativa sobre FMB nos biomas Pampa e Mata Atlântica e também o primeiro estudo molecular e isolamento de riquétsias em cultivo celular de amostras coletadas no RS, Brasil / In 2005 the first Brazilian Spotted Fever (BSF) case was confirmed in the Rio Grande do Sul (RS) state, Brazil. Ever since until April 2016, twelve cases have been confirmed, and four of them are native from Cerro Largo city, an area considered endemic to the riquetsial illness. During the same period, RS also notified 58 suspected cases to the Ministry of Health. There are two distinct biomes in RS, Atlantic Forest and Pampa, the later restricted to RS within the Brazilian land. Until now, no studies reported rickettsial infection in the ixodofauna of RS. Thus, this study aimed to investigate the rickettsial infection of Spotted Fever Group (SFG) in dogs, small mammals and ticks; by immunofluorescence assay (IFA), qPCR and attempted rickettsial isolation in cell culture from ticks collected in an endemic area (Cerro Largo) and non-endemic areas in Pampa and Atlantic Forest biomes of RS. Through serology (IFA), 33.5% (55/164), 2.9% (1/33) and 40% (16/40) small mammals, and 8.3% (3/36), 13.9 % (5/36) and 20.4 (28/137) dogs from the Atlantic Forest, Pampa, and BSF-endemic area, respectively, were seroreactive (titer ≥64) to at least one of the six rickettsia antigens tested. Eight species of ticks were collected in the Atlantic Forest: Amblyomma aureolatum, Amblyomma brasiliense, Amblyomma incisum, Amblyomma ovale, Haemaphysalis juxtakochi, Ixodes loricatus, Rhipicephalus microplus and Amblyomma yucumense, the later described as a new species. In the Pampa fragment, four tick species were found (A. aureolatum, A. ovale, Amblyomma tigrinum and Rhipicephalus sanguineus), and five tick species (Amblyomma dubitatum, Amblyomma longirostre, A. ovale, I. loricatus, R. microplus) in the BSF-endemic area of RS. We performed the first molecular detection in the RS state of "Candidatus Rickettsia amblyommii" in A. longirostre and A. brasiliense; "Candidatus Rickettsia andeanae" in A. aureolatum and A. tigrinum; Rickettsia bellii in I. loricatus; Rickettsia rhipicephali in A. yucumense and H. juxtakochi; and "Candidatus Rickettsia asemboensis" in fleas in Brazil. Noteworthy, we detected the pathogen Rickettsia sp. strain Atlantic rainforest in A. ovale ticks from Cerro Largo (endemic area for BSF in RS). We also performed the first isolation in cell culture of rickettsia from RS state, which comprised R. bellii from I. loricatus collected in the Atlantic Forest and the BSF-endemic area. This study is the first comparative research about rickettsiae among Pampa and Atlantic Forest biomes, and also the first molecular detection and isolation in cell culture of rickettsiae from Rio Grande do Sul, Brazil

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:29:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GLADSTONE SANTOS DE SOUZA.pdf: 1638209 bytes, checksum: 55969fd3f801a5d3226ae0a527951dc1 (MD5) Previous issue date: 2009-05-11 / The bovine tick is the ectoparasite that causes the greatest prejudice to Brazilian farming and cattle raising, and its control is realized basically through chemical products, which are losing effectiveness over time. This work aimed to evaluate the efficacy of a transdermal formulation, developed by the laboratory Clarion Biociências Ltd. It contains the medicine novaluron, against the tick Boophilus microplus in naturally infested animals. Animals used in the experiment were kept in a pasture with Brachiaria brizantha ascendancy, water; animal food and mineral salt were supplied ad libitum. The formulation containing novaluron was tested in five different dosages: 5.0; 2.5; 1.66; 1.25 and 1.0mg/kg of live weight in a single dose compared to a placebo group and control. The weight of the animals of the experiment varied from 290 to 339kg. Only the dosages of 5.0 and 2.5mg/kg attended the least requisites. The evaluation of the plasmatic profiles of the dosages of 2.50 and 5.00mg/kg of novaluron, presented the following results respectively: concentration peak (Cmax) was 378 and 396ng/mL; the time for obtainment of the concentration peak (Tmax) was 4 days for both dosages and the area on the plasmatic concentration curve(ASC) > 100ng was 28 and 42 days. Based on the results of efficacy and analysis of the plasmatic profile it was