Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-05-31T20:46:06Z No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T20:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PauloRicardoPorfirioDoNascimento_TESE.pdf: 3589123 bytes, checksum: d44189d5ff788541433dfaed7669cd11 (MD5) Previous issue date: 2016-12-13 / Introdu??o: Os c?es s?o considerados os principais reservat?rios dom?sticos de Leishmania infantum no Brasil e apresentam um amplo espectro de manifesta??es cl?nicas, variando de perda de peso, anemia grave, hepatoesplenomegalia e les?es d?rmicas disseminadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de express?o g?nica em c?lulas do ba?o e do sangue perif?rico de c?es naturalmente infectados por L. infantum e investigar as altera??es histopatol?gicas no ba?o, f?gado, intestino e pele, visando identificar poss?veis vias imunorreguladoras envolvidas na patog?nese da LVC. Metodologia: Vinte e um c?es oriundos do Centro de Controle de Zoonoses de Natal-RN foram estudados e um subgrupo destes animais (n=8) foi utilizado para estudos de express?o g?nica global. A carga de Leishmania nos diversos tecidos, foi estimada por qPCR e cultura para Leishmania foi realizada. O RNA total do ba?o e do sangue perif?rico foi extra?do e as bibliotecas de cDNA foram obtidas e sequenciadas em plataforma Illumina. As sequ?ncias obtidas foram filtradas e alinhadas contra o genoma de Canis familiaris pelo software Bowtie. A express?o g?nica diferencial foi analisada usando o protocolo do Cufflinks, a anota??o funcional e as caracter?sticas moleculares dos genes foram obtidas no banco de dados Gene Ontology e KEGG atrav?s do pacote STRINGdb. Fragmentos de f?gado, duodeno, pele e ba?o foram coletados, processados e corados com hematoxilina/eosina e imunofluoresc?ncia para an?lises histopatol?gicas. Resultados: As cargas parasit?rias estimadas para ba?o e f?gado apresentam correla??o, por?m n?o h? correla??o entre a carga parasit?ria destes tecidos com aquela presente no sangue. Aproximadamente 756 genes se mostraram super expressos no ba?o de animais sintom?ticos, como CTLA4, CCL2 e IL27; al?m destes, cerca de 1.190 genes apresentaram express?o reprimida neste mesmo grupo, como BMP6, C1QB e C1QC. As vias de ativa??o de c?lulas NK, receptores dos tipos Toll-like e NOD-like expressas no ba?o de animais sintom?ticos estavam com express?o elevada, enquanto as vias de s?ntese de ?ncoras de GPI e ativa??o do imunoproteossoma estavam reprimidas. A progress?o da LVC resulta em desorganiza??o da citoarquitetura do ba?o, com perda parcial da delimita??o entre polpa branca e vermelha. ? observado infiltrado inflamat?rio no f?gado, duodeno e pele. Validando o achado do transcriptoma, foi observada por imunofluoresc?ncia a presen?a de CTLA4, CCR7 e NLRP3 no ba?o de animais sintom?ticos. Conclus?es: A desregula??o de mecanismos tipicamente associados ? imunidade inata pode estar diretamente envolvida na patogenia da LVC. Al?m disso, uma alta efici?ncia no processamento e apresenta??o de ant?genos parecem ser respons?veis, pela resist?ncia ao desenvolvimento dos sinais cl?nicos e integridade tissular durante a infec??o por L. infantum em c?es. / Background: Dog is the main domestic reservoir of Leishmania infantum in Brazil. Those animals present a wide spectrum of clinical manifestations, varying from weight loss, anemia to hepatosplenomegaly and skin lesions. The goal of this study was to evaluate the gene expression profile in the spleen and peripheral blood cells from naturally Leishmania-infected dogs and to study the histology of the spleen, liver, gut and skin, in order to determine possible molecular pathways and histopathological process underlying the mechanisms related to disease progression and resistance. Methodology: 21 dogs was studied and a sub group (n=8) was selected for transcriptomic studies. In addition, spleen, liver, gut and blood parasitism were estimated by qPCR and parasite was isolated from the spleen by culture. Total RNA was extracted and cDNA libraries were constructed and sequenced in an Illumina platform. The reads obtained were filtered and aligned against Canis familiaris genome using Bowtie. Differential gene expression was analyzed using the Cufflinks workflow, functional annotation and molecular features for each gene was obtained from Gene Ontology and KEGG database using STRINGdb. A fragment of liver, gut, skin and another spleen fragment were collected, processed and stained by HE and immunofluorescence for histopathological analysis. Results: Parasite load estimated in the spleen and liver were strongly associated, however no correlation was observed between them and circulating parasite estimation. Approximately, 756 genes were upregulated in the spleens of symptomatic dogs, as CTLA4, CCL2 and IL27, furthermore, about 1,190 genes were downregulated in the same group of animals, as BMP6, C1QB and C1QC. We found that NK cells activation, toll-like and NOD-like receptors pathways are highly expressed in the spleen of symptomatic dogs, while GPI-anchors synthesis and immunoproteasome activation related genes are downregulated in these animals. Additionally, we observed that in symptomatic animals, the cytoarchitecture of spleen is altered, with partial loss of the delimitation between white and red pulp. Furthermore, an intense inflammatory infiltrate in the liver, gut and skin of these animals. Confirming the RNA-Seq findings, we observed by immunofluorescence CTLA4, CCR7 and NLRP3 are overexpressed the spleen of symptomatic dogs. Conclusions: These findings suggest that misregulation of innate immunity is involved in CVL and an efficient antigen presentation maybe decisive for resistance to clinical signs development and tissue integrity during L. infantum infection in dogs.

