Foram coletadas amostras de água de piscinas térmicas e não térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil entre os meses de maio de 2006 e março de 2007, com o objetivo de determinar a presença do gênero Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e trofozoítos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. O potencial patogênico foi avaliado usando testes de osmotolerância e termotolerância. Das 65 amostras analisadas, 13 (20%) foram positivas para amebas de vida livre e identificados morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 9 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 4 com o grupo III. Todos os isolados identificados morfologicamente quando submetidos à Reação de PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba e 38% (5/13) dos isolados foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Neste estudo, o método molecular de RAPD ("Random Amplified Polymorphic-DNA") foi utilizado para investigar a relação genética entre os 13 isolados de piscinas e dois isolados de referência da ATCC. De 10 oligonucleotídeos decaméricos testados, quatro foram selecionados por gerarem produtos de amplificação passíveis de análise. A similaridade entre os isolados foi calculada utilizando-se o coeficiente de Jaccard e o dendrograma construído pelo método da média das distâncias entre grupos ("Average Linkage"). Quatro grupos distintos (G1-G4) de isolados foram formados de acordo com a similaridade genética entre eles. Sugeriu-se que os isolados do G1 por agruparem-se aos isolados de referência de A. castellanii (ATCC 30010 e 50492) possam pertencer a esta espécie. Os dados fenotípicos, tais como, morfologia e testes de tolerância foram relacionados aos dados genotípicos de RAPD e permitiram a caracterização dos isolados. Os resultados deste primeiro estudo de isolamento e caracterização de Acanthamoeba de água de piscinas na cidade de Porto Alegre-RS, Brasil confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana. / Water samples were collected from both heated and unheated swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil between May 2006 and March 2007, to determine the presence of Acanthamoeba in the water of swimming pools as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Escherichia coli. The identification of the isolates was based on the trophozoites and cysts morphology and on the amplification through PCR with genus-specific oligonucleotides. The potential pathogenic was assessed by osmotolerance and temperature tolerance assays. From the 65 samples analyzed, 13 (20%) were positive for free-living amoebae, and the isolates morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 9 presented characteristics compatible with morphological group II, and 4 with group III. All the morphologically identified isolates, when submitted to PCR, were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba, and 38% (5/13) of the isolates were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature tolerance assays. In this study, the molecular RAPD method (Random Amplified Polymorphic-DNA) was used to investigate the genetic relationship among 13 isolates from swimming pools and two strains from the ATCC reference. From the ten decameric oligonucleotides tested, four were selected for generating products of amplification possible to be analyzed. The similarity between isolates was calculated using the Jaccard coefficient and the dendrogram constructed by using the method of the average distances between groups ("Average Linkage"). Four distinct groups (G1-G4) of isolates were separated according to genetic similarity between them. It was suggested that the isolates from G1 once group up with the reference isolates of A. castellanii may belong to this species. The phenotypic data such as morphology and tolerance tests were related to RAPD genotypic data and led to the characterization of isolates. The results of this study about isolation and characterization of Acanthamoeba in swimming pools water at Porto Alegre, RS, Brazil confirm the presence of potentially pathogenic isolates which can present risks to human health.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2011 / Inclui bibliografias / Introdução: Íons metálicos são continuadamente liberados a partir de ligas metálicas de aparelhos ortodônticos fixos. A modulação de virulência de biofilmes de Streptococcus mutans por íons metálicos oriundos de aparelhos ortodônticos ainda é incerta. Est / Introduction: Metal ions are continuously released from orthodontic appliance alloys. However, the effect of these ions on the virulence of Streptococcus mutans biofilms is unknown. In the present study, we evaluated the impact of metal ions commonly shed

