Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Coorientador: João Ferreira de Lima Neto / Banca: Fernanda da Cruz Landim Alvarenga / Banca: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Resumo: O estudo avaliou a viabilidade in vitro do biomaterial "Selante de Fibrina derivado de veneno de serpente" (SF), como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) de ratos. O SF é um material caracterizado como adesivo biológico, e foi produzido e fornecido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP, Brasil. As CTMs foram coletadas a partir da medula óssea de fêmures e tíbias de ratos e foram caracterizadas por meio de citometria de fluxo com auxilio de marcadores positivos: CD 44 e CD 90 (CTMs) e marcador negativo: CD 34 (células tronco hematopoiéticas). Cultivos foram induzidos para diferenciarem-se em linhagens específicas (osteogênico, condrogênico e adipogênico). Para avaliação do crescimento in vitro e a viabilidade celular em conjunto ao biomaterial foram utilizadas microscopia óptica de luz invertida, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O SF em contato com as CTMs não induziu a diferenciação espontânea para as linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. As diferentes técnicas de avaliação microscópica utilizadas mostraram que o SF foi capaz de realizar a captura e manutenção das CTMs e houve interação das células com o interior e superfície do biomaterial. Portanto, a coleta, o cultivo e a caracterização das CTMs de ratos foram possíveis. O SF mostrou-se eficiente como arcabouço biológico e interagiu com as células tronco mesenquimais mantendo-as viáveis, oferecendo-se como uma ferramenta de uso clínico-cirúrgico alternativa para processos regenerativos visando terapias mais eficientes / Abstract: This study evaluated the in vitro viability of biomaterial Fibrin Sealant (FS) derived from snake venom as a scaffold for rat mesenchymal stem cells (MSCs). The FS is characterized as a biological adhesive material, and is produced and was supplied by the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, CEVAP, Brazil. MSCs were collected from the bone marrow of femurs and tibias of rat and were characterized using flow cytometry with CD 44 and CD 90 positive markers (MSC) and CD34 negative marker (mononuclear stem cells). Cultivations were induced to differentiate into specific cell lineage (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). To evaluate the in vitro growth and cell viability with the biomaterial were used inverted light optical microscopy, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy and transmission. The SF did not cause the spontaneous differentiation in contact with MSCs to osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage. Different microscopy techniques showed that the SF was able to accomplish the capture and maintenance of MSCs and there was interaction with the cell interior and surface of the biomaterial. Finally, the collection, cultivation and characterization of rat MSCs were possible. The SF was effective as a biological scaffold and interacted with the MSCs keeping them viable offering itself as a tool for clinical and surgical alternative providing clinical and surgical therapies more efficient for regenerative processes / Mestre

Orientador: Odair Correa Bueno / Banca: Ednildo de Alcantara Machado / Banca: Ana Yoshi Harada / Banca: Jacenir Reis dos Santos Mallet / Banca: Neusa de Lima Nogueira / Resumo: A formiga lava-pés Solenopsis saevissima Smith está entre os insetos que mais causam acidentes no Brasil, e é uma espécie pouco estudada. A presente série de investigações tenta suprir um pouco da necessidade de estudos com esta importante espécie no Brasil. Primeiramente são relatados detalhes da biologia de S. saevissima em comparação com outras espécies de formigas lava-pés: pela primeira vez é mostrada uma lista de artrópodes associados a estes formigueiros no Brasil, incluindo uma série de novos táxons, dos quais um é aqui descrito; as larvas desta espécie são descritas e comparadas com o que se sabe sobre as larvas de outras lava-pés, sendo visto que as semelhanças encontradas são extensas demais para permitir a utilização de caracteres larvais para filogenia e taxonomia em nível de espécie. Ainda na morfologia, são apresentados resultados de análise ultraestrutural do aparato de veneno por meio de microscopia ótica e eletrônica, onde é mostrado que as diferentes regiões do órgão apresentam