Echinococcus granulosus é um parasito cestódeo e o agente etiológico da hidatidose cística. O desenvolvimento dos vermes adultos a partir dos protoscoleces é, provavelmente, desencadeada por diferentes estímulos que são impostos pelos hospedeiros, os quais provocam mudanças moleculares e morfológicas no parasito. No entanto, os mecanismos responsáveis por essas variações não estão totalmente esclarecidos. Para encontrar genes e proteínas possivelmente envolvidos com as alterações fenotípicas observadas durante o desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, relatamos aqui o perfil transcritômico e a detecção de proteínas recémsintetizadas após a indução in vitro de protoescólices ao desenvolvimento estrobilar. Os protoescólices foram tratados com pepsina e mantidos em meio bifásico contendo taurocolato para induzir ao desenvolvimento estrobilar. Azidohomoalanina, aminoácido análogo de metionina, foi adicionado para a incorporação metabólica nas proteínas recém-sintetizadas, que foram visualizadas por microscopia confocal e identificadas por espectrometria de massas Paralelamente, o RNA total foi isolado utilizando o reagente TRIzol e as bibliotecas geradas foram sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq. Nós identificamos 23 proteínas detectadas exclusivamente na presença de estímulos para o desenvolvimento estrobilar (SSD) e 28 na ausência desses estímulos (NSD). Também encontramos 75 proteínas diferencialmente expressas entre as duas condições (34 em SSD e 41 em NSD). Na análise dos dados de RNAseq, 818 genes foram identificados como diferencialmente expressos pelo software GFOLD. De forma geral, genes e proteínas com funções moleculares de transdução de sinal, metabolismo e modificações de proteínas foram observadas com a progressão do desenvolvimento estrobilar. Assim, este estudo fornece informações sobre genes e proteínas que podem ter um papel chave para o desenvolvimento do parasito, além de serem alvo de estudos futuros. / Echinococcus granulosus is a cestode parasite and the etiological agent of the cystic hydatid disease. The development of the adult worms from protoscoleces is probably triggered by different stimuli imposed by the hosts, which lead to molecular and morphological changes. However, the mechanisms underlying these variations remain largely unclear. In order to find genes and proteins possibly involved with the phenotypic changes during the strobilar development, we reported here the transcriptomic profile and the detection of newly synthesized proteins after protoscoleces in vitro induction to strobilar development. Protoscoleces were treated with pepsin and maintained in biphasic medium containing taurocholate to induce the strobilar development. The methionine analogue azidohomoalanine was added for metabolic incorporation in the newly synthesized proteins that were visualized by confocal microscopy and identified by mass spectrometry.In parallel, total RNA from parasite material was isolated using TRIzol reagent and the generated libraries were sequenced on Illumina MiSeq platform. We identified 23 proteins present only after stimuli for strobilar development (SSD) and 28 in absence of these stimuli (NSD). We also found 75 differentially expressed proteins (34 SSD and 41 NSD). In the RNA-seq analysis, 818 differentially expressed genes were identified by the GFOLD software. Gene transcripts and proteins with molecular functions of signal transduction, metabolism and protein modifications were observed with progression of development. This study provides insights on searching for the key genes and proteins that may be important for the correct parasite development and be target for further studies.

