Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Le virus de l’hépatite C (VHC) est l’un des principaux facteurs étiologiques du carcinome hépatocellulaire. Le traitement des hépatites virales C a été récemment amélioré grâce à une trithérapie (interféron, ribavirine et anti-protéase virale). Néanmoins l’importance des effets secondaires et l’émergence de mutants résistants nécessitent de découvrir de nouveaux antiviraux. Dans ce contexte, notre équipe a récemment découvert que les phosphatidylinositol 4-kinases de type III (PI4KIIIα et PI4KIIIβ) étaient indispensables à la propagation du virus dans une lignée hépatique humaine, et ce, à 2 étapes de son cycle biologique : l’entrée et la réplication. L’objectif du présent travail était de poursuivre la validation de ces nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, en approfondissant nos connaissances sur la dépendance du virus à l’égard de ces kinases au cours de son entrée. Pour cela, nous avons utilisé le modèle des hépatocytes humains primaires, système in vitro plus proche du contexte physiologique que les modèles utilisés jusqu’à présent et qui étaient basés sur l’exploitation de lignées. Deux axes ont été développés : Vérification de l’importance de l’activité kinase des PI4KIIIs au cours de l’entrée du VHC dans les hépatocytes humains primaires, à travers une approche chimique ; Validation de l’implication de ces kinases et de leur activité enzymatique au cours de l’entrée virale grâce à une approche génétique basée sur l’ARN interférence et la restauration de phénotype. En parallèle, nous avons étudié l’expression de PI4KIIIα au cours de pathologies hépatiques. Nos résultats suggèrent une implication de PI4KIIIα au cours de l’entrée du VHC dans les hépatocytes humains primaires, mais restent à confirmer quant à l’implication de PI4KIIIβ. Par ailleurs, l’analyse de l’expression de PI4KIIIα dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) conduit à proposer cette kinase comme un nouveau marqueur moléculaire, qui pourrait améliorer les modèles de pronostic déjà établis et pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints d’un CHC, quelque soit l’étiologie. / Hepatitis C virus (HCV) is one of the leading causes of hepatocellular carcinoma. Therapeutic treatment against the virus has been recently improved by a tritherapy including pegylated interferon, ribavirin and antiviral protease. Nevertheless, the importance of side effects and the emergence of resistant mutants require the development of new antivirals. In this context, our team has recently discovered that Type III phosphatidylinositol 4-kinases (PI4KIIIα and PI4KIIIβ) are essential for the propagation of the virus in a human hepatic cell line at the entry and replication steps. To further characterize these potential therapeutic targets, we investigate the implication of these kinases during the HCV entry, using primary human hepatocytes, a model closer to the in vivo conditions. Two lines of research were developed: Verification of the importance of the kinase activity of PI4KIIIs during HCV entry in primary human hepatocytes, through a chemical approach; Validation of the involvement of these kinases and their enzymatic activity during viral entry through a genetic approach based on RNA interference and phenotype rescue. In parallel, we studied the expression of PI4KIIIα in liver diseases. Our results suggest the involvement of PI4KIIIα in HCV entry; the involvement of PI4KIIIIβ needs to be confirmed. The analysis of PI4KIIIα expression in hepatocellular carcinoma led us to propose this kinase as a new molecular marker, which could improve the already established prognosis models and could lead to the development of new therapeutic approaches.

