O presente estudo objetivou identificar as interações do Algodão Bt que expressa Cry1Ac (Bollgard®), com o predador Podisus nigrispinus Dallas (Hemiptera: Pentatomidae), no manejo da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) a lambda-cyhalothrin em duas condições: ausência e presença do inseticida imidacloprid. Foram utilizadas lagartas de S. frugiperda provenientes das seguintes condições: linhagens resistentes (1) e suscetíveis (2) a lambda-cyhalothrin alimentadas de folhas de algodoeiro Bollgard® (DP 404 BG); e linhagens resistentes (3) e suscetíveis (4) a lambda-cyhalothrin alimentadas de folhas de algodoeiro não transgênico (cultivar DP4049). Os resultados dessa pesquisa revelaram que na ausência de imidacloprid, independente do tratamento, o comportamento de predação foi melhor representado pelo tipo III de resposta funcional, pois a taxa de ataque aumentou linearmente em todas as condições estudadas (a= bN). Houve diferenças entre o tempo de manipulação (Th) de fêmeas do predador que receberam lagartas suscetíveis a lambda-cyhalothrin, previamente alimentadas de algodão não transgênico, em relação aos demais tratamentos. Na densidade de 16 lagartas/predador, o número de lagartas predadas por fêmeas de P. nigrispinus foi significativamente superior em lagartas resistentes a lambda-cyhalothrin, alimentadas de algodão Bt ou não Bt, em relação às lagartas suscetíveis alimentadas de algodão não Bt. Além do mais, se constatou que quando foram ofertadas 16 lagartas de S. frugiperda ao predador, o número de indivíduos predados foi significativamente inferior em lagartas suscetíveis a lambda-cyhalothrin que foram alimentadas de algodão não Bt, em relação as que receberam lagartas previamente alimentadas de algodão Bt. Na presença de imidacloprid, constatou-se que o comportamento de predação de P. nigrispinus foi afetado pelo neonicotinóide imidacloprid, sendo a curva assintótica do tipo II, a que melhor descreveu os dados da sua resposta funcional. Na presença de imadacloprid, o tempo de manipulação (Th) de fêmeas do predador não diferiu entre os tratamentos estudados. Todavia, a taxa de ataque foi representada por um decréscimo em função do aumento da densidade de lagartas ofertadas. Independente do tratamento (linhagem de S. frugiperda ou cultivar de algodão), o número de lagartas de S. frugiperda predadas por fêmeas de P. nigrispinus quando na exposição ao imidacloprid, foi significativamente inferior, especialmente na densidade de 16 lagartas/predador. Diante destes resultados, a pesquisa reforça que o custo adaptativo associado à resistência a lambda-cyhalothrin, assim como a cultivar de algodão Bt afetaram a taxa de predação de lagartas de S. frugiperda por fêmeas de P. nigrispinus, somente na maior densidade testada (16 lagartas/predador). O comportamento de predação de lagartas de S. frugiperda por fêmeas de P. nigrispinus foi negativamente afetado pelo inseticida imidacloprid. / This study aimed to identify the interactions of Bt cotton expressing Cry1Ac (Bollgard®), with the predator Podisus nigrispinus Dallas (Hemiptera: Pentatomidae), in resistance management of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) to lambda-cyhalothrin in two conditions: absence and presence of the insecticide imidacloprid. Larvae of S. frugiperda were used from the following conditions: resistant (1) and susceptible (2) strains to lambda-cyhalothrin fed Bollgard® cotton leaves (DP 404 BG); and resistant (3) and susceptible (4) strains to lambda-cyhalothrin fed non-transgenic cotton leaves (cultivar DP4049). The results of this study revealed that in the absence of imidacloprid, independent of treatment, the behavior of predation was best represented by the type III of functional response, because the attack rate increased linearly in all conditions studied (a = bN). There were differences between the handling time (Th) of females of the predator who received larvae of S. frugiperda susceptible to insecticides previously fed non-transgenic cotton in relation to other treatments. The density of 16 larvae/predator, the number of larvae preyed by female of P. nigrispinus was significantly higher in larvae of S. frugiperda resistant to lambda-cyhalothrin, fed on Bt cotton or non-Bt compared to susceptible larvae fed non Bt cotton. Moreover, when we offered 16 larvae of S. frugiperda to the predator, the number of larvae predate were significantly lower in larvae susceptible to lambda-cyhalothrin that were fed non-Bt cotton, compared to larvae that were previously fed on transgenic cotton. In the presence of imidacloprid, the predatory behavior of P. nigrispinus was affected by the neonicotinoid imidacloprid, and the asymptotic curve type II was the one that best described the data of the functional response. In the presence of imadacloprid, handling time (Th) of females of the predator did not differ among treatments. However, the attack rate was represented by a decrease due to the increase of the density of larvae offered. Regardless of the treatment (strain of S. frugiperda or cultivar of cotton), the predation larvae of S. frugiperda by females of P. nigrispinus when exposed to imidacloprid was significantly lower, especially at density of 16 larvae/predator. Given these results, the research reinforces the fitness cost associated to lambda-cyhalothrin resistance as well as Bt cotton affected the rate of predation on larvae of S. frugiperda by females of P. nigrispinus, only at the highest density tested (16 larvae/predator). The behavior of predation on larvae of S. frugiperda by females of P. nigrispinus was affected by insecticide imidacloprid.