Submitted by BRUNO TINOCO NUNES (croookes@gmail.com) on 2018-09-25T16:26:37Z No. of bitstreams: 1 Tese_Bruno_Tinoco_25_09_2018.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-09-25T16:43:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_bt_dr_bot.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-25T16:43:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_bt_dr_bot.pdf: 4179397 bytes, checksum: eb771bc06b406e51cb4c11fd78aa1814 (MD5) Previous issue date: 2018-07-23 / Outra / Aedes aegypti é a espécie de mosquito emergente em áreas urbanas com maior impacto na saúde pública, sendo o principal vetor dos arbovírus dengue, Zika e chikungunya. Por esse motivo, se faz indispensável a compreensão de mecanismos moleculares associados a processos fisiológicos em A. aegypti, como resposta imune, comportamento e homeostase intestinal. Conforme observado em outros organismos, a via PI3K/AKT tem papéis importantes no metabolismo, na reprodução, na tolerância ao estresse e na imunidade. A quinase AKT atua como um regulador negativo da via PI3K/AKT, fosforilando o fator de transcrição FOXO e impedindo sua translocação nuclear. Nosso objetivo foi avaliar o perfil transcricional em A. aegypti com o gene akt silenciado e avaliar as consequências deste silenciamento sobre a microbiota bacteriana. Além disso, investigamos uma provável ativação mitocondrial quando do silenciamento de akt. Mostramos que o silenciamento de akt resultou na ativação de genes essenciais para a manutenção da homeostase intestinal do mosquito, como peptídeos antimicrobianos (AMPs) e genes codificadores de enzimas associadas à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Notavelmente, observou-se uma forte repressão de 11 profenoloxidases (PPOs), além de uma potente indução de genes codificadores de subunidades da enzima NADH desidrogenase, em comparação com o respectivo grupo controle, sugerindo que tal indução esteja associada a um provável aumento da atividade mitocondrial. No contexto comportamental, o transcriptoma de A. aegypti com o gene akt silenciado revelou a modulação de 5 odorant binding proteins (OBPs), das quais todas foram reprimidas no quarto dia após o silenciamento de akt. Além das OBPs, identificamos duas long wavelengh sensitive opsins, ambas reprimidas após dois e quatro dias. Interessantemente, observamos que, dos 345 genes modulados, a grande maioria foi regulada negativamente. O silenciamento de akt, além de modular a carga da microbiota bacteriana de A. aegypti, também modulou táxons específicos após quatro dias de silenciamento, como as Classes Gammaproteobacteria e Betaproteobacteria. Nosso conjunto de dados coloca a via PI3K/AKT no cerce de importantes processos fisiológicos, contribuindo para elucidar mecanismos moleculares até então pouco compreendidos do mosquito. / Aedes aegypti is the emerging mosquito species in urban areas with the greatest impact on public health, being the main vector of arboviruses dengue, Zika and chikungunya. For this reason, it is essential to understand the molecular mechanisms associated with physiological processes in A. aegypti, such as immune response, behavior and intestinal homeostasis. As observed in other organisms, the PI3K / AKT pathway has important roles in metabolism, reproduction, stress tolerance and immunity. AKT kinase acts as a negative regulator of the PI3K / AKT pathway, phosphorylating the FOXO transcription factor and preventing its nuclear translocation. Our objective was to evaluate the transcriptional profile in A. aegypti with the silenced akt gene and to evaluate the consequences of this silencing on the bacterial microbiota. In addition, we investigated a possible mitochondrial activation during the akt silencing. We have shown that akt silencing resulted in the activation of essential genes for the maintenance of mosquito intestinal homeostasis, such as antimicrobial peptides (AMPs) and genes encoding enzymes associated with the production of reactive oxygen species (ROS). Notably, a strong repression of 11 profenoloxidases (PPOs) was observed, as well as a potent induction of genes encoding subunits of the NADH dehydrogenase enzyme, in comparison with the respective control group, suggesting that such induction is associated with a possible increase in mitochondrial activity. In the behavioral context, the A. aegypti transcriptome with the mutated akt gene revealed the modulation of 5 odorant binding proteins (OBPs), all of which were repressed on the fourth day after akt silencing. In addition to the OBPs, we identified two long wavelengh sensitive opsins, both repressed after two and four days. Interestingly, we observed that of the 345 modulated genes, most were down-regulated. The silencing of akt, besides modulating the bacterial microbiota load of A. aegypti, also modulated specific taxa after four days of silencing, such as the Gammaproteobacteria and Betaproteobacteria classes. Our data set puts the PI3K / AKT pathway in the vicinity of important physiological processes, contributing to elucidate the mosquito's poorly understood molecular mechanisms.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) à uma planta nativa do Brasil com grande valor comercial. Isso contribui com a geraÃÃo de milhares de empregos diretos e indiretos, especialmente na RegiÃo Nordeste, em Ãpoca de estiagem. Programas de melhoramento genÃtico vem selecionando cultivares de cajueiro melhores adaptados ao ambiente semiÃrido a fim de colocÃ-lo em um mercado cada vez mais competitivo. A busca por marcadores microssatÃlites pode auxiliar os programas de melhoramento no que diz respeito ao acesso à diversidade genÃtica da espÃcie. O presente trabalho tem como objetivo a identificaÃÃo de marcadores SSR em cajueiro com base no transcriptoma de sementes e folhas, bem como sua validaÃÃo por PCR em diferentes genÃtipos comerciais. Utilizando ferramentas de bioinformÃtica foram encontrados motivos SSRs do tipo di- tri- tetra- penta- e hexanucleotÃdeos, onde o motivo do tipo trinucleotÃdeo foi o mais representativo nos transcritos do cajueiro anÃo CCP 76 e comum variando de 60 a 65%, respectivamente. Os transcritos de cajueiro comum e anÃo CCP 76 compartilham um total de 298 marcadores SSR, destes, 29 foram escolhidos para amplificaÃÃo por PCR, os quais 9 mostraram polimorfismo nos genÃtipos testados. As sequÃncias situadas prÃximas aos marcadores SSR codificam proteÃnas, que em sua maioria pertencem a famÃlias gÃnicas. Pode-se concluir que foram encontrados regiÃes contendo marcadores SSRs na regiÃo transcrita de nove genÃtipos de cajueiro, podendo ser uma ferramenta Ãtil nas anÃlises genÃticas e abrindo perspectivas para o papel endÃgeno dos SSRs na funÃÃo proteica. / The cashew tree is a native plant from Brazil with high market value. This contributes to the generation of thousands direct and indirect jobs, especially in the Northeast region, during dry season. Breeding programs have been selecting cashew cultivars that best adapt to semi-arid environment in order to fit it in the increasingly competitive market. The search for microsatellite markers can assist breeding programs regarding to access to genetic diversity of the species. This study aims to identify SSR markers in the cashew tree based on seeds and leaves transcriptome, as well as assess its validation by PCR technique in different commercial genotypes. Using bioinformatics tools, SSRs motifs from types di- tri- tetra- penta- and hexanucleotides were found. Trinucleotide-type motif was the most representative in transcripts both from dwarf cashew CCP 76 and common cashew, ranging from 60 to 65%, respectively. Transcripts from common cashew and dwarf cashew CCP 76 share a total of 298 SSR markers. 29 of these were selected for amplification by PCR, in which 9 showed polymorphism in genotypes tested. The sequences located near to the SSR markers encode proteins, which mostly belong to gene families. It can be concluded that regions containing SSRs markers were found in the transcribed region of nine cashew genotypes, and can be a useful tool in genetic analysis and open up prospects for endogenous role of SSRs in protein function.