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-02T10:37:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 807554 bytes, checksum: 658a487e853c7bd48eaec0404d9f045c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T10:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 807554 bytes, checksum: 658a487e853c7bd48eaec0404d9f045c (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O leite e os produtos lácteos podem se contaminar com Bacillus cereus, um micro-organismo que dependendo do número, da estirpe e das condições de processamento e comercialização, além de produzir lipases e proteases causadoras de off-flavor nos produtos, está associado a duas síndromes distintas que atingem os humanos: uma de natureza diarréica causada pela toxinas não hemolítica nhe, hemolítica hbl e citotoxina cytk e outra emética, causada pela toxina denominada de cereulide ces. Avaliou-se a presença de B. cereus no leite pasteurizado, leite em pó, leite UHT, queijo ricota e sobremesas lácteas, bebidas lácteas e leite achocolatado comercializados supermercados da microrregião de Viçosa, Minas Gerais. nos Também, determinou-se a presença de fatores de virulência de B. cereus nos isolados e avaliou-se a produção de enterotoxina diarreica. A ocorrência de B. cereus em diferentes produtos lácteos foi avaliada utilizando métodos quantitavivo e qualitativo. Das 129 amostras analisadas, foi observada a presença de B. cereus em 69 (53,4%) considerando ambos os métodos. As contagens do micro-organismo variaram de 1,30 log UFC/mL no leite pasteurizado até 5,32 log UFC/g na ricota. A presença do B. cereus foi detectada no leite UHT apenas no teste qualitativo. Os 69 isolados que apresentaram caraterísticas fenotípicas de B. cereus foram confirmados como sendo dessa espécie pela técnica de PCR para o gene 16S, e foram classificados como pertencentes a três estirpes diferentes (B. cereus KAVK4, B. cereus SVK1 e B. cereus ATCC 4342), sendo predominante em todos os produtos analisados a estirpe B. cereus KAVK4. Dos 69 isolados analisados para a presença de genes produtores de enterotoxinas, 68 (98 %) apresentaram o gene nhe. Este gene foi expresso nos 68 isolados com a produção de pelo menos 6 ng/mL da nhe, limite mínimo de detecção desta toxina na metodologia utilizada. Dos 69 isolados confirmados como B. cereus, 40 (57 %) apresentam a amplificação do gene hbl, em 30 (75 %) destes constatou-se a produção de pelo menos 20 ng/mL da toxina hbl, limite de detecção do kit utilizado. A presença do gene cytk foi verificada nos 69 isolados analisados. A ocorrência de pelo menos um gene produtor de enterotoxina foi constatada em todos isolados, o que indicaria um alto potencial patogênico das estirpes presentes nos produtos lácteos. / Milk and dairy products may be contaminated with Bacillus cereus, a micro- organism that depending on the number, of the strain and of the processing and marketing conditions can produce lipases and proteases that cause off-flavor in dairy product and it is associated with two distinct syndromes that affect humans: one diarrhea caused by toxins, not hemolytic nhe, hemolytic hbl and cytotoxin k cytk and another emetic caused by toxin, called cereulide. The aim of this study was to evaluate the presence of B. cereus in milk products marketed in the supermarkets of Viçosa city, Minas Gerais, Brazil. Also, it was determined the presence of virulence factors of B. cereus isolates and it was evaluated the diarrheal enterotoxin production. The occurrence of B. cereus in different dairy products was evaluated using quantitavive and qualitative methods. Of the 129 samples analyzed, it was observed the presence of B. cereus in 69 (53.4%) considering both methods. The microorganism counts vary from 1.30 log UFC/ml in milk pasteurized up to 5.32 log UFC/g in the ricotta. The presence of B. cereus was detected in the UHT milk only in qualitative testing. The 69 isolates with phenotypic characteristics of B. cereus were confirmed as this species by PCR for gene 16S, and they were classified as belonging to three different strains (B. cereus KAVK4, B. cereus SVK1 and B. cereus ATCC 4342), being predominant in all the products analyzed strain B. cereus KAVK4. From the 69 isolates analyzed for the presence of enterotoxin producing genes, 68 (98%) had the nhe gene. This gene was expressed in the 68 isolates with the production of at least 6 ng / ml of nhe, minimum detection limit of the methodology of this toxin. From the 69 isolates confirmed as B. cereus, 40 (57%) showed the amplification of the gene hbl, 30 (75%) of them it was found containing at least 20 ng / mL of the hbl toxin, according kit detection limit .The presence of cytk gene was found in 69 isolates analyzed. The occurrence of at least one enterotoxin producing gene was found in all isolates, which would indicate a high potential pathogenic strains present in dairy products.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de Ni2+que hidrolisam ureia para produzir amônia e CO2. Estas enzimas são encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilhando estruturas similares. Nosso grupo vem demonstrando que ureases possuem propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica que potencialmente contribuem para a patogenicidade de micro-organismoss produtores de urease. A presença de urease em bactérias patogênicas (p.e. Helicobacter pylori, Proteus mirabilis) está correlacionada com a patogênese em algumas doenças humanas. Alguns fungos de importância médica também são produtores de urease entre eles Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii. Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose em humanos e animais e acomete mais frequentemente indivíduos imunocompetentes. A maioria dos isolados produzem urease e vários autores sugerem que a liberação de amônia pela atividade da urease de Cryptococcus tem papel importante na patogenia da doença favorecendo uma maior permeabilidade que proporciona a transmigração das leveduras para o sistema nervoso central (SNC). No presente trabalho, para analisar o potencial de virulência da urease de C. gattii foram construídos mutantes com inativação do gene estrutural URE (ure1) e dos genes que codificam as proteínas acessórias (URED, UREF – ure4 e ure6 respectivamente). Assim como já descrito para H. pylori, a urease de C. gattii desempenha papel importante na virulência independente da atividade enzimática. Esta função ocorre anterior a invasão do SNC diminuindo a multiplicação da levedura em macrófagos, aumentando a carga infecciosa no sangue e atenuando a mortalidade tanto no mutante ure1Δ como no mutante ure6Δ em camundongos infectados por via intranasal. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes Ni2+ dependents that hydrolyze urea to produce ammonia and CO2. These enzymes are found in fungi, bacteria and plants, show very similar structures. Our group has shown that plant and bacterial ureases display biological properties independent of their ureolytic activity that may contribute to the pathogenesis of urease-producing microrganisms. The presence of urease in pathogenic bacteria (e.g. Helicobacter pylori, Proteus mirabilis) strongly correlates with pathogenesis in some human diseases. Many medically important fungi also produce urease, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii. Cryptococcus gattii is one of the etiologic agent that causes criptococcosis in human and animals, which often affects immunocompromised patients. The majority of clinical isolates produce large amounts of urease, and several authors suggest that the ammonia realease from urease activity might introduce a local damage of the endothelium, thus increasing permeability which provides yeast transmigration to central nervous system (CNS). To analyse virulence potential of C. gattii urease, mutants inactivating structural URE (ure1) gene and coding genes for accessory proteins required to assemble the Ni2+-containing active site (URED, UREF – ure4 and ure6 respectively ). As already described to H. pylori urease, the C. gattii urease play important roles in virulence independent of ureolytic activity before CNS invasion, reducing yeast multiplication in macrophage, decreasing blood burden and also attenuating mortality either ure1Δ and accessory ure6Δ mutant in mice intranasal infection.

A Salmonella continua sendo um dos principais problemas para a avicultura mundial. Os mecanismos pelos quais ela interage com o seu hospedeiro para causar doenças são complexos e dependem de vários fatores que ainda não foram completamente elucidados. Ainda estamos começando a entender como esse mecanismo funciona a nível molecular. Genes associados à virulência, resistência a antimicrobianos e adaptação ao meio em que vivem são considerados fatores de virulência em todas as bactérias. Neste trabalho sete protocolos para PCR (Polimerase Chain Reaction), testados internacionalmente, foram padronizados para a pesquisa de genes associados à virulência de Salmonella sp. em sua fase de aderência e invasão celular. Após a padronização dos protocolos, foi realizada a pesquisa desses sete genes em 41 amostras de Salmonella Hadar (S. Hadar), levando-se em conta a importância que esse sorovar vem adquirindo nos últimos anos. Também foram traçados o perfil de resistência a antimicrobianos e o perfil bioquímico nessas amostras de S. Hadar. Os sete protocolos para PCR se mostram viáveis para a pesquisa dos genes. Ao analisar as 41 amostras de S. Hadar para os genes estudados neste trabalho foram encontrados quatro perfis genéticos diferentes, sendo que apenas os genes sopE (Salmonella Outer Protein) e avrA (Avirulence), apresentando positividade em 4 e 7 amostras respectivamente, variaram entre os perfis. No teste com os antimicrobianos 73,17% das cepas se mostraram resistentes para a tetraciclina e ainda foram observados altos índices de resistência para a estreptomicina (31,70%) e ampicilina (29,27%). 