Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La mastitis bovina es uno de los problemas de mayor impacto económico en la industria láctea en Chile y alrededor del mundo. Esta enfermedad puede ser producida por traumas, hongos, algas, bacterias, entre otras causas. Dentro de los agentes bacterianos, E. coli es la de mayor importancia en granjas chilenas con animales en confinamiento, produciendo una mastitis de curso corto y signos visibles. Por esta razón en la presente memoria se evaluó la presencia de genes codificantes a factores de virulencia, asociados a la etapa de adhesión, descrita como de gran importancia en la patogenia de E.coli. Muestras provenientes de vacas cursando mastitis bovina clínica y subclínica de las zonas central (Región Metropolitana) y sur (Región de Los Lagos) fueron analizadas, a través de técnicas microbiológicas como el cultivo bacteriano y baterías bioquímicas en conjunto con técnicas basadas en el DNA como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). De los 150 animales muestreados, solo 24 de estos mostraron ser positivos a E. coli. Asimismo tras evaluar 5 genes asociados a adhesinas, solo dos de estos se encontraron presentes en cuatro muestras. En todos los casos se encontró solo un gen por muestra. Los resultados concuerdan con otros estudios realizados en otros países, y sugieren que no existe una relación entre determinados factores de virulencia y, la presentación y severidad de la enfermedad / Proyecto FIA PYT 0055-2012

Yersinia enterocolitica es un patógeno Gram-negativo que provoca diversos síndromes gastrointestinales. La cadena O es el componente más expuesto al exterior del lipopolisacárido y se ha descrito como un importante factor de virulencia. En Y. enterocolitica O:8 (YeO8) la expresión de la cadena O está coordinada con la de otros factores de virulencia de Yersinia, como inv, importante en el proceso de colonización intestinal de la bacteria, y flhDC, el principal operón de regulación del flagelo. En esta Tesis Doctoral se ha demostrado como la ausencia de la cadena O también altera la expresión del sistema de secreción tipo III (SSTT) Ysc, otro importante factor de virulencia de Y. enterocolitica, en un proceso dependiente de flhDC. Además, se han descrito las bases moleculares que explican como la ausencia de cadena O determina la disminución de la expresión de inv, la disminución de la secreción de Yops por el SSTT Ysc y un aumento de la motilidad de la bacteria en un circuito de regulación en el que están implicados el operón sspAB, la proteasa ClpXP, el regulador transcripcional H-NS y flhDC.

El género Aeromonas está constituido por bacterias Gram-negativas aisladas frecuentemente en el agua. Adquieren relevancia por estar presentes en alimentos, y ser capaces de ocasionar cuadros diarreicos e infecciones extraintestinales en el hombre, habiéndose demostrado en la presente tesis, que pueden ser las causantes de hasta el 2% de las diarreas del viajero. La taxonomía de Aeromonas es compleja. El género consta de 15 especies difíciles de identificar con métodos bioquímicos, por lo cual en la presente tesis se ha desarrollado un protocolo, basado en los patrones de restricción del gen 16S rRNA, que permite identificar todas las especies aceptadas de Aeromonas. La mayoría de laboratorios clínicos utilizan para la identificación de las especies métodos miniaturizados semiautomáticos u otras pruebas bioquímicas que, como se demuestra en la presente tesis, conducen a identificaciones erróneas tanto a nivel de especies como del género, llegándose a confundir cepas de Aeromonas como pertenecientes a Vibrio. Para evitar esta confusión, se ha diseñado una sonda molecular, basada en el gen que codifica para la glicerofosfolípido-colesterol aciltransferasa, que es capaz de identificar las colonias de Aeromonas en medios de aislamiento primario de una forma rápida y eficaz.La correcta delimitación e identificación de las especies que integran el complejo fenotípico "A. hydrophila" (A. hydrohila, A. bestiarum, A. salmonicida y A. popoffii) constituye uno de los problemas en la taxonomía del género. Por ello, se ha considerado importante investigar las características bioquímicas y genéticas de este grupo de especies, comprobándose que las especies A. bestiarum y A. salmonicida no pueden diferenciarse mediante pruebas bioquímicas ni por métodos genéticos, por lo que sugerimos que se tratan de una única especie.Otro objetivo abordado en la tesis ha sido el estudio de los patrones de resistencia, de las especies de Aeromonas identificadas por métodos genéticos, a los agentes antimicrobianos. Se ha demostrado que las cepas de origen clínico de las especies A. hydrophila, A. caviae y A. veronii son sensibles a las cefalosporinas, aminoglucósidos, y las fluoroquinolonas. Además, se ha evidenciado que las quinolonas o las cefalosporinas de tercera generación deben considerarse como el tratamiento de elección para el tratamiento de las diarreas del viajero causadas por Aeromonas.Para poder avanzar en el conocimiento de la epidemiología de Aeromonas es imprescindible disponer de métodos moleculares de tipado fiables. En esta tesis se han evaluado tres técnicas (RFLP del espaciador intergénico 16S-23S, ERIC-PCR y REP-PCR) para el tipado molecular de Aeromonas, demostrándose que la técnica de ERIC-PCR es la más discriminativa. Sin embargo se ha observado que la combinación simultánea de dos de éstas técnicas (ERIC y REP) mejora el tipado. La virulencia de Aeromonas es compleja y posiblemente multifactorial. Se han descrito numerosos genes que codifican para diversos enzimas (hemolisinas, lipasas, DNasas, proteasas...) en los que se ha demostrado su implicación en virulencia, no obstante no existen estudios que hayan investigado simultáneamente la incidencia de todos ellos en cepas clínicas y ambientales en todas las especies del género. En esta tesis se ha investigado la distribución de los genes que codifican para estos factores de virulencia, así como la actividad enzimática que se les asocia en cepas clínicas y ambientales de todas las especies del género, demostrándose que se encuentran ampliamente presentes en todas ellas. Sin embargo se ha encontrado una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de genes que codifican para los factores de virulencia aerolisina/hemolisina y serina proteasa y la actividad ß-hemolítica, lo que sugiere, tal como han indicado otros autores, que la serina proteasa podría actuar como activador de la aerolisina/hemolisina.Por último, hemos considerado de interés el determinar sí las especies de Aeromonas de mayor relevancia en clínica poseen el sistema de secreción tipo III, descrito en otros microorganismos patógenos como Escherichia coli, Yersinia spp. y Salmonella ssp. y, cuya función principal consiste en hacer llegar toxinas directamente al citoplasma de la célula huésped. En la presente tesis se ha demostrado que dicho sistema está presente en la mayoría de cepas clínicas de A. veronii y A. hydrophila, lo cual indica que dichas cepas poseen un potencial virulento comparable al de los patógenos mencionados. / The genus Aeromonas comprises Gram-negative bacteria frequently isolated from water. They are important because they are found in food and can provoke diarrhoea and extraintestinal infections in humans. The present thesis demonstrates that they can be aetiological agents in up to 2% of traveller's diarrhoea.Aeromonas taxonomy is complex. The genus comprises 15 species difficult to identify with classical biochemical methods. Because of this we have developed a technique based on the 16S rRNA restriction patterns that allows the identification of all the accepted species of Aeromonas. Most clinical laboratories use miniaturized semiautomatic systems or other biochemical tests to identify Aeromonas species. As we demonstrate they can give erroneous identifications as Vibrio at both species and genus level. In an attempt to avoid this confusion, we designed a molecular probe, based on the gene that codifies for glycerophospholipid-cholesterol acyltransferase, which can detect Aeromonas colonies in primary isolation media in a fast and reliable manner.The correct delimitation and identification of the species that integrate the phenotypic "A. hydrophila" complex (A. hydrohila, A. bestiarum, A. salmonicida and A. popoffii) constitutes one of the problems in the taxonomy of the genus. For that reason we considered it important to investigate the biochemical and genetic characteristics of this group of species. We have observed that the species A. bestiarum and A. salmonicida cannot be differentiated either with biochemical or with genetic methodology, suggesting that they may be unique species.Another objective was the study of the resistance patterns, in genetically identified Aeromonas species, to the antimicrobial agents. We demonstrate that clinical isolates of A. hydrophila, A. caviae and A. veronii species are susceptible to cephalosporins, aminoglycosides and fluoroquinolones. Moreover, there was evidence that quinolones and third generation cephalosporines should be considered as the treatment of choice of traveller's diarrhoea.In order to improve our knowledge of the epidemiology of Aeromonas, it is essential to have reliable molecular typing methods. We evaluated three techniques (intergenic spacer region 16S-23S RFLP, ERIC-PCR and REP-PCR) for the molecular typing of Aeromonas, and we found ERIC-PCR to be more discriminative. However, we also observed that the simultaneous combination of two of those techniques (ERIC and REP) further improved the typing.The virulence of Aeromonas is complex and possibly multifactorial. Numerous genes codifying for different enzymes (hemolysins, lipases, DNases, proteases.) have been described and their implication in virulence has been demonstrated, but there have been no studies to investigate simultaneously the incidence of all those genes in clinical and environmental isolates of all the species of the genus. In the present thesis we investigate the distribution of the genes codifying for those virulence factors, and their associated enzymatic activity on clinical and environmental isolates of all the species of the genus. We found a large presence of the genes in all the species, regardless of the origin. However, we also found a statistically significant association between the presence of genes codifying for aerolysin/hemolysin and serine protease and ß-hemolitic activity, which suggests that serine protease acts as aerolysin/hemolysin activator.Finally, we considered it of interest to determine whether the Aeromonas species with major clinical relevance possess the type III secretion system, described in other pathogenic micoorganisms, such as Escherichia coli, Yersinia spp. and Salmonella spp. The principal function of this system is to inject toxins directly into the host cell cytoplasm. We demonstrate that this system is present in most of the clinical A. veronii and A. hydrophila isolates, which indicates that those strains possess a virulence potential comparable to that of the other mentioned pathogens.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-26Bitstream added on 2014-08-13T18:01:12Z : No. of bitstreams: 1 000735330_20140826.pdf: 26004 bytes, checksum: 80491d16dd561bc066d6dacbdc900451 (MD5) / A piometra canina é uma enfermidade caracterizada pela inflamação do útero com acúmulo de exsudatos, acometendo principalmente fêmeas adultas. Ocorre na fase lútea do ciclo estral em decorrência de alterações hormonais e infecção bacteriana. É reconhecida como uma das principais causas de morte em cadelas e a Escherichia coli é o principal patógeno associado a esta doença. O objetivo deste estudo foi isolar e identificar cepas de E. coli provenientes de conteúdo intra uterino, boca e fezes de cadelas diagnosticadas com piometra, estudar a prevalência de genes codificadores de fatores de virulência uropatogênicos das cepas obtidas testando ainda a semelhança genética entre as cepas isoladas de conteúdo intra uterino e boca e avaliar a susceptibilidade “in vitro” das bactérias isoladas frente a 12 agentes antimicrobianos. Setenta cepas de E. coli, 25 provenientes do conteúdo intra uterino, 26 provenientes da boca e 19 provenientes das fezes, isoladas de 6 cadelas foram examinadas por PCR. Entre as cepas examinadas, 67 (95,7%) foram positivas para o gene fim, 19 (27,1%) foram positivas para iss, 18 (25,7%) foram positivas para hly , 13 (18,5%) foram positivas para iuc e 12 (17,1%) foram positivas para usp. Três animais apresentaram grande similaridade entre as cepas de E. coli isoladas do conteúdo intra uterino e da boca, através da análise da diversidade genética realizada mediante emprego da técnica REP-PCR, ERIC-PCR e BOX-PCR. Resistência antimicrobiana predominante foi detectada para cefalotina (67,1%), ampicilina (65,7%), tetraciclina (61,4%) e nitrofurantoina (58,5%) entre as cepas isoladas. Resistência a múltiplos antimicrobianos foi detectada em 12 (48,0%) dos isolados do conteúdo intra uterino, em 22 (84,6%) dos isolados da boca e em 14 (73,6%) dos isolados das fezes... / Canine pyometra is a disease characterized by the inflammation of the uterus with accumulation of purulent discharge, affecting mainly adult animals. Occurs in the luteus phase of the estrus cycle in result of hormone alterations and generally is associated with bacterial infections. It is recognized as one of the main causes of disease and death in the bitch and Escherichia coli is the major pathogen associated with this disease. The aim of this study was to research, isolation and identification of Escherichia coli strains from intrauterine contents, mouth and feces of bitches diagnosed with pyometra, studying the prevalence of uropathogenic virulence factors genes in strains isolated, still testing the genetic similarity among strains isolated from intrauterine contents and mouth and evaluate the susceptibility in vitro of the isolated bacteria to 12 antimicrobial drugs. Seventy E. coli strains, 25 from intrauterine contents, 26 from mouth and 19 from feces isolated from six bitches were examined by PCR. Among the strains 67 (95.7%) were positive for fim, 19 (27.1%) were positive for iss, 18 (25.7%) were positive for hly, 13 (18.5%) were positive for iuc and 12 (17.1%) were positive for usp. Multiple antimicrobial resistance was detected for cephalothin (68.0%), nalidixic acid (56.0%) and ampicillin (56.0%) among the pyomera E. coli isolates. Multidrug resistance was found in 12 (48.0%) of the isolates from pyometra, in 22 (84.6%) of the isolates from mouth and in 14 (73.6%) of the isolates from feces...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-10Bitstream added on 2014-06-13T21:05:09Z : No. of bitstreams: 1 paula_cjs_dr_jabo.pdf: 584953 bytes, checksum: ec9392065fb3f24ecd68608f81b4c9f5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / De 2008 a 2011 foram isoladas 110 cepas de Escherichia coli, sendo 59 a partir de urina de mulheres com ITU bacteriana. Os outros 51 isolados foram coletados por meio de swabs anais dos respectivos animais de estimação. Foram pesquisados por PCR a presença de genes de virulência e os genes mais encontrados foram o hlyF (44,06%), iss (42,37%) e fimH (100%) e hlyF (13,72%), iss (11,76%) e fimH (96,07%) entre as cepas de origem humana e animal, respectivamente. Foi realizada também a técnica de ERIC-PCR, onde pode observar dissimilaridades genéticas entre estes dois grupos bacterianos estudados, dando fortes indícios de que a transmissão no presente trabalho esteve ausente. Foram realizados antibiogramas a partir de cada um dos cinco isolados de cada amostra encontrando maior número de cepas resistentes em mulheres que nos animais em 8 dos 11 antimicrobianos testados, as maiores resistências para as cepas de origem humana foram o ácido nalidíxico e o ciprofloxacino com 97,14% e para as de origem animal a amoxicilina / ácido clavulânico e ampicilina com 74,28% e 68,57% respectivamente. As cepas de origem humana apresentaram também maiores índices de multirresistência que dos animais com 71,42% e 40%, respectivamente. Estas diferenças entre as resistências fortalecem a hipótese de que a origem das bactérias causadoras de ITU em mulheres não é de seus respectivos animais de companhia / A hundred-ten Escherichia coli strains was isolated from 2008 to 2011, among them 59 were from women with urinary tract infection (UTI) and 51 were from their pets collected by rectal swab. The virulence genes was search by PCR and the most found genes were fimH (100%), hly (44%) and iss (42.3%) all of then from women. Also was used the ERIC-PCR method to check the similarity among both bacterial groups analyzed. The results showed different patterns for each pair women-animal bacterial isolates. In general the isolates from human showed more resistance to the antimicrobial drugs examined, the highest resistance rate was for nalidixic acid (97.1%) and for streptomicin (96.0%) both from human isolates. The results obtained in this study do not permit to suggest a transmission of bacterial strains involving humans and their companion animals

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias . / Campylobacter jejuni (C. jejuni) y Campylobacter coli (C. coli) son microorganismos comensales en animales productivos y constituyen una de las principales causas de enteritis de transmisión alimentaria. C. jejuni es responsable del 90% de las campylobacteriosis humanas y C. coli cerca del 10%. Ambas especies son aisladas en proporciones similares de la carne de pollo, la principal fuente de infección del ser humano, representando cada una de ellas cerca del 50% de los Campylobacter spp. aislados. Para estas bacterias, la adherencia e invasión a células intestinales son mecanismos fundamentales de patogenicidad. Se han identificado diversos factores de virulencia asociados a estos mecanismos, como también diferencias entre C. jejuni y C. coli en las prevalencias y tamaños de algunos de los genes que los codifican. El propósito del presente trabajo fue caracterizar la capacidad de adherencia e invasión a células intestinales humanas de cepas de C. jejuni y C. coli aisladas de personas y animales productores de alimentos y relacionar esta capacidad con la presencia de siete genes de virulencia (cadF, flaA, racR, dnaJ, virB11, ciaB y pldA). La hipótesis fue que las cepas de C. jejuni tendrían mayor capacidad de adherir e invadir células intestinales humanas que las cepas de C. coli, y que esta capacidad se relacionaría positivamente con la presencia de genes de virulencia. Se emplearon 15 cepas de C. jejuni y 17 de C. coli aisladas desde pacientes humanos, cerdos, bovinos y pollos broiler. La presencia de los genes de virulencia de cada una de las cepas fue caracterizada en un estudio previo mediante la técnica de PCR convencional. Para evaluar la capacidad de adherencia e invasión a células intestinales humanas se realizaron estudios in vitro empleando la línea celular T84 de epitelio colónico T84 y midiendo el número de bacterias adheridas luego de una h de infección y las bacterias internalizadas luego de tres. La asociación con los genes de virulencia se valoró mediante análisis de regresión logística, el que se complementó con el test Kruskal-Wallis para evaluar diferencias en adherencia e invasión entre cepas portadoras y no portadoras de los genes. Los resultados demostraron que tanto las cepas humanas como las aisladas desde animales productores de alimento tienen la capacidad de adherir e invadir células intestinales in vitro y que esta capacidad varía entre las diferentes cepas. Estadísticamente, no se encontraron diferencias en la capacidad de adherencia e invasión entre C. jejuni y C. coli. El análisis Kruskal- Wallis (y test post-hoc Dunn) reveló que las cepas de C. coli portadoras del gen dnaJ tenían una mayor capacidad de invasión que las cepas de C. coli no portadoras del gen y que las cepas C. jejuni portadoras del mismo. Asimismo, con el análisis de regresión logística se encontró una asociación significativa entre la presencia del gen dnaJ y una mayor capacidad invasora en la especie C. coli. Los resultados de este trabajo sugieren que C. jejuni y C. coli tendrían la misma capacidad de adherir e invadir células intestinales humanas y que solo existiría una asociación positiva entre el gen dnaJ y la invasión de cepas de C. coli. / Campylobacter jejuni (C. jejuni) and Campylobacter coli (C. coli) are commensals microorganisms of food-producing animals, and they are considered one of the major causes of food-borne enteritis. 90% of human campylobacteriosis is caused by C. jejuni and most of the rest by C. coli. Both species are isolated in similar proportions from chicken meat, the main source of human infection, representing each of them almost the 50% of Campylobacter spp. isolated. The adherence to and invasion of human intestinal epithelial cells are essential mechanisms in Campylobacter pathogenesis. There have been identified several virulence factors related to these mechanisms, besides differences between C. jejuni and C. coli in the prevalence and size of some of the genes that encode them. The aim of this work was studied the adherence to and invasion of human intestinal epithelial cells by C. jejuni and C. coli isolated from humans and foodproducing animals, and to relate those abilities to the presence of seven virulence genes (cadF, flaA, racR, dnaJ, virB11, ciaB y pldA). The hypothesis was that C. jejuni strains would have more ability to adhere to and invade human intestinal epithelial cells than C. coli strains, and those abilities would be associated with the presence of virulence genes. We used 15 C. jejuni strains and 17 C. coli strains isolated from human patients, broiler chickens, swine, and bovines. The presence of virulence genes of each of the strains was determined using PCR before this work. We employed the human colonic epithelial cell line T84 to test in vitro the adherence and invasion abilities, and we checked them after one and three hours of infection to determine the number adhered and internalized bacteria, respectively. To test the association with the virulence genes we used logistic regression, and to evaluate differences of adherence and invasion between strains carrying and non-carrying virulence genes we used the Kruskal-Wallis test. We observed that both Campylobacter isolates from humans and from food-producing animals are capable of adhering to and of invading intestinal epithelial cells in vitro, and there are variations between strains in those abilities. Statistically, no significant differences were detected between C. jejuni and C. coli in their abilities to adhere to and to invade T84 cells. The Kruskal-Wallis test (and post-hoc Dunn test) showed that C. coli strains carrying dnaJ gene invaded more than C. coli strains non-carrying the gene, and more than C. jejuni strains carrying the same gene. Besides, a significant association was detected between the presence of the dnaJ gene and a higher invasion in C. coli strains by logistic regression. Our results suggest that C. jejuni and C. coli would have the same adherence and invasion abilities, and that, statistically, it would exist only a positive association between the dnaJ gene and the invasion ability of C. coli strains. / Financiamiento: Programa de Apoyo Económico de Actividades de Investigación para estudiantes de Magíster en Ciencias Animales Veterinarias.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Avícolas. / La campilobacteriosis es una enfermedad emergente transmitida por los alimentos y es la principal enfermedad gastrointestinal en seres humanos en países desarrollados. El desarrollo de resistencia de Campylobacter spp. a los antimicrobianos empleados como tratamiento en personas es un problema de salud pública que está relacionado con el uso inadecuado de estos agentes en los sistemas de salud y en la producción animal. Aún se debe esclarecer la patogenia de esta enfermedad y el mecanismo por el que actúan los factores de virulencia que no son completamente conocidos. En el mundo existe escasa información de la prevalencia de genes de virulencia de Campylobacter spp. aislados de pavos y de igual manera poca información de la susceptibilidad antimicrobiana en esta especie. El objetivo de este trabajo fue determinar los perfiles de resistencia a los antimicrobianos: Ciprofloxacino, Tetraciclina, Eritromicina y Gentamicina de 105 cepas de Campylobacter spp. aisladas de sistemas de producción de pavos, empleando la técnica de Kirby Bauer. Se obtuvieron 76 cepas resistentes a Ciprofloxacino y 42 a Tetraciclina. Ninguna cepa fue resistente a Eritromicina ni a Gentamicina. Del total de la cepas resistentes a Tetraciclina, 41 de ellas fueron multiresistentes (Ciprofloxacino y Tetraciclina). Al mismo tiempo las 105 cepas fueron analizadas por PCR en busca de genes de virulencia asociados con adherencia y colonización (cadF, racR, flaA), invasión (ciaB, pldA), producción de toxinas (cdtA, cdtC) y mimetismo del LPS (wlaN). La prevalencia de cadF fue de 64,8%, racR 45,7%, flaA 53,3%, ciaB 24,8%, pldA 36,2%, cdtA 65,7%, cdtC, 61% y wlaN 21%. Los resultados sugieren que existe un potencial patógeno de algunos de los aislamientos y demuestra la necesidad de implementar un plan de vigilancia con el fin de resguardar la Salud Pública. / Campylobacteriosis is an emerging disease transmitted by foods, it is also a main human gastrointestinal disease in developed countries. The evolvement of Campylobacter spp. resistance to antimicrobials used for treatment in humans is a public health problem, related to the inappropriate use of these agents in animal production and health systems. The pathogenesis of this human disease still needs to be elucidated, since the mechanism by which virulence factors act are not completely known. In the world there is insufficient information on the prevalence of the virulence genes of Campylobacter spp. isolated from turkeys, as well as little information on antimicrobial susceptibility in this species. The aim of this study was to determine the antimicrobial resistance profiles to Ciprofloxacin, Tetracycline, Erythromycin and Gentamicin of 105 strains of Campylobacter spp. isolated from turkey production systems using the Kirby-Bauer technique. As a result we found 76 strains resistant to ciprofloxacin, 42 to Tetracycline, moreover Erythromycin and Gentamicin had no antimicrobial resistance. Of the total tetracycline resistant strains 41 of them were multiresistant (Ciprofloxacin and Tetracycline). These 105 strains were analyzed by PCR for genes associated with virulence adhesion and colonization (cadF, racR, flaA), invasion (ciaB, pldA), toxins production (cdtA cdtC) and mimitims of LPS (wlaN). With a prevalence of 64.8% cadF,45.7% racR, 53.3% flaA, 24.8% ciaB, 36.2% pldA, 65.7% cdtA, 61% cdtC and 21% wlaN. The results suggest that there is a pathogen potential of some of the isolates and demonstrates the necessity of implementing a surveillance plan in order to protect public health.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:44Z : No. of bitstreams: 1 000851710_20160722.pdf: 735546 bytes, checksum: 011c591d928a97fba211a8ca067ba722 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-25T13:17:40Z: 000851710_20160722.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-25T13:18:47Z : No. of bitstreams: 1 000851710.pdf: 5518013 bytes, checksum: 8a378cf5a8a0a17841f43b423f397e01 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP (PADC) / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células do hospedeiro são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, estes utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. O sucesso de colonização dos tecidos do hospedeiro pelo fungo é um evento complexo, geralmente envolvendo um ligante codificado pelo patógeno (adesinas) e um receptor da célula (freqüentemente um componente da matriz extracelular). A identificação de mecanismos de adesão, invasão ou evasão imune por Paracoccidioides é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Neste intuito o estudo dos passos envolvidos desde o contato inicial de P. brasiliensis até os que culminam com a sua entrada na célula através da caracterização funcional de proteínas de membrana de P. brasiliensis, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de elongação Tu, pertence ao grupo de proteínas denominadas moonlighting, tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. Previamente esta proteína foi identificada em P. brasiliensis por análise proteômica, sendo diferencialmente expressa quanto o fungo foi cultivado na presença de sangue de carneiro, porém esta ainda não foi caracterizada sendo interessante então a elucidação do seu papel na interação deste fungo às células epiteliais. O objetivo deste estudo foi produzir a proteína EF-Tu recombinante e seu respectivo anticorpo policlonal, verificar... / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. The adhesion and host cell invasion are critical events involved in the infection and dissemination of the pathogen. Furthermore, they use their surface molecules to bind to extracellular matrix components to establish infection. The successful colonization of host tissues by the fungus is a complex event, usually involving a linker encoded by the pathogen (adhesins) and a cell receptor (often an extracellular matrix component). The identification of adhesion mechanisms, invasion or immune evasion by P. brasiliensis is extremely important and has been investigated in recent studies developed by several groups. In order to study the steps involved from the initial contact of P.brasiliensis until the culminating in its entry into the host cell through the functional characterization of P. brasiliensis membrane proteins, the main targets of interaction with host molecules, is of great importance. The elongation factor Tu (EF-Tu) belongs to the group of proteins called moonlighting such molecules have the ability to perform more than one function, and typically are located in different compartments of the cell. There are reports that EF-Tu of pathogens can act as a virulence factor. This protein has been previously identified in P. brasiliensis by proteomic analysis, but this has not yet been characterized as being interesting then the elucidation of its role in interacting of the fungus with epithelial cells. For this purpose the aim of this study was to produce the recombinant protein and its respective polyclonal antibody, verify your role in the fungus interaction with pneumocytes, extracellular matrix and plasminogen. Also in order to characterize the EF-Tu protein the present study aimed to obtain isolated with low expression of the gene encoding EF-Tu and with this verifies the role of EF-...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-25Bitstream added on 2014-06-13T19:32:19Z : No. of bitstreams: 1 machado_aa_me_jabo.pdf: 431894 bytes, checksum: 1c6062712e3a963ac83a219a776a62f4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O temefós é o larvicida mais utilizado no país, mas tem-se constatado populações resistentes a este inseticida em diversos locais, e a necessidade de substituição por outro larvicida com mecanismo de ação tóxica diferente ao temefós. O diflubenzuron (DFB), inibidor de síntese de quitina, destaca-se com grande potencial para substituir o temefós. Objetivou-se determinar a razão de resistência (RR95) de larvas de duas populações de campo (Pop. A e Pop. B) ao temefós; avaliar a eficácia do DFB para as duas populações, em condições laboratoriais; e avaliar a eficácia do DFB para as duas populações, em condições de campo, em recipientes de plástico, vidro e borracha, com a concentração de 0,25 mg/L. Em condições de laboratório, os ensaios foram realizados em sala climatizada com 26 ± 2ºC, para avaliar a razão de resistência das populações de campo ao temefós, por meio de ensaios concentração-resposta, e para avaliar a eficácia do DFB. Em condições de campo, os testes foram realizados à sombra, em abrigo coberto, com médias de tempfoitura de 22,4°C e umidade relativa do ar de 61%, para a avaliação da eficácia do DFB às três populações de larvas, em recipientes de plástico, vidro e borracha. A população suscetível Rockefeller foi utilizada como padrão de referência em todos os testes. O período de cotrole do DFB foi determinado com o tempo em que o DFB causou mortalidade de larva ≥ 80%. A RR95 é de 7,5 para da Pop. A e de 3,9 para a Pop. B. Nos ensaios de laboratório, o DFB causou inibição total da emergência de adultos viáveis das Pop. A e B a partir da concentração 2,0 μg/L. Nos testes de campo, o DFB é eficaz no controle da cepa suscetível por quatro semanas nos recipientes de plástico e borracha, e por três semanas em vidro. Para a Pop. A... / The temephos is the most widely used larvicide in the country, but it has been found resistant populations this insecticide in sevfoil places, and the need for replacement by another larvicide with different mechanism of toxic action to temephos. The diflubenzuron (DFB), chitin synthesis inhibitor, stands out with great potential to replace temephos. The aim were to determine the resistance reason (RR95) of larvae of two field populations (Pop A and Pop B) to temephos; to evaluate the efficacy of the DFB for both populations, under laboratory conditions; and to evaluate the effectiveness of the DFB for both populations, in the field conditions, in plastic, glass and rubber test vessels, with a concentration of 0.25 mg/L. Under laboratory conditions, bioassays were performed in controlled room with tempfoiture 26 ± 2°C, to evaluate the resistance reason of field populations to temephos, by concentração-response tests, and to evaluate the effectiveness of the DFB. In field conditions, tests were carried out in the shade, under cover, with avfoige tempfoitures of 22.4°C and relative humidity of 61%, to evaluate the effectiveness of the DFB to three populations of larvae in plastic, glass and rubber test vessels. The susceptible population Rockefeller was used as a reference standard in all tests. The residual period of the DFB was determined over time that DFB caused larval mortality ≥ 80%. The RR95 is 7.5 to Pop A and 3.9 to Pop B. In laboratory bioassays, the DFB caused complete inhibition emergence of viable adult of Pop A and B at the concentration 2.0 μg/L. In field tests, the DFB is effective in controlling the susceptible strain for four weeks in plastic and rubber test vessels, and for three weeks in glass test vessel. To Pop A, the DFB is effective for five weeks in all test vessels, and to Pop B, for three weeks in glass and plastic... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:32Z : No. of bitstreams: 1 000829993.pdf: 2533065 bytes, checksum: 0c6cd0ff5f622d1b517444518875e22e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O gênero Paracoccidioides consiste de fungos dimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente, estudos filogenéticos dividem o gênero Paracoccidioides em duas espécies denominadas Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioides lutzii. A primeira é dividida em três espécies filogenéticas S1, PS2 e PS3, e a segunda é chamada de Pb01-like. A correta taxonomia molecular do gênero abriu novas possibilidades para o estudo e compreensão de suas relações com seu hospedeiro. Os fungos do gênero Paracoccidioides têm algumas características que permitem o seu crescimento em condições adversas, que podem contribuir para o desenvolvimento da doença, e têm mecanismos que lhes permitem aderir e invadir os tecidos do hospedeiro. A adesão ocorre através de uma classe específica de proteínas presentes na parede celular, essas proteínas são chamadas adesinas, e são capazes de mediar interações do fungo com os tecidos do hospedeiro durante a infecção. Diferenças na adesão são responsáveis pelo aumento da virulência/patogenicidade de um isolado em relação aos outros. O objetivo deste trabalho foi contribuir para ao maior conhecimento de componentes superficiais de espécies do gênero Paracoccidioides e sua influência na virulência. Para tanto, foram analisados os perfis de adesão e expressão de adesinas, bem como a clonagem e expressão heteróloga da proteína CS (Cell surface protein) que pode estar envolvida na virulência de Paracoccidioides spp e a caracterização e identificação de moléculas por phage display com capacidade de inibir a ligação de Paracoccidioides spp. Assim, ao se avaliar o perfil de adesão das espécies P. brasiliensis e P. lutzii bem como uma análise da expressão de genes codificantes de adesinas previamente caracterizadaspor PCR em Tempo Real, verificou-se alta heterogeneidade de comportamento nas diferentes espécies em relação à adesão, mostrando ainda ... / The Paracoccidioides genus consists of dimorphic fungi, etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently, phylogenetic studies divide the Paracoccidioides genus in two species named Paracoccidioides brasiliensis and Paracoccidioides lutzii. The first is divided in three phylogenetic species, S1, PS2 and PS3 and the second is named Pb01-like. The correct molecular taxonomy of this fungus has opened new possibilities for the study and understanding of their relationships with their hosts. The fungi of the Paracoccidioides genus have some features that allow their growth in adverse conditions provided by the host, which may contribute to disease development and it have mechanisms that enable them to adhere and invade host tissues. Adhesion is provided by a particular class of proteins present in the cell wall called adhesins, capable of mediating interactions with the fungal host tissues during infection. Differences in adhesion are responsible for increased virulence/pathogenicity of an isolate in relation to others. The goal of this study was to contribute to a better knowledge of the superficial components of the species of Paracoccidioides genus e its influence in the fungi virulence. For this, we analyzed the adhesion profile and the adhesins expression during the interaction of the fungi with the host, cloned and expressed the CS protein, in a heterologous system, which may be involved in virulence of Paracoccidioides spp. as well as characterize and identify molecules capable of inhibit the adhesion of Paracoccidioides spp. using a Phage Display system. So, when we evaluated the adhesion profile of the species P. brasiliensis and P. lutzii, as well as the analysis of the expression of genes coding adhesins by Real Time PCR, it has been founded a high heterogeneity of behavior in the different species, showing that the adhesins 14-3-3 and enolase are the most used ones adhesins by the pathogen, independent of the strain ... / FAPESP: 2011/18038-9 / CNPq: CNPQ403586/2012-7