No Brasil, doenças causadas pelo Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) e Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) reduzem a produção e a qualidade dos frutos de abobrinha-de-moita (Cucurbita pepo) e melancia (Citrullus lanatus), assim como em outras cucurbitáceas. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de abobrinha-de-moita e melancia resistentes ao PRSV-W e ao ZYMV. Um sistema eficiente de regeneração in vitro é necessário para a obtenção de plantas transgênicas. O sistema de organogênese in vitro de abobrinha-de-moita foi desenvolvido utilizando como explantes a região basal do cotilédone e um segmento do hipocótilo obtidos a partir de sementes germinadas in vitro. Os explantes foram cultivados em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com diferentes concentrações de BAP (benzilaminopurina). A indução de gemas adventícias foi mais eficiente nas concentrações de 1,0 e 1,25 mg/L de BAP. Este protocolo foi usado para regenerar plantas em experimentos de transformação genética de abobrinha-de-moita cv. Caserta e melancia cv. Crimson Sweet, via Agrobacterium tumefaciens. O vetor binário pCAMBIA2201, contendo fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e do PRSV-W, numa construção gênica do tipo hairpin e o gene de seleção nptII, sob controle do promotor 35S, foi usado nos experimentos de transformação genética. Após 2 dias de co-cultivo, em meio de cultura MS, suplementado com BAP (1 mg/L), os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção, suplementado com BAP (1 mg/L), timentin (400 mg/L) e canamicina (100 mg/L) e cultivados por 3 a 4 semanas, sob fotoperíodo de 16 horas de luz. Plantas regeneradas foram analisadas por PCR, usando primers específicos para detecção dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do PRSV-W e ZYMV. Foram utilizados 1050 explantes de abobrinha-de-moita e de 973 explantes de melancia, resultando em 36 e 59 plantas PCR positivas, respectivamente. A eficiência de transformação foi de 3,4% para abobrinha-de-moita e 6,1% para melancia. Plantas PCR positivas foram aclimatizadas, gradualmente, em sala de luz e transferidas para casa-de-vegetação. Pela análise de Southern blot foi confirmada a integração dos fragmentos dos genes da proteína capsidial do ZYMV e PRSV-W em 3 plantas de abobrinha-de-moita. Depois de desenvolvidas, flores femininas foram polinizadas manualmente e sementes foram coletadas de frutos maduros. Plantas R1 de abobrinha-de-moita e melancia foram inoculadas com o PRSV-W e o ZYMV por meio de Myzus nicotianae virulíferos. Não foram identificadas, até o momento, plantas resistentes aos patógenos em estudo / Diseases caused by the potyviruses Papaya ringspot virus - type Watermelon (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) significantly reduce the yield and fruit quality of zucchini squash (Cucurbita pepo), watermelon (Citrullus lanatus), as well as other cucurbit crops in Brazil. The purpose of this work was to obtain zucchini squash and watermelon transgenic plants resistant to PRSV-W and ZYMV. An efficient in vitro regeneration system which can be associated with the protocol is necessary to obtain transgenic plants. In vitro organogenesis system was successfully developed using comprised of distal region of hypocotyl and the base of cotyledon of a germinated seed. The explants were cultured in MS medium (MURASHIGE; SKOOG, 1962), supplemented with different concentraction of BAP (benzylaminopurine). The induction of adventitious buds was more efficient at concentrations of 1.0 and 1.25 mg.L-1 BAP. This protocol was used to regenerate plants from genetic transformation experiments with zucchini squash cv. Caserta and watermelon cv. Crimson Sweet via Agrobacterium tumefaciens. For transformation, the binary vector pCAMBIA 2201, containing sequences of the coat protein coding regions of ZYMV and PRSV-W in a hairpin construct and the nptII gene, driven by 35S promoter was used. After 2 days of co-culture in MS medium supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), explants were transferred to the MS selection culture medium, supplemented with BAP (1.0 mg.L-1), timentin (400 mg.L-1) and kanamycin (100 mg.L-1), and incubated for 3 to 4 weeks at 27 oC, under 16 h photoperiod. Regenerated plants were analyzed by PCR, using specific pairs of primers for the detection of the coat protein gene segments of PRSV-W and ZYMV. A total of 1,050 zucchini squash and 973 watermelon explants were used in the transformation experiments, resulting in 36 and 59 PCR positive plants, respectively. The genetic transformation efficiency was 3.4% for zucchini squash and 6.1% for watermelon. The PCR positive plants were slowly acclimatized in the culture room and transferred to the greenhouse for further growth. Southern blot analysis confirmed the genome integration of the the ZYMV and PRSV-W coat protein gene fragments in three zucchini squash plants which survived the acclimatization step. Later in development, female flowers were were manually pollinated and seeds were collected from mature fruits. R1 transgenic zucchini squash and watermelon plants were inoculated with PRSV-W and ZYMV by means of viruliferous Myzus nicotianae. Resistant plants were not yet observed among the R1 plants available

