O Vírus Respiratório Sincicial humano (hRSV human Respiratory Syncytial Virus) está entre os principais causadores de doenças do trato respiratório. O hRSV pertence à família Paramyxoviridae. Os sintomas da infecção podem variar de simples estado gripal a doença respiratória grave, e eventualmente levar a óbito. Atualmente não há vacina licenciada ou droga eficaz contra esse vírus. Anteriormente foram obtidos, em nosso laboratório, vetores com genes otimizados. Com essas ferramentas a proteína M foi produzida e purificada tendo sido possível obter anticorpos policlonais específicos e eficientes na sua detecção. Com esses anticorpos confirmamos a interação da proteína M com as proteínas celulares tropomiosina e nucleofosmina. Também foi demonstrado por imunofluorescência e por western blotting que a proteína M quando expressa fora do contexto de infecção apresenta localização nuclear e citoplasmática. Foram feitos testes de imunização com a proteína M purificada ou com um vetor eucariótico que a expressa (DNA). A imunização com proteína M resultou apenas em resposta humoral, enquanto com a vacina de DNA obtivemos apenas resposta celular. Nenhum desses imunógenos, entretanto, foi capaz de conferir proteção contra hRSV. / The human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is among the main causes of respiratory tract diseases, hRSV belongs to the Paramyxoviridae family. The symptoms of the infection can range from simple flulike state to severe respiratory disease eventually leading to death. Currently there is no licensed vaccine or effective drug against this virus. Vectors with genes optimized for of the hRSV Matrix protein (M) expression in bacteria and in eukaryotic cells were previously obtained in our lab. With these tools the M protein was produced and purified. Specific and efficient polyclonal antibodies could then be obtained and used for its detection. Using these antibodies we confirmed M interaction with cellular proteins tropomyosin and nucleophosmin. It was also demonstrated by immunofluorescence and western blotting that protein M when expressed out of viral infection context, presents cytoplasmic and nuclear localization. Immunization tests were made with the purified M protein or with a eukaryotic vector that expresses it (DNA). Immunization with M protein resulted only in humoral response, while with the DNA vaccine only cellular response was obtained. None of these antigens, however, was able to confer protection against hRSV.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-14Bitstream added on 2014-06-13T18:31:21Z : No. of bitstreams: 1 yamasaki_lht_me_sjrp.pdf: 6194517 bytes, checksum: 350d37acd1e46ef2885eecc1354a317c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) é considerada um grande problema de saúde pública, desde a sua descoberta em 1989. Entretanto a terapia mais utilizada atualmente, baseada no uso de Peginterferon, tem sucesso em aproximadamente 50% dos pacientes com o genótipo 1. Embora os mecanismos envolvidos nesta resistência viral ainda não sejam esclarecidos, sugere-se que fatores virais e do hospedeiro participam deste. A proteína não-estrutural 5A (NS5A) está envolvida em diversos processos celulares e é um componente essencial para o HCV. Entretanto, sua estrutura e função ainda não foram bem elucidadas. A partir destes fatos, os objetivos do presente estudo foram elaborar um modelo teórico da NS5A e investigar as propriedades estruturais e funcionais in silico. Foram analisadas 345 sequências da proteína NS5A do HCV de 23 pacientes infectados com o genótipo 1 ou 3. As composições de aminoácidos e de estrutura secundária demonstraram que há diferença entre os genótipos, podendo indicar que há diferenças nas interações proteína-proteína entre os genótipos, o que pode estar relacionado com a diferença da taxa de resistência ao tratamento. A análise funcional foi realizada com o ProtFun, que sugeriu que a NS5A estaria envolvida nas funções celulares de metabolismo intermediário central, tradução, crescimento, tranporte, ligação e hormônio. Estas funções variaram entre os domínios, suportando a hipótese de que a NS5A é uma proteína multifuncional. A análise pelo PROSITE indicou vários sítios de glicosilação, fosforilação e miristoilação, que são altamente conservados e podem ter função importante na estabilização da estrutura e função, sendo assim possíveis alvos de novos antivirais. Alguns deles estão em regiões relacionadas com a resposta ao tratamento. Outro... / Hepatitis C virus (HCV) infects almost 3% of people worldwide and it is considered the main cause of liver chronic diseases and transplants. Until today, there is no effective vaccine and the current most used therapy, based on Peginterferon, is successful only in 50% of patients infected by genotype 1. Although the outcomes of this treatment resistance are unclear, it is suggested host and virus factors may participate in this mechanism. Non-structural 5A (NS5A) protein is involved in several cellular and virus processes