13 cepas apresentaram multiresistência, sendo assim resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Os testes bioquímicos confirmaram todas as amostras como pertencentes ao gênero Salmonella, apresentando variações apenas nos testes de TSI em sua região de bisel, LIA em sua região de bisel, citrato e principalmente a arginina e o dulcitol. / Salmonella remains one of the biggest problems for the poultry industry. The mechanisms by which it interacts with its host to cause disease are complex and depend on several factors that have not been fully elucidated. Although we are just beginning to understand how this mechanism works at a molecular level. Genes associated with virulence, antibiotic resistance and adaptation to environment are considered virulence factors in all bacteria. In this work seven protocols for PCR (Polymerase Chain Reaction), tested internationally, have been standardized for detection of genes associated with virulence of Salmonella sp. in its phase of adhesion and cell invasion. After the standardization of protocols, was performed a research for this seven genes in 41 strains of Salmonella Hadar (S. Hadar), considering the importance of this serovar has acquired in the last years. Were also tested the antimicrobial resistance profile and biochemical profile in these samples of S. Hadar. The seven protocols for PCR are shown viable to the research of genes. Analyzing the 41 samples of S. Hadar for the genes studied in this work were found four different genetic profiles, in with only the sopE (Salmonella Outer Protein) and avrA (Avirulence) genes varied between the profiles, showing positivity in 4 and 7 samples respectively. In the test with the antimicrobials agents 73,17% of the strains proved resistant for tetracycline, and were still observed high levels of resistance to streptomycin (31,70%) and ampicillin (29,27%). Thirteen strains showed multidrug resistance, being resistant to two or more antimicrobial agents. Biochemical tests confirmed all samples as belonging to the genus Salmonella, with variations only in the tests of TSI in the region of the bezel, LIA in the region of bezel, citrate and especially arginine and dulcitol.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, prevalente na América do Sul, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O fungo apresenta estrutura complexa de proteínas e glicoproteínas e dentre esses componentes, alguns estão envolvidos na patogenicidade da doença. A recuperação da virulência de isolados por meio de passagem in vivo foi realizada com sucesso em nosso laboratório. Os isolados Pb18 atenuado e virulento foram analisados sob diversos ângulos para confirmação dessa modificação. Os resultados de curva de sobrevida, recuperação de CFU de órgão e histologia, mostraram claramente as diferenças no padrão de patogenicidade desses dois isolados. Outras características também foram avaliadas como morfometria, padrão de crescimento e ultraestrutura celular. Análises de expressão gênica diferencial apontaram um perfil de regulação positiva para genes relacionados ao metabolismo de proteínas, de lipídeos e aminoácidos. Algumas moléculas anteriormente descritas como putativos fatores de virulência foram moduladas positivamante, entre as quais podemos citar a calmodulina, proteína kex-like e hsp70. Entretanto, ainda pouco se sabe sobre estes fatores virulência para maioria dos fungos dimórficos, entre eles o P.brasiliensis. Várias técnicas têm sido utilizadas, sem sucesso, para caracterização destas moléculas. Utilizando a metodologia de Phage display, foram selecionados três fagos que se ligam preferencialmente ao isolado Pb18 virulento. Por meio de ensaio de ligação, o fago p04 foi capaz de distinguir graus de virulência de outros quatro isolados. As imagens obtidas por microscopia confocal mostraram que o pep04, acoplado a 6-FAM, foi internalizado somente por leveduras do isolado virulento. Imagens seriadas indicam marcação do meio intracelular, frequentemente associada ou co-localizada à marcação por DAPI. Estes resultados demonstraram que ambos, pep04 e p04, podem ser considerados biomarcadores de virulência na PCM. Para avaliar as consequências das interações destes biomarcadores com células fúngicas, foram realizados ensaios in vitro e in vivo. O fago p04 foi suficiente para impedir a implantação e disseminação do fungo. Além disso, foi capaz de reduzir o número de CFUs recuperadas de animais tratados com este fago, quando comparado ao controle (fago sem inserto). Experimentos in vitro utilizando o pep04 demostraram a atividade fungicida deste peptídeo contra, apenas, o isolado virulento. Desta foram, estes biomarcadores poderão ser utilizados tanto no diagnóstico, quanto na pratica clínica como adjuvante terapêutico. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a human systemic granulomatous disease, prevalent in South America, caused by a thermodimorphic fungus, Paracoccidioides brasiliensis. This fungus presents complex antigenic structure and some of these components have been related with its pathogenicity, of which little is known. The virulence recovery of isolates by passage in vivo was performed in our laboratory. Attenuated and virulent Pb18 isolates were analyzed from various angles to confirm this change. The results of the survival curve, the number of CFUs and histology, showed clear differences in pathogenicity pattern of these isolates. Other features were also evaluated as morphology, growth curve and cell ultrastructure. Analysis of differential gene expression profile showed positive regulation genes related to metabolisms of proteins, lipids and