Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-05-11T20:41:59Z No. of bitstreams: 2 Tese - Adeliane Castro da Costa - 2016.pdf: 6997901 bytes, checksum: a6d453a5d3acafaed991fe945aa59330 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-12T10:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Adeliane Castro da Costa - 2016.pdf: 6997901 bytes, checksum: a6d453a5d3acafaed991fe945aa59330 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-12T10:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Adeliane Castro da Costa - 2016.pdf: 6997901 bytes, checksum: a6d453a5d3acafaed991fe945aa59330 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / In the first chapter of this thesis we demonstrate, in a review article, some of the successful strategies employed in the construction of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccines, among others being: overexpression of promising Mycobacterium tuberculosis (Mtb) immunodominant antigens already expressed by BCG introduction of Mtb immunodominant antigens not expressed by BCG, such as antigens in the regions of difference (RD) 1 thru 16; combination of overexpression and introduction of novel antigens to BCG; BCG modification to skew immune response toward TCD8+, as for example recombinant BCG (rBCG) expressing cytokines. In the second chapter, we demonstrate that the recombinant fusion protein CMX is capable of aggregating important immunogenic properties to vaccine vectors, by inducing an effective response for the control of Mtb infection in the mouse tuberculosis infection model. It is hypothesized that the introduction of the rCMX protein in the BCG vaccine could add immunological properties that are absent in BCG, thus leading to the induction of important cell populations for the control of Mtb infection. Our results demonstrate that the introduction of the rCMX in the BCG vaccine, resulting the recombinant BCG vaccine (rBCG-CMX) was an important factor for the observed Th1 and Th17 responses, as well as polyfunctional cells, that could be responsible for the reduced inflammatory lesions seen in the lungs of Mtb infected BALB/c mice, significantly reducing the bacillary load in comparison to in comparison to mice immunized with BCG Moreau vaccine. Lastly, in the third chapter of this thesis we propose that rCMX protein could be responsible for modulating the BCG vaccine to activate a more adequate and protective innate immunity. Our results show that the rBCG-CMX vaccine induces the activation of alveolar macrophages by means of expression of activation-associated molecules CD86 and CD206. The increase in the expression of those molecules are accompanied by the production of TGF-β e IL-1α which in turn could be responsible for the decreased necrosis and higher apoptosis induction promoted by rBCG-CMX vaccination. This phenomenon could be providing a higher cellular survival rate of the recombinant vaccine, leading to a better processing and presentation by MHC-II. As rCMX was shown to induce the production of IL-1α, IL-6 e TGF-β by a pathway that seems to involve the participation of TLR-4, we hypothesize that this recombinant protein could be modulating the BCG vaccine to induce a more appropriate and protectiveresponse for Mtb infection. / A Tuberculose (Tb) é uma doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Apesar de ser uma doença antiga, a Tb continua sendo um dos principais problemas de saúde pública. A Organização Mundial de Saúde acredita que cerca de um terço da população mundial está infectado com Mtb, gerando milhões de mortes por ano. Uma das medidas que podem melhorar a prevenção e bloquear a transmissão do Mtb é o desenvolvimento de novas vacinas que previnam o estabelecimento e a progressão da TB em humanos. Embora exista a vacina BCG que é eficiente contra formas graves de TB na infância, existe a necessidade do desenvolvimento de novas vacinas para controlar a disseminação da TB, que sejam mais eficientes e seguras que a BCG. Com este intuito, o objetivo deste trabalho é avaliar a proteção e a modulação da resposta imune induzida por BCG recombinante expressando espítopos imunodominantes Ag85C, MPT-51 e HspX do Mycobacterium tuberculosis induzida em modelo murino. Nossos resultados demonstram que a inserção da proteína CMX na vacina BCG recombinante (rBCG-CMX) foi um fator determinante para