concluded that the 2.5mg/kg dosage presented a better relation cost/ benefit. Afterwards it was realized the efficacy of the formulation of novaluron 5% in the dosage of 2.5mg/kg live weight in a single dose comparatively to the commercial product fluazuron, formulation containing 2.5% of fluazuron in the dosage of 2.5mg/kg in a single dose compared to the group control. The results for the two products were alike. It was concluded that a formulation containing 5% of novaluron in the 2.5mg/kg dosage owns the safety requisites, efficacy and economic which make feasible complementary studies for register and commercialization. / O carrapato bovino é o ectoparasita que causa o maior prejuízo à agropecuária brasileira, e o seu controle é realizado basicamente através de produtos químicos, os quais vêm perdendo eficácia com o passar do tempo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia de uma formulação transdérmica, desenvolvida pelo laboratório Clarion Biociências Ltda. contendo o fármaco novaluron, frente ao carrapato Boophilus microplus em animais naturalmente infestados. Os animais utilizados no experimento foram mantidos a pasto com predomínio de Brachiaria brizantha, água, ração e sal mineral foram fornecidos ad libitum. A formulação contendo novaluron foi testada em cinco posologias diferentes: 5,0; 2,5; 1,66; 1,25 e 1,0mg/kg de peso vivo, em dose única comparativamente a um grupo placebo e controle. O peso dos animais do experimento variou de 290 a 339kg. Somente as posologias de 5,0 e 2,5mg/kg atenderam os requisitos mínimos. A avaliação dos perfis plasmáticos das posologias de 2,5 e 5,0mg/kg de novaluron, apresentaram os seguintes resultados respectivamente: pico de concentração (Cmax) foi de 378 e 396ng/mL; o tempo para obtenção do pico de concentração (Tmax) foi de 4 dias para ambas as posologias e a área sobre a curva de concentração plasmática (ASC) > 100ng foi de 28 e 42 dias. Com base nos resultados de eficácia e análise do perfil plasmático, concluiu-se que a posologia de 2,5mg/kg apresentou uma melhor relação custo/benefício. Posteriormente foi realizada eficácia da formulação de novaluron 5% na posologia de 2,5mg/kg de peso vivo em dose única comparativamente ao produto comercial fluazuron, formulação contendo 2,5% de fluazuron na posologia de 2,5mg/kg em dose única comparadas ao grupo controle. Os resultados para os dois produtos foram semelhantes. Concluiu-se que formulação contendo 5% de novaluron na posologia de 2,5mg/kg possui os requisitos de segurança, eficácia e econômicos que viabilizam estudos complementares para registro e comercialização.

Neste projeto, objetivou-se o diagnóstico de riquétsias, utilizando metodologia molecular, em material de humanos, carrapatos, pulgas, cães e equinos de áreas endêmicas dos estados de São Paulo (SP) e Rio de Janeiro (RJ). Diagnosticou-se Rickettsia rickettsii infectando Amblyomma cajennense e humanos no estado de SP, indicando ser esta a única espécie responsável pela doença. Rickettsia conorii foi diagnosticada em um paciente procedente de Portugal. No estado do RJ, Rickettsia felis foi detectada Ctenocephalides felis e em Am. cajennense enquanto que R. rickettsii em Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis e Rhipicephalus sanguineus. As frequências mínimas de vetores infectados do estado do RJ apresentaram valores superiores àqueles registrados em outras regiões do país. Demonstrou-se, de forma inédita, o envolvimento de algumas destas espécies no ciclo da bactéria. R. rickettsii foi diagnosticada em cães e equinos indicando a importância dos animais domésticos na manutenção do ciclo da riquetsiose. / This project aimed to diagnose rickettsial diseases using molecular analysis methods on human, tick, flea, dog and horse samples from endemic areas in the States of São Paulo (SP) and Rio de Janeiro (RJ). A diagnosis of Rickettsia rickettsii infecting Amblyomma cajennense and humans in the State of SP was made, indicating that this is the only species responsible for the disease. Rickettsia conorii was diagnosed in a patient from Portugal. In RJ, Rickettsia felis was detected in Ctenocephalides felis and Am. cajennense, while R. rickettsii was detected in Amblyomma aureolatum, Am. cajennense, Anocentor nitens, Boophilus microplus, Ct. felis and Rhipicephalus sanguineus. In the State of RJ the minimum frequency of infected vectors presented higher values than those recorded in other regions of the country. The involvement of some of these species in the bacterium cycle has been demonstrated for the first time. R. rickettsii was diagnosed in dogs and horses indicating the importance of livestock in the maintenance cycle of rickettsial infection.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

