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Detecção de antígenos circulantes como abordagem diagnóstica em leishmaniose visceral. / Detection of circulating antigens as a diagnostic approach in visceral leishmaniasis.Carvalho, Camila Aparecida de 25 August 2017 (has links)
A leishmaniose visceral é uma doença parasitária caracterizada por altos níveis de anticorpos IgG, importantes para o diagnóstico da infecção, mas sem discriminar doença ativa. Sem papel efetivo durante a resposta imune, estes anticorpos participam na formação de imunocomplexos circulantes, indicando a presença de antígenos circulantes. Apesar da alta especificidade diagnóstica, a detecção de antígenos em soro é pouco explorada na leishmaniose visceral. A detecção de antígenos e imunocomplexos dependem tanto da especificidade de anticorpos como das características dos antígenos, que podem ser desde grandes proteínas ou pequenos polissacarídeos. Neste estudo, avaliamos a detecção de antígenos circulantes livres ou em imunocomplexos, e as características e especificidade antigênica de anticorpos IgG a proteínas ou carboidratos de L. (L) infantum chagasi em leishmaniose visceral experimental. Amostras de hamster com infecção experimental por L. (L.) infantum chagasi foram avaliadas aos 15, 30, 45, 60 e 90 dias de infecção. Altas concentrações de anticorpos IgG específicos foram detectadas em amostras com leishmaniose visceral experimental e natural, sempre com alta avidez, mesmo em períodos iniciais da infecção. A purificação por imunoafinidade de IgG de baixa avidez também confirmou esta alta concentração. Proteínas e carboidratos foram isolados do extrato antigênico total de promastigotas por cromatografia de exclusão molecular ou precipitação com etanol e marcadas com biotina para aminas ou açucares. Para uso em ELISA, carboidratos foram conjugados a BSA, o que permitiu a detecção de altos níveis de anticorpos IgG específicos para carboidratos. A presença de carboidratos antigênicos também foi demonstrada através da detecção de incremento de IgG em amostras com infecção experimental, o que confirmou a presença de imunocomplexos circulantes específicos a carboidratos. Nossos dados sugerem, que a participação da resposta imune humoral na leishmaniose visceral deve ter o envolvimento de carboidratos do parasita. O desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas para a detecção de carboidratos antigênicos pode permitir a identificação de imunocomplexos e antígenos circulantes na leishmaniose visceral. / Visceral leishmaniasis is a parasitic disease characterized by high levels of IgG antibodies, important for the diagnosis of the infection, but without discriminating active disease. Without effective role during the immune response, these antibodies participate in the formation of circulating immune complexes, indicating the presence of circulating antigens. Despite the high diagnostic specificity, the detection of antigens in serum is poorly explored in visceral leishmaniasis. The detection of antigens and immunocomplexes depend on both the specificity of antibodies and the characteristics of the antigens, which may be from large proteins or small polysaccharides. In this study, we evaluated the detection of free circulating antigens or immunocomplexes, the characteristics and antigenic specificity of IgG antibodies to proteins or carbohydrates of L. (l) infantum in experimental visceral leishmaniasis. Hamster samples with experimental infection by L. (L.) infantum chagasi was evaluated at 15, 30, 45, 60 and 90 days of infection. High concentrations of specific IgG antibodies were detected in samples with experimental and natural visceral leishmaniasis, always with high avidity, even in initial periods of infection. Immunoaffinity purification of low avidity IgG also confirmed this high concentration. Proteins and carbohydrates were isolated from the total antigenic extract of promastigotes by molecular exclusion chromatography or ethanol precipitation and labeled with biotin for amines or sugars. For use in ELISA, carbohydrates were conjugated to BSA, which allowed the detection of high levels of carbohydrate-specific IgG antibodies. The presence of antigenic carbohydrates was also demonstrated by the detection of IgG increase in samples with experimental infection, which confirmed the presence of circulating immunocomplexes specific to carbohydrates. Our data suggest that the involvement of the humoral immune response in visceral leishmaniasis should have the involvement of carbohydrates of the parasite. The development of new diagnostic tools for the detection of antigenic carbohydrates may allow the identification of immunocomplexes and circulating antigens in visceral leishmaniasis.