amino acids. Some molecules, previously described as putative virulence factors, were positive regulated, among which calmodulin, kex-like protein and Hsp70. However, the number of defined virulence factors for dimorphic fungal pathogens, up to now, is relatively small. Several techniques have unsuccessfully been employed to characterize these elusive antigenic structures. Using phage display methodology, three peptide-displaying phages that bound preferentially to virulent isolates of P. brasiliensis were selected. By binding assay, p04 phage distinguished predefined degrees of virulence of isolates. Using confocal microscopy, the homologue synthetic peptide (pep04), labeled with 6-FAM, was internalized by only virulent isolate yeast cells. Sequential optical section imaging indicated that the labeling was within the intracellular milieu and frequently close or overlapping DAPI staining. These results showed that both, phage p04 and pep04, can be considered as biomarkers of virulence in PCM since both bound to virulent P. brasiliensis. To evaluate the consequences of interactions between the biomarkers and fungal cells, in vitro and in vivo experiments were performed. The latter demonstrated that p04 phage was sufficient to prevent the implantation of the fungus in the lungs and its migration to spleen and liver. In addition, this phage reduced colony-forming units in the lungs of mice infected with P. brasiliensis as compared to controls. In vitro experiments showed that pep04 exhibited fungicidal activity only against virulent P. brasiliensis, leaving unaltered the growth of the attenuated isolate. Therefore, these biomarkers may be useful tools for prognosis in PCM and may be possibly used in the routine clinical practice as therapeutic drug adjuvants. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27 / Em vista do crescimento de infecções fúngicas oportunisticas causadas por Fusarium spp. e da resistência do fungo aos antifúngicos frequentemente utilizados, o estudo visa avaliar o perfil de sensibilidade das associações entre terbinafina, itraconazol, cetoconazol e anfotericina B frente a 20 isolados clínicos e ambientais de Fusarium solani, e verificar fatores associados a virulência como pesquisa de melanina na parede celular e a produção das enzimas extracelulares proteinase, fosfolipase, lipase e DNAse. Anfotericina B associada à itraconazol demonstrou efeito sinérgico em 15% dos isolados, sendo 33% de origem ambiental e 65% de origem clínica. Efeitos sinérgicos foram obtidos contra 10% dos isolados na associação entre anfotericina B e cetoconazol e contra 5% na associação entre anfotericina B e terbinafina. Nossos resultados revelaram efeitos aditivos e indiferentes contra as cepas testadas nas associações entre terbinafina e derivados azólicos. Não foi detectada presença de melanina na parede de F. solani. As culturas de F. solani clínicas e ambientais apresentaram atividade enzimática de proteinase positiva após coloração com ácido acético e negro de amido, com formação de halos ao redor da colônia na proporção de 30% e 45% respectivamente. Atividades enzimáticas de lipase, fosfolipase e DNAse não foram detectadas, contudo, não é possível afirmar que F. solani não produza essas enzimas, considerando que as mesmas podem ser mantidas intracelularmente e não liberadas para o meio. / Despite of the increase of opportunistic fungal infections caused by Fusarium spp. and their resistance to antifungal drugs, the aims of this study were to evaluate susceptibility profiles of 20 clinical and environmental isolates of Fusarium solani against the associations among terbinafine, itraconazole, ketoconazole and amphotericin B, and to verify the presence of associated virulence factors as melanin and extracellular enzymes (proteinase, phospholipase, lipase and DNAse). Amphotericin B combined with itraconazole showed synergism against 15% of the isolates, 33% of these was from the environment and 65% from clinical cases. Synergistic effect was observed against 10% of strains tested by association between amphotericin B and ketoconazole and against 5% in association between anphotericin B and terbinafine. The associations between terbinafine and azole derivatives showed additive effect and no difference against the samples. Presence of melanin in the F. solani cell wall was not observed. Both, clinical and environmental isolates expressed enzymatic activity of proteinase in 30% and 45% of cases. Enzymatic activity of lipase, phospholipase and DNAse were not detected; however, it was not possible to state that F. solani do not produce these enzymes, as they could manteined intracellularly and would not released to the environment. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente, associado à doença diarréica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativo (AA) a superfície de células HEp-2. O fenótipo AA está associado à presença de um plasmídeo de 65 MDa, conhecido como plasmídeo pAA, detectado através de uma sonda genética denominada de CVD432 ou simplesmente AA. Algumas amostras de EAEC, entretanto, apresentam o padrão AA, mas não são portadoras do plasmídeo. No plasmídeo pAA estão presentes vários genes relacionados com as propriedades de virulência, dentre os quais aqueles que codificam as adesinas fimbrias AAF (“Aggregative Adherence Factor” - AAF/I, AAF/II e AAF/III), o regulador de transcrição AggR, a proteína antiagregação (Aap) e as toxinas Pet e EAST1. Outros fatores de virulência de EAEC são codificados por genes cromossômicos, entre eles, a enterotoxina ShET1, o sideróforo Yersiniabactin (irp2), uma ORF críptica (Shf), e uma a-hemolisina. A maioria dos estudos sobre mecanismos de virulência de EAEC compreende amostras que apresentam o padrão AA e que reagem com a sonda AA, ou seja, as amostras de EAEC típicas. Pouco se conhece sobre a presença de potenciais fatores de virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas por nós como EAEC atípicas. Neste estudo analisamos 28 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com diarréia (N = 18) e sem diarréia (N = 10) provenientes de várias cidades brasileiras quanto à presença de seqüências genéticas associadas aos fatores de virulência codificados no plasmídeo pAA e no cromossomo. A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo a média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os marcadores de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly foram encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que de controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado também as seqüências genéticas aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das sequências genéticas astA, shf e irp2.Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF críptica, foram os mais freqüentes (61%) e apresentaram uma freqüência significantemente maior nos casos do que nos controles estudados (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente). A maioria das amostras de EAEC atípicas estudadas reagiu com um dos 175 antissoros utilizados, sendo que alguns desses, como os sorogrupos O42, O126 e O162 foram os mais freqüentes e encontrados apenas nas amostras isoladas de casos. A análise do perfil plasmidial de 12 amostras isoladas de crianças com diarréia mostrou a presença de mais de um plasmídeo de alto peso molecular na maioria das amostras estudadas. Duas amostras, uma contendo apenas um plasmídeo e uma outra sem nenhum plasmídeo foram então selecionadas para caracterização dos genes envolvidos no padrão AA. A amostra RN691-2 portadora de um único plasmídeo e apresentando resistência antimicrobiana múltipla, foi submetida a experimentos de transformação, conjugação e cura, não sendo possível à obtenção de um transformante, transconjugante ou mesmo a amostra isogênica sem o plasmídeo. Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvidos no padrão AA da amostra RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foi construída uma biblioteca genômica e identificado um clone-cosmídeo, designado pVIII-F-1, que apresentou o padrão AA em células HEp-2 de maneira semelhante à amostra selvagem. Para localizar o gene necessário para a adesão, o clone cosmídeo foi submetido a mutagênese com o transposon mini-Tn10 (CmR), sendo identificado o mutante pVIII-F-1 / Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) is emerging as a significant diarrheal pathogen. EAEC is defined by its characteristic “stacked brick” aggregative adherence (AA) pattern of adherence to HEp-2 cells. Most EAEC strains harbor a 60 to 65-MDa virulence plasmid (pAA). A 1-Kb fragment of pAA, referred to as the AA probe or CVD432, has been widely used for epidemiological studies. The pAA also encodes AA fimbrae (AAF) I, II, and III; the transcriptional activator AggR; enteroaggregative heatstable enterotoxin 1 (EAST1); a 104-KDa cytotoxin designated Pet; the cryptic secreted protein Shf; and a novel antiaggregation protein (dispersin) encoded by the aap gene. In addition to the pAA plasmid, some EAEC strains express putative virulence factors that are encoded on the chromosome, including a 116-KDa secreted mucinase (Pic), yersiniabactin (Irp2), and the E. coli a-hemolysin (a-Hly). Shigella enterotoxin 1 (ShET1) is encoded by the antisense strand of the pic gene. Few studies have evaluated the prevalence of EAEC markers in probe-negative strains, reported by us as atypical EAEC. By using atypical EAEC strains isolated in a case-control study, we assessed the prevalence of putative virulence factors, such as AAF/I, AAF/II, AAF/III, AggR, Aap, EAST-1, Pet, Shf, ShET1/Pic, Irp2, and a-Hly, in an attempt to identify their roles as enteric virulence factors. The majority of strains carried two or more of the genes, with two being the modal value; but two strains isolated from a control did not test positive for any of the factors. The AAF, aggR, and aap genes were present in only a minority of strains. The astA, pet, shf, ShET1/pic, irp2 and hly genes were found more frequently in the patients than in the controls. The combination astA and shf was found in 16 strains (57%), followed by 7 strains (25%) possessing the combination astA, shf, and irp2. The common virulence markers found in strains included the Pet, EAST1, Shf, Irp2, ShET1/Pic, and Hly virulence markers. EAST1 and Shf were the most frequently detected markers (61%) in strains and were found to be significantly associated with diarrhea (P = 0,003 and P = 0,020, respectively). The majority (75%) of the EAEC isolates reacted with one of the antisera used. It was interesting that the strains belonging to serogroups O42, O126 and O162 were detected only in children with diarrhea.Plasmid analysis of 12 strains isolated from diarrhea showed that the majority of strains contained large plasmids. Two strains, one carrying only one plasmid (MA691-2) and another one any plasmid (RN153-1), were chosen for genetic studies on the identification of genes responsible for the AA phenotype. Plasmid from MA691-2 strain was transferred to E. coli K12 and no transformant or transconjugant harboring the plasmid or isogenic derivative strain lacking the plasmid was identified. A genomic cosmid library of EAEC RN153-1 was generated in E. coli K12, and the resulting clones were screened for aggregative adherence to HEp-2 cells. One cosmid clone, pVIII-F-1, exhibited the same adherence as the wild-type, albeit to a lesser extent. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pVIII-F-1 responsible for the aggregative phenotype. Plasmid pBSL181 carrying mini-Tn10 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As leveduras do gênero Trichosporon surgem como patógenos emergentes com altas taxas de morbidade e mortalidade em uma população de imunocomprometidos em crescente expansão. O aumento expressivo de relatos de casos de tricosporonose invasiva e a identificação controversa desse gênero implicam em um déficit epidemiológico que por sua vez, dificulta a compreensão da história natural dessas infecções. Isso conduz a atrasos no diagnóstico e, conseqüentemente, na terapia antifúngica apropriada. A presente investigação teve como objetivos avaliar os aspectos epidemiológicos relacionados à colonização e infecção humana por leveduras do gênero Trichosporon através de metodologias fenotípicas e genotípicas e sua correlação com fatores de virulência in vitro. Avaliamos 112 isolados de pele de indivíduos sadios e 26 isolados de urina (22) e cateter (4) identificados pelo método fenotípico. Dos isolados colonizantes (112) as seguintes espécies foram identificadas: T. cutaneum (29,46%), T. asteroides (20,53%), T. ovoides (15,17%), T. inkin (10,71%), T. mucoides (8,92%) e T. asahii (6,25%). Dentre os isolados de urina e cateter as espécies identificadas foram T. asahii, a espécie mais isolada (n = 23; 76,66%), seguido por T. inkin (n = 5; 16,66%) e T. asteroides (n = 2; 6,6%). Na identificação genotípica das leveduras do gênero Trichosporon utilizamos as regiões ITS e IGS do DNA ribossômico. Após a análise filogenética constatamos que a região que melhor discrimina as espécies é a IGS, assim o padrão ouro para nossa investigação foi baseado nessa região. Nos isolados de urina e cateter a espécie T. asahii foi predominante, sendo identificada em 22 isolados (84,6%), seguida por dois isolados de T. inkin (7,69%). T. coremiiforme e T. debeurmannium foram isolados em uma amostra cada (3,84%). Quando comparamos os dados obtidos pela identificação molecular e fenotípica observamos que apenas em 30% dos isolados (21/70), a identificação fenotípica foi capaz de identificar corretamente os isolados de Trichosporon spp. Como ferramenta epidemiológica analisamos o polimorfismo das sequências de T. asahii, segundo a classificação em genótipos. A análise bayesiana classificou o isolado 062 pertencente ao genótipo 3, o isolado 002 pertencente ao genótipo 4 e nenhum isolado pertencente aos genótipos 5, 6 e 7. Da mesma forma não podemos afirmar com qual genótipo, 1 ou 2, o restante dos isolados mais se assemelha devido à grande politomia e a baixa probabilidade a posteriori dos ramos. Avaliamos como fatores de virulência a produção de exoenzimas (Proteinase, Fosfolipase e DNAse) e Índice de adesão desses isolados, sendo possível observar que existe dois padrões distintos: isolados colonizantes com baixa produção de exoenzimas e pouco aderentes e isolados de urina e cateter com produção pronunciada de exoenzimas e com índice de aderência elevados. / Yeasts of the genus Trichosporon appear as emerging pathogens with high rates of morbidity and mortality in immunocompromised patients and is becoming increasingly widespread. The significant increase of invasive tricosporonose and the controversial identification of this kind imply an epidemiological deficit which in turn complicates the understanding of the natural history of these infections, leading to delays in diagnosis and, consequently, appropriate antifungal therapy. The present study aimed to evaluate the epidemiological aspects related to human colonization and infection by Trichosporon spp. through phenotypic and genotypic methods and its correlation with virulence factors in vitro. We evaluated 112 isolates from skin of healthy individuals and 26 isolates from urine (22) and catheter (4) identified by the phenotypic method. Among the colonizing isolates (112) the following species were identified: T. cutaneum (29.46%), T. asteroides (20.53%), T. ovoides (15.17%), T. inkin (10.71%), T. mucoid (8.92%) and T. asahii (6.25%). Among the isolates from urine and catheter the species identified were T. asahii the most species isolated (n = 23; 76.66%), followed by T. inkin (n = 5; 16.66%) and T. asteroides (n = 2, 6.6%). For the genotypic identification of yeasts Trichosporon, the ITS and IGS regions of ribosomal DNAwere used. After phylogenetic analysis, the region that better discriminates the species is IGS, and the gold standard for our investigation was based in that region. In isolates from urine and catheter the T. asahii was the predominant species, being identified in 22 isolates (84.6%), followed by two T. inkin (7.69%). T. coremiiforme and T. debeurmannium were isolated in one sample each (3.84%). When comparing the data obtained by molecular and phenotypic identifications it was observed that only in 30% of the isolates (21/70), the phenotypic identification was able to correctly identify isolates of Trichosporon spp. The polymorphism of the sequences of T. asahii, was analyzed according to the classification of genotypes. Bayesian analysis classified the 062 isolate belonging to genotype 3, the isolated 002 belonging to genotype 4 and no isolate belonging to genotypes 5, 6 and 7. Likewise we cannot say with which genotype 1 or 2, the remainder of the isolates most closely because of the large polytomous and low posterior probability of the branches. Evaluated as virulence factors of production of exoenzymes (proteinase, phospholipase and DNase) and index of adhesion of these isolates and it was observed that there are two distinct patterns: isolates colonizing lowexoenzymes and loosely adhering, and isolated from urine and catheter pronounced production of exoenzymes and high rate of adherence. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-07-22T13:55:42Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 157.86.8.8/reports/doutorado_bibcb/marcelly_brito_ipec_dout_2011.pdf: 1069166 bytes, checksum: 4b503c1616c5d0d2b6ce68455c9495c4 (MD5) 157.86.8.8/reports/doutorado_bibcb/marcelly_brito_ipec_dout_2011.pdf.txt: 151409 bytes, checksum: bd009b4ad05d974c6b0e66e903e60674 (MD5) 157.86.8.8/reports/doutorado_bibcb/marcelly_brito_ipec_dout_2011.pdf.jpg: 1379 bytes, checksum: f38c6fd8a8b41d973bb48e95937c921d (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro,RJ, Brasil / Estudos sobre os aspectos morfológicos, genéticos e de virulência, inerentes ao Paracoccidioides brasiliensis antes e depois da interação com hospedeiro experimental são de grande importância para. Oito isolados avaliados não apresentaram diferenças macro e micromorfológicas póspassagem em animal quando comparadas a morfologia pré-passagem. Entretanto eles diferiram entre si em relação à micromorfologia, in vitro, com diferenças na gemulação e presença de filamentos à temperatura de 36oC. Em relação à virulência, segundo os critérios adotados, índice esplênico, reisolamento de células fúngicas, lesões em diferentes órgãos e taxa de sobrevivência, o isolado Pb235CRS foi considerado o mais virulento; os isolados Pb261, Pb31MAS, Pb285, Pb246, Pb281 apresentaram virulência intermediária e os isolados Pb29EE e Pb639 foram os menos virulentos A genotipagem por RAPD dos isolados demonstrou modificações no perfil de bandas do DNA após interação com o hospedeiro animal, aos 100 dias da inoculação, porém não foi possível correlacionar esses dados com os demais obtidos. Os resultados obtidos em nosso estudo apontam que diferenças entre isolados existem e podem interferir na evolução da doença / Studies of aspects inherent to Paracoccidioides brasiliensis, especially before and after thee interaction with the experimental host are of importance to extend the knowledge about its pathogenesis. Morphology, genetic profile and virulence of eight strains of P. brasiliensis isolated from patients with chronic form of disease from Mato Grosso state were evaluated before and after passage in experimental murine model. Eight isolates evaluated did not show macro and micromorphological differences after animal passage when compared to pré-animal passage. However, differences among them were observed in relation to presence of yeast and filament forms, in vitro, at 36ºC. Evaluation of virulence, in accordance with the criteria used, splenic index, fungal cells recovered, lesions in different organs and survival rate, showed that Pb235CRS was the most virulent isolate; Pb261, P31MAS, Pb285, Pb246, Pb281 had intermediate virulence and Pb639, Pb29EE were the less virulent isolates. Genotyping by RAPD of these isolates showed changes in the profile of DNA after 100 days of interaction with the animal host. It was not possible to correlate the data from morphology, genotyping and virulence. The results obtained in our study pointed out differences among isolates that may interfere with the disease evolution.