Thesis (M.A.)--Miami University, Dept. of History, 2005. / Title from first page of PDF document. Document formatted into pages; contains [7], 53 p. : ill. Includes bibliographical references (p. 49-53).

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T14:19:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T14:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) Previous issue date: 2003-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho abordou a transformação genética em C. perniciosa, fungo causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, investigando os fatores que podem influenciar a eficiência de transformação neste organismo, bem como a forma de integração do vetor no genoma do fungo. A transformação dos protoplastos foi realizada pelo método químico do PEG/CaCl 2 e a seleção dos transformantes foi feita com base na resistência à higromicina B. A eficiência de transformação foi analisada em função do promotor utilizado para expressar o gene marcador (se proveniente de basidiomiceto ou de ascomiceto), da forma do vetor (circular ou linear) e da presença de inibidores de nuclease (ácido aurintricarboxílico, putrecina e espermidina) na mistura de transformação. A técnica REMI (restriction enzyme mediated integration) foi realizada utilizando a enzima de restrição BamHI. Também foi construído um vetor contendo o gene que confere resistência à higromicina B (hph) sob o comando do promotor do gene gpd de Agaricus bisporus, para experimentos futuros de mutagênese insercional. A utilização do promotor gpd de Agaricus bisporus resultou em uma eficiência de transformação cinco vezes superior àquela obtida quando o promoter gpd de Aspergillus nidulans foi utilizado. Além disso, os transformantes desenvolveram- se mais rapidamente, com redução do tempo necessário para visualização das colônias nas placas em comparação aos transformantes que continham o gene hph sob o controle do promotor gpd Aspergillus. Os inibidores de nucleases putrecina e ATA (ácido aurintricarboxílico) reduziram a eficiência de transformação nas condições utilizadas, enquanto que a presença de espermidina não exerceu influência quando comparado ao controle. A linearização do vetor não influenciou a eficiência de transformação e todos os transformantes resultantes desse tratamento que foram analisados por hibridização apresentaram um padrão complexo de integração, com duas ou mais cópias do plasmídeo inseridas em posições distintas no genoma. A mais elevada eficiência de transformação foi obtida com REMI, utilizando-se 10U da enzima de restrição BamHI e 10 μg do vetor na forma circular. Nesta condição, foram obtidos cerca de 64 transformantes/μg de plasmídeo, cerca de três vezes mais transformantes que o tratamento onde BamHI não esteve presente. Não foi verificada a influência da enzima de restrição promovendo a obtenção de transformantes com uma única cópia do vetor integrada. Os transformantes mostraram alto nível de resistência à higromicina (>500 μg/mL). Dos transformantes analisados quanto à estabilidade mitótica, 100% conservaram-se resistentes após a passagem por meio não seletivo durante 40 dias. / The present work has investigated the different conditions that may influence the transformation efficiency and the way transforming DNA integrates into the genome of the fungus Crinipellis perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease of cacao. Protoplast transformation was done by the PEG/CaCl 2 method. Transformant colonies were selected for resistance to hygromycin B. The transformation efficiency was related to the type of promoter used to express the hph gene (either from an ascomycete or from a basidiomycete fungus), vector shape (linear or circular forms), and the presence of nuclease inhibitors (aurintricarboxylic acid, putrescine or spermidine) in the transformation mix. The REMI (restriction enzyme-mediated integration) technique was employed using BamHI. For future experiments of insertional mutagenesis, a plasmid containing the hph gene controlled by the gpd gene from Agaricus bisporus was constructed. The use of the gpd promoter from Agaricus bisporus resulted in a five-fold increase in transformation efficiency compared to that obtained with the gpd promoter from Aspergillus nidulans. In addition, these transformants showed faster growth than those containing gpd from Aspergillus. Putrescine and ATA (aurintricarboxylic acid) decreased the transformation efficiency, while spermidine did not have any influence in comparison to the control. Vector linearization was not effective and a complex pattern of plasmid integrations resulted from this procedure, with two or more copies integrated throughout the genome. The highest efficiency was obtained with REMI (10U of BamHI added prior to transformation with 10 μg of circular vector). An efficiency of 64 transformants/μg of plasmid was obtained in this treatment. Under the analyzed conditions, BamHI did not induce single copy integrations in Crinipellis perniciosa, although an approximate three-fold increase in the transformation efficiency was obtained. The transformants were highly resistant to hygromycin (> 500 μg/mL). All transformants analyzed were mitotically stable after successive transfers to nonselective media for 40 days.