L'identification de biomarqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques constitue un enjeu majeur de la recherche biomédicale visant au développement de la médecine personnalisée. L'objectif de cette thèse est d'étudier, à l'aide de puces à ADN, les modulations transcriptionnelles associées à la pathogénèse et à la réponse thérapeutique dans le cas de deux pathologies: l'infection par le Virus de l'Hépatite C (VHC) et la Polyarthrite Rhumatoïde (PR).Des biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement standard interféron ont été identifiés grâce à un modèle cellulaire ex vivo. Par ailleurs, l'analyse de données d'expression de deux modèles d'infection par le VHC (réplicon et infectieux) a permis de mettre en évidence les modulations transcriptionnelles résultant de l'activité antivirale de la chloroquine, une alternative potentielle anti-VHC. Dans le cas de la PR, nous avons identifié des biomarqueurs dont l'expression est corrélée au succès thérapeutique de l'anti-TNF Enbrel. / The identification of biomarkers and new therapeutic targets is a major challenge of biomedical research for the development of personalized medicine. The objective of this thesis is to study, using DNA microarrays, transcriptional modulations associated with the pathogenesis and therapeutic response in the case of two diseases: infection with Hepatitis C Virus (HCV) and Rheumatoid Arthritis (RA).Predictive biomarkers of response to standard interferon treatment were identified using an ex vivo cell model. Furthermore, analysis of expression data of two models of infection with HCV (replicon and infectious) has highlighted the transcriptional modulations resulting from the antiviral activity of chloroquine, a potential anti-HCV alternative. In the case of RA, we have identified biomarkers whose expression correlates with the therapeutic success of Enbrel anti-TNF drug.

Nous avons développé la base HBVdb (http://hbvdb.ibcp.fr) pour permettre aux chercheurs d'étudier les caractéristiques génétiques et la variabilité des séquences du virus de l'hépatite B (VHB), ainsi que la résistance virale aux traitements. HBVdb contient une collection de séquences annotées automatiquement sur la base de génomes de référence annotés manuellement, ce qui assure une nomenclature normalisée pour toutes les entrées de la base. HBVdb est accessible via un site Web dédié avec des outils d'analyses génériques et spécialisés (annotation, génotypage, détection de profils de résistance), et des jeux de données pré-calculés. La polymérase du VHB est la principale cible des traitements anti-VHB. Les analogues de nucléos(t)ides (NA) inhibent l'activité de la transcriptase inverse (RT), mais il existe des mutations de résistance aux NA. Cependant, un autre domaine enzymatique pourrait être une cible potentielle : la RNase H, liée au domaine RT, permettant la dégradation de l'ARN durant la transcription inverse. Pour pallier l'absence d'une structure expérimentale résolue, et grâce à l'analyse de séquences à partir de HBVdb, nous avons construit le modèle par homologie de la RNase H, qui a permis de définir les caractéristiques de cette RNase H de type 1. Enfin pour vérifier des hypothèses émises à partir de ce modèle, et pour le placer dans son contexte, nous avons construit un modèle plus étendu de la polymérase du VHB, qui comprend la les domaines RT et RNase H, et contribue à répondre à la question sur l'existence d'un domaine de connexion les reliant. Nous avons utilisé notre modèle pour analyser les interactions entre le site catalytique de la RT et le ténofovir / We developed HBVdb (http://hbvdb.ibcp.fr) to allow researchers to investigate the geneticcharacteristics and variability of the HBV sequences and viral resistance to treatment. HBVdb contains a collection of computer-annotated sequences based on manually annotated reference genomes. The automatic annotation procedure ensures standardized nomenclature for all HBV entries across the database. HBVdb is accessible through a dedicated website integrating generic and specialized analysis tools (annotation, genotyping, resistance profile detection), and pre- computed datasets. The HBV polymerase is the main target of anti-HBV drugs, nucleos(t)ides analogues (NA), which inhibit the activity of reverse transcriptase (RT), but NA resistance mutations appeared. Nevertheless, another enzymatic domain could be a potential drug target: RNase H domain, linked to RT, and involved in degradation of the RNA during the reverse transcription. To overcome the lack of experimental solved structure, thanks to sequences analysis from HBVdb, we built an homology model of RNase H, which helped to define the features of this type 1 RNase H. Finally, to confirm assumptions from this model and to put it in a more global context, we built an extensive HBV polymerase model, which includes the RT and RNase H domains, and helps to answer the question about the existence of connection domain linking them. We performed analyses on this model, regarding the interactions between the RT catalytic site and the Tenofovir, mapping known resistance mutations and the most variables positions of the HBV polymerase

