Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Reinaldo José da Silva / Banca: Francisco Luis Franco / Resumo: / Abstract: / Mestre

Algumas espécies de morcegos têm sido reconhecidas como reservatórios naturais de várias famílias virais, desempenhando um importante papel na trasmissão e manutenção desses micro organismos. Devido à descaracterização e fragmentação de habitats naturais, esses mamíferos buscam alternativas de abrigo e alimento, e assim, ficam cada vez mais expostos aos meios antrópicos e em contato com humanos e animais domésticos. Com exceção do vírus rábico, existem poucos trabalhos realizados na detecção de vírus em morcegos no Brasil. Em virtude disso, o presente estudo objetivou a detecção de vírus (circovírus, astrovírus, coronavírus e lyssavírus relacionados ao vírus da raiva) em amostras de órgãos de morcegos do estado do Rio Grande do Sul. Os ácidos nucléicos foram extraídos das amostras de órgãos de morcegos e submetidos à detecão por PCR e RT-PCR. Após a detecção, os fragmentos obtidos foram sequenciados para realizar análise filogenética dos vírus encontrados. Ao total foram analisadas 108 amostras de diferentes espécies e localidades, das quais dez foram positivas para circovírus, seis para coronavírus e 25 para astrovírus, este último sendo o primeiro registro do vírus em morcegos para o Brasil. Todas as amostras foram negativas para lyssavírus relacionados ao vírus da raiva. Análises filogenéticas revelaram que as sequências de circovírus agruparam em ambos os gêneros Circovirus e Cyclovirus, coronavírus no gênero Alphacoronavirus em dois clados diferentes e astrovírus no gênero Mamastrovirus junto com outros astrovírus de morcegos, o qual formam um clado separado dos outros mamíferos. Os resultados demonstram uma diversidade genética entre os vírus encontrados em diferentes espécies de morcegos, que possuem dietas alimentares e habitats distintos. / Some bat species have been recognized as natural reservoirs of several viral families, playing an important role in the transmission and maintaining of these micoorganism. Due to mischaracterization and fragmentation of natural habitats, these mammals seek shelter alternatives and food, and thus are increasingly exposed to anthropism, which make the contact with humans and domestic animals closer. With the exception of the rabies virus, there are few studies on the detection of viruses in bats in Brazil. Therefore, the present study aimed the detection of viruses (circovirus, astrovirus, coronavirus and rabies-related virus) in bats organs samples from Rio Grande do Sul state. Nucleic acids were extracted from bat organs samples and submitted to detection by PCR and RT-PCR. After detection, the obtained fragments were sequenced to perform phylogenetic analysis of the viruses found. From a total of 108 samples analyzed of different species and locations, ten were positive for circoviruses, six for coronaviruse and 25 for astrovirus, which was the first report of this virus in bats in Brazil. All samples were negative for rabies-related virus. Phylogenetic analyzes revealed that the sequences of circoviruses grouped in both Circovirus and Cyclovirus genus, coronaviruses in Alphacoronavirus genus in two different clades and astroviruses in Mamastrovirus genus along with other bats astrovirus, which form a separate clade from other mammals. Results demonstrate a genetic diversity among viruses found in different species of bats, which have different diets and habitats.