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Isolamento, caracterização e atividade anti-leishmania chagasi e anti-trypanosoma cruzi de compostos bioativos de venenos de anfíbios brasileiros / Isolation, characterization, antileishmanial and antitrypanosomal activity of bioactive compounds from brazilian amphibian poisonsPinto, Erika Gracielle 29 February 2012 (has links)
Dentre as doenças parasitárias tropicais, as causadas por protozoários se apresentam como um grande desafio para a saúde pública, sendo representadas pela leishmaniose e doença de Chagas. Afetam grandes populações marginais ao processo econômico globalizado, e desta forma, não são vistas como mercados potenciais. O presente projeto visou o isolamento de novos compostos naturais de venenos animais com atividade anti-Leishmania e anti-T. cruzi. O presente estudo fracionou por diferentes técnicas cromatográficas, os venenos dos anfíbios Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi e Phyllomedusa hypochondrialis, visando o isolamento de peptídeos e metabólitos secundários através de ensaios biomonitorados. Utilizando-se a espectrometria de massas e seqüenciamento por degradação química de Edman, foi possível a caracterização bioquímica de cinco peptídeos ativos da secreção de Phyllomedusa hypochondrialis, sendo estes a bradicinina, as dermaseptinas 1 e 4 e as filoseptinas 7 e 8. Os peptídeos apresentaram uma Concentração Efetiva 50% (CE50) variando entre 0,7 a 20 ?g/mL em L. (L.) infantum chagasi e T. cruzi, com baixa ou nenhuma citotoxicidade para células de mamíferos nas concentrações testadas. Além disso, a separação química da secreção do anfíbio Siphonops annulatus forneceu uma fração altamente ativa em promastigotas de L. (L.) infantum chagasi, com CE50 0,065 ?g/mL, porém com toxicidade bastante elevada para macrófagos peritoneais e nenhuma seletividade nas formas intracelulares. Estudos ultraestruturais de Leishmania demonstraram severos danos mitocondriais, além da formação de grande vacúolos citoplasmáticos, levando o parasita a morte em poucas horas. O presente estudo demonstrou o potencial de peptídeos e metabólitos secundários de venenos de anfíbios, que se adequadamente estudados, poderão contribuir como novos protótipos de fármacos para a doenças negligenciadas. / Among the tropical parasitic diseases, those caused by protozoa present a major challenge to public health, being represented by leishmaniasis and Chagas disease. Affect large populations marginal to the global economic process, and thus are not seen as potential markets. This project aimed the isolation of new natural compounds in animal venoms with anti-Leishmania activity and anti-T. cruzi. The present study fractionated by different chromatographic techniques, the poisons of the amphibians Siphonops annulatus, Corythomantis greeningi, Aparasphenodon brunoi and Phyllomedusa hypochondrialis, aiming the isolation of peptides and secondary metabolites through bioguided assays. By using mass spectrometry and sequencing by Edman degradation, it was possible to do the biochemical characterization of five active peptides from the poison of Phyllomedusa hypochondrialis, as bradykinin, dermaseptins 1 and 4 and phylloseptins 7 and 8. The peptides showed a 50% Effective Concentration (EC50) ranging from 0.7 to 20 ?g/mL in L. (L.) infantum chagasi and T. cruzi, with little or no cytotoxicity to mammalian cells at the tested concentrations. In addition, the chemical separation of the poison of the amphibian Siphonops annulatus provided a highly active fraction against promastigotes of L. (L.) infantum chagasi, with an EC50 of 0.065 ?g/mL, but highly toxicity to peritoneal macrophages and without selectivity against the intracellular forms of Leishmania. Ultrastructural studies of Leishmania showed severe mitochondrial damages and the formation of large cytoplasmic vacuoles, leading to parasite death within few hours. The present study demonstrated the potential of peptides and secondary metabolites of amphibian poisons, and if adequately studied, may contribute as prototypes of new drugs for neglected diseases.
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Identificação de polimorfismos genéticos com impacto no desenvolvimento e progressão da leishmaniose visceral em indivíduos de áreas endêmicas do Maranhão e Piauí / Identificação de polimorfismos genéticos com impacto no desenvolvimento e progressão da leishmaniose visceral em indivíduos de áreas endêmicas do Maranhão e PiauíFrade, Amanda Farage 12 July 2010 (has links)
A leishmaniose visceral constitui grave doença infecciosa causada por um protozoário parasita intracelular obrigatório. Alguns fatores podem alterar a gravidade das manifestações clínicas, sendo um deles a predisposição genética. Este estudo investigou polimorfismos dos genes TGFB1, IL8 e IL6, que são citocinas relacionadas com o desencadeamento e a gravidade da doença, visando identificar fatores de susceptibilidade. Os polimorfismos TGFB1 -509 C/T e TGFB1 +869 T/C, IL8 -251A/T e IL6 -174G/C foram analisados por PCR-RFLP, em 198 pacientes com leishmaniose visceral (LV), 98 indivíduos com infecção assintomática (teste de hipersensibilidade tardia - DTH+) e 100 indivíduos sem evidências de infecção (DTH-). O alelo T na posição -509 do gene TGFB1 conferiu risco duas vezes maior de desenvolver LV ou ser positivo para o teste DTH (p = 0,007, OR = 1,9 [1,19-3,02]), em comparação com indivíduos DTH-. Os resultados sugerem uma associação do polimorfismo TGFB1 -509C/T com a susceptibilidade à LV, podendo contribuir para o desencadeamento da doença clínica. / Visceral leishmaniasis is a serious protozoan infectious disease caused by an obligate intracellular parasite. Some factors can affect the severity of the clinical manifestations; one of which is genetic susceptibility. This study investigated polymorphisms in the TGFB1, IL8 and IL6 genes, which are cytokines related with the onset and severity of the disease, to look for genetic susceptibility factors. Polymorphisms at TGFB1 -509C/T and +869T/C, and IL8 - 251A/T and IL6 -174G/C were analyzed by a PCR-RFLP technique, in 198 patients with Visceral Leishmaniasis (VL), 98 individuals with asymptomatic infection (positive delayed-type hypersensitivity, DTH+) and 100 individuals with no evidence of infection (DTH-). The T allele of the TGFB1 polymorphism in position -509C/T conferred a two risk fold to develop LV or to be DTH+ (p=0.007; OR=1.9 [1.19 - 3.02]) when compared with DTH- individuals. We suggest the TGFB1 -509C/T polymorphism is associated with susceptibility to LV and may contribute to development of the clinical disease.
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Identificação por PCR de infecção natural de flebotomíneos por Leishmania (Leishmania) infantum em uma micro-área do município de Dracena, São Paulo / PCR evaluation for identification of natural infection in sandflies by Leishmania (Leishmania) infantum in a micro area of Dracena city, São PauloBrighente, Kate Bastos dos Santos 18 April 2017 (has links)
A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.
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Avaliação da imunidade celular na pele de cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e sua correlação com transmissibilidade ao vetor / Evaluation of cellular immunity in the skin of naturally infected dogs with Leishmania (Leishmania) infantum chagasi and its relationship with the vector transmissibilityRossi, Claudio Nazaretian 02 August 2013 (has links)
Foram selecionados aleatoriamente 38 cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi oriundos de Araçatuba, São Paulo, área endêmica para leishmaniose visceral, e os quais foram distribuídos em dois grupos: o primeiro com 24 cães sintomáticos e, o outro, composto por 14 animais assintomáticos. Correlacionou-se a caracterização clínica (assintomáticos ou sintomáticos) com os: potencial em infectar o inseto vetor, padrão inflamatório da pele, perfil de imunidade celular e parasitismo tegumentar desses cães. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 no tegumento, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,1584), sendo que a densidade de parasitos na pele mostrou uma correlação positiva moderada com os títulos de anticorpos anti-Leishmania (p = 0,042). Quanto à infectividade ao vetor, evidenciada pelo xenodiagnóstico, 16 (66,7%) cães sintomáticos e 13 (93%) assintomáticos foram capazes em transmitir Leishmania aos flebotomíneos, dentre estes, respectivamente, seis (37,5%) e oito (61,5%) animais não apresentavam parasitismo cutâneo, embora todos, de ambos os grupos, tenham sido positivos quando da pesquisa de parasitos no linfonodo poplíteo. Observou-se um maior percentual de transmissibilidade para o vetor a partir de cães assintomáticos (p = 0,0494). As alterações histológicas cutâneas foram similares em ambos os grupos e se caracterizaram, de modo geral, por um infiltrado inflamatório, ora focal ora difuso, na derme, constituído, principalmente, por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), variando de discreto a intenso. Quanto à caracterização da resposta imune celular no tegumento dos animais, somente a densidade (células/mm2) de células iNOS+ foi significantemente maior na derme dos cães sintomáticos quando comparado aos assintomáticos (p = 0,0368). Observou-se correlação positiva moderada entre a densidade de parasitos na pele e a densidade de macrófagos (p = 0,031), de células T CD4+ (p = 0,015) e CD8+ (p = 0,023), e, também, naquela de células iNOS+ relativamente a de células T CD3+ (p = 0,005), CD4+ (p = 0,001) e CD8+ (p = 0,0001). Verificou-se, ainda, correlação negativa moderada com o número de manifestações clínicas e/ou gravidade da enfermidade (p = 0,028), confirmando, assim, maior transmissibilidade de parasitos ao vetor, a partir de animais assintomáticos, demonstrando-se, dessa forma, que tais cães são fontes de infecção em potencial para insetos vetores em áreas endêmicas para leishmaniose visceral canina. / Thirty-eight dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were randomly selected from Araçatuba of São Paulo state (Brazil), an endemic area for visceral leishmaniasis. The subjects were distributed into two groups: the first comprising 24 symptomatic dogs and the second consisting of 14 asymptomatic dogs. Possible correlations of clinical characterization (in both symptomatic and asymptomatic subjects) with potential to infect the insect vector, skin inflammatory pattern, cutaneous cellular immunity profile and cutaneous parasitism were investigated. Regarding to the number of cutaneous leishmania amastigotes/mm2, there was not a significant difference between the groups (p = 0.1584); density of skin parasites showed a moderate positive correlation with anti-Leishmania antibody titers (p = 0.042). Concerning to the infectivity to the insect vector, as evidenced by xenodiagnosis, 16 (66.7%) symptomatic and 13 (93%) asymptomatic dogs were able to transmit Leishmania to phlebotomines. Among these, six (37.5%) and eight (61.5%) dogs, respectivelly, did not show cutaneous parasitism, although all participant dogs were found positive when searching for parasites in the popliteal lymph nodes. Asymptomatic dogs showed higher transmissibility to the vector than symptomatic ones (p = 0.0494). Histological features in the skin were similar in both groups and were generally characterized by an inflammatory infiltrate, either diffuse or focal, in the dermis, mainly consisted of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes and plasma cells), varying from mild to intense. Concerning characterization of the cutaneous cellular immune response, only iNOS+ cells density (cells/mm2) was significantly higher in the dermis of the symptomatic dogs compared to the asymptomatic ones (p = 0.0368). Moderate positive correlation between the cutaneous parasites density and the macrophages density (p = 0.031), the CD4+ T cells (p = 0.015) and CD8+ T cells (p = 0.023) were observed. Furthermore, density of iNOS+ cells in relation to CD3+ T cells (p = 0.005), CD4+ T cells (p = 0.001) and CD8+ T cells (p = 0.0001) were found positively correlated at a moderate level. It was also found a moderate negative correlation between cutaneous parasites density and the number of clinical signs and/or disease severity (p = 0.028), confirming grater parasites transmission to the vector from asymptomatic animals. It was therefore demonstrated that these dogs are potential sources of infection to insect vectors in endemic areas for canine visceral leishmaniasis.
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Fatores de risco de Leishmaniose Visceral em cães no município de Panorama, Estado de São Paulo, SP, Brasil / Risks factors of Visceral Leishmaniasis in dogs in Panorama, São Paulo, State, BrazilVillegas, Tatiana Jimenez 20 February 2015 (has links)
A Leishmaniose Visceral Canina é uma doença na qual o ciclo de transmissão envolve a interação de vetores, parasitas, reservatórios e hospedeiros além de componentes ambientais, sociais, e biológicos, que tornam complexa a compreensão da dinâmica desta doença nas regiões endêmicas. Este estudo epidemiológico transversal de tipo caso controle objetivou a identificação de fatores sociodemográficos, socioeconômicos, ambientais, da dinâmica populacional canina e do estilo de vida dos cães, associados à ocorrência de Leishmaniose Visceral Canina no município de Panorama, estado de São Paulo, Brasil. Para a identificação destes fatores foi realizada um inquérito epidemiológico nos domicílios com cães positivos e negativos a Leishmaniose Visceral diagnosticados por sorologia no anos 2012 e 2013. Mediante um modelo de regressão logística foram considerados como fatores de risco para a ocorrência de Leishmaniose Visceral Canina: cães não castrados, cães que dormem fora de casa, famílias com renda inferior a três salários mínimos, presença de vegetação próximo do domicilio, não ter vidro na janela, ter vasos com plantas, ter arvores no quintal e aquisição de um cão no último ano. O desenvolvimento deste trabalho auxilia no programa de prevenção e controle da Leishmaniose Visceral Canina do Município de Panorama, mediante a identificação dos principais fatores de risco determinantes para a manutenção da doença. Este estudo demonstrou a presença de fatores de risco sujeitos a modificações por parte da população e das autoridades sanitárias que poderiam contribuir para a redução do risco de transmissão da doença em Panorama, sendo elas: a ordenação do ambiente no peri-domicílio pela redução de matéria orgânica e entulho que poderiam servir como local para reprodução e abrigo da população vetora, a modificação da relação com os cães de modo a aumentar a supervisão e a promoção do uso de medidas de proteção individual (coleira, repelentes, vacina) para a proteção da população canina nesta localidade. / Canine Visceral Leishmaniasis is a disease in which the transmission cycle involves the interaction of vectors, parasites, as well as reservoir hosts and environmental, social, and biological factors, making it very complex to understand the dynamic of this disease in endemic regions. This cross-sectional case-control epidemiological study aimed to identify risk factors for the occurrence of Canine Visceral Leishmaniasis in the city of Panorama, São Paulo, Brazil. An epidemiological survey was done to identify sociodemographic, socioeconomics, environmental, canine population dynamics and dogs life style factors, in households with positive and negative dogs diagnosed by serology in the years 2012 and 2013 in the city of Panorama. A logistic regression model was developed to take into account risk factors for the occurrence of Canine Visceral Leishmaniasis: intact dogs, dogs sleeping away from home, families with lower income, vegetation near the households, windows with no glass panels, potted plants, the presence of trees in the yard and the acquisition of a dog in the last year. The development of this work helps in the prevention and control program of Canine Visceral Leishmaniasis in the city of Panorama by the management of the determinant risk factors that maintain the disease. This study demonstrated the presence of some risk factors that are subject to modifications by the population and the health authorities and that could produce a reduction in the risk of disease transmission in Panorama: environmental ordination in areas around the houses with reduction of organic matter and rubbish that could serve as a place for the reproduction and shelter of the vector population, and the modification of the relationship with dogs promoting the use of individual protective measures (collar, repellents, vaccine etc.) to contribute to the protection of the dog population in this locality.