Os efeitos do algodoeiro geneticamente modificado Bollgard®, que expressa a toxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis (Bt), em artrópodes não-alvo, foram avaliados através de estudos conduzidos em laboratório e em campo. Avaliações da abundância de artrópodes em algodoeiro Bollgard® (Delta Pine 90) e em sua isolinha (Acala 90) foram conduzidas durante três anos agrícolas consecutivos, sendo o primeiro estudo conduzido em Leme-SP (2005/2006) e os dois anos seguintes em Piracicaba-SP (2006/2007 e 2007/2008). Foram realizadas amostragens dos organismos da superfície do solo, através de armadilhas do tipo pitfall (14 coletas), e de artrópodes da mesofauna dos cinco centímetros superficiais do solo coletados com cilíndros metálicos e extraídos em equipamento do tipo Berlese-Tullgren modificado (16 coletas) e de organismos da parte aérea presentes nas folhas (17 amostragens de folhas apicais e 12 de folhas medianas). Foram processados 27.420 organismos das armadilhas do tipo pitfall e 297.696 extraídos por Berlese-Tullgren modificado. Os principais grupos de organismos coletados nos dois tipos de armadilhas foram Acari (Oribatida, Mesostigmata, Prostigmata, Astigmata e outros), Collembola e Formicidae. Chilopoda, Diplura e outros artrópodes (Aranae e larvas de insetos) também foram comuns nas extrações por Berlese-Tullgren modificado, enquanto Coleoptera (Nitidulidae, Carabidae, Staphylinidae, Mycetophagidae e outros) foram abundantes em pitfall. Embora em algumas amostragens tenham sido observadas diferenças significativas na abundância de alguns grupos de organismos edáficos, entre as parcelas com algodoeiro Bt e parcelas com a isolinha, estas diferenças não foram constantes em datas de amostragem de um mesmo ano e/ou não foram detectadas em diferentes anos agrícolas. A dinâmica de quatro espécies de oribatídeos foi monitorada durante os três anos agrícolas e revelou uma maior prevalência de Scheloribates praeincisus, seguido de Galumna glabra, Protoribates sp. e P. praeoccupatus, sendo que a proporção destas últimas três espécies variou em função do ano de coleta. As densidades populacionais de mosca-branca (Aleyrodidae) e de tripes (Thysanoptera) foram semelhantes entre as áreas com algodoeiro Bt e com sua isolinha. A densidade populacional de pulgões (Aphidoidea) foi maior no algodoeiro Bt do que na isolinha somente em cinco das 29 coletas. A abundância de ácaros predadores fitoseídeos foi menor no algodoeiro Bt do que na isolinha em três coletas enquanto a abundância de ácaros fitófagos da família Tetranychidae foi maior no algodoeiro Bt em seis coletas. Uma espécie de Tetranychidae, Mononychellus planki, e outra de Phytoseiidade, Neoseiulus californicus, foram selecionadas para análise comparativa da biologia destes em algodoeiro Bt e na sua isolinha. Não foram detectadas diferenças na duração da fase imatura de M. planki e na biologia de N. californicus no algodoeiro Bt em relação à isolinha. Em geral, não há evidências de que a abundância de artrópodes nos três anos agrícolas tenha sido alterada pelo cultivo do algodoeiro geneticamente modificado Bollgard®. / The effects of the genetically modified cotton (Bollgard®) expressing Bacillus thuringiensis (Bt) Cry1Ac toxin on non-target arthropods was evaluated under laboratory and field studies. Evaluations of arthropod abundance on Bollgard® cotton (Delta Pine 90) and on its isoline (Acala 90) were carried out during three consecutive field seasons. The first study was conducted in Leme-SP (2005/2006) and the following two field seasons were conducted in Piracicaba-SP (2006/2007 and 2007/2008). Soil surface organisms were collected using pitfall traps (14 samples). Mesofauna arthropods from the 5-cm soil surface were collected with metallic cylinders and extracted with modified Berlese-Tullgren equipment (16 samples). From the aerial portion of the plant, arthropods were sampled from leaves (17 samples from apical leaves and 12 samples from median leaves). From the pitfall traps and from the modified Berlese-Tullgren 27,420 and 297,696 organisms, respectively, were collected. The main arthropod groups collected in both types of traps were Acari (Oribatida, Mesostigmata, Prostigmata, Astigmata among others), Collembola and Formicidae. Chilopoda, Diplura and other arthropods (Aranae and insect larvae), were also common in extractions of the modified Berlese-Tullgren, while the pitfall traps revealed also abundance of Coleoptera (Nitidulidae, Carabidae, Staphylinidae, Mycetophagidae and others). Although, among some samples, we had observed significant differences in abundance of some soil organisms between Bt-cotton and isoline plots, these differences were not constant among sample dates from the same year and/or were not detected among different field seasons. Population dynamics of four oribatidae species was monitored during all field seasons and revealed major prevalence of Scheloribates praeincisus, followed by Galumna glabra, Protoribates sp. and P. praeoccupatus. However, the proportion of these last three species varied among field seasons. Population density of whiteflies (Aleyrodidae) and thrips (Thysanoptera) were not different between Bt-cotton and isoline plots. In five out of 29 sample dates, population density of aphids (Aphidoidea) was lower on Bt-cotton than on its isoline. Abundance of Phitoseiidae predatory mites was smaller on Bt cotton than on its isoline in three samples, while the abundance of Tetranychidae phytophagous mites was higher on Bt cotton in six samples. The biology of one species of Tetranychidae, Mononychellus planki, and one species of Phytoseiidade, Neoseiulus californicus, was investigated on Bt cotton and on its isoline. We did not detect any significant differences in duration of immature phase of M. planki and on the biology of N. californicus between cotton genotypes. In general, throughout three field seasons, there was no evidence that the abundance of arthropods has been altered by genetically modified Bollgard® cotton.