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa consiste numa importante enfermidade e apenas o uso de variedades resistentes representa uma solução econômica e ambientalmente viável. Os hormônios vegetais são imprescindíveis na rede de sinalização envolvida na resposta contra uma grande variedade de estresses bióticos e abióticos, sendo bem reconhecido o papel crucial do ácido salicílico (AS), etileno (ET) e os jasmonatos (JA) na interação planta-patógeno. O mecanismo de resistência observado em T. cacao contra o fungo hemibiotrófico M. perniciosa parece não envolver resposta de hipersensibilidade mediada pela sinalização por AS, e caracteriza-se pela menor incidência de sintomas e atenuação do crescimento micelial no material resistente. A resposta regulada por JA e/ou ET é determinada pela contenção e redução da colonização de tecidos infectados pelo patógeno, com atenuação dos sintomas manifestados, e está associada com a indução e produção de inibidores de protease, enzimas líticas da parede de fungos e enzimas do metabolismo secundário e cujo os genes demonstraram indução diferencial em amostras inoculadas com M. perniciosa. Recentemente, foi demonstrada a produção de AS pelo fungo M. perniciosa, o que poderia estar associado a um desarranjo hormonal na planta, auxiliando o pátogeno no processo infectivo. A partir destas evidências este trabalho teve como hipótese que JA e/ou ET estaria regulando a interação T. cacao e M. perniciosa. Sabe-se que a transcrição de genes codificantes das enzimas da via de biossíntese de JA é induzida por aplicação exógena de metil-jasmonato (MJ) e por patógenos, assim para verificar a participação de JA na resposta de defesa de cacau, seqüências de genes que codificam para enzimas da via de biossíntese foram identificadas, classificadas e confirmados sua identidade por seqüenciamento. A indução e expressão quantitativa destes, além dos genes Samsi, Accox, Pal, Jaz e Della, foram avaliadas entre o acesso susceptível à M. perniciosa (\'P7\') e o resistente (\'CAB 214\') de T. cacao, em experimentos de aplicação de indutores (AS, ET e MJ) e inoculação com M. perniciosa. As análises de expressão gênica relativa por RT-qPCR foram conduzidas e a resposta dos genes de biossíntese de JA, quando tratado com MJ no \'P7\' pareceu ser mais intensa e mais específica, enquanto que o acesso \'CAB 214\' apresentou resposta com menor intensidade, porém com resposta mais precoce, demonstrando que o mecanismo de regulação positiva pela aplicação exógena de MJ também ocorre em T. cacao. Em relação à inoculação, os resultados de expressão gênica sugerem uma diferença na resposta transcricional dos genes analisados sob inoculação de M. perniciosa entre o \'P7\' e o \'CAB 214\' onde os transcritos de Aos, Kat, Samsi e Jaz apresentaram elevação significativa somente no \'CAB 214\' em comparação ao \'P7\'. Em acessos resistentes, como \'CAB 214\', o efeito de AS produzido pelo fungo poderia não estar surtindo efeitos antagônicos, como indicado pelo aumento transcricional de Aos, gene codificador da principal enzima envolvida na biossíntese de JA, e embora os demais genes da via estejam sendo reprimidos, muito possivelmente a sinalização da resposta de defesa do acesso resistente \'CAB 214\' seja desencadeada por JA, devido ao papel central de AOS na sua biossíntese, e de maneira sinérgica ET estaria participando do mecanismo de resposta, indicado pela alta indução de Samsi no acesso resistente / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa is an important disease and the use of resistant varieties is the only economic and environmental long-term solution. Plant hormones are essential in the signaling network involved in the response against a variety of biotic and abiotic stresses. It is well recognized the crucial role of salicylic acid (SA), ethylene (ET) and jasmonate (JA) in plant-pathogen interactions. The mechanism of resistance observed in Theobroma cacao against M. perniciosa does not appear to involve hypersensitivity response mediated by AS signaling, and it is characterized by lower incidence of symptoms and reduction of mycelial growth in resistant material. The response regulated by JA and/or ET is determined by the growth inhibition and a reduction of the colonization of infected tissues by the pathogen, together with an attenuation of symptoms. It is also associated with an induction and production of the protease inhibitors, lytic enzymes and enzymes of secondary metabolism and the genes enconding these enzymes have shown differential expression patterns in samples inoculated with M. perniciosa. It has been recently demonstrated that the production of AS by the fungus M. perniciosa could be associated with a hormonal disorder in the plant, which could therefore help the pathogen in the infective process. Considering this, the hypothesis that JA and/or ET would regulate the interaction of T. cacao with M. perniciosa was formulated in order to be tested by this research work. It is known that the transcription of genes encoding the enzymes of the JA biosynthesis pathway is induced by exogenous application of methyl jasmonate (MJ) and by pathogen, thus, in order to verify the involvement of JA in defense response of cocoa, sequences of genes that encode the enzymes of the JA biosynthesis pathway were isolated, identified, classified and had their identity confirmed by sequencing, and relative quantitative gene expression were evaluated in susceptible \'P7\' and resistant \'CAB 214\' plants of T. cacao. In addition genes Sams, Accox, Pal , Jaz and Della, were evaluated in experiments with application of inducers (AS, ET and MJ) and inoculation with M. perniciosa. Analysis of relative gene expression by RT-qPCR were conducted and \'P7\' seems to have the expression of jasmonate biosynthesis genes in a more intense and more specific manner when treated with MJ, while \'CAB 214\' shows an earlier yet lower response suggesting that the mechanism of positive regulation by the exogenous application of MJ also occurs in T. cacao. For the inoculation, the gene expression results suggest a difference in the transcriptional response from inoculation with M. perniciosa between \'P7\' and \'CAB 214\' in T. cacao. The effect of AS produced by the fungus may not have antagonistic effects in resistant materials such as \'CAB 214\', as indicated by the increase of the transcription of Aos gene that encodes the main enzyme involved in JA biosynthesis, so the defense responses of \'CAB 214\' is possibly triggered by JA signaling, because the central role of AOS in its biosynthesis, and may be part of synergistic ET signaling, indicated by high Samsi expression in resistance material

Orientadores: Gonçalo A. Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:53:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabrera_OdalysGarcia_D.pdf: 6336814 bytes, checksum: 10a8f8e8b80239f363cbb4eda5d2746e (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A doença Vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e atualmente constitui um dos maiores problemas fitopatológicos do Brasil. Análises do genoma de M. perniciosa permitiram identificar três genes codificadores para proteínas indutoras de necrose e etileno (NEPs) descritas em oomicetos, bactérias e alguns fungos ascomicetos. Os genes codificadores das proteínas NEP de M. perniciosa (MpNEPs) parecem estar localizados no mesmo cromossomo e foram nomeados 1 e 2 (o terceiro gene está incompleto) segundo a descoberta no genoma (1) ou em uma biblioteca de cDNA de interação M. perniciosa-cacaueiro (2). Os genes codificadores para estas proteínas foram clonados, e expressos usando um sistema de expressão heterólogo em E. coli produzindo proteínas de fusão a cauda de histidinas. As proteínas recombinantes foram purificadas usando colunas de afinidade a metais. MpNEP1 e MpNEP2 apresentam alta similaridade em sua seqüência de aminoácidos e são capazes de induzir necrose e síntese de etileno tanto em folhas de tabaco quanto em cacau. Ambas as MpNEPs apresentam perfis de expressão diferencial nas fases de vida do fungo: MpNEP1 é expressa de forma similar nas fases biotrófica e saprofítica enquanto que MpNEP2 é mais expressa na fase biotrófica. Importantes diferenças no comportamento físico das proteínas foram detectadas: MpNEP1 se comporta como um agregado (dímero ou trímero) em solução e é sensível a tratamento térmico enquanto que MpNEP2 se comporta como monômero e mantém a atividade de necrose depois de submetida a altas temperaturas. Estas diferenças sugerem que estas proteínas podem ter funções complementares durante o desenvolvimento da doença. Esta é a primeira vez que se descreve a presença desta família de proteínas em fungos basidiomicetos e seu estudo pode ser de grande importância para a compreensão dos mecanismos da doença Vassoura-de-bruxa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches¿ broom disease of Theobroma cacao, which constitutes one of the main phytopathological problems of Brazil. An analysis of the M. perniciosa draft genome led to the identification of three putative genes encoding Necrosis and Ethylene inducing Proteins, which have been described in oomycetes, bacteria, and some species of ascomycetous fungi. The NEP proteins of M. perniciosa (MpNEPs) are apparently located on the same chromosome and were named 1 and 2 according to their discovery in the genome (1) or in a cDNA library containing transcripts from the interaction M. perniciosa-cacao (2). The genes codifying MpNEPs were cloned and expressed using a heterologous expression system in E. coli producing recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. MpNEPs were purified using nickel affinity columns. MpNEP1 and 2 have highly similar amino acid sequences and are able to induce necrosis and ethylene emission in both tobacco and cacao leaves. These MpNEPs showed different expression profiles according to the developmental stage of the fungus: MpNEP1 was expressed in a similar way in the biotrophic and saprotrophic mycelias, while MpNEP2 was preferentially expressed in the biotrophic phase. Furthermore, important differences were also detected in the physical properties of these two proteins. MpNEP1 in solution behaves as an oligomer (dimer or trimer) and is very sensitive to temperature. On the other hand, MpNEP2 in solution behaves as a monomer and is able of rapid renaturation after boiling, thus keeping its necrotic activity. These differences indicate that these highly similar NEPs may have complementary roles during disease development. This is the first report of NEP1-like proteins in basidiomycetes and their study will be of great importance in order to acquire a better understanding of the molecular mechanisms underlying Witches¿ broom disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReisJunior_Osvaldo_M.pdf: 4891818 bytes, checksum: f9d97822f44db63385219e9c927eaf29 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As tecnologias de sequenciamento de segunda geração geram um grande número de sequências em um curto espaço de tempo e com baixo custo. O sequenciamento em larga escala de cDNA, conhecido como RNA-seq, tem permitido análises precisas de transcriptomas inteiros sem a necessidade de conhecimento prévio sobre sequências genômicas, conforme exigido pela tecnologia de microarranjos. No entanto, existem muitas discussões sobre os métodos utilizados para o alinhamento de reads, identificação de genes diferencialmente expressos e montagem de transcriptomas. Desde 2000, o Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), tem estudado a doença da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), que é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa. Recentemente, 54 bibliotecas RNA-seq da interação planta-patógeno foram sequenciadas pelo nosso grupo, a fim de ajudar na elucidação da complexa biologia da doença. Desta forma, este trabalho tem como objetivo gerar informações sobre o perfil de transcrição do M. perniciosa e do T. cacao durante a doença vassoura-de-bruxa. Os resultados estão divididos em três seções principais, sendo que na primeira apresentamos uma análise de alinhamento e expressão gênica nas condições e tecidos amostrados. Na segunda, analisamos o estágio inicial da doença, conhecido como vassoura-verde, onde através da análise de expressão diferencial identificamos genes relacionados aos mecanismos de interação entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa. Na ultima seção, desenvolvemos uma estratégia para identificar sequências de possíveis RNAs não codificantes longos (lncRNA) e aplicamos esta estratégia no fungo M. perniciosa. De uma maneira geral estes dados apresentam um importante avanço no estudo desta doença e poderão ser utilizados em trabalhos futuro / Abstract: Next-generation sequencing technologies generate large numbers of sequences in a short time and at low cost. The high-throughput sequencing of cDNA, known as RNA-seq, has allowed precise analyses of entire transcriptomes without the need of previous knowledge on genomic sequences, as required by microarrays. However, there are many discussions about the methods used for read alignment, identification of differentially expressed genes and assembly of transcriptomes. Since 2000, the Genomics and Expression Laboratory (LGE), has been studying the Witches' Broom Disease (WBD) of cacao (Theobroma cacao), which is caused by the basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa. Recently, 54 RNA-seq libraries of this plant-pathogen interaction were sequenced by our group in order to help in the elucidation of the complex biology of the disease. Thus, this work aims to generate information about the transcription profile of M. perniciosa and T. cacao during the Witches' Broom Disease (WBD). The results are divided into three main sections, the first is an analysis of alignment and gene expression under the conditions and sampled tissues. In the second section, we analyze the initial stage of the disease, known as green broom, where through differential expression analysis we could identify genes related to mechanisms of interaction between cacao and the fungus M. perniciosa. In the last section, we developed a strategy to identify possible sequences of long noncoding RNAs (lncRNA) and applied this strategy in the fungus M. perniciosa. In general these data present an important advance in the study of this disease and may be used in future work / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T10:59:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Formighieri_EduardoFernandes_D.pdf: 7946045 bytes, checksum: f2194ed5a131ce1c4510fba4a7bbea5f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O genoma mitocondrial (mtDNA) do fungo Moniliophthora perniciosa foi completamente seqüenciado e contém 109103 pb, com 31% de bases GC, porcentagem menor que a encontrada nas seqüências do genoma nuclear (47%). É o maior genoma mitocondrial de fungos descrito até o momento, e seu tamanho é conseqüência de grande espaço intergênico, que contém diversas ORFs com possibilidade de serem confirmadas como novos genes. Análises computacionais indicam a presença de variação no número de mtDNAs/célula nas diferentes bibliotecas, com tendência significativa de menor número de mtDNAs/célula no grupo de bibliotecas proveniente de culturas submetidas a repetidas repicagens. A maioria dos genes típicos (atp6, atp9, nad1-6, nad4L, cox1-3, cob, sendo a exceção o atp8), todos os rRNAS, tRNAS (foi encontrado pelo menos um para cada aminoácido) e genes das ORFs intrônicas estão orientados no sentido horário. Foram identificados também um gene rps3 e um grupo de ORFs com características semelhantes às dos genes típicos. Surpreendentemente o mtDNA apresenta uma região ocupada por uma estrutura de invertron característica de plasmídeos kalilo-like, integrado de maneira estável ao genoma em todas as variedades do biótipo C, e presente nos demais biótipos testados. Esta seqüência está disponível no GenBank através do número de acesso: AY376688. A outra linha de trabalho foi desenvolvida juntamente com outros bioinformatas do Laboratório de Genômica e Expressão. Foram desenvolvidas ferramentas de mineração e anotação de genes para projetos genoma, sendo os maiores destaques o Gene Projects, que permite mineração e anotação de genes durante o processo de seqüenciamento, e a nova interface de anotação, desenvolvida para otimizar a qualidade e a eficiência da anotação de genes / Abstract: The mitochondrial genome (mtDNA) of the fungus Moniliophthora perniciosa was completely sequenced and it contains 109103 bases pair, with 31% of bases GC, smaller percentage than found in the sequences of the nuclear genome (47%). It is the largest mitochondrial genome of fungus described to the moment, and its size is consequence of great intergenic space, with several ORFs who can be confirmed as new genes. Computational analyses show the presence of variation in the number of mtDNAs / cell in different libraries, with significant tendency of smaller mtDNAs / cell number in group of libraries originating from cultures undergoes to repeatedly reply. Most of the typical genes (atp6, atp9, nad1-6, nad4L, cox1-3, cob, being the exception the atp8), all of the rRNAS, tRNAS (it was found at least one for each amino acid) and genes of the intronic ORFs are guided in the hourly sense. Surprisingly the mtDNA presents one region occupied for a structure of invertron, characteristic of plasmids kalilo-like, integrated in stable way to the genome in all of the varieties of the biotype C, and present in other tested biotypes. This sequence is available in the GenBank through the accession number: AY376688. The other work line was developed together with other bioinformatics of the Genomic and Expression Laboratory. Data mining and annotation of genes tools were developed for projects genome, being the largest prominences the Gene Projects, that allows mining and annotation of genes during the sequencing process, and the new annotation interface, developed to optimize the quality and the efficiency of the annotation of genes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Over the years, there has been much Anthropological inquiry into witchcraft and how it functions in the lives of people. Most of the research conducted in South Africa concerning witchcraft has been carried out amongst black South Africans with very little attention paid to white South Africans. Having come across a group of white, Afrikaans-speaking women who are practicing witches, I decided to investigate how they use their craft in their daily lives to make sense of their past and present. Given that white South Africans have largely escaped anthropological analysis due to privilege, I found no literature pertaining to white, Afrikaans-speaking people being connected to witchcraft. I decided to establish a historical trajectory through the existing literature and then connected my coven to this. I was also given the opportunity to be initiated and the chance to engage in becoming a witch myself. Apart from participant observation, I was able to interview the women and construct detailed life histories which were the primary sources of data that I used for this project. I found that the women primarily use their craft to make sense of their positions as Afrikaans-speaking women in post-apartheid South Africa as well as redefine their connection to nature through their gender and use it to empower themselves. This is an area that warrants much more investigation and as such I will be continuing this project into a PhD in order to explore all that which I did not have the space for in this project. / Mini Dissertation (MA)--University of Pretoria, 2019. / Anthropology and Archaeology / MA / Unrestricted

Alfalfa is the most important forage crop in Utah. It is of particular importance to the Uintah Basin, Utah area where alfalfa hay and seed production are major sources of agricultural income. This crop owes much of its popularity to the fact that it will normally produce large yields of good forage on land which is unsuited to more intensive cultivation. In many cases it is impractical to advocate disease control practices which involve extra labor or expense and as a result most diseases of alfalfa, if controlled at all, are controlled by the use of resistant varieties. During the past few years alfalfa witches' broom has become detrimental in the Uintah Basin area. This disease shortens the length of life of alfalfa stands and reduces the yield. Some diseased stands are killed out in a period of three years. It is difficult and expensive to reestablish alfalfa in this area where water supplies are usually low. Therefore, it is imperative that alfalfa stands remain in production for several years. These problems justify a study to find resistance to alfalfa witches' broom. The objectives of this study are to select varieties of alfalfa which are resistant to alfalfa witches' broom in the Uintah Basin area, to select varieties of alfalfa which are best adapted to the area for high yield per acre, to determine which of a few insects tested are responsible for transmission of alfalfa witches' broom virus, and to determine if certain dodder species (Cuscuta spp.) act as transmission bridges for alfalfa witches' broom.