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alessandra Alves de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T04:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coqueiro_DanilaSouzaOliveira_D.pdf: 3034667 bytes, checksum: 7ce135c75da10c6b26032ec285344dc5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Avaliou-se as alterações transcricionais em laranja 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.) promovidas por quitosana (CHI) e ácido salicílico (SA), utilizando RNA-seq, e o efeito destes compostos no controle do cancro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri) e da clorose variegada dos citros (CVC - Xylella fastidiosa). As plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, foram coletadas amostras foliares para avaliar seus transcriptomas. Para a avaliação dos eliciadores sobre o cancro cítrico e a CVC, as plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, inoculadas com as duas bactérias separadamente. A partir de 24h da inoculação, foram coletadas amostras foliares para avaliar a curva de crescimento de ambas as bactérias, a redução da severidade e/ou incidência das doenças e respostas de defesa da planta por RT-qPCR. Com os resultados do transcriptoma, observou-se que mais genes foram induzidos pelo tratamento com SA do que com CHI. O tratamento com SA aumentou a expressão de genes que participam da via de sinalização do SA na planta (WRKY50, PR2 e PR-9) e genes da biossíntese do etileno e ácido jasmônico (ACS 12, fator de transcrição contendo domínio AP2 e OPR3). Além disso, promoveu a indução de genes relacionados ao metabolismo secundário, processos redox e estresse biótico. No tratamento com CHI, foi observada maior indução de genes relacionados ao metabolismo secundário. Para ambos os tratamentos, a via da auxina foi reprimida. No experimento para controle do cancro cítrico, observou-se que ambos os eliciadores promoveram reduções na severidade e incidência da doença. Entretanto, a CHI pareceu não interferir diretamente na formação do biofilme pela bactéria, mas pode ter dificultado a multiplicação de X. citri na planta. O SA retardou a entrada da bactéria na planta e, aparentemente, inibiu mais a formação do biofilme bacteriano do que a CHI. Comparações da expressão gênica entre os eliciadores reforçam a ideia de que a CHI tem maior potencial de induzir resistência ao cancro cítrico do que SA. No experimento para o controle da CVC, observou-se que a CHI induziu importantes genes da via do SA (NPR1, TGA, EDS1) e etileno (EIN-3, PR-4) 24h após a inoculação. Aplicações exógenas de SA potencializaram o seu efeito endógeno na planta, pois houve indução de NPR1, TGA e PRs. Entretanto, não foi possível estabelecer uma relação clara entre a multiplicação de X. fastidiosa, a incidência da doença e o uso da CHI e SA em laranja 'Pera', já que na maioria das avaliações não houve redução da população bacteriana em amostras foliares e não houve redução da incidência em plantas tratadas. Com base nos resultados, observou-se que CHI e SA induziram diversos genes envolvidos em respostas de defesa em laranja 'Pera'. Entretanto, essas respostas podem ser moduladas diferencialmente a depender do patógeno que afeta a planta, pois os eliciadores foram eficientes no controle da X. citri, um patógeno que coloniza o mesófilo da planta, entretanto não foram efetivos no controle da X. fastidiosa, um patógeno que coloniza o xilema da planta, embora respostas de defesa tenham sido expressas nos momentos iniciais (24h) após a inoculação com X. fastidiosa / Abstract: This study was carried out to evaluate transcriptional modification in sweet orange 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.), promoted by chitosan (CHI) and salicylic acid (SA), using RNA-seq, and the effect of these compounds on citrus canker (Xanthomonas citri subsp. citri) and citrus variegated chlorosis (CVC - Xylella fastidiosa). Plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, leaf samples were collected to assess the transcriptome. In the experiments for disease assessment, the plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, inoculated. Starting from 24h after inoculation, leaf samples were collected to evaluate the multiplication of the pathogens (X. citri and X. fastidiosa), reduction of the severity and / or incidence and plant defense responses by RT-qPCR. Based upon the transcriptome results, it was observed that more genes were induced by SA than by CHI. SA treatment increased the expression of genes that participate in the SA signaling pathway in the plant (WRKY50, PR2 and-PR9), and genes involved in the biosynthesis of ethylene and jasmonic acid (ACS 12, transcription factor containing AP2 and OPR3 domain). Besides these, SA promoted induction of genes of secondary metabolism, redox processes and biotic stress. The treatment with CHI exhibited higher induction of genes related to secondary metabolism. For both treatments, the auxin pathway was suppressed. In the experiment for the control of citrus