A soja é uma das culturas com maior importância sócio-econômica no mundo, visto o complexo agro-industrial que movimenta. A ocorrência de períodos de seca durante a estação de desenvolvimento das lavouras de soja é muito freqüente, provocando reduções drásticas na produtividade. Sendo a seca um fator limitante de produção fora do controle direto do homem, e a necessidade de suprir a demanda mundial crescente de alimentos, fazem com que a estabilidade da produtividade seja a chave para este entrave. O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas fisiológicas e agronômicas de dois genótipos de soja, um geneticamente modificado contendo a construção rd29A:DREB1A, visando maior tolerância à seca, e sua isolínea convencional, comparando-as frente a diferentes condições de disponibilidade hídrica no solo. Para tal, plantas de soja foram transformadas com o cassete rd29A:DREB1A, ambos elementos de Arabidopsis thaliana, introduzido por biobalística. O efeito da super expressão do gene AtDREB sobre parâmetros fisiológicos e agronômicos foi avaliado em casa de vegetação em três cultivos. Os experimentos foram instalados em blocos casualizados em arranjo fatorial (2x2), com quatros blocos e três amostras por bloco, e os resultados submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de Tukey (p 0,05) para comparações múltiplas das médias. Foram utilizadas sementes da cultivar BR16 transformada com a construção rd29A:DREB1A, nomeadas P58, e sementes BR16 não transformadas. As plantas foram submetidas à duas condições de disponibilidade hídrica: 15% de umidade gravimétrica do solo (UG) durante todo o ciclo (controle) e 2,5% de UG (tratamento sob estresse) a partir de R1/R2 (florescimento). Foram avaliadas as taxas fotossintética e transpiratória, condutância estomática e diferença de temperatura entre o ar e a folha com o medidor de trocas gasosas LI-6400 (Li-Cor ®), além da eficiência fotossintética e parâmetros agronômicos. Para condutância estomática, diferença de temperatura, taxas fotossintética e transpiratória, as maiores médias foram verificadas nas plantas sob 15% de UG e, dentro desta umidade, das plantas P58 em relação às BR16 geralmente. No tratamento sob estresse (2,5% de UG), as plantas transgênicas mantiveram valores superiores em praticamente todas as avaliações e, quando não, apresentaram valores que não diferiam estatisticamente das BR16. A eficiência fotossintética foi maior nas plantas P58 apenas nas avaliações finais e para as mesmas UG, e iguais estatisticamente nas demais avaliações. Para as avaliações agronômicas, as plantas BR16 apresentaram as maiores alturas em ambas as umidades, embora o mesmo número de nós que as P58. Para peso da parte aérea, número de sementes e número de legumes com semente e peso de semente, os maiores valores foram das plantas a 15% de UG e, dentro destas, das BR16. Os resultados indicam que a expressão da construção com o gene DREB1A confere maior tolerância à seca das plantas transgênicas, baseado em respostas fisiológicas, embora o desempenho agronômico deva ainda ser comprovado a campo. / Soybean is one of the major socio-economic important crops in the world due to the agro-industrial complex involved. The occurrence of drought during the period of development of soybean fields is very frequent, resulting in drastic yield decrease. As the drought being one limiting factor in the yield without human direct control, and the necessity of supplying the growing world food demand, keeping the stability of the yield seems to be the key for this problem. The objective of this study was to evaluate the physiologic and agronomic response of two soybean genotypes; one genetically modified containing the construction rd29A:DREB1A, aiming drought tolerance, and its conventional isoline, comparing them in different conditions of soil water availability. Soybean plants were transformed with the cassette rd29A:DREB1A, both elements of Arabidopsis thaliana, introduced by biobalistic method. The overexpression effect of AtDREB on physiologic and agronomic parameters was evaluated in greenhouse conditions during three cultivations. The experiment design used was the RBD (Randomized Blocks Design) in factorial scheme (2x2), with four blocks and three samples for block, and the results were submitted to the Analyze of Variance (ANOVA) and to the Tukey test (p 0,05) of multiples means comparisons. Transformed BR16 cultivar seeds were used with the construction rd29A:DREB1A, named P58, and seeds of no-transformed BR16 cultivars. The plants were submitted to two conditions of water availability: 15% of soil gravimetric humidity (GH) during all the experiment time (control) and 2,5% of GH (stress treatment) starting from R1/R2 (flowering stage). Photosynthetic and transpiration rates, stomatal conductance and temperature difference between the air and the leaf were measured with a portable open gas exchange system (LI-6400; Li- Cor ®), besides the photosynthetic efficiency and agronomic parameters, between nine and eleven-thirty in the morning. For stomatal conductance, temperature difference, photosynthetic and transpiration rates, the higher values were verified in the plants under 15% of GH and, within this humidity, these higher values were usually verified in plants P58 in relation to the BR16 plants. In the treatment under stress (2,5% of GH), the transgenic plants maintained higher values in almost all measurements and, when it did not occur, they showed values that did not differ statistically of the BR16 plants. The photosynthetic efficiency was higher in the P58 plants only in the final measures; and for the same GH, and statistically equal in the others measures. For the agronomic evaluations, the BR16 plants showed the highest heights in both humidities, even though they had the same number of nodes as the P58. For the aerial part weight, the number of seeds and the number of legumes with seed and seed weight, the highest values were of the plants under 15% of GH and, within these, of the BR16 plants in general. The results indicate that the expression of the construction with the gene DREB1A leads to a higher drought tolerance of the transgenic plants, based on physiologic response, although they still need tests on the field.