especializações para a produção de cada um dos compostos do veneno. A composição do veneno desta espécie foi analisada pela primeira vez, onde verificou-se que acima de 90% do veneno de S. saevissima é composto de isômeros cis e tras de um mesmo alcalóide piperidinico oleoso, sendo o restante uma solução aquosa de toxinas protéicas, incluindo neurotoxinas, fosfolipases, e alérgenos. De uma forma geral, o veneno de S. saevissima tem uma diversidade menor de compostos que o de Solenopsis invicta, podendo figurar entre os motivos que explicam porque a espécie S. invicta é uma espécie invasora e S. saevissima não. São apresentados pela primeira vez evidências químicas da existência de espécies crítpticas dentro de S. saevissima. Tomados em conjunto, os resultados suprem um pouco da carência de estudos com as formigas lava-pés... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fire ant Solenopsis saevissima Smith is one of the insects most frequently involved in accidents in Brazil, yet being a poorly studied species. The series of studies presented here aimed at filling some of this gap in knowledge about this common and important ant species. Some aspects of the field biology of S. saevissima are shown in comparison with other fire ants: a unique list of associated arthropods collected from field inspections in Southern Brazil is given, which includes several new taxa, one of which is herein described for the first time. The larvae of S. saevissima are described for the first time and compared with larvae from close species, culminating with the demonstration that larval characters within this group cannot be feasibly employed in species-level phylogenetic and taxonomic analyses. In terms of internal anatomy, a detailed ultrastructural description of the venom apparatus of S. saevissima is given, wherein special emphasis was given to the particular organisation of each region of the apparatus, suggesting there are specialised areas for the production of each venom compound. The venom of this species was subject of biochemical analyses for the first time, generally illustrating that the venom of S. saevissima is >90% made of a simple mixture of cis- and trasundecil- pyperidinic alkaloids, being the remainder an aqueous solution of toxic proteins, comprising neurotoxins, and traces of phospholipases and allergens. The venom of S. saevissima proved being less diverse in toxins than the venom of Solenopsis invicta, possibly explaining why S. invicta is a successful invasive species while S. saevissima apparently is not. Moreover, herein is included the first record of intraspecific variation in the nature of venom alkaloids, providing biochemical evidence for the existence of cryptic species in S. saevissima. Taken together, the obtained... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

In this work a new metalloproteinase (BthMP) was purified from the snake venom of Bothrops moojeni. This enzyme was homogeneous by native and SDSPAGE it showed polypeptide chain of 23,5 kDa, pI = 7,1 and N-terminal blocked. BthMP is comprised of high proteolytic activity on casein, fibrin and bovine fibrinogen, but no coagulating, esterase, phospholipase A2 activities, and lightly hemorrhagic; it was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenanthroline and maintained its activity on pH of 7,0 at 9,0 and temperature of 5 to 40°C. Assays with metal ions showed that Ca++ is an activator, whereas Zn++ and Hg++ inhibited about 50 and 80%, respectively. The edema evidenced the important role of the toxin in the inflamatory activity of the venom. BthMP also caused uncloting, and provoked histological alterations in gastrocnemius muscle of mice inducing hemorrhage, necrosis and leucocytic infiltrate. The molecular mass and the inhibition assays suggest that the metalloproteinase BthMP belongs to class P-I SVMPs. / Neste trabalho uma nova metaloproteinase (BthMP) foi purificada do veneno da serpente Bothrops moojeni. A protease é homogênea em PAGE-SDS e nativa, apresentou uma única cadeia polipeptídica de 23,5 kDa, pI = 7,1 e Nterminal bloqueado. BthMP é provida de alta atividade proteolítica sobre a caseína, fibrina e fibrinogênio bovino; foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10- fenantrolina e manteve sua atividade em pH de 7,0 a 9,0 e temperatura de 5 a 40°C. Ensaios com íons metálicos mostraram que Ca++ é ativador, enquanto Zn++ e Hg++ inibiram cerca de 50 e 80%, respectivamente. BthMP é desprovida de atividades coagulante, esterásica, fosfolipásica e fracamente hemorrágica quando comparada ao veneno bruto. O edema induzido pela metaloprotease evidenciou o importante papel da toxina na atividade inflamatória do veneno. BthMP também causou incoagulabilidade sanguínea, e provocou alterações histológicas em músculo gastrocnêmio de camundongos induzindo hemorragia, necrose e infiltrado leucocitário. A massa molecular e os ensaios de inibição com EDTA e 1,10-fenantrolina sugerem que a metaloproteinase BthMP pertence à classe P-I das SVMPs. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / CHAPTER II: Toxoplasmosis affects a third of world population with high incidence in tropical areas. Since this disease has great relevance in health public, the search for new therapeutic approaches has been considered. Here, we report the antiparasitic effects of BnSP-­7 toxin, a Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops pauloensis snake venom, on Toxoplasma gondii. BnSP-­7 presented activity against HeLa host cells in higher doses (200 μg/mL to 50 μg/mL) by MTT assay, whereas in lower doses (25 μg/mL to 1.56 μg/mL) does not interfere with HeLa viability. Also, the toxin did not presented effects on T. gondii tachyzoite viability as carried out by trypan blue exclusion, but decreased both adhesion and parasite proliferation, when tachyzoites were treated before infection. We also performed cytokine measurements from supernatants collected from HeLa cells infected with T. gondii tachyzoites previously treated with RPMI or BnSP-­7. MIF and IL-­6 productions by HeLa cells were increased by BnSP-­7 treatment. These data suggest that the BnSP-­7 toxin is an important tool for the discovery of new parasite targets that can be exploited to develop new drugs for toxoplasmosis treatment. / CAPÍTULO II: A toxoplasmose afeta um terço da população mundial com alta incidência em áreas tropicais. Uma vez que esta doença tem grande relevância na saúde pública, a busca por novas abordagens terapêuticas são constantemente exigidas. Neste trabalho nós relatamos os efeitos antiparasitários da toxina BnSP-­7, uma fosfolipase A2 Lys49 homóloga da peçonha de Bothrops pauloensis, em Toxoplasma gondii. BnSP-­7 apresentou citotoxicidade contra células HeLa em doses mais elevadas (200 μg/mL a 50 ug/ ml), enquanto que em doses mais baixas (25 ug/ml a 1,56 ug/ml), a toxina não interferiu na viabilidade da HeLa. A toxina não alterou a viabilidade de formas taquizotas de T. gondii, realizado pelo ensaio de exclusão de azul de tripan, mas diminuiu tanto a adesão quanto à proliferação desses parasitas, quando foram tratados antes da infecção. Também foi realizado a dosagem de citocinas a partir de sobrenadantes recolhidos a partir de células HeLa infectadas com formas taquizoítas de T. gondii previamente tratados com meio RPMI ou BnSP-­7. A produção de MIF e IL-­6 foram aumentadas pelas células HeLa após o tratamento com BnSP-­7. Estes dados sugerem que a toxina BnSP-­7 é uma ferramenta importante para a descoberta de novos alvos de parasitas que podem ser explorados para desenvolver novos fármacos para o tratamento da toxoplasmose. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chapter II: In the present study, a metalloproteinase named BpMPI was isolated from Bothropoides pauloensis snake venom and its biochemical, enzymatic and immunochemical characteristics were determined. BpMPI was purified in two chromatography steps on ion exchange resins CM-Sepharose Fast flow and Sephacryl S-300. This protease was homogeneous on SDS-PAGE and showed a single chain polypeptide of 23 kDa under reducing conditions. The primary structure of the enzyme showed high similarity with other SVMPs enzymes from snake venoms. BpMPI showed proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at high temperatures. BpMPI was able to hidrolyse glandular and tecidual kallikrein substrates, but was unable to act upon factor Xa and plasmin substrates. The enzyme did not able to induce local hemorrhage in the dorsal region of mice even at high doses. Immunochemistry studies showed that BpMPI was high immunogenic and the antibodies anti-BpMP-I were very efficient to neutralize the hemorrhagic activity and systemic alterations induced by Bothropoides pauloensis snake venom. / Capítulo II: No presente estudo, uma metaloproteinase denominada BpMPI foi isolada da peçonha da serpente Bothropoides pauloensis e suas características bioquímicas, enzimáticas e imunoquímicas