indução de resposta Th1 e Th17, além de células polifuncionais que possivelmente foram responsáveis pela redução das lesões inflamatórias no pulmão de camundongos BALB/c, reduzindo significantemente a carga bacilar em comparação com imunização com BCG Moreau. Além disso mostramos neste trabalho que a proteína rCMX é capaz de modular a vacina BCG e ativar a imunidade inata para a indução de uma melhor resposta protetora. Nossos resultados demonstram que a vacina rBCG-CMX induz ativação de macrófagos pulmonares por meio da expressão de moléculas de ativação CD86 e CD206. O aumento da expressão dessas moléculas é acompanhada por produção de TGF-β e IL-1α, sendo prováveis responsáveis pela menor indução de necrose e maior indução de apoptose pela vacina rBCG-CMX. Este fenômeno pode estar proporcionando a esta vacina maior capacidade de sobrevivência celular, colaborando para um melhor processamento e apresentação por MHC-II. Devido a proteína rCMX ser capaz de induzir produção de IL-1α, IL-6 e TGF-β por uma via que parece haver a participação de TLR-4. In vivo demonstramos que a vacina rBCG-CMX depende de TLR-2 e TLR-4 para induzir respostas Th1 e Th17, após imunização de camundongos com esta vacina. Neste trabalho hipotetizamos que a proteína CMX pode modular a resposta imune inata e adaptativa, por uma via em que há a participação do TLR-4. Esta pode ser a via pela qual a CMX, quando expressa por BCG favorece uma boa resposta protetora em animais desafiados com Mtb.

As meningites representam um importante agravo no quadro sanitário nacional, por suas características epidemiológicas e por seu impacto sócio-econômico. O Haemophilus influenzae tipo b (HIB), causa infecções respiratórias e doenças invasivas como meningites, pneumonias, epiglotites, sinusites, bacteremias, otites e artrites. Entre essas enfermidades, a meningite tem sido a mais estudada, em virtude de sua alta morbi-mortalidade e por ser de notificação compulsória. A proposta deste trabalho foi a de avaliar a tendência, em série histórica, da morbimortalidade e da letalidade das meningites caudadas por HIB no Brasil, como uma alternativa para avaliação do impacto da vacinação específica. O estudo seguiu um delineamento observacional do tipo ecológico e relativo ao período de 1983 a 2002. Foram calculados os coeficientes de incidência, mortalidade e letalidade de meningites por HIB, a partir de base de dados do Ministério da Saúde e da Fundação Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Para a análise de tendência destes indicadores foram estimadas retas de predição, com intervalos de confiança de 95%. Os softwares utilizados para a fase de gerenciamento e para a análise de dados foram: Excel, Epiinfo e Stata. No Brasil, entre 1983 e 2002, foram notificados 23.921 casos de meningites por HIB, dos quais 10.524 (43,99%) em menores de 1 ano e 9.269 (38,75%) na faixa de 1 a 4 anos. Os coeficientes de incidência, mortalidade e letalidade de maior magnitude foram observados nas faixas etárias de menores de 1 ano e de 1 a 4 anos. A partir de 1988, houve incremento na magnitude dos coeficientes de incidência e mortalidade. As regiões Norte e Nordeste apresentaram menor magnitude para esses indicadores, enquanto que para a letalidade, a região Nordeste apresentou indicadores de maior magnitude em menores de 1 ano. De modo geral, embora a letalidade tenha apresentado um padrão de declínio desde o inicio da série, sua magnitude permaneceu elevada até 2001. O impacto da vacinação sobre a letalidade, apenas a partir de 2002, sugere que esta pode levar até três anos, em média, para exercer efeito sobre o prognóstico das meningites por HIB. Com exceção da região Nordeste, a tendência para a incidência e a mortalidade no Brasil e regiões, foi semelhante, no período prévacinação (ascensão), detectando-se declínio após a introdução da vacina na rotina do Programa Nacional de Imunização. No Brasil e nas regiões Norte, Nordeste, Sul e Sudeste (nesta, em menores de 1 ano), a tendência da letalidade foi de declínio em toda a série. Nas regiões Centro-Oeste e Sudeste, o impacto da introdução da vacina sobre a incidência e a mortalidade foi mais precoce (1999-2000), em relação às outras regiões do estudo, talvez pelo fato dessas regiões terem apresentado cobertura vacinal mais elevada. O impacto da vacinação foi mais evidente sobre a incidência e a mortalidade do que sobre a letalidade. Os resultados revelaram um impacto positivo das estratégias de vacinação contra HIB, no Brasil e macrorregiões, inclusive em faixas etárias não vacinadas. Recomenda-se a monitorização contínua desses agravos, através de ações de Vigilância Epidemiológica, com aprimoramento do Sistema de Informação em Saúde. / Meningitis is an important disease within the national health system, due to its epidemiological characteristics and socioeconomic impact. The Haemophilus influenzae (HIB) type B causes respiratory infections as well as invasive diseases such as meningitis, pneumonias, epiglottitis, sinusitis, bacteremias, otitis and arthritis. Among these diseases, the meningitis has been the most studied due to its high morbi-mortality rate and also because requires compulsory notification. The purpose of this study was to evaluate the trend, considering the history series, regarding morbi-mortality and case fatality rates of meningitis caused by Hib in Brazil, as an alternative for the evaluation of the impact of a specific vaccination. This research was an ecologic observation from 1983 to 2002. The author calculated the incidence, mortality and case fatality rates of Hib meningitis, based on data from the National Health Department and the Geography and Statistics Brazilian Foundation Institute. In order to analyze these indicators\' trends, authors estimated prediction lines, with confidence intervals of 95%. The softwares used to manage and analyze data were: Excel, Epiinfo and Stata. In Brazil, from 1983 to 2002, 23.921 cases of Hib meningitis were notified. Among them, 10.524 (43.99%) in babies with less than one year and 9.269 (38.75%) in children with age varying from 1 to 4 years. The higher magnitude of incidence, mortality and case fatality rates were observed in the ages less than 1 year and varying from 1 to 4 years. Since 1988, the author observed an increment in the magnitude of the incidence and mortality rates. The North and Northeast regions presented a lower magnitude for these indicators, while for case fatality, the Northeast region presented indicators of higher magnitude in babies with age less than 1 year old. In general, although the case fatality rates presented a decreasing pattern since the beginning of the series, its magnitude was high until 2001. The impact of vaccination on case fatality rates was perceived only after 2002, suggesting that it can take three years, in average, to have some effect on the Hib meningitis prognosis. With exception to the Northeast region, the trends regarding the incidence and mortality in Brazil were similar, in the pre-vaccination period (increase), detecting a decrease after the introduction of vaccination in the routine of the do Programa Nacional de Imunização. In Brazil and in the North, Northeast, South and Southeast (age less than one year) regions, the case fatality trend was of decline during all series. In the Centerwest and Southwest regions, the impact of the vaccination introduction on the incidence and mortality rates was precocious (1999-2000), if compared to the other regions studied and maybe due to the fact that in these regions the vaccination achieved a greater amount of the population. The impact of vaccination was clearer on the incidence and mortality than on the case fatality rates. Results revealed a positive impact of the vaccination strategies against Hib in Brazil and in macro regions, including the age ranges that were not vaccinated. The author recommends the continuous monitoring of these diseases, through epidemiological surveillance actions and the improvement of the Health Information System.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_ROSANE DA SILVA SANTANA.pdf: 2136458 bytes, checksum: 6e0ab0f96b21e794228bb9481767341a (MD5) Previous issue date: 2015-04-30 / Introduction: In Brazil, the preventable diseases by immunizing are in decline by the wide extent of vaccination coverage, which, for decades, it constitutes the main goal of the National Immunization Program, it established in 1973. Vaccination aims to reduce morbidity and mortality caused by preventable diseases, and to guarantee the efficacy and effectiveness of vaccines, it is necessary to evaluate the quality of conservation of vaccines in the health units. Objective: To analyze the quality of conservation of vaccines in the municipality of basic health network Timon/MA. Methods: This is an exploratory study, observational, descriptive, with quantitative approach, performed in 28 rooms fixed vaccines. To collect the data we used the assessment tool of the Supervisory Instrument Assessment Program on Immunization Room (version 2.0, 2004) using the items: identification of the vaccine room, technical training of professionals and Cold Chain. The collected data was entered into PAISSV and the results tabulated under the guidelines and standards established by the PNI. For analysis, study variables were organized in dimensions Structure and Process. From the percentage reached, the variables were classified as ideal, good, fair and insufficient. Results and Discussion: The results showed that the conservation of vaccines has been affected by several factors such as lack of technical training of professionals in Cold Chain, inadequate physical infrastructure, the monitoring of temperature, conducts related to the organization of vaccines in the refrigerator and vaccines exposure to high temperatures. For effective immunization, the city studied need to adjust the structure of vaccine rooms to achieve optimum working. It is necessary for professionals directly linked to the vaccine area are trained and do refresher courses, fundamental in the consolidation of the rules of procedures of the immunization program thus contributing to the quality of service. Conclusion: To obtain the excellence in the quality of conservation of vaccines, it is necessary to coordinate local immunization implant measures for the supervision of activities, monitoring and evaluating the rooms of vaccines for compliance with the standards established by the PNI and promote courses training in Cold Chain for professionals, aiming to achieve the best quality of service. / Introdução: No Brasil, as doenças evitáveis por imunizantes estão em franco declínio pela ampla extensão da cobertura vacinal, o que, ao longo de décadas, constitui-se meta principal do Programa Nacional de Imunização, implantado em 1973. A vacinação tem como finalidade reduzir a morbimortalidade causada pelas doenças preveníveis, e para a garantia da eficácia e efetividade das vacinas, é necessária a avaliação da qualidade de conservação das vacinas nas Unidades de Saúde. Objetivo: Analisar a qualidade da conservação das vacinas na rede básica de saúde do munícipio de Timon/MA. Métodos: Trata-se de um estudo exploratório, observacional, descritivo, com abordagem quantitativa, realizado em 28 salas fixas de vacinas. Para a coleta dos dados foi aplicado o instrumento de avaliação do Programa de Avaliação do Instrumento de Supervisão em Sala de Vacinação (versão 2.0, 2004) utilizando os itens: identificação da sala de vacina, capacitação técnica dos profissionais e Rede de Frio. Os dados coletados foram digitados no PAISSV e os resultados, tabulados sob as orientações e normas estabelecidas pelo PNI. Para análise, as variáveis do estudo foram organizadas nas dimensões Estrutura e Processo. A partir do percentual alcançado, as variáveis foram classificadas em ideal, bom, regular e insuficiente. Resultados e Discussão: Os resultados mostraram que a conservação das vacinas é afetada por diversos fatores como a falta de capacitação técnica dos profissionais em Rede de Frio, inadequação da estrutura física, o monitoramento da temperatura, as condutas relacionadas à organização das vacinas no refrigerador e a exposição das vacinas a altas temperaturas. Para a efetivação da imunização, o município estudado necessita adequar a estrutura das salas de vacina para alcançar condições ideais de funcionamento. É necessário que os profissionais diretamente ligados à sala de vacina recebam treinamento e façam cursos de atualização, fundamentais na consolidação das normas de procedimentos do Programa de Imunização contribuindo, assim com a qualidade do serviço. Conclusão: Para a obtenção da excelência na qualidade de conservação das vacinas, é necessário que a coordenação de imunização local implante medidas para a supervisão das atividades realizadas, monitorando e avaliando as salas de vacinas quanto ao cumprimento das normas estabelecidas pelo PNI e promova cursos de capacitação em Rede de Frio para os profissionais, com intuito de alcançar a melhor qualidade do serviço.

O comportamento humano é influenciado por fatores sociais, culturais, econômicos e políticos, e pode aumentar ou diminuir o risco de infecção pela dengue, dependendo da relação entre a população e o inseto vetor da doença. Devido ao fato de nenhuma vacina 100% eficaz ter sido disponibilizada ainda, a disseminação da dengue só pode ser contida por técnicas de controle da população de vetores (Aedes aegypti e outros) e pela proteção individual dos componentes da população humana. Este estudo testou a hipótese de que as populações afetadas pela dengue provavelmente vão reduzir a intensidade de seus hábitos relacionados ao controle dos vetores na presença de uma vacina parcialmente protetora. Essa hipótese foi testada por uma avaliação em campo, na qual uma amostra de população de área endêmica para a dengue foi entrevistada sobre seus hábitos de controle do vetor na presença de uma vacina teórica. As entrevistas demonstraram que as pessoas que foram informadas sobre uma vacina muito eficiente iriam reduzir seus hábitos de controle do mosquito de maneira significativa mais importante do que a amostra que foi informada sobre a presença de uma vacina pouco eficaz / Human behaviors, which are influenced by social, cultural, economic and political factors, can increase or decrease the risk of dengue infection, depending on the relationship with the insect vector. Because no 100% efficacious vaccine is currently available, the spread of dengue can only be curtailed by controlling vector populations (Aedes aegypti and others) and by protecting individuals. This study tested the hypothesis that dengue-affected populations are likely to relax their vector-control habits if a potentially protective vaccine becomes available. The hypothesis was tested using an empirical field test in which the local population of an endemic area was interviewed about their vector-control habits given the presence of a theoretical vaccine. The interview showed that people who were informed that a very effective vaccine is available would reduce their vector-control habits significantly compared to a group that was informed that the vaccine is not very effective

A espécie Leishmania (Viannia) shawi foi caracterizada recentemente pelo grupo de Lainson. Estudos recentes indicam o importante papel médico epidemiológico deste parasito no Brasil. Portanto, os objetivos do presente estudo foram caracterizar o modelo experimental murino desta infecção, purificar antígenos protéicos e avaliar seus graus de proteção após desafio. Para caracterizar o modelo murino de infecção, camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram infectados na pata com formas promastigotas e os achados histopatológicos e imunológicos foram avaliados durante a evolução da infecção. Para os estudos de imunização foram utilizados 10 diferentes antígenos: três secretados/excretados pelas formas promastigotas de L. (V.) shawi, dois intracelulares solúveis das formas amastigotas (AgAma) e promastigotas (AgPro), e cinco frações protéicas purificadas a partir do antígeno intracelular solúvel das formas promastigotas. Estes antígenos foram utilizados para imunizar camundongos da linhagem BALB/c duas vezes, subcutaneamente no dorso. Após uma semana da última imunização, os animias foram desafiados com formas promastigotas. O desenvolvimento das lesões nos animais foram acompanhadas por seis ou oito semanas pós desafio (PD), quando os animais foram sacrificados para análise da carga parasitária e dos aspectos relacionados às respostas imune celular e humoral. Camundongos da linhagem BALB/c foram altamente susceptíveis à infecção, uma vez que as mudanças histopatológicas e da imunidade humoral foram mais pronunciadas nos camundongos BALB/c que em C57BL/6. Os antígenos secretados/excretados de baixa massa molecular induziram alta taxa de proteção em comparação aos animais não imunizados, já os antígenos secretados/excretados de média massa molecular protegeram intermediariamente os animais, possivelmente pela alta expressão de IFN-g e IL-4 nos linfócitos T CD8+. AgAma e AgPro tiveram uma resposta antagônica nos animais, pois o AgAma suprimiu a produção de IFN-g e IL-12, contudo houve maior produção de TGF-b, facilitando o aumento do parasitismo na pele e em linfonodos. A despeito da detecção de TGF-b nos animais imunizados com AgPro, houve um balanço entre a produção de citocinas, com a participação de IL-12 e IFN-g, que levou a um controle do parasitismo em pele. Através da purificação do AgPro foi visto que os antígenos F1 e F5 protegeram os animais da infecção na pele após desafio, e ainda F1 também protegeu os linfonodos destes animais. Os antígenos F3 e F4 levaram a exacerbação das lesões de pele. A identificação, por espectrometria de massa, do antígeno F1 revelou a presença de 67 componentes, sendo que a maioria deles não possui identificação. Ainda, o antígeno F1 protegeu duradouramente os animais associado à estimulação de linfócitos T CD8+ de memória, contudo a presença de baixos números de parasitos pode ser o reflexo da alta produção de IL-10. Estes dados indicam que o antígeno F1 pode representar um importante candidato vacinal contra a Leishmaniose Tegumentar Americana / Leishmania (Viannia) shawi specie was recently characterized by Lainson group. Currently, studies indicate important medical and epidemiological role of this parasite in Brazil. Therefore, the aims of this study were to characterize the experimental murine model of this infection, purify proteic antigens and evaluate their protection degrees after challenge. To characterize the murine model of infection, BALB/c and C57BL/6 mice were infected in the footpad with promastigote forms, and the histopathological and immunological findings were evaluated during the evolution of infection. For the immunization studies, 10 different antigens were used, as follow: three released/excreted by promastigote forms of L. (V.) shawi; two intracellular soluble antigens from amastigote (AgAma) and promastigote forms (AgPro), and 5 proteic fractions purified from soluble intracellular antigens from promastigote forms. These antigens have been used to immunize BALB/c mice twice, subcutaneously in the rump. After 1 week of last immunization, the animals were challenged. The lesion developments in animals were followed during either six or eight weeks post-challenge (PC), when the animals were sacrificed to evaluate the parasite load and aspects of cellular and humoral immune responses. BALB/c mice were the most susceptible to L. (V.) shawi infection, since the histopathological and humoral changes were higher in BALB/c than C57BL/6 mice. Secreted/excreted antigens of low molecular mass induced high protection rate compared to non-immunized mice, already mice immunized with secreted/released antigens of medium molecular mass showed mild protection, possibly caused by high expression of IFN-g and IL-4 by CD8+ T lymphocytes. AgAma and AgPro showed antagonic response in animals, since AgAma suppressed the IFN-g and IL-12 production, however high level of TGF-b has been detected, allowing the increasing of parasitism in the skin and lymph nodes. In spite of the detection of TGF-b in AgPro-immunized mice, there was a balance in the cytokines production, with the participation of IFN-g and IL-12, leading to parasite control in skin. Through the purification of AgPro, it was observed a protective effect of F1 and F5 antigens in the skin after challenge; in addition, F1 also protected the lymph nodes of BALB/c mice. Both F3 and F4 antigens exacerbated the skin infection. The identification, by mass spectrometry, revealed that F1 was composed by 67 components, and the majority has not been identified till now. Moreover, F1 induced long-lasting immunity in BALB/c mice, associated to generation of memory CD8+ T lymphocytes, however low parasitism could be the reflect of high production of IL-10. These data indicate which F1 antigen could be an important vaccine candidate against American Tegumentar Leishmaniasis

A dengue é uma doença que afeta milhões de pessoas e possui um número significativo de mortes. Não há nenhum tratamento vacinal legalizado para uso. As estratégias vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais têm demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli com propriedades antigênicas preservados. As condições de cultura foram optimizadas, o que permitiu a expressão dessa proteína na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos após desafio letal com DENV2. A combinação da NS5 com poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 levou a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Os resultados indicam que a proteína NS5 obtida preserva determinantes antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do DENV, busca de drogas antivirais e desenvolvimento de vacinas. / Dengue fever is a disease affecting millions of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those based on structural proteins. The DENV nonstructural protein 5 (NS5), plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide 720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV\'s biology, search for anti-viral drugs and vaccine development.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Aproximadamente 10 milhões de pessoas que vivem em áreas endêmicas estão infectadas com P. brasiliensis e até 2% destas podem desenvolver a PCM. Períodos extensos de quimioterapia são necessários e problemas de recidiva da doença são frequentes. Vacinas anti-PCM ainda não estão disponíveis para uso em humanos, porém, nos últimos anos, testes em modelo animal mostram que estratégias vacinais são viáveis. Formulações vacinais baseadas na proteína gp43 e no peptídeo P10 específico para células T CD4+ mostram-se promissores como antígenos vacinais. No presente trabalho, testamos as propriedades de uma formulação vacinal terapêutica baseada no peptídeo P10 combinado com flagelina de S. enterica, associada ou não a quimioterapia, como tratamento da PCM experimental. Os resultados indicaram que animais tratados apenas com a vacina, combinada ou não com os quimioterápicos, não demonstraram uma redução significativa da carga fúngica no pulmão. No entanto granulomas mais organizados foram observados no pulmão dos animais que receberam a formulação vacinal. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Approximately 10 million people living in endemic areas may be infected with this fungus and up to 2% of them may develop the disease. Extended periods of chemotherapy are often necessary to treat PCM and relapses occur frequently. PCM vaccines are not yet available for use in humans, but in recent years tests in animal models showed that vaccine strategies are viable. Vaccine formulations based in protein gp43 and a derived peptide P10, representing a CD4+ T cell-specific epitope, have showed promising results as vaccine antigens. In the present work, we tested the properties of a vaccine formulation based on the P10 peptide admixed with the S. enterica flagellin, in combination or not with chemotherapy, as a PCM therapeutic treatment. Treated mice, combined or not with chemotherapy, showed no significant reduction in lung fungal burden. Nonetheless, more organized lung granulomas were observed in animals that received the vaccine formulation.

Câncer cervical é a terceira causa de morte em mulheres no mundo, e a quarta causa de morte em mulheres no Brasil. Seu principal agente etiológico é o vírus do papiloma humano (HPV), e diversos estudos estão sendo feitos na tentativa de desenvolver abordagens terapêuticas que combatam tumores induzidos por HPV. Nesse contexto, surgem às vacinas de DNA, capazes de induzir resposta imune específica contra esse tipo de tumores em camundongos. Entretanto essas vacinas apresentam baixa imunogenicidade em humanos, sendo necessária estudar abordagens que aumentem a potência dessas vacinas. Eletroporação in vivo (EP) é um método de entrega de vacinas de DNA, capaz de elevar potência das mesmas. Nosso grupo desenvolveu uma imunoterapia baseada em DNA (pgDE7h), e quando associamos a EP em nossa imunização pela via intramuscular, observamos aumento do efeito antitumoral e da frequência T CD8+E7-específicas e citotóxicas, migração de células para o sítio de inoculação do DNA, indução de células T polifuncionais e de memória, além de maior avidez de células T ativadas. / Cervical cancer is the third leading cause of death in women worldwide, and the fourth leading cause of death in women in Brazil. Its main etiological agent is human papilloma virus (HPV), and several studies are being done in trying to develop therapeutic approaches that fight tumors induced by HPV. In this context, there are the DNA vaccines are capable of inducing specific immune response against this type of tumors in mice. However, these vaccines have a low immunogenicity in humans, it is required to study approaches to increase the potency of these vaccines. In vivo electroporation (EP) is a method of delivering DNA vaccines, capable of raising power of the same. Our group has developed a DNA-based immunotherapy (pgDE7h), and when associate EP in our immunization by intramuscularly observed increase antitumor effect and frequency CD8+E7-specific and cytotoxic, cell migration for the inoculation site of the DNA polyfunctional T cell induction and memory, and higher avidity for activated T cells.

A busca por adjuvantes capazes de estimular eficiente resposta imunológica celular representa uma importante contribuição para a pesquisa de vacinas. No presente trabalho avaliamos o potencial adjuvante de flagelinas de Salmonella para a ativação de linfócitos T, com ênfase na ativação de linfócitos T CD8+, em animais imunizados com diferentes estratégias vacinais, desde vacinas baseadas em linhagens atenuadas de Salmonella; vacinas acelulares que empregaram flagelinas purificadas co-administradas, ou em fusão, a antígenos alvo e, ainda, vacinas de DNA. Nossos resultados demonstram que a utilização de flagelina na forma de vacina de DNA induziu maior proteção terapêutica que a mesma formulação utilizada na forma de vacinas de subunidades, sugerindo que os efeitos adjuvantes da flagelina para ativação de CTLs não estão relacionados apenas a ligação ao TLR5. Os resultados apresentados na presente tese contribuem para a compreensão dos mecanismos de adjuvanticidade da flagelina de Salmonella, particularmente no contexto da ativação de células T. / The search for adjuvants that are able to stimulate an efficient cellular immune response represents an important contribution in vaccine development. In this study, we evaluated the potential of Salmonella flagellin as adjuvant for activation of T lymphocytes, with emphasis on the activation of CD8+ T cells, on the mice immunized with different approaches such as vaccines based on attenuated Salmonella strains; acellular vaccines with purified flagellin co-administered or genetically fusioned to the target antigen; or even DNA vaccines. Our results demonstrate that the use of flagellin in the form of DNA vaccines induced greater therapeutic protection than the same formulation used in the form of subunit vaccines, suggesting that the adjuvant effects of flagellin to the activation of CTLs are related not only to link to TLR5. The results presented in this work contribute significantly to the understanding of the mechanisms of flagellin adjuvanticity, particularly in the context of activation of responses mediated by T cells.

A maioria dos tratamentos antifúngicos são longos e não eficazes, portanto, há uma necessidade de pesquisa de novas alternativas. A fim de prospectar novos epitopos para uma vacina para Paracoccidioides lutzii e Cryptococcus spp.. Foi desenvolvido um sistema com o objetivo de purificar epitopos de macrófagos no contexto de MHCII. Além disso, houve pesquisa de epítopos na parede celular e sobrenadante de Paracoccidioides spp. A atividade antifúngica da miltefosina foi avaliada contra Paracoccicioides spp.. A miltefosina demonstrou atividade inibitória similar à anfotericina B. A atividade fungicida ocorreu em baixas concentrações, se observou alterações ultraestruturais e formação de melanina. A atividade do C7a in vitro e in vivo contra Candida spp. foi analisada. Os resultados mostraram atividade fungicida em valores baixos. Além disso, foi visto inibição da formação de hifas / pseudohifas e alterações morfológicas. Os ensaios in vivo demonstraram uma diminuição significativa na infecção em um modelo de candidíase vaginal e sistêmica. / Most of antifungal treatments are not completely effective or long, thus there is a need to search new alternatives. In order to prospect new epitopes for a vaccine to Paracoccidioides lutzii and Cryptococcus spp.. A system was developed with the purpose of purify epitopes from macrophages in the context of MHCII. Also, a search for epitopes in the cell wall and supernatant of Paracoccidioides spp. was done. The antifungal activity of miltefosina was evaluated against Paracoccicioides spp.. Miltefosine demonstrated inhibitory activity similar to amphotericin B. Fungicidal activity occurred at low concentrations, ultrastructural alterations and melanin production were observed. The activity of C7a in vitro and in vivo against Candida spp. was analyzed. The results showed fungicidal activity at low values. Also, it was revealed that inhibition of formation of hyphae/pseudohyphae and morphological alterations. In vivo assays demonstrated a significant decrease of fungal border of intravaginal and intravenous infected mice.