A cana-de-açúcar vem assumindo um papel de destaque na atual conjuntura nacional, impulsionada principalmente pela produção de etanol, que vai de encontro com a crescente preocupação mundial na busca por fontes de energias renováveis e menos impactantes ao ambiente. Por essa razão, é preciso assegurar o contínuo desenvolvimento técnico-científico do setor sucroalcooleiro nacional, mantendo o Brasil na posição de vanguarda na produção de biocombustíveis. Ante a disponibilidade de inúmeras ferramentas biotecnológicas, tornou-se possível avançar com maior celeridade na compreensão dos campos da genética e fisiologia da cana-de-açúcar. Neste trabalho é demonstrado a transformação genética via biobalística da cultivar RB835486. No processo foram usadas duas construções para silenciamento gênico via RNA de interferência (RNAi), com genes quiméricos do tipo shRNA (short harpin RNA) para silenciamento dos genes SspTIP1;1 e SspPIP1;4, em co-tranformação com o gene marcador npt- II. Os dois genes alvo selecionados codificam aquaporinas, proteínas transmembrana responsáveis pelo transporte de água na planta. Estes genes foram identificados anteriormente por seu possível envolvimento no processo de acúmulo de sacarose. A co-integração dos cassetes de silenciamento gênico e do gene marcador ocorreu em 13 plantas, sendo obtidas três linhagens para o gene SspTIP1;1 e 10 linhagens para o gene SspPIP1;4. Dentre elas, duas linhagens SspTIP1;1 e cinco linhagens SspPIP1;4 foram analisadas via RT-PCR, quanto a possíveis modificações nos níveis de expressão dos genes alvos. Nas duas linhagens transgênicas avaliadas para silenciamento do SspTIP1;1, não houve redução em sua expressão em relação ao controle não transformado, possivelmente devido a efeitos de posição. Nas outras cinco linhagens transgênicas avaliadas para silenciamento do SspPIP1;4, houve redução significativa em seus níveis de expressão em três linhagens em relação ao controle não transformado. Nestas plantas serão realizadas as análises fisiológicas a fim de validá-las funcionalmente quanto ao transporte de água e acúmulo de sacarose. / Sugarcane has taken a leading role in the current national economy, mainly boosted by ethanol production, which meet the growing global concern on searching for renewable energy and with low impact on the environment. Therefore, it is necessary to ensure the continuous technical and scientific development of the national sugar and ethanol sector, maintaining the leading position of Brazil in biofuel production. By the availability of numerous biotechnology tools, it became possible to advance more rapidly in understanding the fields of genetics and physiology of sugarcane. This work demonstrated the genetic transformation of the cultivar RB835486 via biolistic assay. In the process it was used two constructs for gene silencing via RNA interference (RNAi) with chimeric genes of the type shRNA (short harpin RNA) for silencing of the genes SspTIP1;1 and SspPIP1;4, co-transformed with the marker gene npt- II. The two selected target genes encode aquaporins, transmembrane proteins which are responsible for water transport in plants. These genes were previously identified for their possible involvement in the process of sucrose accumulation. The co-integration of both, the cassette gene silencing and gene marker was observed in 13 plants, three strains were obtained for the gene SspTIP1;1 and 10 strains for gene SspPIP1;4. Among them, two strains of SspTIP1;1 and five strains of SspPIP1;4 were analyzed by RT-PCR, searching for possible changes in the levels of target gene expression. In the two transgenic lines evaluated for silencing SspTIP1;1, no reduction in expression compared to control non-transformed was obtained, possibly due to effects of position insertion of the gene in the genome. The other five transgenic lines evaluated for silencing of SspPIP1;4, a significant reduction in their expression levels was obtained in three strains when compared to the control untransformed plants. These silenced plants will be physiologically analyzed to validate their function on water transport and sucrose accumulation.

A exemplo do que ocorre em animais, peptídeos hormonais em plantas desempenham papéis importantes no crescimento, desenvolvimento e defesa. RALF é um peptídeo hormonal ubíquo em plantas que foi primeiramente isolado de folhas de tabaco. Embora não se saiba exatamente sua função, as informações até agora existentes apontam para um envolvimento com aspectos básicos da biologia celular, provavelmente alongamento celular. Peptídeos RALF em Arabidopsis são encontrados em uma família multigênica de 37 membros. Plantas transgênicas superexpressando o AtRALF1 sob o controle do forte promotor constitutivo 35S, mostram um fenótipo semi-anão e inibição do crescimento das raízes. Um fenótipo semelhante também foi observado quando o AtRALF23 foi superexpresso. O AtRALF23, ao contrário do AtRALF1, tem sua expressão inibida por brassinosteróides. Esses fatos sugerem que diferentes peptídeos hormonais RALF, apesar de convergirem para a mesma função, apresentam uma relação individualizada com outros hormônios. O objetivo desse trabalho foi contribuir para a determinação da função dos peptídeos RALF em plantas e para o esclarecimento da inter-relação existente entre eles e os demais hormônios vegetais. Para tal, selecionou-se as isoformas AtRALF1 e AtRALF34 com base em semelhança/dessemelhança estrutural e padrão de expressão. Plantas silenciadas e com altos níveis de expressão para ambos os genes foram obtidas e avaliadas. A construção gênica AtRALF1-GFP foi inserida em Arabidopsis sob o controle do promotor 35S e foi observada fluorescência no retículo endoplasmático, complexo de Golgi e apoplasto. Genes anteriormente reportados como induzidos em plantas 35S:AtRALF1 foram validados e utilizados em experimentos com o AtRALF1 e o brassinolide. O conjunto dos resultados sugere um efeito antagônico do peptídeo AtRALF1 com relação ao efeito do brassinolide no alongamento de hipocótilos e raízes. Plantas com altos níveis de AtRALF1 são resistentes a aplicação exógena de brassinolide, não exibindo as respostas características do hormônio esteróide. O antagonismo entre os dois hormônios também foi sugerido pela análise da expressão de genes que são induzidos por AtRALF1 e brassinolide. / Like in animals, plant peptide hormones play important roles in growth, development and defense. RALF is a peptide hormone ubiquitous in plants that was first isolated from tobacco leaves. Although its function has not been established, the information gathered so far suggest its involvement with basic aspects of cellular biology, probably cellular elongation. RALF peptides in Arabidopsis are found in a multigene family of 37 members. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 under the control of the strong constitutive promoter 35S, show a semi-dwarf phenotype and root growth inhibition. A similar phenotype was also observed when AtRALF23 was overexpressed. AtRALF23, as opposed to AtRALF1, is inhibited by brassinosteroids. These facts suggest that different RALF peptide hormones, despite the convergence to the same function, show a unique relationship with other hormones. The goal of this work was to contribute to the determination of the function of RALF peptides in plants and to clarify the inter-relationship between RALF and the other plant hormones. With that in mind, the isoforms AtRALF1 and AtRALF34 were selected based on primary structure similarity/dissimilarity and pattern of gene expression. Plants with high levels of expression or silenced for both genes were obtained and evaluated. The gene construct AtRALF1-GFP was introduced in Arabidopsis under the control of the 35S promoter and fluorescence was observed in the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and apoplast. Genes previously reported as induced in 35S:AtRALF1 plants were validated and used in AtRALF1 peptide and brassinolide experiments. Taken together our results suggest an antagonistic effect of the peptide AtRALF1 regarding the elongation effect of brassinolide in hypocotyls and roots. Plants with high levels of AtRALF1 are resistant to exogenously applied brassinolide, and do not show typical responses to the steroid hormone. The antagonism between the two hormones was also suggested by the gene expression analysis of the AtRALF1 and brassinolide inducible genes.