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Estudo do potencial terapêutico de fármacos e compostos sintéticos, livres ou incluídos em nanolipossomos: uma abordagem in vitro e experimental na leishmaniose visceral / Studies towards the therapeutic potential of drugs and synthetic compounds free or loaded into liposomes: an in vitro and experimental approach against visceral leishmaniasisPinto, Erika Gracielle 24 February 2016 (has links)
Incluída dentre as doenças tropicais negligenciadas (DTNs), a leishmaniose se apresenta como um complexo de doenças de variados graus de gravidade, ocasionando desde uma lesão cutânea a uma progressiva infecção visceral fatal. O desenvolvimento de novas terapias é imprescindível, devido ao limitado e complexo arsenal terapêutico. Sendo assim, o presente projeto realizou o estudo in vitro e experimental em modelo de hamster infectado com L. (Leishmania) infantum de novas terapias para a leishmaniose visceral, utilizando três abordagens: i) reposicionamento de fármacos em uso na clínica para o tratamento de outras patologias; ii) sistemas de liberação controlada e sustentada de fármacos como os lipossomos e iii) avaliação de análogos sintéticos de naftoquinonas, bem como, análogos sintéticos de quelantes de ferro. O fármaco nitazoxanida (NTZ) foi amplamente estudado, apresentando atividade anti-Leishmania contra amastigotas intracelulares e um índice de seletividade (IS) de 2,5. Quando avaliado em modelo experimental, foi incapaz de reduzir a densidade parasitária no baço e fígado na forma livre, porém a encapsulação em lipossomos (NTZ-LP) conferiu maior direcionamento, resultando em uma eficácia de 50 e 82% no baço e fígado, respectivamente. A captação, in vitro, da NTZ-LP também foi avaliada em macrófagos sadios e infectados demonstrando uma ampla distribuição no citoplasma de ambos os grupos. Os parâmetros físico-químicos avaliados da NTZLP demonstraram uma formulação unilamelar, negativa com diâmetro inferior a 200nm. Estudos farmacocinéticos em modelo murino da NTZ e NTZ-LP demonstraram uma meia vida plasmática (T1/2) similar para ambas às formulações (6,5 minutos para NTZ e 8,7 minutos para NTZ-LP), porém tanto a exposição (AUC) e concentração plasmática máxima (Cmax) resultaram em valores quatro vezes maiores para os lipossomos, justificando a eficácia da formulação no estudo préclínico. Foi realizada ainda a triagem de 10 fármacos antihistamímicos, porém somente a cinarizina apresentou atividade no amastigota intracelular. O estudo experimental demonstrou que o fármaco foi incapaz de reduzir a densidade parasitária tanto no baço como no fígado dos animais, porém quando encapsulado em lipossomos foi observada uma eficácia de 54% apenas no fígado. Outros dois fármacos estudados apresentaram atividade anti-Leishmania, a amiodarona (antiarrítmico) e a sertralina (anti-depressivo). Apesar de a amiodarona ter apresentado potente atividade contra os amastigotas, com Concentração Efetiva 50% (CE50) de 0,5 ?M e um elevado IS de 56, não demonstrou atividade tanto no baço como no fígado no modelo experimental. Sertralina foi o fármaco mais promissor do trabalho, apresentando uma CE50 de 1,8 ?M e IS de 10, alcançando níveis de tratamento de 58% no baço e 87% no fígado dos animais. Novos compostos sintéticos também foram estudados. Dentre os 36 compostos análogos sintéticos de naftoquinonas, 14 demonstraram atividade contra as formas amastigotas intracelulares, destacando cinco compostos com IS >5. Ainda, os compostos sintéticos, quelantes de ferro, não foram capazes de eliminar o amastigota intracelular. O projeto teve como objetivo primordial a obtenção de um novo candidato a fármaco, livre ou encapsulado em lipossomos, que pudesse contribuir com novas perspectivas para estudos de novas terapias para a leishmaniose visceral. / Included among the neglected tropical diseases (NTDs), leishmaniasis present itself as a complex of varying degrees of serious diseases, resulting from a skin lesion to a progressive fatal visceral infection. The development of new therapies is essential, due to the limited and complex therapeutic arsenal. Thus, this project conducted the in vitro and in vivo studies using infected hamsters with L. (L.) infantum for new therapies against visceral leishmaniasis, using the three following approaches: i) drug repurposing; ii) controlled and sustained systems for drug delivery, such as liposomes, and iii) synthetic analogs of naphthoquinones, as well as, analogs of synthetic iron chelators. The nitazoxanide drug (NTZ) has been studied extensively, showing anti-Leishmania activity against intracellular amastigotes and selectivity index (SI) of 2.5. When it was evaluated in an experimental model, was unable to reduce the parasite burden in the spleen and liver in free form. However, when was encapsulated in liposomes (NTZ-LP), it has conferred higher direction, resulting in an efficiency of 50 to 82% in the spleen and liver, respectively. The in vitro uptake of NTZ-LP was evaluated in healthy and infected macrophages demonstrating a broad distribution in the cytoplasm of both groups. The NTZ-LP physical-chemical parameters were evaluated and showed a unilamellar formulation, negative and with diameter lower than 200nm. Pharmacokinetics studies in the murine model with NTZ and NTZ-LP showed a half-life (T1/2) similar for both formulations (6.5 minutes to NTZ and 8.7 minutes to NTZ-LP). However, the exposure (AUC) and maximum plasma concentration (Cmax), resulted, for the liposomes values, four times higher, which justify the efficacy of liposomal formulation in preclinical study. Additionally, 10 antihistamines drugs were evaluated, but only cinnarizine showed activity in the intracellular amastigotes. The experimental study showed that the drug was unable to reduce the parasite burden in both, spleen and liver infected animals. Nevertheless, when it was encapsulated in liposomes, a 54% efficacy, only, in the liver was observed. Other two drugs were studied relating Leishmania activity: amiodarone (antiarrhythmic) and sertraline (antidepressant). Although amiodarone have shown potent activity against amastigotes with Effective Concentration 50% (EC50) of 0.5 ?M and a high SI of 56, no activity was seen in spleen and liver in the experimental model. On the other hand, sertraline was the most promising drug, showing an IC50 of 1.8 ?M and SI of 10, increasing the treatment levels of 58% in the spleen and 87% in the liver of the animals. Novel synthetic compounds were also studied. Among 36 synthetic analogues of naphthoquinones, 14 demonstrated activity against intracellular amastigotes, highlighting five compounds with SI>5. Moreover, synthetic analogues of iron chelators were not able to eliminate intracellular amastigotes. The project had as its primary objective the attainment of a new drug candidate, free or encapsulated into liposomes, and it could contribute with new perspectives for studies towards novel therapies against visceral leishmaniasis.
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Leishmaniose visceral canina: aspectos clínico-epidemiológicos de casos atendidos no período de 1997 a 2007, no Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo / Canine visceral leishmaniasis: clinical and epidemiologic aspects of cases attended between 1997 to 2007, at the Animal Hospital of the Faculty of Medicine and Zootechny of the University of São PauloSonoda, Marcia Cristina 29 November 2007 (has links)
A leishmaniose é uma enfermidade zoonótica causada por protozoário pleomórfico do gênero Leishmania. Face a magnitude de alastramentro da doença, em especial no Brasil, foi realizado levantamento retrospectivo de casos de leishmaniose visceral canina diagnosticados (1997-2007) nos Serviços de Dermatologia e de Clínica Médica de cães e gatos do HOVET/USP. A amostragem compôs-se de 36 casos caninos, naturalmente infectados por Leishmania sp. O diagnóstico fora estabelecido pela caracterização propiciada pelos dados anamnésticos, de exames físico e dermatológico, complementados por exames hematológicos, bioquímicos e imagéticos, afora sorologia (ELISA e/ou RIFI), histopatologia de pele e/ou pela evidencialização do protozoário em exames parasitológicos de biópsia aspirativa de linfonodos e/ou medula óssea e pela técnica de imunoistoquímica. Os objetivos foram: evidenciar os aspectos clínico-dermatológicos de animais com diagnóstico estabelecido; caracterizar epidemiologicamente os casos, enfocando aspectos de aloctonia ou de autoctonia. Afora o de avaliar a aplicação da técnica de imunoistoquímica de pele visando o diagnóstico etiológico, comparando e relacionando-a aos exames complementares. Pôde-se concluir que: todos os casos foram alóctones; não houve predisposição por um determinado sexo; a faixa etária (52,8%) foi aquela dos 13 a 48 meses de vida, com maior acometimento de cães de raças definidas (Poodles e Labradores). Quanto aos municípios de origem: Ilha Bela e Ubatuba, um caso de cada, são considerados como silencioso não receptivo não vulnerável; Campinas, Campo Limpo Paulista, Holambra, São Roque, Sorocaba e Uberaba (um caso de cada) como silenciosos não receptivos vulneráveis. Os demais 28 cães do Estado de São Paulo originaram-se de municípios com transmissão: canina e humana (Araçatuba - três, Bauru - um), canina (Cotia - cinco, Embu - quatro) ou sob investigação (São Paulo - 11, Mogi das Cruzes - um). Já Portugal (um) e Minas Gerais (Belo Horizonte - dois) são locais caracterizados como de transmissão canina e humana. Pôde-se evidenciar deslocamentos breves ou longos, a 14 municípios paulistas (Araçatuba, Birigui, Caraguatatuba, Cotia, Eldorado, Embu e Embu Guaçu, Guarujá, Ilha Bela, Itapecerica da Serra, Peruíbe, Presidente Prudente, São Roque e São Paulo Capital) e cinco Estados (Maranhão, Minas Gerais, Paraná, Rio de Janeiro e Santa Catarina). De acordo com a classificação sintomatológica 50% eram oligossintomáticos, 47,2% sintomáticos e 2,8% assintomáticos. As alterações cutâneas se localizavam principalmente em região cefálica, membros e região abdominal, incluíam-se: rarefação pilosa e/ou alopecia (45,7%), escamas (40%), ulcerações (37,1%) e crostas (37,1%), sendo o prurido associado em 63,9% dos casos. Os achados clínicos mais freqüentes foram: linfoadenomegalia (74%), pirexia (44,4%), disorexia (40,7%), emagrecimento (29,7%), hepato (29,7%) e esplenomegalia (25,6%). As alterações laboratoriais foram: hiperproteinemia (56,5%), hipoalbuminemia (52,1%), anemia e trombocitopenia (34,8% cada). Correlacionando a técnica de imunoistoquímica com os exames de ELISA e RIFI, observou-se que a RIFI (100%) foi mais representativa dos casos positivos, em seguida ao exame de ELISA (87,5%) e ao de imunoistoquímica (37,5%). A técnica de imunoistoquímica, empregada em cortes histológicos de 12 (33%) permitiu evidenciar a presença do agente em sete (58,3%): dois (33,3%) oligossintomáticos e cinco (83,3%) sintomáticos. Desta forma, permite-se caracterizá-la como metodologia de inegável valia, superando os resultados positivos da histopatologia (30,8%). / Leishmaniasis is a worldwide chronic zoonotic disease caused by pleimorphic protozoa of the genus Leishmania. The spread of the disease in Brazil lead to this retrospective survey of canine visceral leishmaniasis diagnosed (1997-2007) at the Service of Dermatology and Medical Clinics of the Small Animal Hospital-USP. We evaluated the records of 36 dogs naturally infected with Leishmania sp. Diagnosis included disease characterization during anamnesis, physical and dermatologic examination, hematology, biochemistry, imaging, serology (ELISA or RIFI), skin histopathology and/or agent isolation from aspiration biopsy samples of lymph nodes and/or bone marrow, and immunohistochemistry. In addition to epidemiologic characterization, we aimed to determine clinical and dermatologic aspects of canine leishmaniasis, and to compare diagnostic efficacy of skin immunohistochemistry, ELISA and RIFI. All cases were allochtonous without gender predilection, 52.8% were 13 to 48 months old; mostly Poodles (20.8%) and Labradors (20.8%). Regarding origin: Ilha Bela and Ubatuba (one case each) are classified as silent, non-receptive and not vulnerable; Campinas, Campo Limpo Paulista, Holambra, São Roque, Sorocaba and Uberaba (one case each) are classified as vulnerable. The remaining 28 cases from the State of São Paulo were located in cities with reported canine-human transmission (Araçatuba - three, Bauru - one), intra-canine transmission (Cotia - five, Embu - four) or cities under investigation (São Paulo - 11, Mogi das Cruzes - one). Portugal (one) and Minas Gerais (Belo Horizonte - two) reported canine-human transmission. Prior to the leishmaniasis development dogs remained for short or long periods in 14 cities in the State of São Paulo: Araçatuba, Birigui, Caraguatatuba, Cotia, Eldorado, Embu e Embu Guaçu, Guarujá, Ilha Bela, Itapecerica da Serra, Peruíbe, Presidente Prudente, São Roque and São Paulo Capital) and five other Brazilian States (Maranhão, Minas Gerais, Paraná, Rio de Janeiro and Santa Catarina. Most animals were oligosymptomatic (50%), 47.2% symptomatic and 2.8% asymptomatic. The majority of lesions was on the head, limbs and abdominal region, and included: hair loss and/or alopecia (45.7%), scales (40%), ulcers (37.1%), and crusts (37.1%), with 63,9% associated pruritus. The most common clinical findings were: lymph node enlargement (74%), pyrexia (44,4%), disorexia (40.7%), weight loss (29.7%) , liver (29.7%) and spleen (25.6%) enlargement. Most frequent alterations in laboratory exams were: hyperproteinemia (56.5%), hypoalbuminemia (52.1%), anemia, and thrombocytopenia (34.8% both). RIFI was more representative (100%) in positive cases, followed by ELISA (87.5%) and immunohistochemistry (37.5%). Immunohistochemistry was used in histology samples of 12 (33%) cases and allowed us to detect the agent in seven (58.3%) cases: two (33.3%) oligosymptomatic and five (83.3%) symptomatic. Thus, immunohistochemistry is a useful method, and more effective than histopathology (30.8%).
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ELISA plasmônica na detecção de anticorpos IgG anti-leishmania sp. /Maciel, Marilene Oliveira dos Santos January 2019 (has links)
Orientador: Valéria Marçal Felix Lima / Resumo: O cão tem sido alvo do controle da Leishmaniose Visceral (LV), pois são reservatórios potenciais de Leishmania infantum e desempenham um papel fundamental na cadeia epidemiológica da doença no homem. Portanto, o diagnóstico da leishmaniose canina (Lcan) no Brasil tem sido um desafio para os órgãos de controle de endemias, uma vez que apresentam limitações quanto à sensibilidade e especificidade em áreas endêmicas. Nesta perspectiva a presente pesquisa objetivou desenvolver e validar um ELISA plasmônica indireto rK28 (pELISA) para o diagnóstica da Lcan. Para o desenvolvimento do pELISA, foram realizados diferentes ensaios de otimização, determinação das concentrações ideais de peróxido de hidrogênio, íons ouro, anticorpo IgG anti-dog biotinilado e também do soro. Para a validação do ensaio, 170 amostras de soro de cães de área endêmica para Lcan e 26 amostras de cães saudáveis de área não endêmica para a doença foram testadas pelo pELISA e comparadas com ELISA indireto rk28 e com o teste imunocromatográfico (Dual Path Platform, TR_DPP®) usando como teste padrão-ouro o qPCR em amostras de sangue e/ou swab de subconjuntival. O ensaio foi padronizado com as concentrações de 250 μM de peróxido de hidrogênio, 0,30 mM de íons ouro e a melhor diluição do conjugado de estreptavidina-catalase foi de 1/50. O TR_DPP®, ELISA indireto rK28 e pELISA apresentaram sensibilidade de 79,0%, 89,5% e 94,7% e especificidade de 90,1%, 91,4% e 100,0%, respectivamente. Os maiores valores preditivos po... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dogs have been the target of control of Visceral Leishmaniasis (VL) in humans, as they are potential reservoirs of Leishmania infantum and play a key role in the epidemiological chain of the disease. Therefore, the diagnosis of Canine Leishmaniasis (CanL) in Brazil has been a challenge for endemic control organs, since they have limitations on sensitivity and specificity in endemic areas. In this perspective the present research aimed to develop and validate an indirect plasmonic ELISA rK28 (pELISA) for the diagnosis of CanL. For the development of pELISA, different concentrations of hydrogen peroxide, gold ions, biotinylated anti-dog IgG antibody and serum were tested in order to establish ideal values to each parameter. For the validation of the assay, 170 dog serum samples from endemic area to CanL and 26 healthy dog samples from an area nonendemic to the disease were tested by pELISA and compared with indirect ELISA rk28 and the imunocromatografic test (Dual Path Platform, TR_DPP®) using as gold standard assay the real-time PCR in blood samples and/or subconjunctival swab. The assay was standardized with the concentrations of 250 μM hydrogen peroxide, 0.30 mM gold ions, and dilution of the streptavidin-catalase conjugate of 1/50. The TR_DPP®, indirect ELISA rK28 and pELISA presented sensitivity of 79.0%, 89.5% and 94.7% and specificity of 90.1%, 91.4% and 100%, respectively. The highest predictive positive (100%), negative (99.3%) and accuracy (99.4%) values were observed... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Genes de cisteíno proteases (catepsina L-like) de Leishmania infantum chagasi: caracterização, relações filogenéticas e diagnóstico molecular / Genes of Cysteine proteases (Cathepsin L-like) from Leishmania infantum chagasi: characterization, phylogenetic relations and molecular diagnosisSilva, Ryan Emiliano da 21 February 2018 (has links)
Os parasitas pertencentes ao gênero Leishmania têm distribuição ubíqua. Este táxon inclui Leishmania infantum chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, uma zoonose negligenciada cujas metodologias diagnósticas acumulam uma série de limitações, requerendo a validação e padronização de metodologias diagnósticas satisfatórias. Vários fatores estão relacionados à patogênese causada por este protozoário, entre eles a catepsina L-like, uma cisteíno protease envolvida em processos regulatórios metabólicos e infecciosos. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do gene de catepsina L-like isoforma CPA como alvo de diagnóstico molecular e como marcador filogenético que permita a compreensão das variações intraespecíficas e elucidem a história evolutiva de L. infantum chagasi no Brasil. Foram utilizados 44 isolados de L. infantum chagasi de diferentes estados brasileiros. Os fragmentos do gene de catepsina L-like foram amplificados, purificados, sequenciados, alinhados manualmente e analisados por métodos filogenéticos de máxima parcimônia e inferência bayesiana. As sequências geradas foram usadas para pesquisar e sintetizar iniciadores a serem usados em reações específicas para o parasita alvo. O gene de catepsina L-like não mostrou variabilidade intraespecífica entre os isolados analisados, sugerindo um evento recente de introdução do mesmo nas Américas. O par de iniciadores propostos amplificou o DNA alvo de isolados de L. infantum chagasi, sendo efetivo na amplificação de DNA em concentrações de até 10-11g / µl. O marcador proposto não apresentou reações cruzadas com outros hemoparasitas de importância clínica. Quando utilizado para o diagnóstico em um painel de amostras clínicas de cães, obteve-se uma frequência de positividade de 49,03% (102/208), contrastando com o valor de 14,42% (30/208) obtido com o marcador para o gene do espaçador ribossomal interno ITS. Quando testado em amostras de flebotomíneos se obteve um valor de 6,25% e em amostras de pacientes humanos o valor foi de 14,28%. Os marcadores também foram eficazes em amplificar DNA extraído de amostras de urina, de sangue fixado em papel filtro e mesmo em amostras de swab de lesões conjuntivas. Este conjunto de parâmetros permite inferir que o CatLeish- PCR é sensível e específico para o diagnóstico de L. infantum chagasi podendo ser aplicado tanto em pesquisas clínicas quanto em inquéritos epidemiológicos de vigilância. / The parasites belonging to the Leishmania genus have a wide distribution. This taxon includes Leishmania infantum chagasi, the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis in the Americas, a neglected zoonosis that requires the validation and standardization of satisfactory diagnostic methodologies. Several factors are related to the pathogenesis caused by this protozoan, as Catepsin L-like, a cysteine protease involved in regulatory and infectious processes. Given this information this work aimed to evaluate the effectiveness of Cathepsin L-like isoform CPA as a target for molecular diagnosis and as a phylogenetic marker that allows understanding the intraspecific variations and the evolutionary history of L. infantum chagasi in Brazil. We used 44 isolates of L. infantum chagasi from different Brazilian states. The cathepsin L-like gene fragments were amplified, purified, sequenced, manually aligned and analyzed by maximum parsimony and Bayesian inference methods. The sequences generated were researched to construction of oligonucleotide primers to be used in reactions specific to the target parasite. The Cathepsin L-like gene did not show intraspecific variability among the isolates analyzed, suggesting a recent event of introduction of the same in the Americas. The pair of proposed primers amplified the target DNA of L. infantum chagasi isolates, being effective in DNA amplification at concentrations of up to 10-11g/µl. The proposed marker did not present cross-reactions with other hemoparasites of clinical importance. When used for the diagnosis in a panel of clinical samples of dogs obtained a positive frequency of 49.03% (102/208), against the 14.42% (30/208) to ribosomal ITS marker. Samples of sandflies obtained a value of 6.25% and in humans the value was 14.28%. The markers were also effective in blood samples fixed on filter paper and even in samples from conjunctival lesion swabs. This set of parameters allows to infer that CatLeish-PCR is a sensitive and specific marker for the diagnosis of L. infantum chagasi in clinical and epidemiological surveys.
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