Les maladies à transmission vectorielle, qui représentent dix-sept pour cent de l’ensemble des maladies infectieuses, sont un réel problème de santé publique. Parmi elles, la borréliose de Lyme est la maladie vectorielle la plus répandue de l’hémisphère nord. Elle est causée par la transmission d’une bactérie, Borrelia burgdorferi sensu lato, par une tique dure du genre Ixodes. Le premier contact entre l’hôte vertébré et la tique, et donc a fortiori entre l’hôte vertébré et la bactérie, se fait au niveau cutané. La peau est donc une interface essentielle dans le développement précoce de l’immunité envers Borrelia. La tique effectue un repas de plusieurs jours qui induit une lésion cutanée par ses pièces piqueuses et sa salive, créant une cavité lui permettant de se nourrir. Ce processus facilite le repas sanguin, mais aussi la transmission de Borrelia. Nous avons caractérisé une protéine présente dans la salive de tique responsable de la formation de la cavité : l’histone H4. Celle-ci lyse les fibroblastes et possède une activité bactéricide envers les bactéries commensales de la peau. Ces deux activités pourraient être exploitées par Borrelia afin de favoriser sa transmission et son développement dans la peau. Une fois injectées, Borrelia et la salive interagissent avec les cellules de la peau telles que les kératinocytes de l’épiderme, les fibroblastes et les cellules immunitaires du derme. Nous avons montré que l’inflammation induite par la lésion augmente la réponse inflammatoire des kératinocytes contre Borrelia. Cependant, la salive de tique inhibe efficacement cette coopération inflammatoire dont la mise en place dépend des voies inflammatoires TLR3/TRIFF et TLR2/MyD88. Une fois la tique détachée de l’hôte vertébré et la salive de tique disparue, la coopération inflammatoire ne serait plus inhibée et pourrait expliquer en partie l’apparition de l’érythème migrans. L’inflammation cutanée précoce implique d’autres cellules que les kératinocytes et les fibroblastes telles que les macrophages, les cellules dendritiques ou encore les neutrophiles. Nous avons étudié l’implication d’un autre type cellulaire peu exploré dans le contexte de la borréliose de Lyme : les mastocytes. Ces cellules sont capables de répondre efficacement contre Borrelia par la sécrétion d’IL-6 et la dégranulation. Les antigènes bactériens nécessaires à l’activation des mastocytes semblent liés à la bactérie intacte et vivante. La salive de tique réduit la sécrétion d’IL-6 induite par Borrelia, mais ne l’inhibe pas complètement. A ce stade de nos études, les mastocytes ne semblent pas jouer un rôle majeur. Lors de la transmission, Borrelia exprime différents gènes qui lui permettront notamment de disséminer vers différents organes cibles de l’hôte vertébré : le système nerveux, l’articulation et la peau à distance. Nous avons identifié chez un clone de B. burgdorferi sensu stricto aux propriétés disséminatrices importantes, l'expression de deux gènes, bb0347 et bb0213, qui semblent associés à cette virulence. bb0347 code une protéine d’adhésion à la matrice extracellulaire, ce qui pourrait favoriser la migration de la bactérie à travers les tissus cutanés de l’hôte vertébré et donc sa dissémination. Le rôle de bb0213 n’est pas connu à ce jour. / Vector-borne diseases account for seventeen percent of world-wide infectious diseases. They are amajor threat to public health. Lyme borreliosis is the first vector-borne disease of the northernhemisphere. It is caused by a bacteria, Borrelia burgdorferi sensu lato, inoculated by a hard tickbelonging to the Ixodes genus. The first contact between the vertebrate host and the tick, and sobetween the vertebrate host and the bacteria, occurs at the skin interface. The skin is then of majorimportance for the early development of the immune response against Borrelia.The tick bite induces a skin injury owing to its biting pieces, the hypostome and two chelicerae. The ticksaliva also creates a feeding pool allowing the tick to feed efficiently. This