A demanda por carne de frango vem crescendo globalmente, assim como as exigências com relação à qualidade microbiológica do produto final. Associa-se a frequência de Campylobacter spp. em aves às enterites em humanos. O principal reservatório do agente é o trato digestivo de animais de diversas espécies, como aves de corte. Campylobacter spp. possui ampla diversidade genotípica e fenotípica, e apresentam diversos mecanismos de virulência para se aderir e colonizar o epitélio intestinal no hospedeiro. Apesar de o controle sanitário e biossegurança implementados nas granjas refletirem na redução de contaminação das carcaças no matadouro-frigorífico, esses procedimentos não eliminam o Campylobacter completamente das aves, podendo comprometer a qualidade microbiológica do produto final e propiciar casos de toxinfecção de origem alimentar aos consumidores. Esse trabalho tem como objetivo verificar a ocorrência de seis genes de virulência de Campylobacter jejuni em amostras de carcaças de frango e em casos de campilobacteriose em humanos. Foram avaliadas 50 amostras de C. jejuni, das quais 25 eram de origem aviária, provenientes da coleção do Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), e 25 eram de origem humana, cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para detecção dos genes iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC e wlaN. Das amostras analisadas, 92% (23/25) de origem humana e 88% (22/25) de origem aviária foram positivas para o gene cdtB, 44% (11/25) de origem humana e 84% (21/25) de origem aviária para o gene cdtA; 20% (5/25) de origem humana e 80% (20/25) de origem aviária para o gene flaA; 48% (12/25) de origem humana e 76% (19/25) de origem aviária para o gene cdtC; 16% (4/25) de origem aviária para o gene wlaN e 12% (3/25) de origem humana e 4% (1/25) de origem aviária foram positivas para o gene iam. Em nenhuma das amostras pesquisadas de origem humana (0/25) foi observado o gene wlaN. Com este trabalho concluiu-se que os genes pesquisados podem estar presentes em cepas de C. jejuni provenientes de carne de frango e nas cepas isoladas de casos de infecção alimentar em humanos. Ainda assim, conforme os resultados apresentados, o gene cdtB teve maior frequência nas amostras provenientes de origem humana e aviária. / The demand for poultry meat has increased globally, as well as the microbiologic requirements of the final product. The frequency of Campylobacter spp. in poultry meat has been related to enteritis in humans. The digestive tract of several animals’ species, as poultries, is the main reservatory of the agent. Campylobacter spp. has a wide genotypic and phenotypic diversity, and, in addition to that, it presents several virulence factors which allow to adhere and colonize the intestinal epithelium of the host. Although good hygienic and biosecurity practices employed at poultry farms help to reduce the carcass contamination, these procedures do not completely eliminate Campylobacter spp. at the slaughterhouses and it may affect the microbiologic quality of the final product, which may cause alimentary toxinfection cases. This study aims to verify the occurrence of six virulence genes of Campylobacter jejuni from poultry carcasses samples and campylobacteriosis cases in humans. 50 samples of C. jejuni were evaluated, of which 25 were originated from poultry collected at the Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária (CDPA - UFRGS), and 25 were originated from human samples of the Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Polymerase chain reaction (PCR) technique was employed to detect the following genes: iam, flaA, cdtA, cdtB, cdtC and wlaN. In the samples analyzed, 92% (23/25) from human origin and 88% (22/25) from poultry for cdtB gene; 44% (11/25) from human origin and 84% (21/25) from poultry for cdtA gene; 20% (5/25) from human origin and 80% (20/25) from poultry for flaA gene; 48% (12/25) from human origin and 76% (19/25) from poultry for cdtC gene; 16% (4/25) from poultry for wlaN and gene 12% (3/25) from human origin and 4% (1/25) from poultry were positive for iam gene. This study concludes that the researched genes may be present in Campylobacter from poultry meat origin and from isolates of human cases of alimentary toxinfection. However, according to the results found, the cdtB gene had a higher frequency in samples of human and avian origin.