La modélisation de maladies métaboliques hépatiques et les approches de thérapie cellulaire nécessitent de disposer d’une source fiable et illimitée d’hépatocytes. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches pluripotentes peuvent représenter une telle source. Nous avons tout d’abord mis au point une approche originale pour différencier une lignée de cellules souches embryonnaires humaines européenne, générée en conditions GMP-compatibles, en hépatocytes fonctionnels in vitro et in vivo après transplantation dans un modèle murin d'insuffisance hépatique aiguë. Nous avons ensuite utilisé les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques d’un patient homozygote pour une mutation entrainant une absence de récepteur des lipoprotéines de basse densité (RLDL) afin de modéliser l'hypercholestérolémie familiale (HF) in vitro. Nous avons amélioré notre approche pour différencier ces iPSC en hépatocytes plus matures et polarisés car les hépatocytes sont les seules cellules capables de dégrader le cholestérol via la bile. Nous avons montré que ce modèle reproduit la physiopathologie de l'HF et établit la preuve de concept de la correction génétique ciblée par la technologie CRISPR/Cas au locus AAVS1 par la restauration de l’expression, inductible par les statines, et de la fonctionnalité du récepteur. Nous avons également mis en évidence que le RLDL ne semble pas impliqué dans l'entrée du virus de l'hépatite C (VHC) mais plutôt dans les étapes tardives de la morphogénèse virale. Ce modèle pourra désormais servir à l’étude physiopathologique de différents patients HF, au criblage de nouvelles drogues hypocholestérolémiantes et antivirales ainsi qu'à de nouvelles approches thérapeutiques. / Liver metabolic diseases modeling and cell therapy approaches require a a reliable and well-characterized cell source. Due to their specific properties, pluripotent stem cells represent a credible alternative to primary human hepatocytes. Thus, we have defined a new approach to differentiate a European human embryonic stem cell line, generated in GMP-compatible conditions, into hepatocytes that are functional in vitro and in vivo after transplantation into a murine model of acute liver failure. We have then used induced pluripotent stem cells from a homozygous patient with a mutation leading to an absence of the low-density lipoproteins receptor (LDLR) to model familial hypercholesterolemia type IIA (FH) in vitro. As hepatocytes are the only cells able to metabolize cholesterol into bile acids, we have improved our approach to differentiate these iPSC into hepatocytes displaying cell functional organization and polarization. We have shown that our model reproduced FH physiopathology and have also restored, by the genetic targeted correction at the AAVS1 locus using CRISPR/Cas technology and subsequent hepatocyte differentiation, the LDLR expression – inducible by statins - and functionality. Moreover, we have demonstrated that the LDLR does not seem to be involved in hepatitis C virus entry or replication but rather in viral morphogenesis steps. This model will be useful to develop new cholesterol-lowering and antiviral drugs as well as new cell therapy options. Furthermore, it can be applied to similar studies for other liver metabolic disorders.

L’hépatite B est une maladie du foie qui pose un problème majeur de santé publique. Il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir complètement de l’infection, et de nouvelles thérapies ont besoin d’être développées. Étant donné son rôle clé dans le cycle de vie du virus de l’hépatite B (VHB), la protéine core qui forme la capside virale est aujourd’hui l’une des cibles avec le plus grand potentiel thérapeutique. Nos recherches sont focalisées sur la caractérisation des capsides du VHB dans différents états conformationnels en utilisant des techniques de biochimie et de RMN du solide, afin de révéler leur conformation précise sous différentes conditions, incluant l’interaction des capsides avec des antiviraux, et la relation entre la conformation de la capside et la maturation du virus. Un système d’expression bactérienne ainsi qu’un système acellulaire de synthèse de protéine à base de germes de blé ont été établis au laboratoire pour produire les capsides, et des protocoles pour désassembler puis réassembler les capsides en présence de différents types d’ARN ont été implémentés. Des échantillons de capsides formées dans E. coli et réassemblées in vitro ont été analysés par RMN. Les différentes formes de capsides observées incluent les protéines tronquées Cp140 et Cp149, la protéine entière Cp183, phosphorylée P-Cp183, et enfin des mutants. Dans un premier temps, nous avons préparé des échantillons pour l’attribution séquentielle de la protéine core par RMN du solide. L’utilisation de la détection carbone en RMN requiert plusieurs dizaines de milligrammes d’échantillon, qui ont pu être produits en utilisant l’expressions bactérienne en milieu minimum contenant des isotopes marqués. Les attributions séquentielles ont été réalisées sur la protéine tronquée Cp149, qui donne des spectres très similaires à Cp183. Cet échantillon a également été utilisé pour identifier les différences conformationnelles entre les 4 monomères de la capside, qui sont provoquées par la symétrie icosaédrale T=4. Ensuite, l’objet principal de cette thèse a été l’investigation et la comparaison d’une large variété de capsides, dans leur forme autoassemblée dans les bactéries E. coli, ainsi que dans leur forme réassemblée. Pour le réassemblage de la protéine entière, qui requiert la présence d’acides nucléiques, nous avons testé différents types d’ARN y compris l’ARN viral prégénomique. Nous avons étudié différentes symétries (T=3 et T=4), ainsi que les états d’oxydation de la capside, et comparé les différences de conformation grâce aux perturbations de déplacements chimiques observées dans les spectres RMN. Nous avons pu identifier les acides aminés impliqués dans les changements conformationnels majeurs entre les différentes préparations. La RMN du solide en détection proton à 100 kHz a récemment émergé comme un outils important pour l’analyse de protéines produites en quantités moindres. Nous avons appliqué cette stratégie à l’analyse des capsides de Cp149 afin d’obtenir l’attribution des protons amides. La détection proton par RMN du solide peut être combinée avec succès à la synthèse des protéines en système acellulaire, qui donne de faibles rendements par rapport aux cultures en bactéries. Cette approche est particulièrement intéressante pour analyser la modulation de l’assemblage des capsides induite par la présence de drogues. Bien que nous ayons commencé à étudier l’impact de modulateurs d’assemblage par RMN en détection carbone sur des capsides formées dans E. coli et réassemblées (données préliminaires non montrées dans ce manuscrit), la détection proton ouvre la voie vers l’analyse de l’impact de ces modulateurs sur l’assemblage des protéines core directement à la sortie du ribosome / Hepatitis B is a widely spread liver disease which causes a heavy burden for human health, with 257 millions of people affected by chronic infection and about 780,000 deaths per year. Yet, infected patients can not be completely cured by current treatments using notably nucleos(t)ide analogues and interferons. In order to achieve the goal of the World Health Assembly (WHA), who wishes to eliminate hepatitis B by 2030, new therapies need to be developed. Given its critical role for the Hepatitis B virus (HBV) life cycle, the core protein (Cp) is today one of the antiviral targets with the highest potential. Our research focuses on the characterization of HBV capsids in different conformational states using biochemistry and solid-state NMR, aiming at revealing their precise conformation under different conditions, including the interaction of capsids with antivirals, and the correlation between capsid conformation and viral maturation. For sample preparation, both a bacterial expression system and a wheat germ cell-free protein synthesis system have been established in the laboratory to produce HBV capsids, and protocols to disassemble and reassemble capsids with different nucleic acids have been implemented. Both capsids preformed in E. coli and capsids reassembled in vitro were addressed to NMR studies. Different capsids forms include the truncated versions Cp140 and Cp149, the full length protein Cp183, the phosphorylated P-Cp183 and mutant forms. First, we have prepared samples for the sequential assignment of the protein using solid-state NMR. The use of carbon-13 detection asks for several tens of milligrams of sample, which were produced using labeled isotopes and bacterial expression in minimal media. Sequential assignments were performed using the truncated capsid Cp149, which showed highly similar spectra to Cp183. This sample was also used to identify conformational differences between the four different monomers in the capsid, which are due to the T=4 icosahedral symmetry. Then, the main body of the thesis is the investigation and comparison of a variety of different capsid forms, including Cp183, P-Cp183, Cp149, Cp140, another truncated form resulting in mainly T=3 icosahedral assemblies, and Cp140 C61A and Cp183 F97L mutants. We investigated all samples in both the E. coli-produced and reassembled forms, which needs for the full-length protein the presence of nucleic acids, of which we tested several, including the viral pregenomic RNA. We investigated different symmetries, as well as oxidation states of the capsid, and compared the differences via chemical shift perturbations observed in NMR spectra. We reported in a site-specific manner the major conformational changes observed between the different preparations. Proton-detected solid-state NMR at 100 kHz has recently emerged as a tool for analyzing proteins with the need of less sample amount. We have applied this strategy to the analysis of the Cp149 capsids, in order to obtain sequential assignments of the amide proton resonances. For this, deuteration of the protein in bacteria was used as well, needing adaptation of sample preparation protocols. Proton detection can be successfully combined with cell-free protein synthesis, which gives low yields compared to bacterial expression. This approach is of potential interest to analyze capsid assembly modulation induced by the presence of drugs. While we have started in the framework of this thesis to analyze the capsid in presence of different capsid assembly modulators by carbon-13 detected NMR on E. coli and reassembled capsids (preliminary results not reported here), proton detection opens the way to an analysis of the impact of capsid modulation directly on the exit of the core proteins from the ribosome, on assembly. We showed that cell-free expression combined with proton-detection solid-state NMR can be used to analyze capsid chemical shifts, and thus in future work the conformational modulations

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Le virus de l'hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique dont les usagers de drogues (UD) constituent la principale source de contamination en France. Réaliser des enquêtes séro-épidémiologiques auprès de cette population pour suivre la dynamique du VHC s'avère difficile notamment en raison de leurs pratiques illicites. Cette population est en partie accessible par les lieux d'enquêtes et en partie "cachée" car ne fréquentant aucun lieu répertorié. Pour enquêter chaque partie, nous avons considéré l'échantillonnage lieux-moments (TLS) puis l'échantillonnage conduit par les répondants. Après avoir formalisé le TLS dans le cadre d'un sondage indirect, nous avons proposé un estimateur pour un total et une proportion, qui tient compte de la fréquentation multiple et hétérogène des lieux d'enquêtes. Nous recommandons cette méthode pour estimer la prévalence d'une maladie dans des études auprès de populations fréquentant des services, même en cas d'erreurs sur les fréquentations déclarées par les participants. L'enquête ANRS-Coquelicot réalisée en 2004 auprès des UD fréquentant des centres dédiés, puis répétée en 2011, a permis d'estimer la prévalence du VHC à 43,7%. A partir des deux enquêtes, nous avons ensuite estimé l'incidence du VHC par âge et en fonction du temps en construisant un modèle mathématique reposant sur la formulation d'une relation entre la prévalence et l'incidence. Ce modèle consistait en la combinaison d'un modèle compartimental et d'un modèle de régression. L'incidence du VHC a ainsi été estimée à 4,4/100 personnes-années en 2011. Cette approche est une alternative satisfaisante pour estimer l'incidence d'une maladie à partir d'enquêtes épidémiologiques transversales en l'absence de cohorte ou de tests biologiques permettant d'identifier les infections récentes. Compte tenu de la baisse de la prévalence, des mesures de réduction des risques et des avancées thérapeutiques, une diminution de l'incidence du VHC devrait se poursuivre malgré une potentielle augmentation des comportements à risque des UD. / Hepatitis C virus (HCV) is a public-health issue that drug users (DU) remain the major source of contamination in France. Conducting seroepidemiological surveys among this population to assess the HCV dynamic is difficult particularly due to their illicit practices. This population can be accessible through survey locations or can be hidden (who does not visit any location). To survey each part, we presented time-location sampling (TLS) and respondent-driven sampling. We presented TLS in the context of an indirect sampling and proposed a design-based inference taking into account the frequency of venue attendance (FVA) to estimate a total or a proportion. We recommend this method for estimating the prevalence of a disease in surveys among hard-to-reach populations, even if errors occur in the FVA reported by the participants. The ANRS-Coquelicot survey carried out in 2004 among DU attending centres providing services to drug users, then repeated in 2011, allowed us to estimate the HCV prevalence at 43.7%. Using these two surveys, we estimated age- and time-dependent HCV incidence from a mathematical model linking prevalence and incidence. This model consisted in combining a compartmental model with a regression model. The HCV incidence was thus estimated at 4.4/100 person-years in 2011. This method is an alternative approach to estimate incidence of a disease from cross-sectional epidemiological data in the absence of cohort or biological tests to identify acute infections. The decline in HCV incidence is to be expected given decreasing prevalence, recent developments in harm reduction measures and new therapeutic approaches despite a potential increase of at-risk behaviors.

L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) est un problème de santé publique majeur car en absence de vaccin et de thérapie suffisamment efficace, l’infection peut dégénérer en carcinome hépatocellulaire. Il est alors important d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer de nouveaux antiviraux. Ainsi, nous avons étudié l'activité anti-VHC de différents composés : l'arbidol (Arb), la silymarine (SM) et les molécules la composant, notamment la silibinine (SbN). Ces composés ont l'avantage d'être déjà utilisés en médecine humaine depuis de nombreuses années et ont ainsi prouvé leur innocuité. Ils présentent un large spectre antiviral et inhibent plusieurs étapes du cycle viral, dont la fusion membranaire. Cette étape du cycle est intéressante à cibler car le virus serait bloqué précocement, avant de provoquer des dommages cellulaires.Nous avons approfondi notre connaissance du mécanisme d'inhibition de la fusion par Arb en montrant par différentes stratégies qu'il s'associe avec les phospholipides à l'interface membranaire et interagit avec des résidus aromatiques. Cela suggère que Arb pourrait former durant le processus de fusion un complexe entre glycoprotéine virale et membrane, permettant d'inhiber les changements conformationnels de la glycoprotéine, nécessaires à la fusion. De même SM et ses composés inhibent la fusion de pseudoparticules de HCV, probablement en stabilisant les membranes impliquées dans le processus. Enfin, nous avons observé une activité antivirale et anti-inflammatoire très différente entre deux formulations de SbN. Tous ces résultats sont discutés dans le contexte actuel d'un arsenal thérapeutique anti-HCV qui reste limité. / Infection by the hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem since the infection can lead to hepatocellular carcinoma in the current absence of vaccine and effective treatment. It is therefore important to identify new therapeutic targets and to develop novel antiviral drugs. Here we studied the anti-HCV activity of two compounds : arbidol (Arb), the herbal extract silymarin (SM) and molecules therein, including silibinin (SbN). These compounds are already in use in human medicine for several years and have proven safety. They display a broad antiviral spectrum and inhibit several steps of the virus life cycle, including membrane fusion. This step is very interesting to target, since the virus could be blocked upstream the cellular damages it could induce. Using different biophysical strategies, we showed that Arb associates with phospholipids at the membrane interface and interacts with aromatic residues. This suggests that Arb could form during the fusion process a complex between viral glycoprotein(s) and membrane, leading to the inhibition of the conformational changes within the glycoprotein that are required during the fusion process. SM and its components inhibit fusion of HCV pseudoparticles, probably by stabilizing the membranes involved in this process. Finally, we observed different antiviral and anti-inflammatory activities between two different formulations of SbN. Knowledge of these antiviral mechanisms should lead to innovative therapeutic strategies against HCV.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui contrôlent l’expression génique, en s’hybridant, le plus souvent, de manière imparfaite à des séquences spécifiques qui se trouvent généralement dans la région non traduite en 3' (3’UTR) de transcrits cibles. Les miARN guident sur l’ARN messager (ARNm) un complexe protéique appelé RNA-induced Silencing Complex (RISC), composé des protéines Argonaute et TNRC6, qui perturbe l’initiation de la traduction et provoque la déadénylation et la dégradation du transcrit. C'est l’interaction entre le RISC et le complexe de pré-initiation de la traduction 43S (composé de la petite sous-unité ribosomique 40S et des facteurs d’initiation associés) qui entraîne la répression traductionnelle de l’ARNm ciblé. Des résultats récents ont démontré que le RISC perturbe le balayage de la région non traduite en 5’ (5’UTR) par le ribosome, étape qui requiert la présence de 2 facteurs d’initiation qui sont eIF4F qui reconnaît et lie la coiffe ainsi que la protéine PABP, fixée le long de la queue poly(A). Toutefois, les miARN peuvent également induire la stimulation de la traduction des transcrits cibles dans les cellules quiescentes, dans un lysat d’embryons de drosophiles ou encore dans les ovocytes de Xénope. Le mécanisme moléculaire de stimulation de l’expression par les miARN est encore mal connu mais requiert l’absence de queue poly(A) en 3’ des ARN cible et de TNRC6 au sein du complexe RISC. Le Virus de l’Hépatite C (VHC) possède en 5’ de son ARNg un site d’entrée interne du ribosome (IRES) qui recrute la petite sous-unité ribosomique 40S, sans nécessiter la reconnaissance de la coiffe par eIF4F, ni la protéine PABP, ni le balayage de la 5’UTR par le ribosome. Ces caractéristiques singulières nous ont conduits à rechercher l'impact du complexe RISC fixé en 3’ de l’ARNm sur l’initiation de la traduction du VHC. Pour cela, nous avons utilisé des transcrits contenant l'IRES du VHC en 5' et des sites d’hybridation du miARN let-7 en 3’. Ces ARNm ont ensuite été transfectés dans des lignées cellulaires hépatocytaires, ou non. A notre grande surprise, nous avons observé que la fixation du miARN let-7 sur la région 3' du transcrit stimulait fortement l’expression dirigée par l’IRES de VHC. Toutefois, l’augmentation de l’expression n’est pas due à la stabilisation du transcrit mais bien à une hausse significative de la synthèse protéique indépendamment d’un quelconque effet de miR-122. En utilisant d’autres IRES dites 'HCV-like', nous avons pu confirmer ces résultats et démontrer que, l’ajout d’une queue poly(A) en 3’ du transcrit, capable de fixer la PABP, annule cet effet stimulateur suggérant que l’absence de cette protéine est nécessaire pour que le complexe RISC stimule la traduction du VHC. / MicroRNAs (miRNAs) are small non coding RNAs which control gene expression by recognizing and hybridizing to a specific sequence generally located in the 3’UTR of targeted messenger RNA (mRNA). miRNAs serve as a guide for the RNA-Induced Silencing Complex (RISC) that is composed by, at least, the Argonaute proteins and TNRC6. Recent studies have suggested that translation inhibition occurs first and is then followed by deadenylation and degradation of the targeted transcript. The miRNA-induced inhibition of protein synthesis occurs at the level of translation initiation during the ribosomal scanning step and it requires the presence of both the initiation factor eIF4G and the poly(A) Binding Protein (PABP). In this process, the RISC interacts with both PABP and 43S pre-initiation complex (composed by initiation factors and ribosome) and it results in the disruption of linear scanning of the ribosome along the 5’ Untranslated Region (5’UTR). In some specific cases, the binding of miRNAs to their target sequences can upregulate translation initiation. This has notably been demonstrated in G0 quiescent cells, drosophila embryos and Xenopus oocytes. Although the molecular mechanism by which upregulation occurs remains to be precisely determined, it appears that the absence of a poly(A) tail and the lack of availability of the TNRC6 proteins are amongst the major determinants. In the particular case of the Hepatitis C Virus (HCV), the genomic RNA is uncapped and non polyadenylated and harbors an Internal Ribosome Entry Site (IRES) which directly binds to the ribosome with no need for cap-recognition, PABP binding and ribosome scanning. These peculiar features of the HCV IRES prompted us to investigate how viral translation can be regulated by the miRNA machinery. In order to do that, we have used a mRNA that contains the HCV IRES in 5’ and 4 let-7 binding sites in its 3’ extremity. To most of our surprise, we have observed a strong stimulation of the expression of the HCV IRES when the construct is bearing the let-7 sites. This effect is not due to any interference with the miR-122 binding sites although the magnitude of stimulation reached the same level. Our data show that it is the presence of the RISC on the 3' end of the transcript that can stimulate internal ribosome entry at the 5' end. By using other HCV-like IRESes, we could confirm these data and further showed that the absence of a poly(A) tail was an absolute requirement for the stimulation to occur. These effects are not due to an increase of mRNA stability and are rather exerted at the level of translation.