process also facilitates Borreliatransmission. We have characterized a tick saliva protein which might participate to the formation ofthe feeding pool: histone H4. This protein lyses fibroblasts and harbors bactericidal properties againstcommensal bacteria. These two activities might help Borrelia to infect the vertebrate host by sustainingits development in the skin. Once bacteria have been injected into the skin, they interact with residentskin cells, keratinocytes and fibroblasts, and immune cells. We have shown that the inflammationinduced by the tick bite increases the keratinocyte inflammatory response against Borrelia. However,the saliva inhibits this cross-talk which depends on TLR3/TRIFF and TLR2/MyD88 pathways. Once thetick has detached and the saliva has disappeared, the cross-talk might explained the inflammationobserved during the erythema migrans.Other skin cells than keratinocytes and fibroblasts are involved in the early inflammatory responseagainst Borrelia such as dendritic cells, macrophages and neutrophils. We have explored theinvolvement of another poorly-studied cell-type: mast cells. We have shown that these cells can secreteIL-6 and degranulate in response to Borrelia. Bacteria antigens responsible of the activation mightdepends on the living state of Borrelia. The tick saliva is able to negatively control the secretion of IL-6,but not to completely inhibit it. At this point, we cannot conclude in a WSH mouse model deficient inmast cells, to a major role of these cells in the inflammatory response against Borrelia.While in the skin, Borrelia expresses many genes which will facilitate the dissemination across thevertebrate host, to reach different target organs (brain, joint, distant skin). We have characterized twogenes potentially involved in the dissemination of a virulent clone of B. burgdorferi sensu stricto: bb0347and bb0213. bb0347 encodes for an adhesion which can specifically interact with the extracellularmatrix of the skin while the role of bb0213 is unknown. bb0347 might help the bacteria to migratethrough skin tissues and then increases the infection rate.

Ixodes ricinus est l’espèce de tique la plus abondante et ayant la plus vaste répartition géographique en Europe. Elle est le vecteur de nombreux agents pathogènes d’importance en santé publique et vétérinaire. Le remplacement des acaricides générant pollution environnementale et apparition croissante de résistances requiert le développement urgent de nouvelles stratégies de lutte efficaces contre les tiques et les agents pathogènes qu’elles transmettent. La découverte de telles stratégies passe nécessairement par une meilleure connaissance des interactions entre les tiques, leurs hôtes et les agents pathogènes transmis. La salive de tique, à l’interface de ces interactions, est un fluide essentiel pour ces arthropodes et possède notamment des propriétés protéolytiques, anticoagulantes, immunomodulatrices, analgésique, et anti-inflammatoires qui permettent à la tique de réaliser ses repas sanguins extrêmement longs. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission des agents pathogènes et pour identifier de possibles candidats vaccinaux contre I. ricinus, une étude transcriptomique comparative entre des glandes salivaires infectées et non infectées par la bactérie Bartonella henselae a été antérieurement réalisée. Le transcrit le plus surexprimé suite à cette infection était IrSPI, un inhibiteur de sérine protéase de la famille des Kunitz. Les analyses fonctionnelles par ARN interférence ont montré l’implication de ce gène dans le gorgement et de l’infection des glandes salivaires par B. henselae. Ainsi, les travaux de thèse présentés ici ont concerné l’analyse structurelle, biochimique et fonctionnelle de IrSPI en tant que molécule impliquée dans les interactions tick-hôte-pathogène. Le premier objectif était de définir la structure et la séquence du gène IrSPI mais, malheureusement, bien que nos résultats aient permit des avancés sur cette question, nous n'avons pu obtenir la totalité de sa séquence. Dans un second temps, la dynamique d’expression d’IrSPI a été évaluée au cours du gorgement et de l’infection des tiques par différents agents pathogènes, montrant que son expression est induite par le repas sanguin, par des agents transmis par la tique mais pas par Escherichia coli, bactérie non transmise. De plus, nos résultats