and it is a critical component of HCV. However, its structure and function are still uncertain. Regarding these facts, the present study attachments were to elaborate a model of the NS5A protein and to investigate NS5A structural and functional features, using in silico tools. It was analyzed 345 sequences of HCV NS5A protein from 23 patients infected by genotypes 1 or 3. Residues and secondary structure composition of all sequences demonstrated that there are differences between genotypes. It may indicate that there are differences in interactions between genotypes, which could be related with the distinct average of treatment resistance. In addition, among those that varied between genotypes, there were amino acids in regions that studies suggested as related with virus persistence. Functional analysis was performed with ProtFun. It suggested that NS5A is involved with central intermediary metabolism, translation, growth, transport, ligation and hormone functions in the cell. These functions vary between the domains, strengthening the hypothesis that NS5A is a multifunctional protein. Prosite motif search indicated that there are many glicosilation, fosforilation and myristoilation sites, which are highly conserved and may play an important role in structural stabilization and... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3209236 bytes, checksum: 730f245d59f62f2daccf53d9d6fb9b93 (MD5) Previous issue date: 2010-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lactic acid bacteria (LAB) can be infected and lysed by an extensive range of bacteriophages, which is recognized as the main cause of failure or slow fermentation in the modern dairy industry. Contaminated fermentation processes affect product quality or even cause its complete loss. Although technological advances have reduced the incidence of these infections, they certainly do not eliminated it. The objective of this work was the isolation, identification and molecular characterization of lytic bacteriophages of Lactococcus lactis from sera from lactic fermentation. For this, serum samples were collected from three different dairies facilities. From one of them, were isolated 17 bacteriophages, which were propagated in L. lactis grown in GM17 medium and molecularly characterized using the techniques of multiplex PCR, DNA restriction profile, protein profile, transmission electron microscopy, cloning and sequencing. The extraction of the genome of bacteriophages isolated and its analysis revealed a strand of DNA of 48 kb for phage LIMG1 and 42 kb for phage LIMG4, while phage protein profile allowed the distinction of four groups, and the differentiation between them was consistent with the sample from which they were isolated. The PCR, coupled to microscopic analysis, confirmed the presence of members of the group 936-type phages, Siphoviridae family, the most abundant in dairy products worldwide. Phages contain isometric heads with 50 nm in diameter and a 180 nm long tail, without basal plate. The amplified sequence of isolate LIMG1 revealed high identity with other members of 936-type phages, although two punctual mutations had differed LIMG1 from the others. / Bactérias do Ácido Láctico (BAL) podem ser infectadas e lisadas por uma extensa faixa de bacteriófagos, o que constitui reconhecidamente a principal causa de fermentação falha ou lenta na indústria de laticínios moderna. Processos fermentativos contaminados prejudicam a qualidade do produto ou causam até mesmo sua perda completa. Embora avanços tecnológicos tenham reduzido a incidência destas infecções, eles certamente não as eliminaram. Assim, o objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e caracterização molecular de bacteriófagos líticos de Lactococcus lactis a partir de soros provenientes de fermentações lácticas. Para isto, amostras de soro foram coletadas em três diferentes laticínios e, a partir deles, foram isolados 17 bacteriófagos, os quais foram propagados em L. lactis cultivado em meio GM17 e caracterizados molecularmente utilizando-se as técnicas de multiplex PCR, perfil de restrição enzimática de DNA, perfil proteico, microscopia eletrônica de transmissão, clonagem e sequenciamento. A extração do genoma dos bacteriófagos isolados e sua análise revelaram uma fita de DNA de 48 kb para o isolado LIMG1 e 42 kb para o isolado LIMG4, enquanto o perfil de proteínas dos fagos permitiu a distinção de quatro grupos, sendo que a diferenciação entre eles foi condizente com a amostra da qual foram isolados. A técnica de PCR, associada à análise microscópica, confirmou a presença de fagos do grupo 936, família Siphoviridae, o mais abundante em laticínios em todo o mundo. Foram encontrados fagos de cabeça isométrica de 50 nm de diâmetro e caudas longas de cerca de 180 nm de comprimento, sem placa basal. O sequenciamento do genoma do isolado LIMG1 revelou alta identidade com outros representantes do grupo 936, embora tenham sido encontradas duas mutações pontuais que o diferenciaram dos demais.

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: José Luiz Proença Módena / Banca: Maria Elisabete Jorge Amaral / Resumo: As infecções do trato respiratório estão associadas com mortalidade significativa no mundo inteiro e afetam principalmente crianças menores de cinco anos de idade. A maioria das infecções respiratórias é causada por agentes virais como: Vírus Sincicial Respiratório (RSV), Influenzavírus tipo A e B (FLUA e FLUB), Parainfluenza tipo 1, 2 and 3 (PIV-1, PIV-2 e PIV-3), Rhinovirus (HRV) e Metapneumovirus Humano (hMPV). O conhecimento da epidemiologia e prevalência desses vírus é importante para que metodologias terapêuticas possam ser aplicadas apropriadamente e saber como esses vírus estão circulando. O objetivo deste trabalho foi investigar a incidência de 8 tipos de vírus respiratórios em 279 amostras de aspirado nasofaríngeo obtidas de Julho/2004 a Setembro de 2005 de 120 crianças (73 do sexo masculino e 47 do sexo feminino) com idade entre 0 a 6 anos com sintomas de infecção respiratória aguda. A análise foi realizada pela técnica de RT-PCR e seqüenciamento direto. Nossos resultados mostraram que 27,2% (76/279) das amostras foram positivas para pelo um dos vírus respiratórios, sendo 84,2% (64/76) de Picornavírus, 76,3% (58/76) de Rhinovírus e 7,9% de Enterovírus (6/76), 7,9% (6/76) de RSV, 1,3% (1/76) de hMPV, 2,6% (2/76) de FLUA, 2,6% (2/76) de PIV-1 e 1,3% (1/76) de PIV-2. As infecções repetidas acometeram 29% (22/76) das crianças com infecção respiratória. A maioria das re-infecções, 82% (18/22), foram pelo gênero Rhinovírus. Os sintomas mais freqüentes foram coriza diagnosticada em 89,5% dos casos (68/76) seguido de tosse em 67,1% (51/76). Os Rhinovírus foram detectados em todo o período de estudo, com picos de infecção nos meses de inverno e outono, porém não houve associação significativa entre a presença viral e a sazonalidade. Neste estudo houve prevalência de infecção e re-infecção por Rhinovírus. Portanto, este estudo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Respiratory tract infections are associated with significant mortality worldwide and affect mostly children under five years of age. Most respiratory infections are caused by viral agents such as: Respiratory Syncytial Virus (RSV), the viruses of Influenza type A and B (FLUA and FLUB), Parainfluenza type 1, 2 and 3 (PIV-1, PIV-2 and PIV-3), Rhinovirus (HRV) and Human Metapneumovirus (hMPV). Knowledge of the epidemiology and prevalence of these viruses is important for therapeutic methods can be applied as appropriate and to know how these viruses are circulating. The aim of this work was to investigate the incidence of 8 types of respiratory viruses in 279 samples of nasopharyngeal aspirated obtained from July/2004 to September/2005 of 120 children (73 male and 47 female) with age between 0 to 6 years with symptoms of acute respiratory infection. The analysis was performed by RT-PCR and direct sequencing. Our results showed that 27,2% (76/279) of samples were positive at least for a type of the respiratory viruses, with 84,2% (64/76) of Picornaviruses, with 76,3% (58/76) of Rhinovírus e 7,9% of Enterovírus (6/76), 7,9% (6/76) of RSV, 1,3% (1/76) of hMPV, 2,6% (2/76) of FLUA, 2,6% (2/76) of PIV-1 and 1,3% (1/76) of PIV-2. The recurrent infections affect 29% (22/76) of children with respiratory infection. Most re-infections, 82% (18/22), were by Rhinovírus genus. The most frequent symptoms were runny nose diagnosed in 89.5% (68/76) followed by cough in 67.1% (51/76). Rhinovírus were detected throughout the study period, with peaks of infection during the winter and autumn, but there was no significant association between viral presence and seasonality. In this study there was prevalence of infection and re-infection by Rhinovírus. Therefore, this study provided better understanding of the circulation of respiratory viruses in a population of day care in the region... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os vírus influenza A (VIA) e circovírus suíno tipo 2 (PCV2) são os agentes etiológicos da influenza suína (IS) e da circovirose suína (CS), respectivamente. Estas doenças têm um impacto econômico significativo na suinocultura mundial. Adicionalmente, o VIA pode ser transmitido entre animais e humanos, sendo por isso, importante para a saúde pública. O presente trabalho teve o objetivo de pesquisar a ocorrência desses vírus em suínos de abate no sul de Moçambique. As amostras foram coletadas em um abatedouro na cidade da Matola, nos períodos de dezembro de 2014 a fevereiro de 2015 e dezembro de 2015 a fevereiro de 2016. Os materiais e métodos aplicados e resultados obtidos estão apresentados em dois artigos científicos. O primeiro relata a infecção pelo VIA associada à caracterização anatomopatológica e imuno-histoquímica (IHQ) das lesões pulmonares. Foram avaliados 457 pulmões de suínos, e amostras de 38 (8.3%) pulmões, que apresentaram áreas de consolidação, foram coletadas e submetidas ao exame histopatológico e IHQ para a detecção de antígenos do VIA, PCV2 e Mycoplasma hyopneumoniae. Antígenos do VIA foram detectados em 32/38 (84.3%) dos pulmões com pneumonia através da IHQ, e os suínos positivos eram provenientes dos distritos de Matutuine (5/32), Moamba (2/32), Namaacha (21/32), Boane (3/32) e Cidade da Matola (1/32). Todos os pulmões com pneumonia foram negativos no exame de IHQ para PCV2 e M. hyopneumoniae. O segundo artigo teve o objetivo de detectar lesões histológicas, antígenos e DNA de PCV2 em linfonodos mesentéricos de suínos e realizar a caracterização filogenética de isolados de PCV2 circulantes no sul de Moçambique. Foram coletados aleatoriamente 111 linfonodos mesentéricos de suínos de abate provenientes de nove distritos do sul de Moçambique. As amostras foram submetidas ao exame histopatológico, IHQ e reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma amostra positiva para PCV2 na PCR de cada distrito (n=9) foi selecionada aleatoriamente e submetida ao sequenciamento da região aberta de leitura ORF2. DNA de PCV2 foi detectado em 53.8% (62/111) das amostras e em 73.8% de granjas dos nove distritos. No exame de IHQ, linfonodos mesentéricos de seis suínos positivos para PCV2 na PCR apresentaram antígenos desse vírus associados à depleção linfoide e infiltrado de histiócitos e células gigantes multinucleadas. Na análise filogenética, sequências dos isolados dos distritos de Namaacha, Moamba e Maputo ficaram agrupadas no genótipo PCV2d-2; as sequências de isolados dos distritos de Manhiça e Matola, no genótipo PCV2d-1; enquanto os isolados dos distritos de Boane, Matutuine, Chibuto e Xai-Xai, no genótipo PCV2b-1A/B. Os resultados do trabalho permitem concluir que o VIA e PCV2 circulam na população suína em vários distritos da região sul de Moçambique. / Influenza A virus (IAV) and porcine circovirus type 2 (PCV2) are the etiological agents of swine influenza (SI) and porcine circovirus associated diseases (PCVAD) respectively. These diseases represent a significant economic impact on pig production worldwide. In addition, IAV can be transmitted between animals and humans with consequences for public health. The objective of this study was to investigate the occurrence of these viruses in slaughter pigs in Southern Mozambique. Samples were collected in a slaughterhouse in Matola city, from December 2014 to February 2015 and December 2015 to February 2016. The materials and methods applied and the results obtained are presented in two manuscripts. The first article reports IAV infection in pigs and characterize the anatomopathological and immunohistochemical features of the associated lung lesions. Lungs from 457 slaughtered pigs were evaluated grossly, and samples from 38 (8.3%) of these that presented pulmonary consolidation were collected and examined for histopathology and immunohistochemistry (IHC) for the presence of IAV, PCV2 and Mycoplasma hyopneumoniae antigens. IAV antigens were detected in 32/38 (84.3%) of pneumonic lungs, and positive pigs were from Matutuine district (5/32), Moamba district (2/32), Namaacha district (21/32), Boane district (3/32) and Matola City (1/32). All lung samples were immunohistochemically negative for PCV2 and M. hyopneumoniae. The second article aimed to detect histological lesions, PCV2 antigens and DNA and perform phylogenetic analysis of PCV2 strains circulating in Southern Mozambique. At slaughter, mesenteric lymph nodes were collected from 111 randomly