foram determinadas. BpMPI foi purificada utilizando dois passos cromatográficos em resinas de troca iônica CM-Sepharose Fast Flow e Sephacryl S-300. Esta protease mostrou-se homogênea em SDS-PAGE apresentando uma única cadeia polipeptídica de 23 kDa sob condições redutoras. A estrutura primária da enzima mostrou alta similaridade com outras enzimas SVMPs de venenos de serpentes. BpMPI mostrou atividade proteolítica sobre azocaseina e fibrinogênio bovino e foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina e β- mercaptoetanol. Além disso, esta enzima apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas. BpMPI também foi capaz de hidrolisar os substratos da calicreína glandular e tecidual, mas foi incapaz de hidrolisar os substratos do fator Xa e plasmina. A enzima não foi capaz de induzir hemorragia local na região dorsal de camundongos mesmo em altas doses. Estudos imunoquímicos demostraram que os anticorpos anti-BpMP-I foram eficientes em neutralizar a atividade hemorrágica e as alterações sistêmicas induzidas pela peçonha de Bothropoides pauloensis. / Mestre em Genética e Bioquímica

A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-06-22T20:27:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2576144 bytes, checksum: fb628d04d3221c6ac7ccaf79cc3d60ea (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com), reason: on 2018-06-22T20:38:02Z (GMT) / Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-06-22T20:39:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-27T11:25:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-27T11:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Bj-PRO-7a, a heptapeptide isolated and identified from Bothrops jararaca (Bj) venom, evoke potent therapeutic effects, as antihypertensive effect, natriuretic and diuretic effects, promotion of angiogenisis and vasodilatation. The effects of heptapeptide are independent of Angiotensin Converting Inhibitor (ACE), possibly dependent of Muscarinic Receptors subtype 1 (M1R) activation and oxido nitric pathways. Also, the Bj-PRO-7a actions upon central nervous system still need to be evaluated. Thus, the aims of this study were: i) to assess the effects of acute administration of Bj-PRO-7a upon behavior; ii) to reveal mechanisms involved in the effects of Bj- PRO-7a upon locomotion/exploration, anxiety and depression-like behaviors. For this purpose, adult male Wistar (WT) and Spontaneous Hypertensive Rats (SHRs) (300-380 g) received i.p. injections of Vehicle (NaCl 0.9%), Diazepam (2 mg/kg), Imipramine (15 mg/kg), Bj-PRO-7a (71, 213 or 426 nmol/kg), Pirenzepine (852 nmol/kg), α-metil-DL-tirosina (200 mg/kg) or Chlorpromazine (2 mg/kg) and were placed in the Elevated Plus Maze (EPM), Open Field (OF) and Forced Swimming (FS) tests. The heptapeptide promoted anxiolytic and antidepressantlike effects and increased the locomotion/exploration. These effects of Bj-PRO-7a seem to be strongly dependent on activation of M1R, catecholaminergic paths and dopaminergic receptors. / O Bj-PRO-7a, um heptapeptídeo isolado e identificado no veneno da Bothrops jararaca (Bj), evoca potentes efeitos terapêuticos, tais como o efeito anti-hipertensivo, efeitos natriurético e diurético, promoção da angiogênese e vasodilatação. Os efeitos do hepapeptídeo são independentes da inibição sobre a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), possivelmente dependentes da ativação dos Receptores Muscarínicos de Acetilcolina subtipo 1 (M1Rs) e vias do óxido nítrico. Ademais, as ações do Bj-PRO-7a sobre o sistema nervoso central ainda precisam ser avaliadas. Assim, os objetivos deste estudo foram: i) acessar os efeitos da administração aguda do Bj-PRO-7a sobre o comportamento; ii) revelar os mecanismos envolvidos nos efeitos do Bj-PRO-7a sobre a locomoção/exploração, comportamento tipo-ansiedade e depressão. Para esse propósito, ratos machos adultos Wistar (WT) e Espontaneamente Hipertensos (SHR) (300-380 g) receberam injeções i.p. de Veículo (NaCl 0,9%), Diazepam (2 mg/kg), Imipramina (15 mg/kg), Bj-PRO-7a (71, 213 ou 426 nmol/kg), Pirenzepina (852 nmol/kg), α-metil-DL-tirosina (200 mg/kg) ou Clorpromazina (2 mg/kg) e foram colocados nos testes de Labirinto em Cruz Elevado (LCE); Campo Aberto (CA) e Nado Forçado (NF). O heptapeptídeo promoveu efeito tipo-ansiolítico e antidepressivo e aumentou a locomoção/exploração. Esses efeitos parecem ser fortemente dependentes da ativação dos M1Rs, vias catecolaminérgicas e receptores dopaminérgicos.

Neste trabalho, mostramos que a extração de veneno promove aumento na ativação dos fatores de transcrição NF<font face=\"symbol\">kB e AP-1. Noradrenalina, liberada após extração de veneno, é responsável por esse aumento. A estimulação dos adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b estão envolvidos nessa resposta, entretanto, o grau de ativação de AP-1 é alterado dependendo do tempo. Foi verificado dimorfismo sexual na ativação dos fatores de transcrição da glândula de veneno, sendo a ativação de NF<font face=\"symbol\">kB mais rápida nas fêmeas do que nos machos e a ativação de AP-1 maior nas fêmeas. Mostramos ainda que a extração de veneno ativa a glândula de veneno através da estimulação da inervação noradrenérgica. Noradrenalina atuando em adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b regula a síntese de proteínas da glândula de veneno e não a síntese de toxinas do veneno. Em conclusão, a estimulação da inervação noradrenérgica desencadeia o ciclo de produção de veneno regulando a síntese de proteínas da glândula que provavelmente são essenciais para sua ativação e posterior produção de veneno, através da ativação de fatores de transcrição. Thesis: Noradrenergic Innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake. / In this work we showed that venom extraction increases the activation of transcription factors like NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1. Noradrenaline released after venom extraction is responsible for NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Stimulation of both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors is involved in this response, however the increase of AP-1 activation is time dependent. A sexual dimorphism has been verified in NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Activation of NF<font face=\"symbol\">kB occurs earlier in female than in male snakes and activation of AP-1 is greater in female than in male snakes. We also showed that venom extraction activates venom gland by stimulating noradrenergic innervation. Noradrenaline acting at both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors regulates synthesis of protein of the venom gland, but not the toxin of the venom. In conclusion, stimulation of noradrenergic innervation triggers the venom production cycle by regulating synthesis of protein that probably is essential to activate venom gland to produce venom by activating transcription factors.

Na Martinica, os envenenamentos por Bothrops lanceolatus apresentam um quadro clínico trombótico, acompanhado de inflamação local extensa, envolvendo edema, dor e hemorragia limitada. Neste estudo foi mostrado que vários componentes do veneno compartilham similaridades antigênicas com venenos de espécies da América do Sul. O veneno de B. lanceolatus é citotóxico para queratinócitos e células endoteliais, induzindo a produção de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias pelas células. O veneno de B. lanceolatus ativa a cascata do complemento, liberando anafilatoxinas, assim como o complexo terminal do complemento. Ele apresenta uma ação proteolítica sobre os componentes purificados C3, C4, C5, e o inibidor de C1, C1-INH. O veneno também desequilibra o balanço de expressão dos reguladores do complemento na membrana das células endoteliais. Estes dados demonstram que o veneno de B. lanceolatus exibe uma potente ação proinflamatória, pela ativação do sistema complemento e pela sua toxicidade em células endoteliais. / In Martinique envenomations by Bothrops lanceolatus are characterized by a systemic thrombotic syndrome and important local inflammation, involving oedema and pain, but limited haemorrhage. In this study, we show that several components of B. lanceolatus venom share antigenic similarities with South American Bothrops species. Still, B. lanceolatus venom proteases present substrate specificity. The venom is cytotoxic for keratinocytes and endothelial vascular cells, inducing the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. B. lanceolatus venom activates the complement cascade, releasing anaphylatoxins and the terminal complement complex. It also shows a direct proteolytic activity upon the purified complement proteins C3, C4, C5, and the inhibitor of C1, C1-INH. B. lanceolatus venom modified the balance of complement regulators on endothelial cells membrane. In conclusion, B. lanceolatus venom displays important pro-inflammatory properties, as it activates the complement cascade and impacts endothelial cells.

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:40:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dourado_DorotyMesquita_D.pdf: 6138629 bytes, checksum: 583afdc02d280fcf5b42546f6eeb5981 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O estudo de substâncias naturais visa não só a caracterização dos seus princípios ativos e efeitos biológicos, mas também a compreensão de fenômenos patofisiológicos que muitas vezes são reproduzidos experimentalmente por essas substâncias. Dentre estas, nos países de clima tropical, os venenos ofídicos merecem importância particular pela riqueza de constituintes farmacologicamente ativos e pela freqüência dos acidentes causados por picada de serpentes venenosas, particularmente abundantes em países tropicais. No Brasil, esses acidentes adquirem relevância em termos de saúde pública porque podem causar graves alterações sistêmicas e no local da picada, sendo o gênero Bothrops responsável por 90% deles. Neste trabalho, as alterações patológicas locais e sistêmicas (mionecrose, edema e hemorragia) induzidas pela injeção intramuscular (i.m.) do veneno de Bothrops moojeni (40 µg/mL, 0,1 ml/100 g do peso do animal) em camundogos foram estudadas histologicamente, através da contagem de capilares e pela imunomarcação do fator de crescimento endotelial de vasos (VEGF) no músculo gastrocnêmio e pelas alterações nos níveis séricos das enzimas creatino kinase (CK), fosfatase ácida (AcPase), fosfatase alcalina (AlkPase), desidrogenase lática (LDH), transaminase oxalo-acética (AST) e da proteína mioglobina ao longo de 3, 12, 24 horas, 3, 7 e 21 dias (n = 5/período) após o envenenamento. Os efeitos de protocolos de irradiação por lasers de baixa potência, HeNe (632,8 nm) e o diodo AsGa (904 nm), ambos com densidade de energia de 4 J/cm², sobre esses parâmetros foram avaliados. A primeira sessão de irradiação foi administrada logo após a injeção i.m. do veneno e depois a cada 24 h, de forma que o número de irradiações feito foi uma, uma, duas, 4, 8 e 22, respectivamente, incididas perpendicularmente no local da injeção por 120 s (HeNe) e 18,3 s (GaAs) de duração de cada sessão. Para as dosagens de LDH, AST e mioglobina o tempo zero, sem irradiação foi acrescentado. Os resultados foram comparados com animais controles, injetados com solução salina estéril (0,9%). Morfologicamente, o veneno produziu imediata série de alterações, a qualidade das quais mostrou-se semelhante das 3 às 24 h (pós-injeção) p.i., porém com aumento do número de células mionecróticas e de infiltrado inflamatório. A fase regenerativa iniciada 3 d p.i., mostrou crescente número de fibras em regeneração, decrescente número de fibras degeneradas e substituição de polimorfos nuclerares por população de macrófagos. Histologicamente, a irradiação pelo HeNe atenuou as alterações iniciais (3 h), porém a do AsGa foi mais efetiva em longo prazo (21 d), induzindo ao maior número de miotubos e à melhor citoarquitetura do tecido. A contagem do número de vasos sangüíneos no local e vizinhanças da lesão, mostrou que o grupo tratado com veneno e não irradiado com laser de baixa energia teve diminuição do número médio de capilares na área afetada, e que a irradiação laser acelerou a neovascularização, sendo o HeNe mais eficaz do que o AsGa. Os resultados também mostraram que o VEGF e seus receptores foram expressos em parte dos neutrófilos, em esparsas células satélites nos períodos iniciais do envenenamento (3 ¿ 24 h), nos capilares das áreas periféricas à lesão, e nos interstícios de fibras em degeneração. A irradiação com HeNe induziu o aparecimento desse marcador nos polimorfonucleares, mas o AsGa aboliu a positividade a eles. O HeNe promoveu a expressão de VEGF nos capilares dos tendões e nas células musculares intactas. Aos 7 d p.i., na região das fibras regenerativas a irradiação com HeNe levou ao aparecimento de positividade em células do interstício semelhantes a fibroblastos, além de marcação em células ¿satélites¿ de miotubos em formação. A irradiação por ambos os lasers induziu também o aparecimento de VEGF positivo nos fibroblastos do tendão que atravessava o músculo, nas camadas média e adventícia de pequenas artérias e veias e nos fusos neuromusculares, além do interstício dos ramos nervosos intramusculares, principalmente nos períodos de 7 e 21 dias. Os resultados da análise das enzimas mostraram que a irradiação pelo laser HeNe reduziu marcadamente a atividade de CK de 3 h até 7 dias, enquanto o laser AsGa de 12 h até 21 dias p.i. A atividade da AcPase aumentou dramaticamente às 12 h p.i., após o que houve um declínio que foi mais acentuado com o laser AsGa. A irradiação com o laser HeNe induziu aumento gradual da atividade de AlkPase até 24 h e então diminuiu-a, ao passo que o laser AsGa causou um extraordinário aumento entre 12 h e 24 h, mantendo diferença signifitiva em relação ao grupo veneno de camundongos não irradiados. A irradiação com HeNe não foi eficaz em diminuir os níveis de LDH, ao invés foi prejudicial elevando os seus níveis em diferentes momentos. Já a irradiação com AsGa foi eficaz em diminuir significativamente os níveis da enzima ao longo de todos os períodos observados. Com relação a AST, a irradiação com HeNe foi eficaz em diminuir os níveis da enzima apenas às 3 h p.i., após o que teve efeitos deletérios. Por outro lado, a irradiação com AsGa não foi eficaz em diminuir os níveis de AST, exceto aos 7 dias, quando houve redução significativa de16,6%. Os níveis elevados de mioglobina sérica causados pelo veneno de B. moojeni, foram diminuídos significativamente com o laser AsGa das 12 h p.i. até os 7 d, ao passo que o HeNe só mostrou eficácia dos 3 aos 7 d p.i. O grupo de camundongos injetados com solução salina não mostrou nenhuma diferença significante em todos os tempos analisados para esses parâmetros. Concluímos que a terapia laser de baixa energia, arsenieto de Gálio aplicada localmente é capaz de alterar o conteúdo sérico de biomarcadores de dano da fibra muscular (CK e mioglobina), como também de marcadores de alterações sistêmicas, como o laser HeNe foi eficaz para aumentar a quantidade de vasos sanguíneos no tecido lesado. A fotoestimulação promovida pela irradiação com laser de baixa energia pode alterar favoravelmente indicadores de alterações locais e sistêmicas causadas por envenenamento por Bothrops moojeni, apontando esse recurso como promissor na recuperação do músculo afetado e nos distúrbios sistêmicos advindos / Abstract: The study of natural substances aims not only characterization of its active principles and biological effects, but also the comprehension of pathophysiologic phenomena that frequently are reproduced experimentally by these substances. Among these substances, snake venoms deserve special importance for the richness of pharmacologically active components and the frequency of accidents caused by venomous snake bites, particularly abundant in tropical countries. In Brazil these accidents acquires relevance in terms of public health because they may cause severe systemic and local alterations, being the Bothrops genus responsible for 90% of them. In this work, the pathologic local and systemic alterations induced by the intramuscular (i.m.) injection of Bothrops moojeni venom (40 µg/mL, 0.1 ml/100 g of animal weight) in mice were studied histologically, by capillary counting, immunolabeling of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in the gatrocnemius and by the changes of creatinekinase (CK), acid phosphatase (AcPase), alkaline phosphatase (AlkPase), lactic acid desidrogenase (LDH), transaminase oxaloacética (TGO) and mioglobin serum levels at 3, 12, 24 hours, 3, 7 and 21 days (n = 5/period) after envenoming. The effects of protocols of irradiation using low potency lasers, HeNe (632.8 nm) and GaAs diode (904 nm), both with a energy density of 4 J/cm-2, on these parameters were evaluated. The first section of irradiation was administered soon after the i.m. injection of venom and then at each 24 h interval, in such a way that the number of irradiations done were one, one, two, 4, 8 and 22, respectively, applied perpendicularly right at the injection site during 120 s (HeNe) and 18.3 s (GaAs) duration for each session. For determination of LDH, TGO and mioglobin, a zero time without irradiation was added. The results were compared with control animals, injected with sterile saline (0.9%). Morphologically, the venom produced a immediate series of changes, the quality of which were similar from 3 to 24 h p.i., but with a progressive number of myonecrotic fibers and inflammatory infiltrate. The regenerative phase starting at day 3, showed a crescent number of regenerating and decreasing number of degenerated fibers with polymorphonuclear cells being replaced by macrophages. Histolgically, HeNe irradiation attenuated the first stages of degeneration (3 h), but GaAs¿s was more effective considering the whole period of observations (21 d), leading to the presence of higher number of miotubes and better cytoarchitecture of the tissue. The counting of capillaries at the site and periphery of lesion showed that the venom-injected unirradiated mice had a decrease in the average number of capillaries, and that laser irradiation accelerated the neovascularization, being HeNe more efficient than GaAs. The results also showed that VEGF and its receptors were expressed in a parcel of neutrophils, in sparce satellite cells in the initial periods of the envenoming (3 ¿ 24 h), in capillaries of the periphery of lesion and in the middle of the degenerating fibers. The irradiation with HeNe induced enhancement of VEGF expression in the neutrophils, but the GaAs abolished it. HeNe also promoted VEGF expression in the tendon capillaries and intact skeletal muscles. At 7 d p.i., VEGFlabeled fibroblast-like cells were seen in the regenerative region, as well as ¿satellite¿-like cells around developing miotubes after irradiation with HeNe. The irradiation by both lasers also induced VEGF positivity in tenocytes, in smooth muscle cells of blood vessels, in adventitia layer, in neuromuscular spindle and in the interstices of intramuscular nerves in the periods from 7 to 21 days p.i.. The results from serum enzymes showed that HeNe irradiation reduced markedly CK activity from 3 h to 7 days, whereas GaAs reduced it from 12 h to 21 days p.i.. AcPase activity increased dramatically at 12 h p.i. after which there was decline, which was more accentuated with laser GaAs. HeNe irradiation induced a gradual increase of AlkPase activity until 24 h p.i., followed by decrease, whereas GaAs caused an extraordinary increase between 12-24 h, maintaining a significant difference in comparison to the venom unirradiated mice. The irradiation with HeNe was not efficient in decrease the LDH levels; on the contrary, it was deleterious, elevating their levels. Conversely, the irradiation with GaAs was efficient in decrease significantly the enzyme levels during all observed periods. In regard to TGO, the irradiation with HeNe was efficient in diminishing the enzyme levels in the initial 3 h p.i., after which it was deleterious. On the other hand, irradiation with GaAs was not effective in minimizing AST serum levels, except at day 7 when there was a significant 16.6% reduction. The high mioglobin serum levels induced by B. moojen venom, significantly declined with GaAs from 12 h to 7 d p.i., while HeNe irradiation showed efficacy between 3-7 days p.i. The group of mice injected (I.m.) with sterile saline did not show any significant difference in all periods analyzed for these parameters. We conclude that therapy with low potency laser applied locally is capable of alter the serum content of muscle damage biomarkers (CK and myoglobin), as well markers of systemic alterations. The photostimulation promoted by low energy laser irradiation can alter favorably markers of local and systemic alterations caused by Bothrops moojeni snake envenoming, suggesting this approach as a promising resource for recovery of affected muscle as well as in the resulting systemic disturbances. Key-words: B. moojeni, CK, seric enzymes, morphometry, VEGF, laser irradiation / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural