Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rincones_Johana_D.pdf: 3507237 bytes, checksum: b5905da7ffa8ea3a869dd3090e9a1d1f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Vassoura-de-Bruxa do cacaueiro constitui um patosistema complexo e até o momento não foi estabelecido um plano de controle efetivo na região produtora da Bahia. O objetivo principal deste trabalho foi aprimorar os conhecimentos sobre a interação C. perniciosa-Cacaueiro com informações referentes à: 1) tamanho e organização do genoma através da obtenção do cariótipo molecular do fungo; 2) variabilidade genética deste fitopatógeno a nível cromossômico na região produtora da Bahia; e 3) expressão gênica do fungo em presença de extratos do hospedeiro. O cariótipo molecular foi estabelecido por eletroforese em gel de campo pulsado. Esta mesma metodologia foi utilizada em combinação com análise tipo microsatélites para um estudo de variabilidade a nível cromossômico de 38 isolados provenientes de três biótipos e diferentes regiões geográficas. Para análise da expressão gênica foram seqüenciadas quatro bibliotecas de cDNA do fungo sob diferentes condições de cultivo e em diferentes estágios do desenvolvimento, incluindo uma biblioteca subtrativa obtida por SSH. Como resultados, apresentamos o cariótipo molecular de C. perniciosa e a existência de polimorfismos cromossômicos. A análise dos 38 isolados permitiu observar que o cariótipo do biótipo-C é estável ao longo do tempo e sua variabilidade na região da Bahia é baixa, mostrando assim a fragilidade do programa de melhoramento genético do cacaueiro na Bahia, onde os clones resistentes selecionados no campo foram desafiados contra apenas dois genótipos do patógeno. Com relação à análise da expressão do fungo, obtivemos 1427 unigenes e sua análise por similaridade com as bases de dados permitiu a identificação de diversos mecanismos pelos quais o fungo poderia estar manipulando o metabolismo da planta para seu benefício e em detrimento da produção de cacau. Assim, consideramos que a partir deste trabalho foi possível obter uma maior compreensão dos mecanismos utilizados por C. perniciosa no desenvolvimento da Vassoura-de-Bruxa em cacaueiro e estudos mais aprofundados, baseados nos resultados aqui obtidos, deverão auxiliar no desenvolvimento de estratégias de controle para esta importante doença / Abstract: Witches' broom disease of cocoa is a complex pathosystem that has evaded an efficient control program in the cacao-producing region of Bahia, Brazil. The main goal of this work was to acquire a better understanding of the C. perniciosa-Cacao interaction by providing new data regarding: 1) the size and organization of the fungal genome through molecular karyotyping; 2) the genetic variability of this phytopathogen at the chromosomal level in the cacao-producing region of Bahia; and 3) the gene expression of the fungus in the presence of host extracts. The molecular karyotype was obtained through pulsed-field gel electrophoresis. This same technique was applied in combination with microsatellite PCR analysis of 38 isolates from different biotypes and geographic regions in order to study the chromosomal-level genetic variability of this pathogen. For the gene expression analysis, four cDNA libraries of the fungus grown under different culture conditions and developmental stages, including a subtractive library using SSH, were sequenced and searched for similarities in the public databases. As results, we present the molecular karyotype of C. perniciosa and the existence of chromosome-length polymorphism. The analysis of the 38 isolates showed that the karyotype of the C-biotype is very stable in time and that the variability of the pathogen in Bahia is very low, thus indicating the fragility of the current cacao-breeding program in Bahia, where the resistant cacao clones selected in the field were challenged against only two different genotypes of the pathogen. With regards to the gene expression analysis, we obtained 1427 unigenes and the similarity searches allowed the identification of various mechanisms through which the fungus might be manipulating the metabolism of the plant for its own benefit and in detriment of cocoa production. Therefore, we consider that this work allowed us to acquire a better understanding of the molecular mechanisms used by C. perniciosa during witches' broom development in cacao and more detailed studies, based on the results presented here, might aid in the development of novel control strategies for this important disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T06:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scarpari_LeandraMaria_D.pdf: 5130527 bytes, checksum: 37ee3077a3d859fb1da23df8ea1fa70c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença vassoura-de-bruxa, provocada pelo fungo hemibiotrófico Crinipellis perniciosa, é uma das doenças mais importantes do cacaueiro, diminuindo drasticamente a produção e causando grandes prejuízos econômicos. Uma maior compreensão sobre a interação cacaueiro - C. perniciosa e sobre os processos que ocorrem na planta durante a progressão da doença é necessária para estabelecer novas estratégias de controle para a doença. O presente trabalho teve dois objetivos principais: 1) identificar as mudanças bioquímicas que ocorrem no cacaueiro durante o desenvolvimento da doença; 2) identificar os genes diferencialmente expressos no micélio biotrófico do fungo C. perniciosa cultivado in vitro, sendo este micélio o estágio do ciclo de vida do fungo que induz os sintomas da doença. Os resultados da caracterização bioquímica da doença, usando plântulas de cacau infectadas artificialmente, indicaram uma elevação inicial de metabólitos secundários relacionados à defesa da planta, como alcalóides, fenólicos e taninos. Como esses mecanismos não são eficientes para deter a colonização da planta pelo fungo, uma cascata de eventos, provavelmente ativada pelo aumento dos níveis de etileno, eleva os teores de asparagina, de açúcares, malondialdeido (MDA) e glicerol, altera o perfil de ácidos graxos, reduz os níveis de aminoácidos individuais e de pigmentos fotossintéticos, causando a morte da vassoura. O importante avanço do desenvolvimento de um sistema que permite a manutenção in vitro do micélio biotrófico de C. perniciosa, estabelecido recentemente por nosso grupo, permitiu o estudo da expressão gênica diferencial das duas fases miceliais do ciclo de vida do fungo: biotrófica e necrotrófica. Utilizamos a técnica de microarrays de DNA, analisando 2.304 fragmentos de bibliotecas de DNA genômico do Projeto Genoma da Vassoura-de-bruxa, selecionados a partir da similaridade com genes de patogenicidade de outros patógenos. Os resultados mostraram supressão da expressão de genes relacionados ao transporte e metabolismo de hexoses e ao metabolismo de lipídeos no micélio biotrófico do fungo. Já os genes da família do citocromo P450, hidrofobinas, aglutinina, lacase, várias proteases, lipases, álcool oxidase (AOX) e proteínas pol do sistema de retrotransposição de vírus, tiveram sua expressão induzida no micélio biotrófico, sugerindo uma possível participação nos mecanismos de patogenicidade do fungo. Esses resultados representam avanços significativos para as pesquisas sobre o metabolismo do fungo C. perniciosa e sobre as bases moleculares da progressão da doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro, e servirão como base para orientar futuras investigações visando o controle da doença / Abstract: Witches¿ broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Crinipellis perniciosa, is one of the most important diseases of cocoa, causing dramatic production and economic losses. A better understanding of the cacao - C. perniciosa interaction and the processes that occur in the plant during disease progression becomes necessary in order to establish novel control strategies for this disease. In view of this, the present work had two main goals: 1) establishment of the biochemical modifications that occur in the host plant during disease development; and 2) identification of differentially expressed genes in in vitro grown biotrophic mycelia of C. perniciosa, which constitutes the fungal life stage that induces disease symptoms. The results of the biochemical characterization of the disease in artificially infected cocoa seedlings indicated an initial increase of secondary metabolites related to plant defenses, such as alkaloids, phenolics, and tannins. Since these mechanisms fail to control plant colonization by the fungus, a cascade of events, probably triggered by the increased levels of ethylene, boosts the contents of asparagine, sugars, malondialdehyde (MDA) and glycerol, alters the profile of fatty acids, lowers the levels of individual amino acids and photosynthetic pigments, and ultimately leads to tissue death. The important technological development of an in vitro system that allows the maintenance of the biotrophic phase of C. perniciosa, which was recently established by our group, allowed the analysis of the differential gene expression between the two mycelial phases of the life cycle of this fungus: the biothophic and the necrotrophic phases. For this study we employed the technique of DNA microarrays, analyzing 2,304 fragments obtained from the genomic DNA libraries of the Witches¿ Broom Genome Project, and which were selected based on their sequence similarity to pathogenicity genes of other pathogens. The results showed suppressed expression of genes related to the metabolism and transport of hexoses and to the metabolism of lipids in the biotrophic mycelia of the fungus. On the other hand, the expression of genes of the cytochrome P450 family, hydrophobins, agglutinin, laccase, several proteases, lipases, alcohol oxidase (AOX), and pol proteins of the viral retrotransposition system were induced in the biotrophic mycelia, thus suggesting their possible participation in fungal mechanisms of pathogenicity. These results represent significant advances to our understanding of the metabolism of C. perniciosa and also regarding the molecular basis underlying the progression of witches¿ broom disease of cocoa, and will be valuable as a basis for future investigations aimed at disease control / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Frequentemente, fitoplasmas têm sido associados com doenças em cucurbitáceas, tanto cultivadas, como silvestres e daninhas. Em abobrinha-de-moita cultivada no Vale do Ribeira, Estado de São Paulo, foi observado superbrotamento de hastes, malformação da parte aérea e folhas deformadas e enrugadas, sugerindo uma possível infecção por fitoplasmas. A associação de fitoplasmas com morangueiro parece ser rara no Brasil. No entanto, nos municípios de Domingos Martins e Santa Maria de Jetibá, Estado do Espírito Santo, foram observadas plantas de morango apresentando expressiva filodia de frutos, sintoma suspeito de infecção por fitoplasmas. O presente trabalho teve por objetivos detectar e identificar molecularmente os possíveis fitoplasmas associados às plantas doentes. O DNA total das amostras, extraído com um kit comercial ou pelo