O objetivo do trabalho foi estudar uma forma alternativa para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, pela produção de plantas transgênicas contendo o gene da proteína capsidial do Passionfruit woodness virus - PWV. O vetor de expressão foi construído utilizando-se os plasmídeos pCambia 2300 e pCambia 2301, que contêm o gene de seleção nptII, para resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pCambia 2301 contém também o gene repórter uidA (GUS). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens, estirpes EHA 105 e LBA 4404, pelo método do choque térmico. Os explantes para transformação genética constituíram-se de discos de folhas jovens (6 mm de diâmetro), das variedades IAC 275 e IAC 277, coletados de plantas mantidas em sob fotoperíodo de 16 h luz, a 27 °C. Os explantes foram inoculados com suspensão bacteriana (5x108 UFC/mL) por 20 min e transferidos para placa de Petri contendo o meio de cultura MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + nitrato de prata (AgNO3 - 4 mg/L) + acetoseringona (1 µM/L). O co-cultivo foi realizado à temperatura de 24 °C, em ausência de luz, por um período de 3 dias. Para seleção e regeneração de plantas os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + canamicina (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). A incubação foi realizada a 27 °C, em ausência de luz, por um período de 4 - 6 semanas. As gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para o meio de cultura MSM + 10% de água de coco e incubadas sob fotoperíodo de 16 h de luz. A transformação genética foi identificada pelo teste histoquímico GUS e por PCR. Obteve-se um total de 22 plantas PCR positivas. Destas, 8 foram analisadas por Southern blot para confirmação da integração do transgene. A transcrição e expressão do transgene foram analisadas por Northern e Western blot, respectivamente. As plantas transgênicas avaliadas foram multiplicadas e inoculadas com 3 diferentes estirpes do PWV. A linhagem T2 apresentou resistência a infecção dos três isolados utilizados. / The main purpose of this work was to study an alternative way to control the Passionfruit woodiness virus - PWV through the production of transgenic plants which contained the Passionfruit woodness virus coat protein gene. The binary vector was built by using pCambia 2300 and pCambia 2301 plasmids, which contain the selection gene nptII. The pCambia 2301 plasmid also contains the reporter gene uidA (GUS). The plasmids were introduced into Agrobacterium tumefaciens, EHA 105 and LBA 4404 strains, via thermal shock method. The explants for the genetic transformation were young leaf disks (6 mm of diameter) of IAC 275 and IAC 277 varietys, extracted from plants kept under 16 h photoperiod, at 27 °C. The explants were inoculated with a bacterial suspension (5x108 UFC/mL) for 20 min and then transferred to Petri dishes containing cocolture medium MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + silver nitrate (AgNO3 - 4 mg/L) + acetosyringone (1 µM/L). The co-culture was performed at 24 °C t, in the dark, for a three-day period. For the selection and regeneration of plants, the explants were transferred to the selection culture medium MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + kanamycin (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). The incubation was performed at 27 °C, in dark, for 4 - 6 weeks. The adventitious buds developed were then transferred to the culture medium MSM + 10% coconut water and kept incubated under 16 h photoperiod. The genetic transformation was identified through GUS and PCR tests. There were 22 PCR positive plants. Out of those, 8 were Southern blot analyzed for the confirmation of transgenc integration. The transgene transcription and expression were determined by Northern and Western blot respectively. The transgenic plants were then multiplied and inoculated with 3 different strains of PWV, and the line 2 showed resistance to the three strains used.

Fungos associados às plantas desempenham diversas funções biológicas importantes e constituem imensos reservatórios de novos compostos químicos, atividades biológicas e processos biotecnológicos ainda subexplorados. A diversidade estimada para esses microrganismos é enorme, porém menos de 7 % das espécies é conhecida. Em cana-de-açúcar, uma das principais culturas agrícolas do Brasil, estudos de interação e diversidade são recentes e ainda incipientes, principalmente com relação à comunidade fúngica e sua interação com plantas transgênicas. Uma das espécies presentes na comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar é o fungo Trichoderma virens, o qual apresenta grande potencial de exploração como agente de controle biológico, promotor de crescimento vegetal e produtor de enzimas e metabólitos secundários. Nesse sentido, o presente trabalho buscou primeiramente determinar a estrutura e diversidade da comunidade de fungos (endófitos de raiz e rizosfera) associados a duas variedades de cana-de-açúcar, uma convencional (SP80-1842) e outra transgênica (IMI-1, expressando resistência ao herbicida imazapir), e avaliar possíveis efeitos da transgênese, do estágio de crescimento e do manejo agrícola. Além disso, uma linhagem de T. virens, isolada como endófito de raiz dessa planta, foi selecionada para estudos de interação fungo-planta e determinação dos mecanismos envolvidos na sua atividade de controle biológico. Na primeira etapa do trabalho, que compreendeu isolamento, caracterização e avaliação de alterações na comunidade fúngica, os resultados obtidos mostraram que a comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, a maioria do filo Ascomicota, sendo que a sua estrutura incluiu um grande número de gêneros pouco frequentes e um pequeno número de gêneros altamente frequentes (Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma e Epicoccum), dos quais alguns apresentam especificidade ao local de isolamento (raiz ou rizosfera). A avaliação de possíveis efeitos sobre a comunidade fúngica mostrou que a idade da planta foi o único fator que influenciou de forma significativa as características dessa comunidade, sendo que os efeitos da transgênese, se existentes, devem ser secundários quando comparados às fontes naturais de variação. Na segunda etapa, a linhagem de T. virens T.v.223 foi transformada pelo sistema Agrobacterium tumefaciens e o transformante gerado (expressando resistência à higromicina B e a proteína GFP) foi utilizado em ensaios de interação via reisolamento e microscopia. Os resultados revelaram que esse fungo não promoveu alterações fenotípicas visíveis na planta hospedeira, colonizou predominantemente as raízes, onde formou camadas densas de micélio ao seu redor, antes de penetrar o espaço intercelular das primeiras camadas de célula da epiderme do tecido radicular. Por último, mutantes de T. virens deficientes para produção de quitinases foram gerados por deleção gênica e silenciamento gênico via RNAi e avaliados quanto à capacidade de controle biológico de diferentes fitopatógenos em ensaios em casa de vegetação. Curiosamente, os resultados mostraram que as enzimas quitinolíticas podem ser essenciais à atividade de controle biológico efetuada por T. virens, mas que a importância e a participação dessas enzimas no processo dependem do tipo de planta e de patógeno envolvidos na interação, já que mais de um mecanismo deve contribuir para o controle biológico por T. virens, como por exemplo, a indução de resistência da planta. / Plant-associated fungi perform several important biological functions and are considered a vast source of novel chemical compounds, biological activities and biotechnological processes, whose potential is underexplored. The estimated diversity for these microorganisms is massive, but less than 7% of the species are already known. Sugarcane, one of the most important crops in Brazil, has only recently been studied regarding interactions and diversity, but these studies are still incipient, mainly concerning fungal community and its interaction with transgenic plants. One of the species found on sugarcane fungal community is the fungus Trichoderma virens, whose potential on biological control, growth promotion, and enzymes and secondary metabolites production is huge. Taking this into consideration, the current work aimed to determine the structure and diversity of the fungal community (root endophytes and rhizosphere) associated to two varieties of sugarcane, the conventional (SP80-1842) and the transgenic counterpart (IMI-1, expressing imazapyr herbicide resistance), and assess possible effects from transgenese, growth stage and management. In addition, a strain of T. virens, isolated as a sugarcane endophyte, was selected to perform the fungal-plant interaction assays and to determine its biological control mechanisms. The results of the first part of this work, including the isolation, characterization and evaluation of fungal community changes, showed that the sugarcane fungal community is made up by at least 35 different genera, most of them belonging to Ascomycota phylum, and its structure included many genera observed in very low frequencies, and a few genera highly frequent (Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma and Epicoccum), from which some have specificity to the place of isolation (root or rhizosphere). Assessing possible effects upon the fungal community showed that the growth stage was the only factor significantly influencing the communitys features, besides, if transgenese effects are present, they may be minor compared to other natural sources of variation. The second part of this work included the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of T. virens strain T.v.223 and utilization of the generated transformant (hygromycin B resistant and GFPexpressing) to perform interaction studies by re-isolation and microscopy. The results revealed that this fungus did not promote any phenotypic change in the host plant, it was found mostly in roots, formed a dense mycelia cover over the roots and was able to penetrate intercellular spaces of root epidermis first layers. Finally, T. virens chitinase-deficient mutants were generated by gene deletion and RNAi gene silencing, and tested for biological control activity against different phytopathogens in greenhouse assays. Curiously, the results showed that chitinolytic activity may be essential to the biocontrol activity of T. virens, but its significance and the input of each chitinase depends on the plant and pathogen playing the interaction, since more than one mechanism may account for T. virens biological control, for instance, the induction of plant resistance.