ont montré l’expression de IrSPI dans plusieurs organes de la tique, suggérant son implication dans diverses fonctions au sein de ce vecteur. Parmi elles, la mise en évidence d'une injection, par la salive, de la protéine à l'hôte vertébré nous a permis d'envisager un rôle sur les réponses de l'hôte à la piqûre de tique. Nos résultats n’ont montré aucune implication dans la voie extrinsèque de la coagulation ni dans la fibrinolyse, ni dans l’angiogenèse. En revanche, ils ont démontré que IrSPI inhibe la prolifération des lymphocytes TCD4+ sous stimulation monogénique quand chez des lymphocytes B non stimulés IRSPI, il induit une hausse de la prolifération. De plus IrSPI a montré une action négative significative sur la production de la majorité des cytokines et chimiokines pro-inflammatoires produites par les macrophages et les splénocytes. Ainsi, IrSPI, correspond à un des composants salivaires d’I. ricinus lui permettant de moduler la réponse immune de l’hôte pour lui permettre de prélever son repas sanguin tout en favorisant la transmission des agents pathogènes. Enfin, des résultats préliminaires dans l'identification des interactants de IrSPI à la fois chez la tique et l’hôte vertébré ouvre de nombreuses voies de recherche quant à la compréhension de ses fonctions. / Ixodes ricinus tick species, the most abundant and widespread tick in Europe, is an important vector of pathogens affecting both animal and human health. To replace the use of acaricides that generate environmental contamination and resistances, new environmentally sustainable approaches providing broad protection against ticks and tick-borne pathogens (TBP) are urgently needed. Such development requires improved understanding of the biology of ticks and more particularly of their interactions with vertebrate hosts and TBP. Tick saliva is an essential biofluid for ticks, as its proteolytic, anticoagulant, immunomodulatory, analgesic and anti-inflammatory activities allow ticks to acquire their blood meal under optimal conditions. Moreover, injection of saliva during blood feeding represents the principal route by which TBP are transmitted to the host. To understand the molecular mechanisms involved in TBP transmission, as well as to identify putative vaccine candidates against I. ricinus, salivary glands from bacteria infected and uninfected ticks were previously compared by high throughput transcriptomics. The most up-regulated transcript following infection was IrSPI, which belongs to the Kunitz/BPTI inhibitor family. Functional analyses via RNAi knockdown experiments revealed that IrSPI enhances both blood feeding and bacterial burden in the salivary glands. This present PhD work concerns then the structural, biochemical and functional characterization of IrSPI as a molecule involved in tick-host-pathogen interactions. Our aim was first to define the structure of IrSPI gene but, unfortunately, while our results have led to progress on this issue, we have not been able to get the full sequence. Then, the dynamic of IrSPI expression was evaluated during both tick feeding and colonization of ticks by pathogens, showing that its expression is induced by blood feeding and TBP but not by Escherichia coli that is not transmitted by I. ricinus. In addition, our results shown the expression of IrSPI in several tick organs, suggesting its implication in several functions in tick physiology. Among them, the discovery of the injection of IrSPI, through the saliva, to the vertebrate host allowed us to consider a role in host responses to tick bite. Evaluation of IrSPI effect on host showed no impact on coagulation through extrinsic pathway, as determined by analysis of thrombin generation time and by fibrinolysis, or in angiogenesis. However, it inhibited the proliferation of mitogen-stimulated CD4+ lymphocytes and increased unstimulated-B cell proliferation. In addition, IrSPI also modulated cytokine production from macrophages and splenocytes, repressing significantly most of proinflammatory cytokines and chemokines. Thus, we demonstrated that IrSPI plays a role in modulating the host immune response during blood feeding. Finally, preliminary results in the identification of the protein’s interactants open many research perspectives for understanding how IrSPI acts in tick physiology and counteracts host responses to tick injury and pathogen transmission.