O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV) afetam uma ampla variedade de hospedeiros e encontram-se distribuídos mundialmente. O CDV é considerado um dos mais importantes agentes infecciosos dentro das populações caninas. Este vírus é o agente causal da cinomose, uma doença potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae, sendo recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em carnívoros aquáticos e grandes felinos. O CPIV, por sua vez, é altamente contagioso entre cães, podendo infectar roedores e gatos em infecções experimentais. Geralmente, o CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante, porém pode atuar sinergicamente com outros agentes infecciosos, como o CDV, causando sinais clínicos mais graves. Como em nosso meio são escassas as informações sobre estes vírus, o presente estudo visou aprofundar os conhecimentos sobre a prevalência de CDV e CPIV em cães e felinos silvestres mantidos em cativeiro. Para tanto, soros destes animais foram testados em busca de anticorpos neutralizantes contra amostras padrão do CDV (Rockborn e Snyder Hill) e do CPIV (V660). Inicialmente, foram testados soros de 173 cães de rua mantidos em canis municipais em Novo Hamburgo e Porto Alegre, RS. A prevalência de anticorpos neutralizantes anti-CDV frente às amostras de vírus da cinomose Rockborn e Snyder Hill, foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Somente dois cães apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores contra CDV Rockborn (igual ou maior que 100) e nenhum soro apresentou título de anticorpos neutralizantes considerado protetor para a amostra Snyder Hill (igual ou maior que 100). Contra a amostra de parainfluenza canino V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes encontrada foi de 51,4 %. Conclui-se, portanto, que a população de cães de rua amostrada apresenta poucos indícios de contato prévio com CDV, sugerindo grande susceptibilidade à cinomose. Por outro lado, o CPIV parece circular amplamente nesta população. Na segunda parte do presente estudo, como no Brasil não existem relatos sobre CDV e CPIV em felinos silvestres, buscou-se verificar a possibilidade da ocorrência dessas infecções em felinos silvestres brasileiros. Para tanto, foram testados soros de 84 felinos silvestres de seis diferentes espécies nativas do Brasil (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), todos mantidos em cativeiro em criatórios de distintas regiões do País. Todos os felinos amostrados apresentaram-se soronegativos frente às amostras de CDV e CPIV utilizadas. Estes resultados indicam que CDV e CPIV parecem não circular nas populações de felinos silvestres amostradas. / Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) infect a great variety of hosts ranges and are distributed worldwide. CDV is one of the most important infectious agents in dogs. This virus may cause potentially lethal disease among members of the Canidae, Mustelidae and Procionidae families. It has also caused diseases of significant morbidity and mortality in aquatic carnivores and large felids. CPIV, on its turn, is highly contagious among dogs, whilst rodents and cats are susceptible to experimental infections. CPIV is usually associated with an acute selflimiting tracheobronchitis. However, it can act sinergistically with other infectious agents, such as CDV, and cause clinical signs of variable severity. As information on CDV and CPIV infections in our millieu are scarce, this study was carried out aiming to increase knowledge on the prevalence of CDV and CPIV in stray dogs as well as in captive Brazilian wild felids. In order to have an estimate on such prevalences, sera from these animals were tested for neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill, and to CPIV strain V660. Initially, 173 sera from stray dogs kept in kennels from the municipalities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, were examined. The prevalences of neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill were 9.3 % and 4.1 %, respectively. Only two dogs had antibody levels which could be correlated to protection (that is, titre ≥ 100) to CDV Rockborn whereas no sera presented antibody titres high enough to be considered protective to CDV strain Snyder Hill (that is, titre ≥ 100). Regarding CPIV, the prevalence of anti-V660 neutralizing antibodies was 51.4 %. It can be concluded that the stray dog populations under study shows few serological evidence of previous contact with CDV and seem largely susceptible to CDV infections. On the other hand, CPIV seems to circulate widely in the examined population. In the second part of this study, as there are no reports on CDV and CPIV infections in wild felids in Brazil, it was aimed to determine whether there would be any evidence of such infections among some of such species. For that, 84 sera from wild felids of six different Brazilian native species (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), all kept in captivity in different regions of the country, were tested for neutralizing antibodies to both CDV and CPIV. All wild felid sera tested were negative for antibodies to the two strains of CDV as well as to CPIV. These results indicate that CDV and CPIV do not seem to circulate among the wild felid populations examined.