selected pigs from nine districts of Southern Mozambique. Samples were submitted to histopathological examination, IHC and polymerase chain reaction (PCR). One PCV2 PCR positive sample from each district (n=9) was randomly selected in order to obtain sequences covering the ORF2 region. PCV2 DNA was detected in 53.8% (62/111) of the samples and 73.8% of the farms from all nine districts. PCV2 antigen was detected by IHC in six lymph nodes that were positive for PCV2 by PCR and antigens were associated with lymphoid depletion and infiltrate of histiocytes and multinucleated giant cells. Phylogenetic analysis demonstrated that three sequences from Maputo, Namaacha and Moamba were grouped with PCV2d-2, two sequences from Manhiça and Matola were grouped as PCV2d-1, and four sequences from Boane, Matutuine, Chibuto, and Xai-Xai were closely related to PCV2b-1A/B genotypes. The results of this study indicate that IAV and PCV2 circulate in the swine population in several districts of the southern region of Mozambique.

As doenças associadas ao circovírus suíno (DACS) causam impacto econômico negativo nos sistemas de criação de suínos no mundo todo. As perdas incluem tratamento da doença, mortalidade, bem como diminuição no desempenho dos animais. Uma das manifestações mais relevantes das DACS é a síndrome multissistêmica do definhamento dos suínos (SMDS). O principal agente patogênico na causa da SMDS é o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), no entanto, estudos observacionais e experimentais demonstraram que outros agentes estão envolvidos na patogênese e manifestação dos sinais clínicos. O sequenciamento de alto desempenho aliado a metagenômica são ferramentas que tornam possível a identificação da microbiota total de uma determinada amostra, independentemente de cultivo dos microrganismos. Visando contribuir para o conhecimento dos possíveis vírus envolvidos na SMDS, o presente trabalho realizou o sequenciamento genético de alto desempenho de soros de suínos e posterior análise do metagenoma resultante. Foram utilizadas amostras de soro coletadas em 2008, de 16 suínos com sinais clínicos da SMDS, entre 80 e 100 dias de idade, em uma granja no interior do Rio Grande do Sul. Os dados revelaram sequências virais de PCV2, parvovírus suíno tipo 1 a 6 (PPV1-6), torque teno vírus de suínos (TTSuV) tipo 1b, k2a e k2b e vírus de DNA circular de fita simples codificador de proteína associada a replicação (CRESS). A ocorrência de PCV2, PPV1-5 e TTSuV já foi descrita em suínos com SMDS, portanto este estudo reforça resultados anteriores. O PPV6 foi recentemente descrito na China, Europa e Estados Unidos, e os estudos não relacionaram o vírus com nenhuma doença específica de suínos. Os CRESS já foram identificados em todos os continentes, em vários tipos de amostras, incluindo fezes de suínos, mas sem nenhuma conexão com doenças de animais. Portanto, este é o primeiro relato de PPV6 e CRESS em suínos apresentando sinais de SMDS. Porém estudos posteriores são necessários para poder atribuir relação entre PPV6 e CRESS no desenvolvimento da SMDS. / Porcine circovirus associated disease (PCVAD) is one of the causes of negative economic impact on pig farming systems described worldwide. Losses include expenditures with treatment, increased mortality rates, and decreased productivity. One of the most relevant manifestations of PCVAD is the post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). The main pathogen present in PMWS is porcine circovirus type 2 (PCV2). However, observational and experimental studies have shown that other agents may be involved in the pathogenesis and clinical manifestation. High-throughput sequencing combined with metagenomics analyses make it possible to identify the total microbiota in a given sample, regardless of microorganism culture. In order to contribute to the knowledge of the viruses involved in PMWS, the present study carried out the high-throughput sequencing of swine sera and subsequent analysis of the resulting metagenome. Sixteen serum samples collected in 2008 on a farm in Rio Grande do Sul, from 80 and 100 days old pigs with clinical signs of PMWS, were examined. Data revealed viral sequences of PCV2, porcine parvovirus type 1 through 6 (PPV1-6), torque teno sus virus (TTSuV) types 1b, k2a and k2b and circular replication-associated protein (Rep) encoding single-stranded (CRESS) DNA viruses. The occurrences of PCV2, PPV1-5 and TTSuV have already been described in pigs with PMWS, so this study reinforces previous results. PPV6 was recently described in China, Europe and the United States, and the studies did not correlate the virus to any specific disease. CRESS DNA viruses have been identified on all continents in various types of samples, including swine feces, but without any connection to animal diseases. The present study is the first report of PPV6 and CRESS in pigs presenting PMWS signals. However, further studies are necessary to be able to attribute the relationship between PPV6 and CRESS in the development of SMDS.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

O parvovírus canino (CPV-2) e o coronavírus canino (CCoV-II) são considerados os principais patógenos responsáveis pela gastroenterite viral aguda em cães filhotes, causando, em alguns casos a alta morbidade e mortalidade, sobretudo em função da capacidade de potencializar infecções por outros agentes. Esses vírus estão distribuídos mundialmente na população canina, sendo responsáveis por diversos surtos em muitos países, sobretudo onde ocorre grande concentração de animais, como em abrigos e canis. O CPV-2 e o CCoV-II foram identificados a partir da década de 1970 e desde então, têm sido detectados em animais clinicamente saudáveis, assim como em cães que apresentam vômitos e diarreia severa. A presente tese tem como objetivo a identificação desses agentes na população canina do Brasil, sendo constituída de dois capítulos distintos: Capítulo 1- Caracterização de cepas de parvovírus canino circulantes no Brasil entre 2008 e 2010 e o Capítulo 2 - Caracterização do coronavírus canino pantrópico no Brasil. No Capítulo 1, foram analisadas amostras de fezes de 144 cães pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para CPV-2, 29,2% (42/144) das amostras foram positivos. Das 42 amostras positivas, 71,4% (30) dos cães tinham sinais de gastroenterite hemorrágica. O sequenciamento de 583 pb do gene VP2 das amostras positivas, identificaram 78,6% (33/42) como CPV-2c, 19% (8/42) como CPV-2b e 2,4% (1/42) como tipo de 2a. A análise filogenética dos CPV-2 encontrados nas amostras brasileiras mostrou que elas são muito semelhantes às de outros países e o CPV-2c tornou-se predominante no Brasil. No Capítulo 2, foram analisadas amostras de órgãos de cinco cães jovens pela transcrição reversa (RT-PCR) para os genes M e S de CCoV-II, sendo que três cães foram positivos para CCoV-II e CPV-2, um foi positivo apenas para CCoV-II e um para o CPV-2 e o outro foi negativo para todos os agentes pesquisados. O sequenciamento dos produtos de amplificação identificou que eles eram CPV-2c e CCoV-IIa. A análise filogenética dos CCoV-IIa circulantes na população canina da região Sul do Brasil mostrou que são semelhantes aos encontrados em outros países. No entanto, os espécimes brasileiros tendem a agrupar-se em um único clado, sugerindo um ancestral comum. Os sinais clínicos e lesões causados pela nova variante de CPV-2 e do subtipo pantrópico CCoV-II foram muito semelhantes entre si, sendo de grande importância a inclusão do diagnóstico diferencial entre esses dois agente virais. Esta foi a primeira caracterização do subtipo CCoV-IIa em cães no Brasil. A detecção e caracterização do CPV-2 e do CCoV-II, que estão circulando atualmente, são essenciais para o entendimento da evolução viral e para o desenvolvimento de medidas de controle e prevenção. / Canine parvovirus (CPV-2) and canine coronavirus (CCoV-II) are considered the major pathogens causing acute viral gastroenteritis in puppies, in some cases with high morbidity and mortality, especially in terms of ability to potentiate infections by other agents. These viruses are distributed worldwide being responsible for outbreaks in many countries, especially where there is high concentration of animals, such as shelters and kennels. The CPV-2 and CCoV-II were identified from the late 1970 and since then have been detected in clinically healthy animals, as well as in dogs with vomiting and severe diarrhea. This work aims the identification of these agents in the canine population of Brazil, comprised by two distinct chapters: Chapter 1- Typing of canine parvovirus strains circulating in Brazil between 2008 and 2010, and Chapter 2- Characterization of pantropic canine coronavirus in Brazil. In chapter 1, stool samples of 144 dogs were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for CPV-2, 29,2% (42/144) of them were positive. Of the 42 positive samples, 7,4% (30) of the dogs had signs of hemorrhagic gastroenteritis. The sequencing of 583 bp VP2 gene of the positive samples identified 78,6% (33/42) as CPV-2c, 19% (8/42) as CPV-2b and 2,4% (1/42) as type 2a. Phylogenetic analysis of CPV-2 found in the canine population of Brazil, has shown that they are very similar to those of other countries and CPV-2c has become prevalent in Brazil. In Chapter 2 organ samples of five puppies were analyzed by reverse transcription (RT-PCR) for CCoV-II M and S genes, of wich three dogs were positive to CCoV-II and CPV-2, one was positive only to CCoV-II and one for CPV-2 and the other was negative for all the agents searched. The sequencing of the amplification products identified that they were CPV-2c and CCoV-IIa. Phylogenetic analysis of circulating CCoV-IIa in canine population in southern Brazil showed that they are similar to those found in other countries. However, the Brazilian specimens tend to group together in a single clade, suggesting a common ancestor. Clinical signs and injuries caused by the new CPV-2 variant and of pantropic subtype of CCoV-II are very similar to each other, being of great importance for the diagnosis including the differential diagnosis of these two viral agents. This was the first characterization of subtype CCoV-IIa in dogs in Brazil. The detection and characterization of CPV-2 and CCoV-II, that are currently circulating, are essential to understanding the viral evolution and to the development of more effective control and prevention measures.

A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.

O mamastrovirus 5 (MAstV5) é classificado no gênero Mamastrovirus da família Astroviridae, sendo associado com surtos agudos de gastroenterite transitória em filhotes de cães ao redor do mundo. O objetivo desta dissertação foi detectar e analisar a variabilidade genética dos MAstV5 circulantes em cães no Brasil. Para isto, amostras de suabe retal foram coletadas de 269 cães de diferentes regiões do Brasil no período de 2008-2014, dos quais 26,39% foram positivos para MAstV5 através de RT-PCR convencional e de RT-Hemi-nested PCR, amplificando porção conservada do gene do capsídeo e do gene da polimerase, respectivamente. Quatro destas cepas tiveram seu genoma parcialmente sequenciado, caracterizado e analisado filogeneticamente. A caracterização dessas amostras revelou uma notável heterogeneidade genética entre as cepas de MAstV5. A baixa identidade entre as sequências do gene do capsídeo (<85%) indicaria uma possível nova classificação entre a espécie MAstV5 em dois genótipos. Conclue-se que o MAstV5 ocorre em cães no Brasil e as cepas circulantes possuem uma grande diversidade genética. / The Mamastrovirus 5 (MAstV5) is classified in the genus Mamastrovirus of the Astroviridae family, being associated with acute episodes of transient gastroenteritis in puppies around the world. The aim of this work was to detect and analyze the genetic variability of circulating MAstV5 in dogs in Brazil. For this, rectal swab samples were collected from 269 dogs from different regions of Brazil in the 2008-2014 period, of which 26.39% were positive for MAstV5 by conventional RT-PCR and RT-Hemi-nested PCR, amplifying conserved portion of the capsid gene and polymerase gene, respectively. Four of these strains had its genome sequenced partially characterized and analyzed phylogenetically. The characterization of these samples revealed a remarkable genetic heterogeneity among strains of MAstV5. The low identity between the sequences of capsid gene (<85%) indicate a possible new classification between the two genotypes MAstV5 species. We conclude that the MAstV5 occurs in dogs in Brazil and circulating strains have a high genetic diversity.