protocolo 2X CTAB, foi amplificado por dupla PCR com os primers universais P1/Tint e R16F2n/R16R2. Os produtos amplificados com o primeiro par de primers foram reamplificados usando os pares R16(I)F1/R16(I)R1 e R16(III)F2/R16(III)R1, visando a identificação e os produtos de dupla PCR, amplificados com o segundo par de primers, utilizados na análise por RFLP e no sequenciamento. Para as análises filogenéticas adotaram-se seqüências nucleotídicas de fitoplasmas pertencentes a diversos grupos. Observações feitas ao microscópio eletrônico de transmissão revelaram a presença de corpúsculos pleomórficos típicos de fitoplasmas no floema de morangueiro. Por dupla PCR com os primers universais, foi consistentemente detectada a presença de fitoplasmas nos tecidos das plantas doentes. Com o uso dos primers específicos foi possível a identificação de um fitoplasma afiliado ao grupo 16SrIII em abobrinha-de-moita e de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII em morangueiro. A análise por RFLP confirmou os resultados obtidos com os primers específicos e demonstrou a presença de um fitoplasma afiliado ao grupo 16SrXIII nas amostras de morangueiro. O sequenciamento permitiu a obtenção de duas seqüências a partir das amostras de morangueiro. A primeira seqüência nucleotídica, SFP-Br1 (EU719107), apresentou 99% de similaridade com as seqüências dos fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrIII e a análise filogenética mostrou um maior relacionamento com o subgrupo 16SrIII-B. A segunda seqüência nucleotídica, SFP-Br-3 (EU719109), apresentou 98% de similaridade com as seqüências dos fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrXIII. A análise filogenética mostrou este fitoplasma como um representante do grupo 16SrXIII, porém localizado em um novo ramo, diverso daqueles conhecidos para representantes deste grupo. Os coeficientes de similaridade calculados para SFP-Br3 e para os subgrupos 16SrXIII-A, 16SrXIII-B e 16SrXIII-C variaram de 0,91 a 0,96, o que distinguiu o fitoplasma presente no morangueiro dos outros subgrupos de fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrXIII já existentes. Assim, através de análise molecular, foi possível relatar a abobrinha-de-moita como um novo hospedeiro de fitoplasmas do grupo 16SrIII, bem como detectar e identificar distintos fitoplasmas nas plantas de morango, inclusive um novo representante, aqui denominado de 16SrXIII-D. / Phytoplasmas have been associated with some diseases of cucurbit as cultivated as sylvester and weed species. Symptoms of witches broom and leaf malformation were observed in summer squash cultivated in the Vale do Ribeira, São Paulo State, suggesting infection by phytoplasma. The association of phytoplasmas with strawberry diseases seems to be rare in Brazil. Nevertheless, in Domingos Martins and Santa Maria de Jetibá cities, located in Espirito Santo State, strawberries plants with expressive fruit phyllody were observed. This kind of symptom also suggested infection associated to phytoplasma. So, the present work was conducted in order to detect and identify possible phytoplasmas associated to simptomatic plants through molecular analysis. The DNA, extracted with a commercial kit or through 2X CTAB protocol, was amplified by nested PCR with universal primers P1/Tint and R16F2n/R16R2. The amplified products with the first primers pairs were reamplified using the primers R16(I)F1/R16(I)R1 and R16(III)F2/R16(III)R1 for specific identification; and the products of nested PCR, amplified from second primers pair, were submitted to RFLP analysis and to sequencing. For phylogenetic analysis were included sequences of phytoplasmas belonging to many groups. Results showed that pleomorphic bodies were present in the phloem of diseased strawberries plants, by using electronic microscopy. The amplifications by nested PCR with universal primers allowed the detection of phytoplasmas in the tissues of symptomatic strawberry and squash plants. PCR assays with specific primers revealed a phytoplasma of 16SrIII group in summer squash and phytoplasmas of 16SrI and 16SrIII groups in strawberry plants. RFLP analysis confirmed the occurrence of a member of 16SrIII group in summer squash and demonstrated the presence of phytoplasmas affiliated to 16SrI, 16SrIII and 16SrXIII groups in strawberry samples. The sequencing allowed the attainment of two sequences from strawberries samples. The first sequence, designated SFP-Br1 (EU719107) representing a phytoplasma affiliated to 16SrIII group, showed 99% of similarity with other sequences of phytoplasmas affiliated with this group. The phylogenetic analysis showed that this phytoplasma was more related with the subgroup 16SrIII-B. The second sequence, designated SFP-Br3 (EU719109) representing a phytoplasma affiliated to 16SrXIII group, showed 98% of similarity with members of this group. The phylogenetic analysis revealed this phytoplasma belonging to 16SrXIII group, but located on a new different branch from those previously known. The similarity coefficient indicated variations between SFP-Br3 and the three phytoplasmas affiliated to 16SrXIII-A, 16SrXIII-B and 16SrXIII-C sub-groups, varying on 0.91 to 0.96, distinguishing the strawberry phytoplasma from the other sub-groups of phytoplasma affiliated with the 16SrXIII group already existing. This way, through molecular analysis, it was possible to relate summer squash as a new host of 16SrIII group phytoplasma, as well as detecting and identifying distinct phytoplasmas on strawberry plants and characterize a new 16SrXIII-D subgroup.