canker, it was observed that both elicitors reduced the severity and incidence of the disease. However, CHI seems not to interfere directly in biofilm formation, but may have hindered the multiplication of X. citri in the plant. The SA slowed down the entry of the bacteria into the plant and, apparently, inhibited the formation of biofilm more efficiently than the CHI. Comparisons of gene expression between elicitors reinforce the idea that CHI has higher potential to induce resistance to citrus canker than SA. In the experiment for the control of CVC, it was observed that the CHI induced important genes of the SA (NPR1, TGA, EDS1) and ethylene (EIN-3, PR-4) pathways 24h after inoculation. Exogenous applications of SA potentiated its endogenous effect in the plant, since there was induction of EDS-1, NPR1, TGA and PRs. However, it was not possible to establish a clear relationship between the multiplication of X. fastidiosa, the incidence of the disease and the use of CHI and SA in 'Pera' sweet orange, since most of the assessments did not show reduction of bacterial populations in leaf samples and there was no reduction of the incidence in treated plants. Based upon the results of this study, it was observed that CHI and SA induced several genes involved in defense responses in 'Pera' sweet orange. However, these responses can be modulated differentially depending on the pathogen that affects the plant. This fact was demonstrated in this study, as elicitors were effective in controlling X. citri, a pathogen that colonizes the mesophyll of the plant, but were not effective in controlling X. fastidiosa, a pathogen that colonizes the xylem of the plant, although defense responses were expressed in the early stages (24 h) after inoculation with X. fastidiosa / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Diversos estudos elucidaram mecanismos envolvidos com a organogênese in vitro, porém pouco é conhecido a respeito da fase de aquisição de competência, fundamental para que a regeneração ocorra. Alguns genes já foram identificados por interferirem na fase de aquisição de competência em tomateiro (Solanum lycopersicum), mas ainda existem diversas lacunas a serem esclarecidas. Para investigar a expressão de genes e o controle hormonal na fase de aquisição de competência, foram utilizados os mutantes de tomateiro, sob o background genético da cultivar Micro-Tom (MT), MT-Rg1 e MT-pro (procera), os quais afetam positiva ou negativamente a organogênese in vitro, respectivamente. Embora a resposta constitutiva a giberelina no mutante MT-pro seja conhecida, a identidade molecular do gene RG1 permanece indefinida. O mutante MT-Rg1 apresenta aumento tanto na formação de gemas caulinares quanto de raízes e reduz o tempo necessário para a indução desses órgãos, devido à diminuição do período para a aquisição de competência. A partir do estabelecimento das fases de aquisição de competência e indução da organogênese in vitro para MT e MT-Rg1, foram identificados genes diferencialmente expressos entre estes genótipos. Entre estes genes, CELL DIVISION CYCLE ASSOCIATED 7 e LACCASE 1A estão regulados positivamente em MT-Rg1 e todos estão fortemente relacionados à fase de aquisição de competência, e a alterações na proliferação de células do protoxilema durante o início da organogênese. Por outro lado, a resposta constitutiva à giberelina no mutante MT-pro reduz a formação de gemas caulinares e raízes e aumenta a formação de calos in vitro, sem afetar o tempo requerido para a indução de gemas caulinares e raízes. De forma oposta a MT-Rg1, o gene CDCA7 apresenta expressão reduzida durante a fase de aquisição de competência em MT-pro, diminuindo o número de células do protoxilema em divisão. Outro fator importante para a divisão celular no mutante MT-pro é o aumento da expressão do gene WUS, causando um aumento da proliferação das stem cells, que são células indiferenciadas relacionadas à formação de novos órgãos. Esta proliferação celular inadequada, somada a uma alteração desfavorável na homeostase das citocininas, justifica o efeito negativo do alelo pro na formação de gemas caulinares, o que permitiu a criação de um novo modelo para organogênese in vitro / Several studies have enabled the discovery of mechanisms to achieve in vitro organogenesis; however, little is known about the phase of acquisition of competence, essential for regeneration. A few genes have been identified to interfere in the acquisition of the competence phase in tomato (Solanum lycopersicum), but there are still many gaps to be filled. We have used the mutants, under the genetic background of the Micro-Tom cultivar, MT-Rg1 and MT-pro (procera), which positively or negatively affect in vitro organogenesis, respectively, to investigate gene expression and the hormonal control in the phase of acquisition of competence. Despite the fact that the constitutive gibberellin response in the procera mutant is well-established, the molecular identity of RG1 gene remains unknown. The MT-Rg1 mutant presents an increase in the formation of both shoot and roots and a reduced period for the induction of these organs, because of the reduced time required for acquisition of competence.We searched for the identity of differentially expressed genes between MT and MT-Rg1 after the establishment of the competence acquisition phase and organogenesis induction stages. Among those genes, CDCA7 and LAC1A are upregulated in MT-Rg1 and these genes appear to be strongly related with the acquisition of competence phase and changes in proliferation of protoxylem cells during early organogenesis. The constitutive response to gibberellin in the MT-pro mutant decreases the formation of shoot and roots and increase in vitro calli formation, without reducing the induction phase of shoots and roots. Unlike MT-Rg1, MT-pro reduces the CDCA7L expression during the acquisition of competence phase, causing a reduction of the protoxylem dividing cells. Another important factor for cell division in MT-pro mutant is the increased expression of the WUS gene, leading to an abnormal proliferation of stem cells. Thereby, this abnormal cell proliferation, in addition to an unfavorable change in the cytokinin homeostasis, justify the negative effect of the pro allele in the shoot formation, which enabled the proposal of a new model for in vitro organogenesis

Echinococcus granulosus é um parasito cestódeo e o agente etiológico da hidatidose cística. O desenvolvimento dos vermes adultos a partir dos protoscoleces é, provavelmente, desencadeada por diferentes estímulos que são impostos pelos hospedeiros, os quais provocam mudanças moleculares e morfológicas no parasito. No entanto, os mecanismos responsáveis por essas variações não estão totalmente esclarecidos. Para encontrar genes e proteínas possivelmente envolvidos com as alterações fenotípicas observadas durante o desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, relatamos aqui o perfil transcritômico e a detecção de proteínas recémsintetizadas após a indução in vitro de protoescólices ao desenvolvimento estrobilar. Os protoescólices foram tratados com pepsina e mantidos em meio bifásico contendo taurocolato para induzir ao desenvolvimento estrobilar. Azidohomoalanina, aminoácido análogo de metionina, foi adicionado para a incorporação metabólica nas proteínas recém-sintetizadas, que foram visualizadas por microscopia confocal e identificadas por espectrometria de massas Paralelamente, o RNA total foi isolado utilizando o reagente TRIzol e as bibliotecas geradas foram sequenciadas na plataforma Illumina MiSeq. Nós identificamos 23 proteínas detectadas exclusivamente na presença de estímulos para o desenvolvimento estrobilar (SSD) e 28 na ausência desses estímulos (NSD). Também encontramos 75 proteínas diferencialmente expressas entre as duas condições (34 em SSD e 41 em NSD). Na análise dos dados de RNAseq, 818 genes foram identificados como diferencialmente expressos pelo software GFOLD. De forma geral, genes e proteínas com funções moleculares de transdução de sinal, metabolismo e modificações de proteínas foram observadas com a progressão do desenvolvimento estrobilar. Assim, este estudo fornece informações sobre genes e proteínas que podem ter um papel chave para o desenvolvimento do parasito, além de serem alvo de estudos futuros. / Echinococcus granulosus is a cestode parasite and the etiological agent of the cystic hydatid disease. The development of the adult worms from protoscoleces is probably triggered by different stimuli imposed by the hosts, which lead to molecular and morphological changes. However, the mechanisms underlying these variations remain largely unclear. In order to find genes and proteins possibly involved with the phenotypic changes during the strobilar development, we reported here the transcriptomic profile and the detection of newly synthesized proteins after protoscoleces in vitro induction to strobilar development. Protoscoleces were treated with pepsin and maintained in biphasic medium containing taurocholate to induce the strobilar development. The methionine analogue azidohomoalanine was added for metabolic incorporation in the newly synthesized proteins that were visualized by confocal microscopy and identified by mass spectrometry.In parallel, total RNA from parasite material was isolated using TRIzol reagent and the generated libraries were sequenced on Illumina MiSeq platform. We identified 23 proteins present only after stimuli for strobilar development (SSD) and 28 in absence of these stimuli (NSD). We also found 75 differentially expressed proteins (34 SSD and 41 NSD). In the RNA-seq analysis, 818 differentially expressed genes were identified by the GFOLD software. Gene transcripts and proteins with molecular functions of signal transduction, metabolism and protein modifications were observed with progression of development. This study provides insights on searching for the key genes and proteins that may be important for the correct parasite development and be target for further studies.

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Resumo: O Aedes aegypti é o mosquito mais sinantrópico e antropofílico da família Culicidae. Esta espécie sempre coabita com os seres humanos e é extremamente oportunista. A dispersão vetorial está diretamente relacionada à capacidade das fêmeas de encontrar um parceiro com sucesso em um cenário urbano geralmente irregular. No presente trabalho, investigamos alterações transcricionais em fêmeas de Ae. aegypti durante o processo de cortejo e após o acasalamento. Observamos uma alteração substancial na expressão gênica desencadeada logo após o contato com machos de Ae. aegypti, que por sua vez não estavam totalmente correlacionados com as alterações desencadeadas pelo contato. Após analisar genes compartilhados significativamente e diferencialmente regulados entre contato específico e inseminação, a maior parte da mudança transcriptômica observada desencadeada por contato é revertida após o acasalamento, indicando uma situação intermediária entre as condições virgens e de cortejo que supomos ser crucial para o sucesso do acasalamento. Após o contato, vários genes quimiossensoriais relacionados são reprimidos, especialmente proteínas de ligação a odorante. A maioria desses genes retorna a taxas de expressão mais altas após o acasalamento. Nenhum desses genes é significativamente regulado pelo encontro de uma espécie diferente, em nosso estudo, Aedes albopictus. Os resultados apresentados aqui podem ser aplicados a uma abordagem inovadora de controle, focada nos sistemas semioquímicos de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aedes aegypti is the most synanthropic and anthropophilic mosquito of Culicidae. This species always cohabits with humans and is extremely opportunistic. Vector dispersal is directly related to the ability of the females on successfully finding a mate in a generally patchy urban scenario. In the present work, we investigate transcriptional changes in Ae. aegypti females during the courtship process and after mating. We observe a substantial alteration in gene expression triggered just upon contact with Ae. aegypti males, which in turn was not fully correlated to the changes triggered by the contact. After analysing shared significant differentially regulated genes between conspecific contact and insemination, the major part of the observed transcriptomic change triggered by contact is reversed after mating, indicating an intermediary situation between naive and mating conditions that we hypothesize to be crucial for mating success. Upon contact, several chemosensory related genes are repressed, especially odorant binding proteins. Most of these genes return to higher expression rates after mating. None of these genes are significantly regulated by the encounter of a different species, Aedes albopictus. The results presented here might be applied to an innovative control approach focusing on the semiochemical systems of mosquitoes in an effort to disrupt undesirable host–insect interaction to reduce the risk of pathogen transmission to humans. / Mestre

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-27T18:14:58Z No. of bitstreams: 1 Raphael_Tavares_da_Silva_BCS_Dissertacao_Aprovada_Definitiva.pdf: 4336076 bytes, checksum: f1085dad138bd375d802492afe1782ff (MD5) / Approved for entry into archive by Priscila Nascimento(pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-03-27T18:24:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Raphael_Tavares_da_Silva_BCS_Dissertacao_Aprovada_Definitiva.pdf: 4336076 bytes, checksum: f1085dad138bd375d802492afe1782ff (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-27T18:24:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raphael_Tavares_da_Silva_BCS_Dissertacao_Aprovada_Definitiva.pdf: 4336076 bytes, checksum: f1085dad138bd375d802492afe1782ff (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Um dos mecanismos capaz de aumentar a diversidade do proteoma de eucariotos é o splicing alternativo nos pré-mRNAs. Este mecanismo celular ocorre durante a transcrição dos genes, sendo ocasionado por um ou mais dos seguintes eventos: retenção de íntrons, uso alternativo de sítio de splice 5', uso alternativo de sítio de splice 3' e uso alternativo de éxons. Análises recentes de Bioinformática utilizando experimentos de RNA-Seq mostram que aproximadamente 90% dos genes humanos produzem mais de um transcrito decorrente de eventos de splicing alternativo. O impacto do splicing alternativo no proteoma humano vem sendo alvo de algumas abordagens de Bioinformática, sendo esperado que uma grande porção de tais transcritos alternativos possa alterar o conteúdo da cadeia polipeptídica obtida após a sua tradução. Devido à sua importância, diversos trabalhos já foram desenvolvidos com o objetivo de facilitar a identificação de eventos de splicing alternativo a partir de dados provenientes de cDNA, bem como sua associação com a estrutura das proteínas de suas isoformas. Entretanto, são poucas as abordagens que realizaram a tradução in silico do transcriptoma humano na busca por variantes de splicing e a utilização de dados oriundos de sequenciadores de segunda geração (NGS) ainda é muito pouco explorada para tratar do tema. Desta maneira, o presente projeto tem como objetivo a aplicação de uma nova abordagem para a identificação e tradução de variantes de splicing alternativo usando dados de NGS. Foram utilizadas leituras da plataforma de sequenciamento Roche/454 oriundas de estudos de câncer para um enriquecimento de nosso banco de dados original que continha previamente mRNAs completos e ESTs. Após o enriquecimento, a metodologia empregada pelo nosso grupo conseguiu detectar 4.574 variantes de splicing inéditas em nosso banco. O novo banco gerado foi traduzido levando a criação de um repertório proteico contendo 159.638 sequências polipeptídicas não redundantes. Na busca por variantes inéditas utilizando dados de proteômica, foram identificadas três possíveis nos genes humanos tubulina 2b, tubulina 4b e actina. Dados de sequenciamento da plataforma Illumina também