O complexo coletor de luz (LHC) do fotossistema II (PSII) é o principal complexo de proteínas associado a pigmentos situado na membrana dos tilacóides de cloroplastos em plantas. O LHCII funciona como uma antena de transferência de energia para a captura e direcionamento da energia luminosa do PSII para o PSI. A ação coordenada dos dois fotossistemas com o direcionamento do fluxo de elétrons gera a quebra da molécula de água, através da membrana do tilacóide, produzindo força assimilatória ATP e NADPH. A energia química produzida na fotossíntese é de suma importância para a assimilação de carbono, biossíntese de aminoácidos e metabólicos secundários. Portanto, este é um importante gene para estudos em biotecnologia. Linhagens transgênicas de tabaco (TR-1 e TR-2) as quais expressam constitutivamente o transgene Lhcb1*2 de ervilha obtidas por Labate e colaboradores (2004) foram utilizadas nesse trabalho. Estas plantas apresentaram diversos efeitos pleiotrópicos relacionados à anatomia, morfologia, bioquímica e fisiologia. Uma proteína pode não atuar isoladamente, mas freqüentemente interagindo com outras proteínas, influenciando diversos processos metabólicos. O perfil de proteômica dessas linhagens transformantes, em relação à planta selvagem (WT) foi investigado. As proteínas totais foram extraídas de folhas de plantas de três meses crescidas em câmaras de crescimento, então separadas por 2D-PAGE. As proteínas diferencialmente expressas foram identificadas por LC-MS/MS. Os resultados mostram que 244 spots apresentaram alterações significativas na expressão nas duas linhagens transgênicas em relação à WT. 122 spots são expressos exclusivamente nas linhagens transformantes, e 24 spots somente na selvagem. Muitas proteínas como ATP synthase e ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase foram mais expressas nas linhagens transgênicas, mas a glutamine synthetase, uma importante proteína na reciclagem de nitrogênio nos cloroplastos, teve sua expressão diminuída. Para analisar as alterações na expressãode genes relacionados ao ritmo circadiano entre outros, como a conformação do PSII, cotilédones de plântulas estioladas foram submetidas à luz e amostras coletadas depois de 0, 3, 6, 12 e 24 horas. O nível de transcritos foram analisados por PCR quantitativo. A diferenciação de plastídio à cloroplasto maduro foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, para se entender as diferenças entre os genótipos em estudo no desenvolvimento vegetal. A expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de ervilha em plantas transgênicas de tabaco acarretou a indução e repressão de várias proteínas e genes em distintos passos de vias metabólicas, estabilizando a homeostase celular, exercendo uma influência significativa no desenvolvimento vegetal e produção de biomassa. / The light harvesting complex (LHC) of photosystem II (PSII) is the major ensemble of pigmet-biding proteins situated in the thylakoid membranes of the chloroplast in plants. The LHCbII functions as an energy-transferring antenna for capturing and delivering light energy to the photosystems PSII and PSI. The coordinated actions of the two photosystems in turn drive the flow of electrons, generated by the splitting of water, through the thylakoid membranes to produce the assimilatory force ATP and NADPH. The chemical energy produced by photosynthesis is very important for the assimilation of carbon, amino acids biosynthesis, and secundary metabolism. Therefore it is an important gene for biotechnological studies. Transgenic tobacco lines (TR-1 and TR-2) which express the pea Lhcb1*2 transgene constitutively obtained by Labate et al. (2004) were used in this work. These plants presented pleiotropic effects related to anatomy, morphology, biochemistry and physiology. As a protein may not act by itself, but it is, frequently interacting with other proteins, influencing a lot of metabolic processes. The proteomic profile of these transgenic lines, in relation to the wild type (WT), was investigated. The total proteins extracted from leaves of three-month old plants grown in growth chambers were separated by 2DPAGE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. The results showed that 225 spots displayed significant changes in the expression of the two transgenic lines in relation to the WT. 122 spots were exclusively expressed in the transgenic lines, and 24 only in the wild type. Many proteins as ATP synthase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase are overexpressed in the transgenic lines, but the glutamine synthetase, an important protein tor nitrogen recycling in the chloroplasts, showed a reducted level of expression. In order to analyse the alterations of the expression of genes related to the circadian rhythm among others, involved in the conformation of the PSII, cotyledons from etiolated seedlings were thenexposed to light and samples collected after 0, 3, 6, 12 and 24 hours. The level of transcripts were analysed by RT/RT-PCR. The PSII conformation were analysed by transmition electron microscopy, with the aim of verifying the evolution of plastids into the chloroplasts which could be leading to changes in plant development. The overexpression of the pea Lhcb1*2 gene in transgenic tobacco plants, lead to the induction and suppression of several proteins and genes in key metabolic pathways, as a way to establish a cellular homeostasis, exerting a significant influence on plant development and biomass production.

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:15:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Liberato_CarolinaRibeiro_M.pdf: 4975605 bytes, checksum: 97b439dccaccd215ccfca5504f9c6cb5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cana-de-açúcar é uma das plantas cultiváveis de maior importância para o Brasil. Embora atualmente o país seja responsável pela produção de 671 milhões de toneladas (safra 2014/2015), a produtividade da cana no Brasil é afetada por diversos fatores ambientais, dentre os quais se destaca a seca. A produção de novos cultivares com maior tolerância à seca não só contribuiria para aumentar a produtividade como aumentaria a sustentabilidade da cultura. Com o intuito de compreender o funcionamento do gene ScPetC, que codifica uma proteína com similaridade a ISP (Iron Sulfur Protein), este trabalho estudou os efeitos da superexpressão do gene ScPetC na tolerância à seca em plantas transgênicas de tabaco. Nossos estudos mostram que sua superexpressão em tabaco aumenta a sobrevivência das plantas em resposta à suspensão de rega. Ainda, foi observada maior tolerância dessas plantas ao estresse oxidativo, e maior eficiência dos fotossistemas I e II sob condições de estresse por seca / Abstract: Sugarcane is one of the most important cultivated plants in Brazil and the estimated production in the 2014/2015 harvest is 671 million tones. The productivity of sugarcane is affected by various environmental factors, and drought is considered as the major abiotic stress. The production of new cultivars with increased drought tolerance can help to increase productivity and enhance the sustainability in the sugarcane fields. In order to understand the function of ScPetC gene, which encodes a protein with similarity to ISP (Iron Sulfur Protein), this study evaluated the drought tolerance in transgenic tobacco plants overexpressing the ScPetC gene. Our studies showed that overexpression of ScPetC increases the ability of plants to survive to water withheld. Moreover, we provide evidence that plants had increased tolerance to oxidative stress and improved efficiency of photosystems I and II under drought / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestra em Genética e Biologia Molecular