A vassoura-de-bruxa é a doença mais importante da cultura do cacaueiro, nos países onde ela ocorre. Em 1989 foi constatada pela primeira vez a presença do patógeno causador dessa doença na principal região produtora do Brasil. A falta de medidas de controle eficientes resultou, nos últimos anos, em menor produção, mudanças no uso da terra, venda de propriedades, diminuição do nível de emprego e danos ao meio ambiente. Em vista do pouco conhecimento sobre aspectos epidemiológicos da doença nas condições do sudeste da Bahia, elaborou-se o presente trabalho com os seguintes objetivos: estudar o gradiente de infecção da vassoura-de-bruxa em ramos e frutos em cacaueiros enxertados; comparar o efeito de genótipos e três tratamentos (poda fitossanitária semestral, poda fitossanitária mensal e poda fitossanitária aliada a aplicação de fungicida mensais) no controle da doença; estudar o progresso da vassoura-de-bruxa no tempo, quantificado em ramos e frutos doentes. O experimento foi conduzido em Uruçuca, BA, em área contendo 16 genótipos diferentes, adjacente a uma área com cacaueiros abandonados com alta incidência da doença. A área experimental foi dividida em três partes, as quais receberam os seguintes tratamentos: poda fitossanitária semestral, poda fitossanitária mensal e poda fitossanitária aliada a aplicação de fungicida mensal. Pelo menos uma vez por mês foram contados os ramos e frutos com vassoura. Os resultados mostraram a ausência de evidência clara da existência de gradiente de doença. Os níveis de resistência genética à vassoura-de-bruxa de ramos e frutos não foram correlacionados entre si. Houve bom ajuste do progresso da doença ao modelo monomolecular. As menores taxas de crescimento foram obtidas no tratamento com poda e aplicação de fungicida mensal. O tratamento que combinou poda e pulverização com fungicida apresentou diferença significativa na redução do percentual de frutos com vassoura. Os genótipos NO-34, NO-17 e NO-02 foram os que apresentaram menores percentagens de frutos com vassoura, sendo significativamente diferentes dos genótipos NO-24 e NO-13. / Witches' broom is the most important disease of cocoa, in the countries where it occurs. In 1989, it was verified for the first time the presence of the pathogen in the main producing area of Brazil. The lack of efficient control measures resulted, in the last years, in losses in the production, changes in the use of the soil, sale of properties, decrease of the employment level and damages to the environment. In view of the little knowledge on epidemic aspects of the disease in the conditions of the southeast of Bahia, the present work was elaborated with the following objectives: to study the gradient of the witches' broom infection in flushes and pods in grafted cocoa; to compare the effect of genotypes and three treatments (half-yearly phytosanitation, monthly phytosanitation and monthly phytosanitation allied to fungicide application) in the control of the disease; to study the witches' broom temporal progress, quantified in flushes and pods. Trials were carried out in Uruçuca, BA, in area contends 16 different genotypes, adjacent an area with abandoned cocoa with high incidence of the disease. The experimental area was divided in three parts, which received the following treatments: half-yearly phytosanitation, monthly phytosanitation and monthly phytosanitation allied to fungicide application. At least once a month, flushes and pods with broom were counted. Results showed the absence of clear evidence of the existence of disease gradient. The levels of genetic resistance to the witches' broom of flushes and pods were not correlated to each other. There was good adjustment of progress of the disease to the monomolecular model. The smallest growth rates were obtained in the treatment with monthly phytosanitation and fungicide application. The treatment that allied phytosanitation and fungicide application presented significant difference in the reduction of the percentage of witches' broom infected pods. The genotypes NO-34, NO-17 and NO-02 presented smaller percentages of diseased pods, being significantly different from the genotypes NO-24 and NO-13.

Orientador: Nelson Horacio Pezoa Garcia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Efraim_Priscilla_D.pdf: 3005113 bytes, checksum: 644805cbb4b729e262d0a9e849b572b8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho buscou contribuir com o Programa Brasileiro de Melhoramento Genético de Cacau por meio do processamento e caracterização dos principais derivados de nove clones estudados e utilizados comercialmente na Bahia por sua resistência à vassoura-de-bruxa: CEPEC 42, EET 397, TSA 654, TSA 656, TSAN 792, TSH 516, TSH 565, TSH 774, TSH 1188 e do cacau Comum, tradicional na região e suscetível à doença. Os frutos foram colhidos em um mesmo período, fermentados simultaneamente em lotes de 50 Kg e secos naturalmente ao sol. As amêndoas obtidas foram quebradas em nibs, que foram torrados em 3 diferentes tempos em forno elétrico rotativo a 150 ºC e moídos até 25 µm para obtenção dos liquors. A análise sensorial de preferência definiu o tempo de torração de cada material. A manteiga de cacau foi obtida por prensagem hidráulica dos liquors. Chocolates amargos foram produzidos pelo método convencional. A caracterização física dos frutos e sementes demonstrou diferenças entre os materiais quanto ao peso total dos frutos e rendimento de sementes com polpa por fruto. O monitoramento de temperatura e pH da massa em fermentação e a avaliação dos teores de umidade, atividade de água, pH, acidez total titulável, açúcares, ácidos orgânicos, proteínas, compostos fenólicos totais e da contagem microbiológica, durante a fermentação e ao término da secagem, demonstraram que a evolução do processo fermentativo foi distinta para cada material. A caracterização da manteiga de cacau quanto à composição em triacilgliceróis e curva de sólidos indicou que os todos os cultivares estudados, exceto o TSH 774, apresentaram melhorias em relação ao cacau Comum. A análise sensorial descritiva quantitativa dos liquors por duas equipes treinadas e de aceitação dos chocolates, por painel não treinado de consumidores, indicaram diferenças entre os materiais para alguns atributos avaliados de acordo com sua ascendência genética, sendo que os materiais descendentes dos grupos Trinitário e Forastero apresentaram maior preferência em relação aos descendentes apenas do grupo Forastero. Apesar das diferenças físicas e químicas verificadas nos liquors e chocolates, observou-se a viabilidade industrial de todos dos materiais estudados. Estudou-se ainda a influência da mistura de 0, 30, 50 e 100% de sementes danificadas pela vassoura-de-bruxa com sementes sadias na fermentação às características de amêndoas, liquors, manteiga e pó de cacau obtidos. Os perfis de temperatura e pH da massa em fermentação, os teores de açúcares e ácidos orgânicos e a análise da fração volátil demonstraram que reações que normalmente ocorrem na fermentação podem ter se iniciado nos frutos, antes da colheita. O teor de polifenóis totais das sementes danificadas foi maior que o de sementes sadias, porém, as perdas na fermentação foram maiores. Os teores de lipídios e proteínas das amêndoas e liquors foram menores quanto maior a proporção de sementes danificadas. A vassoura-de-bruxa não causou alterações nas propriedades físicas e químicas avaliadas nas manteigas de cacau. A análise da fração volátil das sementes, amêndoas e liquors indicou que o aumento do teor de sementes danificadas levou à diminuição ou ausência de importantes alquilpirazinas, indicando que o uso destas, nas porcentagens estudadas, pode prejudicar a qualidade sensorial dos derivados de cacau / Abstract: The aim of this study was to contribute with the Brazilian Genetic Improvement Program of cocoa by processing and characterizing the main cocoa-derived products from nine clones studied and used commercially in Bahia due to their resistance to ¿witches¿ broom¿: CEPEC 42, EET 397, TSA 654, TSA 656, TSAN 792, TSH 516, TSH 565, TSH 774, TSH 1188 and Comum cocoa, traditional in the area and susceptible to the disease. The fruits were harvested in the same period, fermented in 50 kg batches and sun-dried. The cocoa beans obtained were broken into nibs, roasted during 3 different times in a rotative electric oven at 150ºC and milled to 25 µm to obtain the liquors. A preference sensory evaluation defined the specific roasting time for each material. Cocoa butter was obtained by hydraulic pressing of the liquors. Bitter chocolates were produced by the conventional method. The physical characterization of the fruits and seeds demonstrated differences among the materials regarding total weight of the fruits and yield of seeds with pulp per fruit. Temperature and pH monitoring of the mass during fermentation and evaluation of moisture content, water activity, pH, total acidity, sugars, organic acids, proteins, total phenolic compounds and microbiological count during fermentation and at the end of drying demonstrated that the evolution of the fermentation process was different for each material. The triacylglycerol composition and the solid fat content of the cocoa butters from all the cultivars studied, except TSH 774, presented improvements compared to Comum cocoa. The quantitative descriptive analysis of the liquors carried out by two trained panels and the acceptance of the chocolates by an untrained consumer panel indicated differences for some of the parameters evaluated among the materials studied according to their genetic ascendance. The cultivars descending from Trinitario and Forastero groups presented greater preference in relation to the descendants of the Forastero group only. The physical and chemical characterization of the liquors and chocolates demonstrated differences among the materials studied; however, it also showed their industrial viability. The influence of the mixture of 0, 30, 50 and 100% of seeds damaged by ¿witches¿ broom¿ with healthy seeds during the fermentation process on the characteristics of cocoa beans, liquors, cocoa butter and powder was also studied. The temperature and pH profiles of the mass during fermentation, the amounts of sugars and organic acids and the analysis of volatile compounds demonstrated that some reactions that usually occur during fermentation might have been initiated in the fruits before harvesting. The total content of polyphenols in the damaged seeds was higher than in the healthy seeds; however, losses during fermentation were also greater. Lipid and protein contents of cocoa beans and liquors decreased with the increase of the proportion of damaged seeds. ¿Witches¿ broom¿ did not cause changes in the physical and chemical properties evaluated in the cocoa butters. The analysis of the volatile compounds of the seeds, beans and liquors showed that the increase of the content of damaged seeds led to the decrease or absence of the main alkylpyrazines, indicating that their use in the percentages studied may negatively affect the sensory quality of cocoa-derived products / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_PauloJosePereiraLima_D.pdf: 96794209 bytes, checksum: ecb31f47caf999afd03d8b9da31315f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cacaueiro se destaca como uma das principais culturas perenes na agricultura, sendo economicamente relevante por fornecer a matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto que movimenta bilhões de dólares no mercado mundial a cada ano. Apesar de sua importância, o cacaueiro é drasticamente atacado por diversas doenças que diminuem sua produtividade e reduzem a qualidade das amêndoas do cacau. Dentre estas, a vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, é um importante fator limitante da produção cacaueira nas Américas. Utilizando tecnologias de sequenciamento de DNA de nova geração, realizamos uma abrangente análise transcriptômica da vassoura de bruxa neste trabalho. Um banco de dados denominado Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa foi construído, o qual compreende aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq representativas dos mais variados estágios de desenvolvimento, condições de crescimento e respostas a estresse do fungo M. perniciosa sob condições in vitro e in planta. O primeiro capítulo desta tese apresenta uma análise global do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa. Este conjunto de dados tem suportado uma série de estudos específicos relacionados a variados aspectos da doença, os quais são apresentados e detalhados nos demais capítulos da tese. Notavelmente, uma análise detalhada da interação biotrófica entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa (Capítulo II) revelou a ocorrência de intensa reprogramação transcricional e importantes alterações fisiológicas em plantas infectadas, incluindo a ativação de respostas de defesa ineficientes e a ocorrência de privação de carbono. Curiosamente, um processo de senescência prematura se estabelece no tecido infectado e parece ser um evento central no desenvolvimento da doença, possivelmente disparando o início da fase necrotrófica desta interação planta-patógeno. Ainda, nossos dados também permitiram a identificação de potenciais efetores de virulência em M. perniciosa, como também a caracterização do status metabólico do fungo durante a infecção do cacaueiro. Um modelo detalhado que sumariza os aspectos moleculares da vassoura de bruxa foi elaborado. De maneira geral, o Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa representa um importante avanço no estudo desta doença e tem servido como ponto de partida para uma série de estudos adicionais. A utilização destes dados na identificação e caracterização de potenciais fatores de patogenicidade de M. perniciosa (Capítulos III, IV e VI) e de mecanismos de defesa do cacaueiro (Capítulo V) também é apresentada nesta tese / Abstract: Cacao stands out as one of the major perennial crops in the world, being economically relevant as the source of chocolate, a multi-billion dollar product appreciated worldwide. Despite its importance, cacao is seriously affected by several diseases that reduce crop yield and decrease the quality of cocoa beans. Among them, the witches' broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, is a major constraint for cacao production in the Americas. Using next generation sequencing technologies, a comprehensive transcriptomic analysis of WBD was performed. We developed a database named "WBD Transcriptome Atlas", which comprises approximately 60 RNA-seq libraries that represent a wide range of developmental stages, growth conditions and stress responses of the fungus, either under in vitro or in planta conditions. The first chapter of this thesis presents a global analysis of the WBD Transcriptome Atlas. This data set has supported a number of specific analyses related to several aspects of WBD, which are presented and detailed in the other chapters of the thesis. Strikingly, a detailed analysis of the biotrophic interaction between M. perniciosa and cacao (Chapter I) revealed the occurrence of intense transcriptional reprogramming and remarkable physiological alterations in infected plants, including the activation of ineffective defense responses and the occurrence of carbon deprivation. Curiously, a premature senescence process is established in infected tissues and appears to be a central event in WBD, possibly triggering the onset of the necrotrophic stage of this plant-pathogen interaction. Additionally, our data also allowed the identification of potential virulence effectors in M. perniciosa, as well as the characterization of the metabolic status of the fungus during cacao infection. A detailed model summarizing the molecular aspects of WBD is presented. Overall, the WBD Transcriptome Atlas represents an important advance in the study of this disease and constitutes a starting point for a number of additional studies. The use of these data in the identification and characterization of potential pathogenicity factors of M. perniciosa (Chapters III, IV and VI) and defense mechanisms of cacao (Chapter V) will also be presented in this thesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:25:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_Javier_D.pdf: 13138837 bytes, checksum: 410e11bd8ba7df37c003fae0919eec2e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A doença vassoura de bruxa do cacaueiro, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa tem sido um dos maiores problemas fitopatológicos do hemisfério sul. O fungo tem uma fase biotrófica longa, pouco comum entre fungos com o estilo de vida hemibiotrófico. Este fato sugere que M. perniciosa deve dispor de importantes mecanismos de evasão do sistema de defesa da planta e que estes teriam um papel fundamental para o sucesso da infecção. Assim sendo, o objetivo deste trabalho é entender os mecanismos de supressão envolvidos na resposta de defesa basal da planta. Especificamente, aqueles mecanismos mediados por hormônios que poderiam influenciar na suscetibilidade da planta ao patógeno durante a invasão do M. perniciosa. Com este fim, foram construídas bibliotecas de RNAseq da interação cacau-M. perniciosa durante o inicio da fase assintomática da doença. As bibliotecas representantes desta interação mostraram expressão diferencial de genes relacionados com a sinalização de auxina, mas não foi observado indução de genes da biossíntese planta. Estes dados sugerem a presença de auxina "exógena" produzida provavelmente pelo patógeno. Adicionalmente, foram encontrados genes relacionados com o ácido jasmônico e etileno. Com o intuito de identificar se M. perniciosa era capaz de secretar um composto com função de auxina, sementes de Arabidopsis thaliana foram crescidas em amostras de sobrenadante do fungo. Estes experimentos mostraram alteração da morfologia das raízes semelhantes à adição de auxina exógena. Amostras de sobrenadantes do fungo foram submetidas às técnicas de RMN, LC MS/MS e GC-MS e mostraram a presença de um composto com estrutura semelhante ao indol-3-acetoácido sendo produzido pelo fungo. Estudos do time course de produção deste composto mostraram que a auxina produzida é rapidamente metabolizada formando diferentes derivados indólicos com provável função na patogênese do fungo. Finalmente, encontramos um novo composto com estrutura parecida à auxina e capacidade de indução de genes de resposta a este hormônio. Este trabalho é o primeiro relato a mostrar o time course da síntese de auxina por M. perniciosa e a indução de respostas de sinalização de auxina nos tecidos de cacau infectados pelo fungo. A intervenção nas vias de síntese de auxina pelo fungo seria um caminho plausível na tentativa por conter a doença vassoura de bruxa / Abstract: The witches' broom disease in Cacao is caused by the fungus Moniliophthora perniciosa has been one of the most important problems phytopathological in the southern hemisphere. The fungus has an unusual long biotrophic phase with the lifestyle hemibiotrofic suggesting that M. perniciosa must have important evasion mechanisms for breaking of the plant defense system and it would have a key role to success in the infection. Therefore, the aim of this work is to understand some of the mechanisms involved in the suppression of basal defense response of the plant. Specifically, hormones-mediated mechanisms that could influence plant susceptibility to pathogens during the infection of M. perniciosa. For this purpose, RNAseq libraries were constructed of the interaction cacao - M. perniciosa during the asymptomatic phase of the disease. Genes related with the auxin and jasmonic acid signaling and ethylene production were differential expressed during the initial stage of the disease. Furthermore, auxin-responsive genes were induced, but not observed induction of plant biosynthesis genes for this hormone. These data suggest presence of auxin "exogenous" probably produced by the pathogen. In order to identify whether M. perniciosa was able to secrete a compound like an auxin, Arabidopsis thaliana seedlings were grown in mediums with supernatant of the fungus. These experiments showed alterations on the roots morphology, similar to the addition of exogenous auxin. Samples of supernatants were subjected to the techniques of NMR, LC-MS/MS and GCMS and showed the presence of a compound with a similar structure of Indole-3- Acetic Acid (IAA) being produced by the fungus. A time course of the production of this compound was examinated by LC-MS/MS and showed that the auxin is produced by M. perniciosa, but is rapidly metabolized forming different indole derivatives, some of them with a probable role in the pathogenesis. Finally, we found a new compound with a structure similar to auxin and with the ability to induce gene response to this hormone / Doutorado / Genetica Vegetal / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Maria Carolina Scatolin do Rio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_GleidsonSilva_D.pdf: 5340667 bytes, checksum: a5eb7198bd79e4c57ea6ac55d5742b85 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo hemibiotrofico Moniliophthora perniciosa, e uma das principais doenças que acometem o cacaueiro (Theobroma cacao L.). Durante a fase biotrófica, o patôgeno coloniza o espaço intercelular e estimula a formação de ramos hipertróficos denominados vassoura verde. No estagio avançado da doença, o fungo passa a colonizar também o interior das células e observa-se a morte do tecido originando a vassoura seca. A semelhança destes sintomas aos observados em outras fitopatologias sugere um desequilíbrio hormonal em resposta a infecção. Neste contexto, este trabalho apresenta um estudo integrado dos genes relacionados a diferentes hormônios vegetais e uma caracterização dos genes relacionados às citocininas. A possível participação dos hormônios no estabelecimento e na progressão da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro e discutida. Dados de RNA-seq foram gerados durante as diferentes fases da interação. Em seguida, genes diferencialmente expressos foram classificados de acordo com a terminologia do Gene Ontology. Além disso, a capacidade de biossíntese de citocininas pelo fungo M. perniciosa foi avaliada através do teste de complementação utilizando a levedura TM128 sln1?. Em paralelo, foi realizada uma caracterização detalhada dos genes que constituem o mecanismo de percepção de citocininas em cacau, sistema denominado two-component. Genes relacionados às respostas hormonais e de defesa foram os mais representados entre o grupo de diferencialmente expressos. Durante a fase assintomática, e observada a indução de genes relacionados a auxinas e etileno. Por outro lado, no estagio avançado, foram identificados genes relacionados à degradação de citocininas e as respostas de defesa mediadas por acido salicílico e jasmonato/etileno. Paralelamente, foi identificado no M. perniciosa um gene para a síntese de citocininas, entretanto, a funcionalidade deste não foi confirmada. Em T. cacau, a arquitetura do sistema two-component e similar a encontrada em Arabidopsis sp., porem, nenhuma alteração significativa na expressão dos genes que constituem este sistema foi identificada. Por essa razão, não foi possível estabelecer uma relação clara entre as citocininas e os sintomas da Vassoura-de-bruxa. Contudo, o padrão de expressão de genes relacionados à homeostase de auxinas, sugere uma regulação negativa das respostas de defesa contra patogenos biotroficos durante fase inicial da doença / Abstract: The Witches' Broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is the major disease affecting cacao (Theobroma cacao L.). During its biotrophic phase, the pathogen colonizes the intercellular space and stimulates the formation of hypertrophic branches called green broom. In the advanced stage of the disease, the fungus starts also to colonize the interior of the cells and it is noted the death of tissue originating the dry broom. The similarity of these symptoms to those observed in other plant diseases suggests a hormonal imbalance in response to the infection. In this context, this work presents an integrated study of plant hormone-related genes and a characterization of cytokinin-related genes. The possible participation of these genes in the establishment and progression of Witches' Broom in cacao is discussed. RNA-seq data regarding different phases of the interaction were generated. After this, differentially expressed genes were classified according to Gene Ontology terminology. Furthermore, the ability of cytokinin biosynthesis by M. perniciosa was assessed by a complementation test using the yeast TM128 sln1?. In parallel, we performed a detailed characterization of genes that constitute the mechanism of perception of cytokinins in cacao, the two-component system. For these, the gene expression values have been accessed through the previously generated RNA-seq data. Defense and hormone-related genes were the most represented among the differentially expressed genes. During asymptomatic phase, we observe the induction of auxin and ethylene-related genes. During the symptomatic stage, genes related to the degradation of cytokinins and defense responses mediated by salicylic acid and jasmonate/ethylene was identified. Simultaneously, a putative gene for the synthesis of cytokinins was identified in M. perniciosa genome; however, the participation of this gene in cytokinin synthesis was not confirmed. In T. cocoa, the architecture of two-component system is similar to that one found in Arabidopsis sp.; however, no significant change in the expression of genes that constitute this system was identified. For this reason, it was not possible to establish a clear relationship between cytokinins and the symptoms of the Witches' Broom disease. Moreover, the expression pattern of homeostasis auxin-related genes suggests a negative regulation of defense responses against biotrophic pathogens during the initial stage of the disease / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

This study examines pedagogical patterns associated with wizard, witch, and fairy archetypes in fantasy literature. The fact that magic exists in fantasy literature as a mysterious and elusive element allows narratives to maintain and validate various means of knowledge acquisition – one archetypal form, such as a wizard, pursues a radically different mode of pedagogical engagement with magic than another archetypal form, such as a fairy. According to Carl Jung, archetypes are anchored by ancient elements of mythological lore, yet continuously shape-shift in the present day. My qualitative research process involved close readings of selected passages in popular works of fantasy literature, selected for analysis based on their salient educational themes as well as a presence of witches, wizards, and fairies. I examine how archetypes in fantasy literature frame various approaches to education, investigating whether these pedagogical multiplicities tend to re-codify magic itself. I investigate how these archetypes acquire, dispel, manipulate, and embody magic with opposing or unique tactics, while considering how each archetype confronts the unknown. I also reflect on the relevant folkloric and mythic dimensions of each archetype, examining the extent in which the magical discourse surrounding each archetype relates to ideas about teaching and learning. Each archetype presents pedagogic nuances, subtle parallels, layers, and metaphorical veins of meaning. How does education in fantasy literature establish broad and vexing challenges to the realities that we are familiar with or conscious of in the everyday contemporary educational field? Are there idiosyncratic pedagogical possibilities (and impossibilities) through archetypal representations in fantasy literature, allowing for multifaceted and meaningful representations of teaching and learning? I find that each archetype’s distinct pedagogical model includes variations as well as overlapping representations of creative agency, amplified possibilities, enhanced notions of growth, radical receptivity, calls for empathy, and visions of transformation. After examining each archetype in consecutive chapters, my conclusion summarizes the prismatic meaning of their pedagogical engagements, while reflecting on the implications and cross-pollination of education and magic. The intersection of praxis and knowledge for each archetype induces a mythopoeic imagination in relation to education, as each reconciles and renews significant transformational elements of pedagogy.

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