Os herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são alfaherpesvírus freqüentemente associados a meningoencefalites. Por outro lado, o vírus da raiva é o agente mais frequentemente identificado como causador de encefalites virais em bovinos no Brasil. O objetivo do presente estudo foi examinar a ocorrência de infecções por BoHV-1 e/ou BoHV-5 em amostras de tecido encefálico bovino submetidas ao diagnóstico de raiva e avaliar seu possível envolvimento nos quadros de encefalite que originaram a suspeita de raiva. Para tanto, 101 amostras desses tecidos, sendo 39 positivas para raiva e 62 negativas, recebidas pelo órgão oficial responsável pelo diagnóstico de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (IPVDF) no período de 2009- 2010, foram submetidas a exames buscando o isolamento viral e amplificação de genomas de herpesvírus bovinos. Ao isolamento viral, todas as amostras foram negativas para vírus infeccioso após a realização de três passagens cegas em células MDBK. As mesmas foram submetidas à amplificação por “nested PCR” (nPCR) para a pesquisa de genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Das 101 amostras totais analisadas esta técnica revelou que 25,7% (26/101) continham genomas de BoHV-1 e 21,8% (22/101) continham genomas de BoHV-5. Genomas de ambos os tipos foram identificadas em 30 (29,7%) amostras. Entre as amostras que foram também positivas para raiva em 23% (9/39) foram detectados genomas de BoHV-1 e em 15,4% (6/39) continham genomas de BoHV-5. Em 16 destas 39 amostras (41%) foram detectados genomas de BoHV-1 e BoHV-5. Em contrapartida, nas amostras negativas para o vírus rábico, 27,4% (17/62) também foram positivas para BoHV-1, 25,8% (16/62) foram positivas para BoHV-5. Detectaram-se os genomas de ambos BoHVs em 22,6% (14/62) dos animais. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas, indicando não haver correlação entre a ocorrência de raiva e infecções por herpesvírus na amostragem realizada. Estes resultados indicam que, embora as infecções por BoHV-1 e BoHV-5 tenham apresentado elevada incidência nessas amostras, não havia vírus infeccioso nas mesmas, sugerindo infecções latentes sem envolvimento aparente nos quadros de encefalite que originaram a suspeita inicial de raiva. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are alphaherpesviruses associated with a number of clinical manifestations in cattle, including encephalitis. On the other hand, rabies virus is the agent most frequently identified as cause of viral encephalitis in cattle in Brazil. The aim of this study was to examine the occurrence of BoHV-1 and / or BoHV-5 in bovine brain tissue samples submitted to rabies diagnosis. The search was carried out by virus isolation and nested polymerase chain reaction (PCR) in brain tissues of cattle submitted to rabies diagnosis in the state of Rio Grande do Sul in the period 2009-2010. One hundred and one brain samples from cattle with signs of neurological disease, of which 39 were positive and 62 negative for rabies, were used in this study. At virus isolation, all samples were negative for the presence of infectious herpesviruses after three successive passages in MDBK cells. Of the 101 total samples analyzed, this test revealed that 25.7% (26/101) of cattle were infected with BoHV-1 and 21.8% (22/101) were infected with BoHV-5. Genomes of both types were detected in 29.7% (30/101) samples. With the 39 samples positive for rabies virus, BoHV-1 genome was detected in 23% (9/39) and 15.4% (6/39) were positive for BoHV-5 as well as in 41% (16/39) of these samples, which were positive for both BoHVs. On the other hand, the negative samples for rabies virus, 27.4% (17/62) also were positive for BoHV-1, as well and 25.8% (16/62) were positive for BoHV-5. Genomes of both BoHVs were detected in 22.6% (14/62) of the specimens. These differences were not statistically significant indicating no correlation between the occurrence of rabies and herpesvirus infections in the animals. These results do not imply that the herpesviruses detected, even showing a high incidence, were the causative agents of meningoencephalitis in the samples tested, once it was not possible to isolate virus in its infectious form, however it suggests a latent infection in the animals involved with neurological signs of meningoencephalitis whose primary suspicion was rabies.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros. / Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) é um dos principais agentes causadores de prejuízos econômicos em criações de bovinos. A vacinação tem sido amplamente utilizada para minimizar as perdas causadas por infecções pelo BoHV-1. Dentre as vacinas disponíveis, as vacinas desenvolvidas a partir de amostras virais recombinantes apresentam a vantagem de permitirem a diferenciação entre animais infectados e imunizados. Anteriormente, foi desenvolvida uma vacina recombinante diferencial com uma amostra de BoHV-1 brasileira baseada na deleção do gene que codifica a glicoproteína E (gE). No primeiro capítulo do presente trabalho, a segurança e imunogenicidade desta vacina recombinante inativada foi avaliada. Os experimentos de imunização, desafio e reativação da vacina diferencial em animais experimentalmente inoculados demonstraram que a vacina recombinante foi segura e eficiente ao minimizar ou mesmo prevenir os efeitos da infecção pelo BoHV-1. No segundo capítulo, a segurança da vacina gE- foi avaliada, através da imunização intramuscular (IM) de 22 vacas (14 BoHV-1 soronegativas e 8 soropositivas) prenhes. Foi observada soroconverão, mas não abortos e nem anormalidades fetais nos animais imunizados. Na segunda parte do mesmo estudo foi analizada a capacidade do vírus recombinante difundir-se em um rebanho bovino. Quatro terneiros foram inoculados pela rota intranasal (IN) com a amostra recombinante gE- e, posteriormente, adicionados a outros 16 animais com mesma idade e semelhante condição corporal durante 180 dias. Todos os animais foram monitorados diariamente em busca de sintomatologia clínica. Foi observada soroconversão apenas nos animais imunizados. Estes resultados indicam que, nas condições deste estudo, a amostra recombinante não causou nenhum dano nas vacas prenhes ou em seus terneiros e não foi capaz de difundir-se horizontalmente no rebanho. No terceiro capítulo foi avaliada a patogenicidade de uma amostra recombinante de BoHV-1 com deleção no gene Us9, utilizando coelhos como modelo experimental. Coelhos com quatro semanas de idade foram divididos em quatro grupos (A, B, C, D). Dois grupos (A e B) foram infectados via intranasal (IN) e dois (C e D) infectados via intraocular (IO). Em cada via de infecção, um grupo foi infectado com o vírus recombinante e o outro com o vírus selvagem (wt). Após a infecção IO, todos os animais, de ambos os grupos, desenvolveram intensa conjuntivite entre os dias 3 a 10 pós-inoculação (pi). Vírus infeccioso foi consistentemente isolado a partir dos suabes oculares entre os dias 1 a 10 pi chegando a um título máximo de 103,05 TCID50/mL. Nos grupos infectados pela via IN com BoHV-1 wt, 4/4 coelhos apresentaram sintomatologia característica da doença, tais como: pirexia, apatia, anorexia, tosse, secreção nasal severa (entre os dias 2 e 8 pi). Animais inoculados com o recombinante apresentaram apatia, anorexia e descarga nasal (entre os dias 3 e 7 pi). Vírus infeccioso foi isolado em diversos tecidos tanto nos animais inoculados com o vírus wt como recombinante. Ambos os vírus foram capazes de replicar nas mucosas. Análises histológicas dos tecidos dos animais demonstraram lesões em ambos os grupos. Este estudo apresentou que a proteína Us9 não tem um papel significante na patogenicidade in vivo. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) is an the major cause of losses in cattle. Vaccination has been widely applied to minimize losses induced by BoHV-1 infections. Vacines developed from recombinant strains have the advantage of allow the differentiation between immunized and infected animals. Previously, a recombinant differential BoHV-1 vaccine based on a glycoprotein E deleted (gE) virus was developed. In the first chapter of the present work, the safety and immunogenicity of such recombinant, as a inactivate vaccine, was evaluated. The experiments showed that the DIVA vaccinne was safe and efficient in order to minimize or even prevent the clinical signs of the infection by BoHV- 1. In the second chapter of the present study, the safety of the gE- vaccine during pregnancy was evaluated by the intramuscular inoculation into 22 pregnant dams (14 BoHV-1 seronegative; 8 seropositive). Seroconversion was detected but no abortions, stillbirths or fetal abnormalities were seen after vaccination. In the second part of the same study, the potential of the gE- vaccine virus to spread among beef cattle under field conditions was examined. Four heifers were inoculated intranasally (IN) with the gE- vaccine and mixed with other 16 animals at the same age and body conditions, for 180 days. All animals were daily monitored for clinical signs.. Seroconversion was observed only in vaccinated heifers. These results indicate that, under the conditions of the present study, the gE vaccine virus did not cause any noticeable harmful effect on pregnant dams and on its offspring and did not spread horizontally among cattle. In the third chapter the pathogenicity of a US9 negative recombinant strain BoHV-1 using rabbits as an experimental model was avaluated. Rabbits four weeks old were divided in four groups (A, B, C, D) within four rabbits per group. Two groups were infected IN route and two via intraocular (IO). In each route, one group was infected by recombinant virus and the other infected by wild type (wt) virus. After IO infection, all rabbits developed intense conjunctivitis between days 3 to 10 pos infection (pi). Infective virus was consistently isolated from ocular swabs on days 1 to 10, reaching a maximum of 103.05 TCID50/mL. Animals infected in the IN rote with BoHV-1 wt, 4/4 rabbits showed characteristic signs of disease, which included pyrexia, apathy, anorexia, cough, severe nasal secretion between days 2 to 8. Rabbits inoculated with recombinant virus showed apathy, anorexia, nasal secretion (between days 3 and 7pi). Infectious virus was isolated in differents tissues as much as animals inoculated with wt and recombinant virus. Both virus were capable of replication in the mucosa nasal and ocular of the inoculated rabbits. Histopatological lesions were evident in both groups. In the present study showed which the US9 protein have not significantly in the pathogenicity in vivo.

O parvovírus canino (CPV-2) e o coronavírus canino (CCoV-II) são considerados os principais patógenos responsáveis pela gastroenterite viral aguda em cães filhotes, causando, em alguns casos a alta morbidade e mortalidade, sobretudo em função da capacidade de potencializar infecções por outros agentes. Esses vírus estão distribuídos mundialmente na população canina, sendo responsáveis por diversos surtos em muitos países, sobretudo onde ocorre grande concentração de animais, como em abrigos e canis. O CPV-2 e o CCoV-II foram identificados a partir da década de 1970 e desde então, têm sido detectados em animais clinicamente saudáveis, assim como em cães que apresentam vômitos e diarreia severa. A presente tese tem como objetivo a identificação desses agentes na população canina do Brasil, sendo constituída de dois capítulos distintos: Capítulo 1- Caracterização de cepas de parvovírus canino circulantes no Brasil entre 2008 e 2010 e o Capítulo 2 - Caracterização do coronavírus canino pantrópico no Brasil. No Capítulo 1, foram analisadas amostras de fezes de 144 cães pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para CPV-2, 29,2% (42/144) das amostras foram positivos. Das 42 amostras positivas, 71,4% (30) dos cães tinham sinais de gastroenterite hemorrágica. O sequenciamento de 583 pb do gene VP2 das amostras positivas, identificaram 78,6% (33/42) como CPV-2c, 19% (8/42) como CPV-2b e 2,4% (1/42) como tipo de 2a. A análise filogenética dos CPV-2 encontrados nas amostras brasileiras mostrou que elas são muito semelhantes às de outros países e o CPV-2c tornou-se predominante no Brasil. No Capítulo 2, foram analisadas amostras de órgãos de cinco cães jovens pela transcrição reversa (RT-PCR) para os genes M e S de CCoV-II, sendo que três cães foram positivos para CCoV-II e CPV-2, um foi positivo apenas para CCoV-II e um para o CPV-2 e o outro foi negativo para todos os agentes pesquisados. O sequenciamento dos produtos de amplificação identificou que eles eram CPV-2c e CCoV-IIa. A análise filogenética dos CCoV-IIa circulantes na população canina da região Sul do Brasil mostrou que são semelhantes aos encontrados em outros países. No entanto, os espécimes brasileiros tendem a agrupar-se em um único clado, sugerindo um ancestral comum. Os sinais clínicos e lesões causados pela nova variante de CPV-2 e do subtipo pantrópico CCoV-II foram muito semelhantes entre si, sendo de grande importância a inclusão do diagnóstico diferencial entre esses dois agente virais. Esta foi a primeira caracterização do subtipo CCoV-IIa em cães no Brasil. A detecção e caracterização do CPV-2 e do CCoV-II, que estão circulando atualmente, são essenciais para o entendimento da evolução viral e para o desenvolvimento de medidas de controle e prevenção. / Canine parvovirus (CPV-2) and canine coronavirus (CCoV-II) are considered the major pathogens causing acute viral gastroenteritis in puppies, in some cases with high morbidity and mortality, especially in terms of ability to potentiate infections by other agents. These viruses are distributed worldwide being responsible for outbreaks in many countries, especially where there is high concentration of animals, such as shelters and kennels. The CPV-2 and CCoV-II were identified from the late 1970 and since then have been detected in clinically healthy animals, as well as in dogs with vomiting and severe diarrhea. This work aims the identification of these agents in the canine population of Brazil, comprised by two distinct chapters: Chapter 1- Typing of canine parvovirus strains circulating in Brazil between 2008 and 2010, and Chapter 2- Characterization of pantropic canine coronavirus in Brazil. In chapter 1, stool samples of 144 dogs were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) for CPV-2, 29,2% (42/144) of them were positive. Of the 42 positive samples, 7,4% (30) of the dogs had signs of hemorrhagic gastroenteritis. The sequencing of 583 bp VP2 gene of the positive samples identified 78,6% (33/42) as CPV-2c, 19% (8/42) as CPV-2b and 2,4% (1/42) as type 2a. Phylogenetic analysis of CPV-2 found in the canine population of Brazil, has shown that they are very similar to those of other countries and CPV-2c has become prevalent in Brazil. In Chapter 2 organ samples of five puppies were analyzed by reverse transcription (RT-PCR) for CCoV-II M and S genes, of wich three dogs were positive to CCoV-II and CPV-2, one was positive only to CCoV-II and one for CPV-2 and the other was negative for all the agents searched. The sequencing of the amplification products identified that they were CPV-2c and CCoV-IIa. Phylogenetic analysis of circulating CCoV-IIa in canine population in southern Brazil showed that they are similar to those found in other countries. However, the Brazilian specimens tend to group together in a single clade, suggesting a common ancestor. Clinical signs and injuries caused by the new CPV-2 variant and of pantropic subtype of CCoV-II are very similar to each other, being of great importance for the diagnosis including the differential diagnosis of these two viral agents. This was the first characterization of subtype CCoV-IIa in dogs in Brazil. The detection and characterization of CPV-2 and CCoV-II, that are currently circulating, are essential to understanding the viral evolution and to the development of more effective control and prevention measures.

O mamastrovirus 5 (MAstV5) é classificado no gênero Mamastrovirus da família Astroviridae, sendo associado com surtos agudos de gastroenterite transitória em filhotes de cães ao redor do mundo. O objetivo desta dissertação foi detectar e analisar a variabilidade genética dos MAstV5 circulantes em cães no Brasil. Para isto, amostras de suabe retal foram coletadas de 269 cães de diferentes regiões do Brasil no período de 2008-2014, dos quais 26,39% foram positivos para MAstV5 através de RT-PCR convencional e de RT-Hemi-nested PCR, amplificando porção conservada do gene do capsídeo e do gene da polimerase, respectivamente. Quatro destas cepas tiveram seu genoma parcialmente sequenciado, caracterizado e analisado filogeneticamente. A caracterização dessas amostras revelou uma notável heterogeneidade genética entre as cepas de MAstV5. A baixa identidade entre as sequências do gene do capsídeo (<85%) indicaria uma possível nova classificação entre a espécie MAstV5 em dois genótipos. Conclue-se que o MAstV5 ocorre em cães no Brasil e as cepas circulantes possuem uma grande diversidade genética. / The Mamastrovirus 5 (MAstV5) is classified in the genus Mamastrovirus of the Astroviridae family, being associated with acute episodes of transient gastroenteritis in puppies around the world. The aim of this work was to detect and analyze the genetic variability of circulating MAstV5 in dogs in Brazil. For this, rectal swab samples were collected from 269 dogs from different regions of Brazil in the 2008-2014 period, of which 26.39% were positive for MAstV5 by conventional RT-PCR and RT-Hemi-nested PCR, amplifying conserved portion of the capsid gene and polymerase gene, respectively. Four of these strains had its genome sequenced partially characterized and analyzed phylogenetically. The characterization of these samples revealed a remarkable genetic heterogeneity among strains of MAstV5. The low identity between the sequences of capsid gene (<85%) indicate a possible new classification between the two genotypes MAstV5 species. We conclude that the MAstV5 occurs in dogs in Brazil and circulating strains have a high genetic diversity.

Made available in DSpace on 2015-06-12T13:55:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 378.pdf: 2569017 bytes, checksum: a251ac616bcce584ad81bcd947e3562a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os principais vetores da dengue, doença que afeta mais de 100 países e atinge, a cada ano, mais de 50 milhões de pessoas. Para que uma espécie seja incriminada como vetor de uma doença, ela deve ser capaz de se infectar com um determinado patógeno via oral, resistir à replicação deste no seu interior e transmiti-lo a um hospedeiro susceptível. Esta habilidade é denominada competência vetorial. Os rápidos avanços da biologia molecular têm facilitado o surgimento de novas abordagens que podem ser utilizadas para avaliar quantitativamente alguns aspectos da competência vetorial. Neste sentido, a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) tem sido amplamente usada em estudos sobre a interação vírus-vetor. O presente estudo visou avaliar o processo de infecção do vírus Dengue (DENV) em amostras de intestinos e glândulas salivares Ae. aegypti e Ae. albopictus, através da quantificação de partículas virais de três sorotipos de DENV via PCR em tempo real. Os resultados mostraram que as três populações de Ae. aegypti (RecLab, Recife e Petrolina) analisadas no presente estudo foram suscetíveis à infecção com DENV-1, DENV-2 e DENV-3. De uma maneira geral, as populações de Ae. aegypti de campo (Recife e Petrolina) foram mais competentes para a infecção do que a colônia de laboratório (RecLab). Considerando a espécie Ae. albopictus, as duas populações (laboratório e campo) também foram suscetíveis à infecção com os três sorotipos, porém a colônia de laboratório foi mais suscetível à infecção do que a população de campo. Os dados obtidos no presente estudo indicam que diferenças na carga viral usada durante a alimentação artificial podem influenciar nas taxas de infecção do vírus no intestino, porém não influenciam a disseminação dos vírus para as glândulas salivares. Outro aspecto importante foi o curto período de incubação extrínseco (PIE) apresentado pelas duas espécies, exceto na população de Ae.aegypti de Petrolina, diferente do que é descrito na literatura. Este resultado tem uma grande importância epidemiológica, pois quanto menor o PIE, maior será o tempo que a espécie vai ser capaz de transmitir o vírus para um hospedeiro sadio, aumentando assim as chances de transmissão de dengue. Além disso, revela a necessidade da implementação de estratégias mais rápidas para bloquear a transmissão da doença. Estas informações serão necessárias para os estudos de avaliação de risco de transmissão da dengue