foram utilizados para uma avaliação da sua contribuição em número de variantes e sequências polipeptídicas traduzidas em nosso repertório. Encontramos que a nossa abordagem foi capaz de anotar 53% mais sequências polipeptídicas quando comparada ao repertório de ENSEMBL Gene. Desta forma, acreditamos que o presente projeto pode auxiliar no melhoramento da anotação de peptídeos encontrados por técnicas de proteômica, bem como no descobrimento de novos marcadores moleculares. / Alternative splicing of pre-mRNAs is one of the mechanisms capable to increase the proteome diversity in eukaryotes. This cellular mechanism occurs during the transcription of genes and is associated with one or more of the following events: intron retention, 5’ alternative splice, 3’ alternative splice and exon skipping. Recent Bioinformatics analysis using RNA-Seq experiments showed that approximately 90% of human genes produce more than one transcript due to alternative splicing events. The impact of alternative splicing in the human proteome has been the focus of some Bioinformatics approaches and is expected that the majority part of these alternative transcripts can alter the polypeptide chain produced after its translation. Due to its importance, many studies have been developed focused on facilitating the identification of alternative splicing events based on cDNA data, as well as to study the protein structure of its isoforms. However, few studies performed the in silico translation of the human transcriptome to search for new splicing isoforms using Next Generation Sequencing (NGS) data. In this way, our project aims to the development of a new approach to identify and translate alternative splicing isoforms using NGS data. Roche/454 reads of cancer studies were used to enrich our initial database, which was previously populated with full-length mRNAs and ESTs data. After the enrichment step, the methodology developed by our group could detect 4,574 new splicing variants in our database. The enriched database was translated, producing a protein repository with 159,638 non-redundant polypeptide sequences. Searching for new isoforms using experimental proteomic data, three possible new isoforms were identified for the human genes tubulin 2b, tubulin 4b and actin. Illumina sequencing data was used to assess its contribution for the number of new isoforms and the translated polypeptide sequences on our database. We realized that our approach was capable to annotate 53% more polypeptide sequences when compared with the ENSEMBL Gene repository. In this way, we believe that our project can support the improvement of peptide annotation found by proteomic techniques, as well as to discover new molecular markers.

Orientador: Lucia Galvão de Albuquerque / Coorientador: Daniele Fernanda Jovino Gimenez / Banca: Maurício de Alvarenga Mudadu / Banca: Luciana Correia de Almeida Regitano / Banca: Henrique Nunes de Oliveira / Banca: Rogério Abdallah Curi / Resumo: Mais de 80% da carne bovina brasileira é proveniente de animais de origem zebuína. Este produto é considerado de baixa maciez e reduzido teor de gordura entremeada quando comparado à carne de animais de raças taurinas. Investir na melhoria das características organolépticas como marmoreio e maciez da carne torna-se importante do ponto de vista econômico, pois tratam-se de atributos muito apreciados pelo consumidor. A maciez pode ser medida por meio de análises sensoriais, índice de fragmentação miofibrilar ou força de cisalhamento. Nesse último, um aparelho é utilizado para medir a força necessária para o cisalhamento de uma seção transversal de carne e, quanto maior a força dispensada, menor é a maciez apresentada pelo corte de carne. Outra característica relacionada à qualidade da carne é o marmoreio, que pode ser analisada por meio de escala de graduação visual denominada Quality Grade. No entanto, estas metodologias só podem ser utilizadas após o abate do animal. As técnicas de análise do transcriptoma, como o RNA-Seq, permitem a identificação de genes cuja expressão está relacionada com o controle de características quantitativas e podem ser alternativas na busca pelo melhoramento destes atributos. Com isso, o objetivo deste trabalho foi identificar genes diferencialmente expressos utilizando a técnica RNA-Seq, em tecido muscular de bovinos da raça Nelore, visando contribuir para o conhecimento dos fatores genéticos que estão relacionados com a qualidade da carne. Para i... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: More than 80% of Brazilian beef comes from zebu animals. The Zebu meat show reduced marbling and is considered harder when compared to Taurine meat. The improvement of the organoleptic traits like marbling and meat tenderness is important from an economic point of view, because these attributes are highly appreciated by the consumer. The meat tenderness can be measured by sensory analysis, myofibril fragmentation index or by shear force. This method use an apparatus which measure the force required to shear a cross section of meat. The higher the strength dispensed, lower is the tenderness showed by the cut of meat. Another trait related to meat quality is marbling, which can be analyzed by Quality Grade visual graduation scale. However, these methods can only be performed after the animal was killed. The transcriptome analysis techniques, as RNA-Seq, are able to identify genes whose expression are related to quantitative traits control and can be used as alternative to help the improvement of these traits. Thus, the aim of this study was to identify differentially expressed genes using RNA-Seq, in Nelore cattle muscular tissue, to contribute to the knowledge of the genetic factors that are related to meat quality. We sequenced the mRNA of 40 samples divergently ranked to meat tenderness (20 with hard meat and 20 with tender meat) and sequenced the mRNA of 40 samples divergently ranked to marbling (20 with high and 20 with low marbling). These samples were chosen based on she... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor