Neisseria lactamica está envolvida na aquisição da imunidade natural contra Neisseria meningitidis, causadora da doença meningocócica. Vesículas de membrana externa (OMV) de N. lactamica são antígenos potenciais contra N. meningitidis. Analisou-se a cinética de biomassa, de produção de OMV, da fonte de carbono (lactato), e dos metabólitos, para maximizar a produção de OMV. Realizaram-se ensaios em biorreator, em batelada simples, batelada alimentada com lactato, com ou sem pulsos de aminoácidos e extrato de levedura (YE). Utilizou-se o meio de Catlin (MC) como meio mínimo, e analisaram-se efeitos das concentrações do lactato, aminoácidos e YE. Lactato foi consumido e citrato e acetato produzidos. Os melhores resultados obtidos foram no meio com adição de 2 g/L de YE e concentrações dobradas de lactato e 5 aminoácidos constitutivos do MC, em batelada alimentada com pulsos. O lactato apresentou efeito positivo sobre o rendimento de OMV e o YE sobre a biomassa. Os 5 aminoácidos constitutivos do MC foram necessários para obtenção de biomassa e rendimento de OMV. / Neisseria lactamica is involved with the acquisition of natural immunity to Neisseria meningitidis. N. lactamica outer membrane vesicles (OMV) are potential antigens against N. meningitidis, the pathogen of meningococcal disease. The objective of this work was to analyze the kinetics of bacterial growth, OMV production, the carbon source (lactate), and products of metabolism, to improve growing conditions and OMV production. Groups were studied in batch process, fed-batch process with lactate, fed-batch process with pulses of amino acids and YE. MC was considered as minimal medium and it was analyzed the effect of lactate, amino acids and YE. Lactate was consumed and citrate and acetate increased in the medium. The best results were in fed-batch with pulses, in MC with the double concentrations of lactate and amino acids, added with 2 g/L of YE. The lactate had a positive effect over OMV yield and YE had a positive effect over biomass. 5 amino acids of MC were necessary to obtain biomass and OMV yield.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é um patógeno causador de infecções respiratórias que causa a morte de 1 milhão de crianças anualmente no mundo todo. Neste trabalho a propriedade adjuvante da vacina celular pertussis (wP) em combinação com o antígeno PspA5 de S. pneumoniae foi avaliada em modelos animais. Combinações de PspA5 com wP, wPlow (vacina celular pertussis com baixa quantidade de LPS) ou com a vacina DTPlow foram inoculadas em camundongos por via nasal ou subcutânea. A resposta protetora induzida pela imunização nasal com PspA5-wP e PspA5-wPlow ao desafio letal com pneumococo foi caracterizada pelo aumento de anticorpos anti-PspA5 sistêmicos e na mucosa respiratória e infiltração de linfócitos T CD4+, T CD8+ e B no pulmão dos animais. A inoculação subcutânea de PspA5-DTPlow também protegeu contra desafio letal com pneumococo e a resposta induzida foi caracterizada pelo aumento de IgG anti-PspA5 sistêmicos e na mucosa respiratória. Não houve prejuízo às respostas contra difteria, tétano ou pertussis quando PspA5 foi combinado à DTPlow. / Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a pathogen that causes respiratory infections leading to the death of 1 million children per year, worldwide. Here, the adjuvant property of the whole cell pertussis vaccine (wP) in combination with the PspA5 antigen from S. pneumoniae was evaluated in animal models. Combinations of PspA5 with wP, wPlow (whole cell pertussis vaccine with low amount of LPS) or with the DTPlow vaccine were inoculated in mice by nasal or subcutaneous routes. The protective response induced by nasal immunization with PspA5-wP and PspA5-wPlow against the lethal challenge with pneumococci was characterized by increased systemic and mucosal anti-PspA5 antibodies and influx of TCD4+, TCD8+ and B cells in the lungs of mice. The subcutaneous inoculation of PspA5-DTPlow also protected against the lethal challenge with pneumococci and the response was characterized by increased levels of systemic and mucosal anti-PspA5 IgG. There was no prejudice to the responses against diphtheria, tetanus or pertussis when PspA5 was combined with DTPlow.

Objetivo: Descrever os eventos adversos pós-vacina DPT (EAPV-DPT) notificados no Estado de São Paulo entre 1984 a 2001; identificar preditores de gravidade desses eventos; avaliar o Sistema de Vigilância de Eventos Adversos Pós-Vacina DPT (SVEAPV-DPT).Métodos: Estudo descritivo e exploratório de preditores de gravidade. A definição de caso adotada é do SVEAPV, sendo este também a fonte dos dados. A avaliação do SVEAPV-DPT foi efetuada segundo metodologia proposta pelo Center for Disease Control and Prevention. Para identificação dos preditores usou-se a regressão logística não-condicional.Resultados: Foram identificados 6266 casos, dos quais 53% eram graves, 29,5% foram hospitalizados; os eventos mais freqüentes foram: febre<39,5ºC, episódio hipotônico-hiporresponsivo, reação local e convulsão. Em cerca de 75% dos casos o evento ocorreu nas primeiras seis horas após a vacinação. Mostraram-se independentemente associadas à gravidade: o intervalo de tempo inferior a uma hora entre a aplicação da vacina e o evento (OR=2,1), primeira dose aplicada (OR=5,8), antecedentes neurológicos pessoais (OR=2,2) e familiares (OR=5,3). O sistema passivo de EAPV é simples, flexível, de baixa sensibilidade, porém útil, descrevendo diferentes tipos de EAPV, identificando lotes mais reatogênicos e oferecendo subsídios para a elaboração de normas técnicas.Conclusões: Apesar das limitações, os sistemas passivos de VEAPV constituem o principal instrumento para estudar a segurança de vacinas no período pós-licença, sendo porém recomendável a incorporação de novas metodologias, entre elas a de municípios e unidades sentinelas. Além disso, é recomendável a inclusão na pauta de discussão das revisões periódicas do calendário de imunizações, a introdução da vacina DPT acelular. / Objective: Describe the DPT post vaccine adverse events (DPT- PVAE) notified in the state of São Paulo between 1984 and 2001; identify seriousness predictors of these events; evaluate the DPT Post Vaccine Adverse Events Vigilance System (DPT- PVAEVS).Methods: Descriptive and exploratory study of seriousness predictors. The case definition adopted was that of the PVAEVS, being it the data source as well. The evaluation of the DPT- PVAEVS was conducted according to the methodology proposed by the Centers for Disease Control and Prevention. To identify the predictors, non-conditional logistical regression was used.Results: 6266 cases were identified, of which 53% were serious, 29,5% were hospitalized; the most frequent events were: fever <39,5ºC, hypotonic-hyporresponsive episode, local reaction and convulsion. In around 75% of the cases, the event occurred during the first six hours after vaccination. They were show to be independently associated to the gravity: the time interval inferior to one hour between the application of the vaccine and the event (OR=2,1), first dose administered (OR=5,8), personal (OR=2,2) and family (OR=5,3) neurological history. The PVAE passive system is simple, flexible, of low sensitivity, yet useful describing different types of PVAE, identifying reatogenic lots and offering subsidies to the elaboration of technical norms.Conclusions: Despite the limitations, the PVAE passive systems constitute the main instrument to study the safety of vaccines during the post license period. Nevertheless, the incorporation of new technologies is advisable, among which are municipalities and sentinel units. Besides this, it is advisable to include the introduction of the acellular DPT vaccine as a discussion point of the periodic reviews of the immunization calendar.

O desenvolvimento de vacinas contra o vírus do papiloma humano (HPV) representa uma importante alternativa para o controle da infecção sexualmente transmissível e do câncer cervical. Neste trabalho exploramos uma estratégia vacinal inédita contra tumores induzidos pelo HPV-16 empregando a proteína E7 obtida após fusão genética com a glicoproteína D do vírus herpes tipo 1, uma proteína com propriedades adjuvantes para linfócitos T. A proteína recombinante gDE7 foi expressa em bactérias e em células de inseto e purificada por cromatografia de afinidade. A proteína gerada em bactérias foi administrada nas formas insolúvel e solúvel como vacina em camundongos. A gDE7 insolúvel conferiu 80% de proteção profilática para o crescimento tumoral, a gDE7 que manteve a forma solúvel após refolding protegeu 100% dos animais nas mesmas condições. Já a proteção terapêutica alcançou 30% dos animais. Além disso, verificamos o potencial neutralizante dos soros gerados frente ao HSV-1. As condições de obtenção das proteínas expressas em células de inseto também foram estabelecidas. / The development of vaccines against human papillomavirus (HPV) represents an important alternative to control the sexually transmitted infection and cervical cancer. In this paper we explored a novel vaccine strategy against tumors induced by HPV-16 using the E7 protein obtained after genetic fusion to the glycoprotein D of herpes virus type 1, a protein with adjuvant properties for T lymphocytes. The recombinant protein gDE7 was expressed in bacteria and in insect cells and purified by affinity chromatography. The protein generated in bacteria was administered in soluble and insoluble forms as a vaccine in mice. The insoluble gDE7 gave 80% prophylactic protection for tumor growth, the gDE7 that kept the soluble form after refolding protected 100% of the animals under the same conditions. The therapeutic protection reached 30% of the animals. We also verified the neutralizing potential of sera generated against the HSV-1. The conditions for obtaining the proteins expressed in insect cells were also established.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:27:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_TamiresFernandaVilasBoas_M.pdf: 3029203 bytes, checksum: 69ac5762ed6eaafac425a284455352cf (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Salmonella enterica é um dos patógenos de origem alimentar mais prevalente. É uma bactéria gram-negativa, pertencente à família Enterobacteriaceae, intracelular facultativa, não formadora de esporo, anaeróbia facultativa, capaz de infectar animais incluindo o homem. Geralmente é adquirida por meio de alimentos contaminados com tal micro-organismo e pode causar em humanos gastroenterite e bacteremia. O presente trabalho propõe a construção de linhagens mutantes de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de proteínas associadas ao nucleóide (NAPs ¿ Nucleoid-Associated Proteins). Tais proteínas auxiliam no enovelamento do DNA, permitindo que o cromossomo bacteriano seja compactado, além disso também influenciam na regulação transcricional de genes, em especial daqueles que respondem a mudanças ambientais. As NAPs são numerosas e o estudo desse grupo é bastante importante, pois vários esclarecimentos ainda precisam ser feitos a respeito de grande parte dessas proteínas. Dados recentes do nosso grupo de pesquisa têm demonstrado que mutantes nulos de S. enterica Typhimurium para genes codificadores de NAPs são atenuados quanto à virulência e capazes de induzir proteção no modelo murino de infecção. Esses resultados demonstram o importante papel de tais proteínas na virulência bacteriana. Assim, o presente estudo tem como objetivo a construção de mutantes nulos para dois genes codificadores de NAPs (stpA e ybaB) em S. enterica Typhimurium e a avaliação do fenótipo desses mutantes. Não há dados na literatura sobre o papel de tais NAPs com relação à virulência bacteriana. No caso de YbaB, não existem dados na literatura sobre o papel desta NAP em enterobactérias. Foi utilizado o sistema de recombinação ? Red para obtenção dos mutantes. Para observação do fenótipo de tais linhagens, foram feitos experimentos in vitro e in vivo. Os resultados observados nos experimentos in vitro mostram fenótipos interessantes das linhagens mutantes em comparação com as respectivas linhagens selvagens. No caso da mutação ?stpA, foi observada maior sobrevivência de células com essa deleção a certas situações de estresse em comparação com a linhagem selvagem. Já para a mutação ?ybaB, nossos ensaios de motilidade sugerem que a deleção desse gene teve efeito sobre a motilidade das células mutantes. Quanto à virulência dos mutantes construídos, tais mutações não afetaram a patogenicidade de S. enterica de modo considerável. Assim, as linhagens mutantes obtidas no presente trabalho não apresentam potencial de serem aplicadas como vacinas, mas lançam perspectivas para estudos futuros a respeito do papel biológico de YbaB em S. enterica / Abstract: Salmonella enterica is one of the most prevalent foodborne pathogens. It is a gram- negative bacterium, belonging to the Enterobacteriaceae family, intracellular facultative, non-spore forming, anaerobic facultative, capable of infecting animals, including man. It¿s usually acquired through foods contaminated with such microorganism and can cause gastroenteritis and bacteremia in humans. This study proposes the construction of mutant strains of S. enterica Typhimurium for genes encoding nucleoid-associated proteins (NAPs). These proteins help on folding of DNA, allowing the bacterial chromosome to be compressed, also influencing the transcriptional regulation of genes, especially those that respond to environmental changes. The NAPs are numerous and the study of this group is very important, because several explanations still have to be made regarding most of these proteins. Recent data from our research group has shown that null mutants of S. enterica Typhimurium for genes encoding NAPs are attenuated for virulence and capable of inducing protection in a murine model of infection. These results demonstrate the important role of these proteins in bacterial virulence. Thus, the present study aims at the construction of null mutants for two genes encoding NAPs (stpA and ybaB) in S. enterica Typhimurium and at the evaluation of the phenotype of these mutants. There are no data in the literature about the role of such NAPs regarding bacterial virulence. For the YbaB, there are no data in the literature about the role of this NAP in enterobacteria. The ? Red recombination system was used to obtain the mutants. For observation of the phenotype of such strains, in vitro and in vivo experiments were performed. The results obtained in in vitro experiments showed interesting phenotypes of mutant strains compared to their wild-type strains. In the case of ?stpA mutation, increased cell survival was observed on certain stress situations compared to the wild-type strain. For the ?ybaB mutation, our studies suggest that deletion of this gene had effect on motility of mutant cells. For virulence of the constructed mutants, these mutations did not affect the pathogenicity of S. enterica considerably. Thus, the mutant strains obtained in this study have no potential to be applied as vaccines, but this work provides prospects for future studies on the biological role of YbaB in S. enterica / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Marcos Tadeu Nolasco da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:17:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mazzola_TaisNitsch_D.pdf: 5322017 bytes, checksum: e684a35934a223e0ea20110ed186af8d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Este estudo teve como objetivo analisar se há associação entre a viremia plasmática do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e a resposta imunológica adaptativa de crianças e adolescentes com infecção vertical pelo HIV-1 em uso de terapia antirretroviral combinada (TARVc). Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas e no Centro de Orientação e Apoio Sorológico (COAS), em Jundiaí, ambos no estado de São Paulo, Brasil. Constituíram-se dois grupos de pacientes: a) com controle virológico sustentado por mais de um ano (Carga viral - CV < limite de detecção de 50 cópias de RNA viral/mL, pelo método de Branched-DNA); e b) com CV > 1000 cópias/mL. Crianças e adolescentes saudáveis participaram como controles. Foram realizadas, por citometria de fluxo, imunofenotipagens de linfócitos T CD4+, T CD8+, B total e de memória e a proliferação de linfócitos T em culturas de células mononucleadas do sangue periférico estimuladas com HIV-1 inativado por aldritiol-2. A concentração de citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? e TGF-?1 no sobrenadante destas culturas foi analisada com Cytometric Bead Array e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Também foram dosados imunoglobulinas por nefelometria; anticorpos anti-hepatite B e anti-rubéola por Chemiluminescent Microparticle Immunoassay e anti-tétano e anti-difteria por Toxin Binding Inhibiton test. Empregaram-se os testes estatísticos de Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, exato de Fisher, Comparações Múltiplas Não Paramétricas e Correlação de Spearman, sendo o nível de significância de p < 0,05. Não houve diferença na contagem de linfócitos T CD8+, B total e de memória entre os grupos de pacientes. O número de linfócitos T CD4+ estava reduzido no grupo virêmico no momento da avaliação da resposta vacinal. Observaram-se maiores valores absolutos de linfócitos B de memória nos pacientes com CV indetectável (CVI) de menor idade à introdução de TARVc. A concentração de IgM e IgG foi superior nos pacientes virêmicos em relação aos com CVI e controles. Pacientes com CVI tiveram maior nível de IgA que os controles. Os pacientes com CVI apresentaram maior proliferação de linfócitos T e produção de IL-2 e IFN-? HIV-1 específicas em relação aos virêmicos. A proliferação e produção de IFN-? e IL-2 se correlacionaram com a duração da TARVc bem-sucedida no controle da viremia. Em pacientes virêmicos, a concentração de IFN-? correlacionou-se inversamente à CV e a proliferação foi menor nos que iniciaram TARV após um ano de idade. A proporção de respondedores para as vacinas de tétano, difteria, rubéola e hepatite B foi similar entre os grupos de pacientes, e aqueles com CVI apresentaram maiores títulos de anti-hepatite B e anti-rubéola. Os controles apresentaram maior número de respondedores para rubéola, hepatite B e difteria e maiores títulos de anti-hepatite B, anti-rubéola e anti-tétano que os pacientes. Concluímos que o controle virológico sustentado em crianças e adolescentes com infecção crônica pelo HIV trouxe benefícios diretos na manutenção das respostas anti-HIV e vacinais e que a administração de TARV precoce contribuiu para melhor resposta celular ao HIV e maior número de linfócitos B de memória / Abstract: The aim of this study was to evaluate if there was an association of Human Immunodeficiency Virus (HIV) plasma viremia and the development of adaptative immune responses from vertically-HIV-1 infected children and adolescents under combination Antirretroviral Therapy (cART). The individuals were recruited at the Pediatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the University of Campinas Clinical Hospital (UNICAMP, Campinas) and at the Center for Orientation and Serologic Support (COAS, Jundiaí), in São Paulo State, Brazil. They were separated in two groups, according to HIV RNA plasma viral load (VL): one had sustained undetectable VL (UVL, with VL < 50 copies of RNA/mL) for at least one year before blood collection; the other had VL > 1,000 copies/mL. Healthy children and adolescents participated in the study as controls. Aldrithiol-2-inactivated HIV-1-stimulated peripheral blood mononuclear cells were cultured to evaluate HIV-specific lymphoproliferation by flow cytometry and IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? and TGF-?1 concentration by Cytometric Bead Array and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Adaptative immunity was also evaluated with T CD4+, T CD8+, total and memory B cell counts by flow cytometry, immunoglobulin dosage by nephelometry, Chemiluminescent Microparticle Immunoassay to antibodies anti-hepatitis B and anti-rubella and Toxin Binding Inhibiton test to anti-tetanus and anti-diphtheria were carried out to humoral response evaluation. Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, Fisher's exact, Nonparametric Multiple Comparisons and Spearman Correlation tests were used, with a p value < 0.05. There was no difference in T CD8, total and memory B cell counts between the groups of patients. T CD4 cell numbers were decreased in the viremic group at the time humoral immunity was performed. Greater memory B cell counts were observed among patients with UVL who were younger at cART beginning. IgM and IgG levels were higher in viremic patients in comparison to control and patients with UVL, which had increased levels of IgA in comparison to controls. There was no difference in the proportion of responders for tetanus, diphtheria, rubella and hepatitis B vaccines between the two groups of patients; nevertheless, the group with UVL showed higher titers of anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus than the viremic group. Controls showed higher frequency of responders to diphtheria, rubella and hepatitis B and titers to anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus in comparison to patients. Patients with UVL showed higher HIV-1-specific T lymphocyte proliferation and IL-2 and IFN-? production in comparison to viremic patients. Greater time since the start of successful cART in patients with UVL was associated with higher proliferation and IFN-? and IL-2 levels in cultures with HIV. Among viremic patients, HIV-specific proliferation was lower in individuals who started ART after one year of age, and IFN-? concentration was inversely correlated with VL. We concluded that sustained HIV-1 virologic control was valuable on mounting responses to HIV and vaccines and the early initiation of ART contributed to improved HIV cellular immunity and greater memory B cell counts / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutora em Ciências

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:10:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leite_JulianaAlmeida_D.pdf: 9218064 bytes, checksum: c5126692d8ce8a22660fbf8604dae7ef (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document. / Doutorado / Imunologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Lucimara Gaziola de La Torre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-21T16:14:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_GabrieladeSaCavalcanti_M.pdf: 2289921 bytes, checksum: fab97f76a524bba1b46aeeb55756ed3f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Esta pesquisa visou o desenvolvimento de lipossomas catiônicos contendo o DNA plasmideal e recobertos com o ácido hialurônico, para o desenvolvimento de novas estratégias de vacinas gênicas. Os lipossomas foram compostos dos lipídios: fosfatidilcolina natural de ovo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP). A primeira etapa, avaliou-se a influência do tipo de lipossoma (extrudado ou DRV - "Dehydrated-rehydrated") e de duas massas molares de ácido hialurônico (HA 6 e 16 kDa) nas propriedades dos complexos finais. Lipossomas extrudados apresentaram diâmetro médio reprodutível, quando comparado com lipossomas do tipo DRV. Surpreendentemente, complexos formados por lipossomas extrudados e HA 16 kDa apresentaram diâmetro na faixa nanométrica (200-400nm). Na segunda etapa, estudou-se o efeito da incorporação de um DNA modelo nas estruturas contendo HA e lipossomas catiônicos através da construção do perfil de diâmetro médio e potencial zeta em função da razão molar entre as cargas positivas (dos lipídeos catiônicos) e das cargas negativas proveniente do DNA (R+/-). A proporção escolhida foi R+/- = 3, pois permite toda a incorporação do DNA na estrutura lipossomal. Estudos de transfecção mostraram que a presença do HA nas estruturas eleva a eficiência de transfecção em células HeLa, porém de forma independente da quantidade de HA. A partir destes estudos, amostras contendo LACKDNA/Lipossomas catiônicos/HA foram preparadas e enviadas para estudos in vivo no Laboratório de Imunofarmacologia - Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ para avaliação da capacidade destas nanoestruturas na vacinação contra a Leishmaniose / Abstract: This research has the goal of develop a vaccine composed of liposome containing DNA and covered by hyaluronic acid as a new strategy for gene delivery. The hyaluronic acid is a natural polysacaride with mucoadhesive properties and has been used in vaccines using nasal route. This biopolymer allows the increase in the gene delivery in liposome systems because it has specific sinals for the cells, CD44 and RHAMM. The liposomes use in this research are composed of egg phosphatidylcholine(EPC), 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane(DOTAP), l-alpha-dioleoyl phosphatidylethanolamine(DOPE), and hyaluronic acid used was of low molecular weight (6 and 16 kDa). The first step study the influence of the kind of liposome (extruded liposome or DRV - "Dehydrated-rehydrated") and polymer mplecular weight. The final properties of the systems were checked. Extruded liposomes show diameter results more reproductive compared to DRV. The complexe of HA 16 kDa and extruded liposomes has the diameter in the nano scale (200-400 nm). The morphology of these complexes indicat the HA is covering the liposome. In a second step study the DNA incorporation in liposome using the construction of diameter and zeta potential profile in function of molar charge ratio ( positive molar charge from cationic lipid/ molar negative charge ratio from DNA).The best molar charge ratio considered was 3 for futher studies with liposome , DNA and HA. Transfection studies demonstrated that the HA presence increase the eficience of gene delivery in HeLa cells, no matter the amount of HA. Using this study, the structures composed of liposome/LACKDNA/HA, are prepared to be used in in vivo and in vitro studies of Leishmanioses in the Carlos Chagas Institute/UFRJ / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T14:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milanez_GuilhermePaier_M.pdf: 1651986 bytes, checksum: 4681c88f937b4fe6f4d915fce0eb3f20 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Salmonelose e a malária são duas doenças infecciosas negligenciadas de grande prevalência no mundo, mas acometendo particularmente populações humanas que vivem em regiões e países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Apesar dos esforços ainda não existem formulações vacinais totalmente efetivas no controle destas enfermidades. Desta forma, nosso grupo tem buscado aprimorar a expressão do Domínio M2 do antígeno MAEBL de Plasmodium yoelii, que apresenta similaridade com a proteína de Plasmodium falciparum, em linhagens de Salmonella enterica Typhimurium, atenuadas para virulência. Em estudos prévios constatou-se que a expressão em níveis baixos não seria suficiente para a indução de uma resposta imune protetora. Com isso, ficou clara a necessidade de se aprimorar os níveis de expressão deste antígeno nas linhagens a serem testadas. Para tanto, o vetor de expressão anteriormente utilizado foi modificado, os codons da seqüência a ser expressa foram otimizados para expressão em salmonela e um sinal de secreção periplasmática foi adicionado no início da seqüência a ser expressa. Adicionalmente, modificamos novas linhagens atenuadas de S. enterica desenvolvidas por nosso grupo de tal forma a utiliza-las na expressão de antígenos heterólogos, empregando um sistema letal balanceado (Asd) de estabilização da expressão gênica. Apesar do sucesso na construção dos novos vetores, e da otimização de codons para a expressão, constatamos um possível efeito deletério do domínio M2 quando expresso em grande quantidade, o que impossibilitou a obtenção de algumas construções planejadas. Entretanto, os resultados obtidos na estabilização de plasmídios em novas linhagens vacinais significam um avanço no teste e uso de tais linhagens no desenvolvimento de vacinas multifatoriais / Abstract: Salmonellosis and malaria are two infectious diseases of high prevalence in the world, particularly affecting human populations living in underdeveloped regions and countries or developing countries. Despite several efforts, there is not a vaccinal formulation totally effective to control these diseases. This way, our group has sought to enhance the expression of M2 MAEBL's antigen Domain of Plasmodium yoelii, which is quite similar to same protein of P. falciparum, in attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium. In previous studies we found that the expression at low levels was not sufficient to induce a protective immune response. Thus, there was a clear need to improve M2 expression levels in the new strains to be tested. The expression vector previously used was modified, the m2 sequence was codon-optimized for expression in Salmonella, and a periplasmic secretion signal was added at the beginning of the sequence to be expressed. Additionally, new attenuated S. enterica strains developed by our group were modified in a way to use them in the expression of heterologous antigens, employing a balanced lethal system (ASD) for expression plasmid stabilization. Despite of the new vectors successfully built as well as codon optimization for m2 expression, we found a possible deleterious effect of the M2 domain when expressed in large quantities, making it impossible to obtain some planned constructs. However, the results obtained on stabilization of expression vectors in the new vaccine strains are an important advance for the use of such strains as multifactorial vaccines / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Eliana Guedes Stehling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:02:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mobilon_Cristiane_D.pdf: 11609484 bytes, checksum: 06504829a16dd9fe15e1e7aff6ed5392 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A shigelose, uma infecção intestinal grave, causada por bactérias Gram-negativas pertencentes ao gênero Shigella, é uma patologia com incidência significativa, principalmente em países em desenvolvimento, onde ocorrem 99% dos casos relatados, sendo que, 69% deles acometem crianças menores de 5 anos de idade. A alta incidência de Shigella em países em desenvolvimento é, geralmente, atribuída à falta de saneamento básico, condições de higiene inadequadas, subnutrição e alto custo dos antimicrobianos. O modo predominante de transmissão ocorre por via fecal-oral. Os mecanismos de patogenicidade descritos para as diferentes espécies de Shigella incluem numerosos genes de virulência, sendo a maioria encontrada em um plasmídio (pINV) de 220 kb. O plasmídio pINV de S. flexneri codifica 2 operons cruciais para seu fenótipo invasivo: o operon ipa e o operon mxi-spa. O operon ipa codifica os antígenos plasmidiais de invasão denominados IpaA, IpaB, IpaC e IpaD, os quais são efetores para o processo de invasão bacteriana. O operon mxi-spa juntamente com as proteínas IpaB, IpaC e IpaD são essenciais para a invasão in vitro de células epiteliais. Sabe-se, também, que essas proteínas, ou antígenos plasmidiais de invasão, podem ser altamente imunogênicos. Neste trabalho, clonou-se o gene ipaC no vetor pET28a para expressão em Escherichia coli e em vetores constitutivos para bactérias lácticas com a finalidade de se verificar a capacidade imunogênica da proteína expressa por este gene. Além disso, verificou-se que os anticorpos produzidos pela resposta à proteína IpaC foram capazes de inibir a adesão e invasão de Shigella flexneri em culturas celulares cultivadas in vitro confirmando, assim, a importância dessa proteína no processo invasivo da bactéria e seu possível uso no desenvolvimento de futuras vacinas a serem usadas contra a shigelose / Abstract: Shigellosis is a severe intestinal infection caused by Gram-negative bacteria which belongs to the genus Shigella. It is a pathology with high incidence and it is known that 99% of cases occur in underdevelopment countries. Among these cases, 69% of them affect children under 5 years old. The high incidence of Shigella in underdevelopment countries, is mainly atribbuted to substandard hygiene, unsafe water supplies, subnutrition and antibiotic high cost. The predominant mode of transmission is by fecal-oral contact. The pathogenicity mechanisms described for Shigella species include several virulence genes, most of them been encoded in a plasmid (pINV) with 220 kb. This plasmid encodes 2 important operons which are essential for the invasive phenotype: the operon ipa and the operon mxi-spa. The ipa operon encodes the invasion plasmid antigens called IpaA, IpaB, IpaC and IpaD, which are effector proteins required for the bacteria invasion process. The mxi-spa operon together with IpaB, IpaC and IpaD are essential to epithelial in vitro cell invasion. It is also known that these proteins or invasion plasmid antigens may be highly immunogenic. During the development of this work, ipaC gene was cloned in the plasmidial vector pET28a for expression in Escherichia coli and in constitutive vectors for lactic acid bacteria to prove its immunogenic importance. Furthermore it was verified that the antibodies produced in response to IpaC protein were able to inhibit Shigella flexneri adhesion and invasion in in vitro cultured cells, confirming its important hole in bacteria invasion process and its possible usage in vaccine development against shigellosis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular