Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-30T14:39:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO - MARINEIDE SOUZA DA SILVA.pdf: 2429345 bytes, checksum: e0dd6988a96097cdd1e4eb856b6b2faf (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Dengue is currently considered the most important arbovirose. Its main vector is the mosquito Aedes aegypti, present in several regions around the world. The serological diagnosis by means of the NS1 antigen search is the one that has greater applicability, because of easy of execution and the window for detection between the 1st and the 9th day of the onset of symptoms, with a higher frequency until the 5th day. This study aimed to investigate the presence of dengue virus in samples with non-reactive results for the NS1 antigen, assessing if there was a failure in laboratorial diagnosis, or the existence of other arboviruses circulating in the state of Amazonas. Using the RT-qPCR technique, the presence of dengue virus was investigated in 306 serum samples from patients with clinical suspicion of infection. The samples that remained negative were investigated for the presence of the Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Oropouche (OROV) viruses with the same methodology, as well as the presence of IgG and IgM for dengue virus by ELISA. Of the 306 analyzed samples, 17 (5.5%) were positive for DENV, with three sequenced for serotype 4. Thirty-four (10.8%) were positive for ZIKV, one (0.3%) for CHIKV, thirteen 4.2%) for MAYV and nine (2.9%) for OROV. In relation to the NS1 test, all kits evaluated presented 100% agreement in negativity. For the screening of anti-DENV antibodies of the IgG class, of the 306 samples tested 134 (43.8%) had positive results. Regarding the detection of the IgM antibody, different positivities were observed for commercial kits: VIRION (n = 250) 35.6% positive; FOCUS (n = 105) 10.5% positive and PANBIO (N = 80) 20% positive. Our results confirm cases of false negative results for the NS1 tests of three commercial kits, in addition to the circulation of other arboviruses among patients from different municipalities in the state of Amazonas. / A dengue é considerada atualmente a mais importante arbovirose. O seu principal vetor é o mosquito da espécie Aedes aegypti, presente em diversas regiões do mundo. O diagnóstico sorológico por meio da pesquisa do antígeno NS1 é o que tem maior aplicabilidade, pela baixa complexidade na execução e por ser detectado entre o 1º e 9º dia de início dos sintomas, porém com frequência maior até o 5º dia. Esse estudo teve por objetivo principal investigar a presença do vírus dengue em amostras com resultados “Não Reagentes” para o antígeno NS1, avaliando se houve falha no diagnóstico laboratorial, ou a existência de outros arbovírus circulando no estado do Amazonas. Utilizando a técnica de RT-qPCR, pesquisou-se a presença do vírus dengue em 306 amostras de soros de pacientes com suspeita clínica de infecção. As amostras que continuaram negativas foram pesquisadas quanto a presença dos vírus Zika (ZIKV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) e Oropouche (OROV), pela mesma metodologia, bem como foi pesquisada a presença de anticorpos das classes IgG e IgM para o vírus dengue por ELISA. Das 306 amostras analisadas 17 (5,5%) foram positivas para DENV, com três sequenciadas para o sorotipo 4. Trinta e quatro (10,8%) foram positivas para o ZIKV, uma (0,3%) para CHIKV, treze (4,2%) para MAYV e nove (2,9%) para OROV. Em relação ao teste NS1 todos os kits avaliados apresentaram 100% de concordância em negatividade. Para a pesquisa de anticorpos anti-dengue da classe IgG, das 306 amostras testadas 134 (43,8%) tiveram resultados positivos. Em relação à detecção do anticorpo IgM foram observadas diferentes positividades para os kits comerciais: VIRION (n=250) 35,6% positivas; FOCUS (n=105) 10,5% positivas e PANBIO (N=80) 20% positivas. Nossos resultados confirmam casos de resultados falso-negativos, para os testes NS1 de três kits comerciais, além da circulação de outros arbovírus entre os pacientes de diferentes municípios do estado do Amazonas.

Submitted by Taiwany Oliveira (taiwanyrodriguess@gmail.com) on 2018-10-22T14:48:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE DE DOUTORADO LIGIA FERNANDES ABDALLA.pdf: 4835970 bytes, checksum: 41de8abe90eea5b202c2800675761f12 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Roberto Gomes (mrobertosg@gmail.com) on 2018-10-22T15:27:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE DE DOUTORADO LIGIA FERNANDES ABDALLA.pdf: 4835970 bytes, checksum: 41de8abe90eea5b202c2800675761f12 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-23T14:07:04Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE DE DOUTORADO LIGIA FERNANDES ABDALLA.pdf: 4835970 bytes, checksum: 41de8abe90eea5b202c2800675761f12 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-23T14:07:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE DE DOUTORADO LIGIA FERNANDES ABDALLA.pdf: 4835970 bytes, checksum: 41de8abe90eea5b202c2800675761f12 (MD5) Previous issue date: 2018-09-26 / Zika virus (ZIKV) is an emergent arbovirus of the family Flaviviridae and the genus Flavivirus, which until 2007 was restricted to some cases of mild disease in Africa and Asia. In Brazil, it`s suspected that the entry of the virus occurred during the 2013 Confederations Cup and in the first half of 2015, there were already confirmed cases in states in all regions of the country. The Brazilian epidemic revealed that the usually mild and self-limiting infection could be related to neurological disorders. The objectives of this study were to clarify numerous questions regarding ZIKV infection, aiming to contribute to a better understanding of the mechanisms involved in the immunopathogenesis and course of the disease. As a result, the first report of atrial fibrillation in patients with Zika was described and could be considered an atypical manifestation during the virus infection; elevation of proinflammatory cytokines during ZIKV infection was observed; CXCL10 chemokine was identified as a potential biomarker for infection; saliva was characterized as the fluid of choice for the detection of Zika virus in the acute phase of the disease and a logistic regression model for the classification of cases of zika in relation to dengue was set up based on the clinical evaluation. / O Zika virus (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae e do gênero Flavivirus, que até 2007 estava restrito a alguns casos de doença leve na África e na Ásia. No Brasil, suspeita-se que a entrada do vírus tenha se dado durante a Copa das Confederações de 2013 e no primeiro semestre de 2015, já havia casos confirmados em estados de todas as regiões do país. A epidemia brasileira revelou que a infecção geralmente leve e autolimitada poderia estar relacionada à distúrbios neurológicos. Os objetivos deste trabalho era esclarecer inúmeros questionamentos existentes em relação à infecção pelo ZIKV, visando contribuir com uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na imunopatogênese e curso da doença. Como resultados, descreveu-se o primeiro relato de fibrilação atrial em pacientes com Zika, podendo ser considerado uma manifestação atípica durante a infecção pelo vírus; observou-se elevação de citocinas pró-inflamatórias durante a infecção ZIKV; identificou-se a quimiocina CXCL10 como um biomarcador potencial de infecção; caracterizou-se a saliva como fluído de escolha para o detecção do vírus Zika na fase aguda da doença e, montouse um modelo de regressão logística para a classificação de casos de zika em relação à dengue, com base na avaliação clínica.

Background Arboviral diseases are one of the most common causes of acute febrile illness (AFI) and a significant health problem in South America. In Peru, laboratory etiologic identification of these infections occurs in less than 50% of cases, leading to underdiagnoses of important emerging arboviruses. Aim To assess the prevalence of the Dengue (DENV), Oropouche (OROV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Zika (ZIKV) viruses in patients with acute febrile illness from Puerto Maldonado (Peru). Methodology Serum samples were obtained from patients with AFI during January 2016 to March 2016. A total of 139 specimens were analyzed for the presence of DENV, OROV, CHIKV, MAYV, and ZIKV using polymerase chain reaction (PCR). Results CHIKV in 9.4% and OROV in 8.6% were the most prevalent arboviruses, followed by DENV and ZIKV, with a prevalence of 6.5% and 5%, respectively. Among all patients, the most common symptoms accompanying fever were headaches 79.9%, muscle pain 65.5% and joint pain 63.3%. Conclusions During this short 3-month period, 4 arboviruses were detected by PCR, CHIKV and OROV being the most common arboviruses in Puerto Maldonado (Peru). Thus, it is crucial to include OROV detection in the national health surveillance. Furthermore, the etiologic clinical diagnosis of arboviral infections is not possible due to the low specificity of symptoms; therefore an increase of cases confirmed by molecular diagnostic methods will enhance arboviral surveillance in Peru.

Orientador: Sonia Maria Oliani / Coorientador: Jusciele Brogin Moreli / Banca: Estela Maris Andrade Forell Bevilacqua / Banca: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni / Resumo: Introdução: A associação da infecção por Zika vírus (ZIKV) com malformação congênita e sequelas neurológicas trouxe uma preocupação global significativa. Estudos recentes têm mostrado que a infecção viral induz altos níveis de inflamação nas vilosidades placentárias. Neste contexto, a proteína anti-inflamatória anexina 1 (ANXA1) tem sido avaliada especialmente em células de defesa e associada com atividades antiparasitárias em explantes placentários infectados. Embora esses efeitos tenham sido explorados em diversas investigações, suas atividades ainda não estão completamente esclarecidas em placentas infectadas com ZIKV. Objetivos: Avaliar o envolvimento da proteína ANXA1 em placentas de mães infectadas pelo ZIKV. Materiais e métodos: Com o sangue materno e placentas, usando a técnica PCR em tempo real, foi possível classificar três grupos de estudo: (i) Neg/Neg (mãe e placenta negativas para o vírus), (ii) Pos/Neg (mãe infectada com vírus e placenta negativa) e (iii) Pos/Pos (mãe e placenta infectadas com vírus). Os fragmentos placentários foram fixados, incluídos em parafina e analisados para presença do ZIKV (anti-flavivirus 4g2), estruturalmente e para imunomarcações de células trofoblásticas (citoqueratina), mesenquimais e endoteliais (vimentina) e vasos (α-sma). As células inflamatórias foram analisadas por imunofluorescência e os níveis das citocinas IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-8 pelo analisador Multiplex Magpix. A expressão da ANXA1 foi avaliada por... / Abstract: Introduction: The association of Zika virus infection (ZIKV) with congenital malformation and neurological sequelae brought a significant global concern. Recent studies have shown that maternal viral infection induces inflammation in the placental tissue. In this context, the antiinflammatory protein annexin 1 (ANXA1) has been specially related to resolution of inflammation through multiple mechanisms and associated with antiparasitic activity in infected placental explants. Although these effects have been explored in several investigations, its activities have not yet been fully elucidated in placentas infected with ZIKV. Objectives: This study was conducted to evaluate the involvement of ANXA1 in placentas of ZIKV-infected mothers. Methods: With maternal blood and placenta, using the rt-PCR techinique, It was classified three study groups: Neg/Neg (mother and placenta negative for the virus), Pos/Neg (infected mother, but no virus detected in placenta) and Pos/Pos (mother and placenta infected with ZIKV). Placental fragments were fixed, embedded in paraffin and analyzed for the presence of ZIKV (anti-flavivirus 4g2), structurally, and immunohistochemistry for trophoblast (cytokeratin), mesenchymal and endothelial cells (vimentin) and arterial vessels (α-sma). Inflammatory cells were analyzed by immunofluorescence (CD-3, CD-15 and CD45 positive cells) and levels of the cytokines IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-8 by the Magpix Multiplex analyzer. ANXA1 expression was assessed ... / Mestre

Antecedentes:La infección por arbovirus es una de las causas más comunes de síndrome febril agudo y un problema de salud emergente en América del Sur. En el Perú, el número de casos de dengue se ha duplicado en el último año; sin embargo, menos del 50% de los síndromes febriles agudos fueron confirmados por laboratorio, lo que conduce a un diagnóstico limitado de otros arbovirus importantes. Objetivo:Evaluar la frecuencia de Dengue (DENV), Oropuche (OROV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Zika ZIKV) en pacientes con síndrome febril agudo de Puerto Maldonado, Perú. Metodología:Se obtuvieron muestras de pacientes con síndrome febril agudo entre enero de 2016 y marzo de 2016. Se recolectaron un total de 139 especímenes y se evaluó la presencia de DENV, OROV, CHIKV, MAYV y ZIKV con la técnica de RT-PCR. Resultados: Los arbovirus de mayor frecuencia fueron CHIKV 9.35% (13/139) y OROV 8.63% (12/139), seguidos de DENV (6.47%) y ZIKV (5.04%). Entre todos los pacientes, los síntomas más comunes que acompañaron la fiebre fueron: Cefalea 79.86% (111/139), mialgias 65.47% (91/139) y artralgias 63.31% (88/139). Conclusiones:CHIKV y OROV fueron los arbovirus más frecuentes en nuestro estudio. Es crucial mejorar la vigilancia de los arbovirus para poder entender el papel de estos patógenos en el Perú. La PCR representa una prueba confiable para la vigilancia de arbovirus y debe ser considerada como el método más adecuado para la confirmación por laboratorio en el Perú. / Background:Arboviruses are one of the most common causes of acute febrile illness and an emerging health problem in South America. In Peru, the number of Dengue cases have double in the last year; however, less than 50% of acute febrile illnessare laboratory confirmed leading to an underdiagnoses of other important arboviruses. Aim:To assess the frequency of Dengue (DENV), Oropuche (OROV), Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV) and Zika ZIKV) in patients with acute febrile illness from Puerto Maldonado, Peru. Methodology: Samples were obtained from patients with acute febrile illness during January 2016 to March 2016.A total of 139 specimens were collected and assessed for the presence of DENV, OROV, CHIKV, MAYV and ZIKV via RT-PCR. Results: CHIKV in 9.35% (13/139) and OROV in 8.63% (12/139) were the most prevalent arboviruses, followed by DENV (6.47%) and ZIKV (5.04%). Among all patients, the most common symptoms accompanying fever were: Headache 79.86% (111/139), Muscle pain 65.47% (91/139) and Joint pain 63.31% (88/139). Conclusions: CHIKV and OROV were the most common arboviruses in our study. To enhance arbovirus surveillance is crucial to understand the role of these pathogens in Peru. PCR represents a reliable test for arboviral surveillance and should be considered as the preferred method for laboratory confirmation in Peru. / Tesis

<p>A successful flaviviral life cycle involves several coordinated events between viral proteins and host factors. The polyprotein processing at the surface of the ER membrane results in the formation of several replication proteins that bring about changes in the ER membrane making it permissive for viral genome amplification. Non-structural proteins 4A (NS4A) and non-structural protein 4B (NS4B) are two of the most important integral membrane proteins of DENV that are essential part of the viral replicase complex. The cleavage at NS4A-2K-NS4B is temporally and spatially regulated. The cleavage at the N-terminal of 2K is carried out by viral NS2B/3 protease while host signalase cleaves on the C-terminal side at the ER lumen to give rise to a mature NS4B protein. This thesis primarily focuses on demonstrating the function of 2K as an independent peptide rather than simply a signal sequence, and the role 2K plays, when present as 2K-NS4B vs NS4B. Moreover, this thesis has attempted to explore the function of transmembrane domains (TMDs) in replication separating them from their membrane anchor function. This thesis will also describe the development of a ZIKV replicon and its use in screening small molecule inhibitors in the last chapter.</p><p>In Chapter 2 of the thesis, we established 2K as an independent, information carrying peptide rather than just a signal peptide. A strategy involving chimeric virus generation and mutational analysis supported the notion that 2K is rather unique and important for viral replication and infectious particle production. Using an interserotypic 2K chimeric virus, it was established that the 2Ks of DENV are serotype specific, however, they are interchangeable with a huge fitness cost in infectious particle production. We further showed that individual amino acid residues towards then end of h-region and C-terminus of the 2K peptide affect viral replication and infectious particle production. Moreover, it was shown that the 2K peptide consists of a highly conserved ‘DNQL’ region at its N-terminal that plays an important role in viral replication.</p><p>Chapter 3 details the mechanistic aspect of the effects observed in interserotypic 2K chimeric viruses. The interserotypic chimeric viruses were comparable to wild type in replication, however, they were deficient in infectious particle production early in the life cycle. The major change to be noted in the chimeric viruses was the absence of signalase cleavage at the 2K-NS4B junction. We demonstrated that in a virus infected system, 2K-NS4B and NS4B populations are always present which led us to look for any specific functions of the cleaved vs uncleaved 2K-NS4B protein. Using a transcomplementation system where NS4B was presented in the absence of 2K, we showed that particle production can be rescued in the interserotypic 2K chimeric viruses. It was further concluded using NS4B truncations that the property of NS4B to rescue particle production was concentrated in the ER luminal loop. Further, alanine scanning mutagenesis of the conserved residues of ER loop resulted in pinpointing T198 and its involvement in the early stages of viral packaging.</p><p>Chapter 4 examined the role of TMDs of NS4A and NS4B and attempted to define their roles separately from their membrane anchoring functions. Several interserotypic TMD chimeric viruses were generated to address the function of these domains. We concluded that TMD1 and TMD3 of NS4A could be replaced with partial success across the DENV serotypes, whereas, TMD2 was serotype specific. The specificity of TMD2 of NS4A is not contributed by a single amino acid and should be a function of the secondary structure formed by TMD2 as it sits on the inner leaflet of the ER membrane. We demonstrated the variable roles different TMDs of NS4B play in viral replication using a similar strategy of reverse genetics of chimeric viruses. TMD1 of NS4B was replaceable with no to minimal effect, whereas, the remaining four showed variable effect upon substitution. More importantly, we demonstrated how the reorientation of TMD5 of NS4B post NS2B/3 cleavage might vary in different serotypes of DENV using revertant virus obtained from the TMD5 interserotypic chimera. Analysis of interserotypic cytosolic and ER luminal loop chimeras of NS4B pointed to functional conservation of the cytosolic loop between DENV-2 and DENV-3, whereas, the remaining cytosolic loops and the ER loops showed variable level of defects upon substitution, suggesting their functions in serotype-dependent manner.</p><p>Chapter 5 describes the construction and characterization of a ZIKV replicon system and use of it to screen several small molecule inhibitors of the flaviviruses MTase. Several small molecule inhibitors of flavivirus N-7-MTase were designed/synthesized in Dr. Arun K Ghosh’s lab which would target the extra pocket unique to the flavivirus SAM-binding site. We analyzed the docking of a set of these compounds into MTase domain of NS5 of ZIKV, DENV and YFV and screened them for their ability to inhibit replication of ZIKV, DENV and YFV. A huge variation in the activity profile of these compounds were observed against different flaviviruses even though these compounds were targeted against the highly conserved MTase domain of flavivirus NS5. GRL-002- and GRL-004-16-MT specifically inhibited ZIKV replication with low micromolar IC₅₀ value, while these compounds showed little to no effect on DENV and YFV.<b> </b>On the other hand, compounds GRL-007-, GRL-0012- and GRL-0015-16-MT demonstrated a dual inhibitory effect against DENV and YFV albeit the CC₅₀ values of the GRL-012 and GRL-015 were concerning. Compounds GRL-007-16-MT showed broad spectrum activity against ZIKV, DENV and YFV even though it was slightly cytotoxic to Vero cells. Moreover, GRL-002-16 was inhibitory to YFV while ineffective against DENV, whereas, GRL-016-16 had the opposite effect. Our results reveal the differential efficacies of the small molecule inhibitors targeting N-7-MTase. The experimental data suggests these compounds have different cytotoxicities in different cell lines and the compounds act in a virus-specific way. Nonetheless, we were able to shortlist some potent compounds for future modifications.</p>

Das Dengue-Virus ist ein, in tropischen und subtropischen Regionen endemisches, humanpathogenes Virus, welches durch Moskitos des Genus Aedes übertragen wird. Jährlich werden ca. 95 Millionen der Infektionen klinisch manifestiert, wobei 1 % davon in der schwersten Form des Dengue-hämorrhagischen Fiebers verlaufen. Eine schnelle und einfache Diagnostik spielt dabei für die Behandlung sowie für epidemiologische Studien eine wichtige Rolle. Die serologische Diagnostik flaviviraler Infektionen im Allgemeinen und DENV im Speziellen, ist durch die Vielzahl kreuzreaktiver und infektionsverstärkender Antikörper hoch komplex. Die starke Co-Zirkulation verschiedener Flaviviren und deren ähnliche klinische Symptomatik erschwert zusätzlich die spezifische Diagnostik. Seit 2015 führte insbesondere der massive Vormarsch von ZIKV‑Infektionen in DENV-endemischen Gebieten Südamerikas zu einer noch komplexeren Sachlage, da die serologische Unterscheidung beider Infektionen kaum möglich war. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden daher rekombinante virale E-Proteine exprimiert und charakterisiert, welche die Spezifität serologischer DENV- und ZIKV‑Tests erhöhen sollen. E-Proteine sind stark immunogen, da sie die Virusoberfläche dominieren. Jedoch ist deren hochkonservierte DII-FL Region gleichzeitig das Ziel von einem Großteil kreuzreaktiver Antikörper. Studien mit WNV und JEV haben zuvor belegt, dass Mutationen in diesem Sequenzbereich, die Kreuzreaktivität mit heterologen Flaviviren herabsenken können. Deshalb wurden vier Punktmutationen in die DII-FL Region von DENV 1-4 und ZIKV E (Equad) eingefügt und in einem Insektentenzellen- basierten System exprimiert, aus dem Kulturüberstand aufgereinigt und mit Humanseren in IgM- und IgG-ELISAs untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden in zwei Publikationen dargelegt, welche die Grundlage für diese Promotionsschrift darstellen.

Background: The mosquito Aedes aegypti has long been a vector for human illness in the Southeastern United States. In the past, it has been responsible for outbreaks of dengue, chikungunya, and yellow fever and, very recently, the Zika virus that has been introduced to the region. Multiple studies have modeled the geographic distribution of Ae. aegypti as a function of climate factors; however, this ignores the importance of humans to the anthropophilic biter. Furthermore, Ae. aegypti thrives in areas where humans have created standing water sites, such as water storage containers and trash. As models are developed to examine the potential impact of climate change, it becomes increasingly important to include the most comprehensive set of predictors possible. Results: This study uses Maxent, a species distribution model, to evaluate the effects of adding poverty and population density to climate-only models. Performance was evaluated through model fit statistics, such as AUC, omission, and commission, as well as individual variable contributions and response curves. Models which included both population density and poverty exhibited better predictive power and produced more precise distribution maps. Furthermore, the two human population characteristics accounted for much of the model contribution-more so than climate variables. Conclusions: Modeling mosquito distributions without accounting for their dependence on local human populations may miss factors that are very important to niche realization and subsequent risk of infection for humans. Further research is needed to determine if additional human characteristics should be evaluated for model inclusion.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit zwei Aspekten der serologischen Forschung am Zika-Virus (ZIKV). Im ersten Teil wurden ZIKV NS1 und ZIKV Equad in ihrer Eignung als Antigene für serologische Assays zur spezifischen Detektion der ZIKV Infektion in Abgrenzung zu Infektionen mit anderen Flaviviren untersucht. Der zweite Teil vergleicht zwei Methoden zur Expression von ZIKV NS1: Drosophila S2 Zellen und in E. coli Bakterien. ZIKV zog 2014-2016 bei einem Ausbruch in Brasilien große Aufmerksamkeit auf sich, da Zusammenhänge mit einerseits gehäuft auftretenden Mikrozephaliefällen bei Infektionen in der Schwangerschaft und andererseits schweren neurologischen Komplikationen wie dem Guillain-Barré-Syndrom hergestellt wurden. ZIKV ko-zirkuliert mit anderen Flaviviren wie dem West-Nil Virus (WNV) und dem Dengue Virus (DENV). Da viele Infektionen mit Flaviviren asymptomatisch verlaufen oder nur mit unspezifischen Symptomen einhergehen, ist eine sichere labordiagnostische Unterscheidung von hoher Relevanz. Die Flavivirus-Diagnostik basiert dabei hauptsächlich auf zwei Methoden: dem direkten Virusnachweis aus Blut oder Urin (bis zu 14 Tage nach Symptomauftritt möglich) mithilfe von PCR und dem serologischen Nachweis von Antikörpern. Hohe strukturelle Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Flaviviren wie ZIKV und DENV, welche zum Auftreten kreuzreaktiver Antikörper führen, sorgen dafür, dass die spezifische Serologie bisher eine Herausforderung darstellt. Ein häufig verwendetes Antigen in der serologischen Flavivirus-Diagnostik ist das Envelope-Protein (E-Protein). Dieses ist bei der ZIKV-Diagnostik aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit mit den E-Proteinen anderer Flaviviren Ziel kreuzreaktiver Antikörper. Besonders eine Struktur, die Fusion-Loop Sequenz, ist hoch konserviert. Das Auftreten kreuzreaktiver Antikörper erschwert eine spezifische Diagnostik. Um die mangelhafte Spezifität der serologischen Tests zu verbessern, wurden zwei Antigene entwickelt. Ein Antigen basiert auf dem Nicht-Struktur-Protein 1 (NS1), ein anderes auf einer E-Protein-Mutante mit vier Aminosäureninsertionen in der Fusion-Loop-Sequenz. ZIKV NS1 zeigte bisher in zwei Studien durch Huzly et al. (2016) und Steinhagen et al. (2016) eine hohe Spezifität. Das modifizierte E-Protein konnte bereits bei WNV und DENV die serologische Spezifität verbessern. Diese beiden Antigene wurden in der vorliegenden Arbeit mit einem Panel aus Seren von Infektionen mit ZIKV, DENV, WNV und Tick-borne encephalitis Virus (TBEV) getestet. Als Referenzgruppe diente eine Reihe Flavivirus-negativer Seren. Nach Klonierung, Synthese und Aufreinigung des NS1 Proteins wurde dieses sowie das ZIKV Equad mit den Seren in IgM und IgG Assays getestet. Aus den Ergebnissen dieser Tests wurden für beide Proteine Sensitivität und Spezifität ermittelt, anschließend wurden beide Antigene verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass ZIKV NS1 statistisch signifikant im IgM- und IgG-Assay zwischen ZIKV und anderen Flavivirus-positiven Seren unterscheiden kann (p<0,05). Diese Unterscheidung war bei ZIKV Equad im IgG Assay zwischen ZIKV- und DENV-positiven Seren statistisch signifikant. Nach Ermittlung eines ROC-Cut-Offs war ZIKV Equad dem ZIKV NS1 in Hinblick auf Sensitivität (IgM: NS1 100%, Equad 86%; IgG: NS1, Equad 100%) und Spezifität (IgM: NS1 90%, Equad 85%; IgG: NS1 97% Equad 73%) jedoch unterlegen. Die Spezifität von ZIKV NS1 zu DENV positiven Seren ist mit 89% bereits gut. Dennoch zeigt sich anhand der hohen Signale zweier DENV positiver Seren, dass auch ZIKV NS1 Ziel kreuzreaktiver Antikörper ist. Diese Beobachtung wird durch die Studien von Chang et al. (2017) und Freire et al. (2017) bestärkt, welche ZIKV NS1 mit bioinformatischen Methoden untersuchten und so durch Vergleich mit DENV NS1 auf das Vorhandensein kreuzreaktiver Epitope schlossen. Für ZIKV Equad konnte von Rockstroh et al. (2018) durch einen Kompetitionsassay mit DENV Equad eine deutliche Verbesserung der Spezifität erreicht werden, die eine nahezu sichere Abgrenzung zu DENV ermöglicht. Daraus folgend könnte ein analog durchgeführter Kompetitionsassay mit ZIKV und DENV NS1 ebenfalls eine Verbesserung der Spezifität bringen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Verfahren zur Synthese des ZIKV NS1 Proteins verglichen. Das im ersten Teil verwendete Protein wurde in Drosophila S2 Zellkulturen hergestellt. Eine sehr weit verbreitete Methode stellt die Synthese in E. coli Bakterien dar. Diese hat den Vorteil, dass mit wenig Aufwand, kostengünstig und in kurzen Zeitabschnitten eine große Proteinmenge synthetisiert werden kann. Sie hat im Vergleich zu eukaryontischen Zellkulturen wie der S2 Zelllinie den Nachteil, dass E.coli das Protein nicht in löslicher, sondern hauptsächlich in aggregierter Form produziert. Das Protein sammelt sich im Zellinneren an. Da das Protein bei der Extraktion denaturiert werden muss, ist im Anschluss eine Rückfaltung notwendig, um es in die korrekte Konformation zu überführen. Die richtige Faltung der Proteine ist in der serologischen Diagnostik besonders wichtig, da viele Antikörper strukturelle Epitope erkennen. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen Vergleich und eine Bewertung der beiden unterschiedlich hergestellten Proteine in Hinblick auf Sensitivität und Spezifität mit einem Panel an ZIKV- und DENV-positiven Seren sowie negativen Seren durchzuführen. Daraus lässt sich ableiten, ob eine Proteinsynthese in E. coli äquivalente Sensitivtäten und Spezifitäten ergeben. Die Ergebnisse zeigen, dass grundsätzlich auch mit dem E. coli synthetisierten NS1 Protein eine spezifische und sensitive ZIKV Diagnostik möglich ist. Die Spezifität in Abgrenzung zu DENV-positiven Seren war allerdings niedriger als bei ZIKV NS1, welches in Insektenzellen synthetisiert wurde. Außerdem ließ sich eine stärkere Hintergrundbindung der negativen Seren messen. Möglicherweise lässt sich dies aber durch eine weitere Aufreinigung durch Größenausschlusschromatographie verringern. Zusammengefasst ergibt sich, dass die ZIKV NS1 Synthese in Drosophila S2 Zellen im Hinblick auf die Spezifität der Synthese in E. coli überlegen ist. Aufgrund der geringen Anzahl untersuchter Seren ist die Beobachtung aber statistisch nicht signifikant und sollte mit einem größeren Serumpanel auch unter Einbeziehung von Seren mit Infektionen durch andere Flaviviren verifiziert werden.:1. Abkürzungsverzeichnis 5 2. Einleitung 7 2.1 Klinik & Historie 7 2.2 Epidemiologie der Flaviviren 8 2.3 Transmission 9 2.4 Struktur 9 2.5 Serologische Immunreaktion 11 2.6 Diagnostik 13 Direkter Virusnachweis 13 Serologischer Nachweis 13 2.7 Expression rekombinanter Proteine 14 3. Fragestellung 15 4. Material 17 4.1 Allgemeine Materialien: 17 4.2 Zellkulturmaterialen 17 4.3 Chemikalien 18 4.4 Kits 18 4.5 Puffer 19 4.6 Molekularbiologische Materialien 19 4.7 Antikörper 19 4.8 Geräte 20 4.9 DNA Sequenzen der Proteine 20 4.10 Primer 21 4.11 Verwendete Vektoren 21 4.12 Patient*innenproben 22 5. Methoden 23 5.1 Molekularbiologische Methoden 23 Klonierung 23 Transformation 26 Transfektion Drosophila S2 Zellen durch Calcium-Phosphat-Präzipitation 26 Analyse- und Messmethoden Molekularbiologie 28 Extraktions- und Reinigungsmethoden Molekularbiologie 28 5.2 Mikrobiologische Methoden 28 Bakterienkultivierung 28 Insektenzell-Kultivierung 28 Proteinexpression in Bakterienzellen 29 Proteinexpression in Insektenzellen 29 5.3 Proteinbiochemische Methoden 30 Aufreinigung der Insektenzell-exprimierten Proteine 30 Aufreinigung des E. coli-exprimierten ZIKV NS1 31 Proteinrückfaltung 32 Bicinchoninic Acid (BCA) Assay 32 Bradford Assay 33 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 34 Western Blot 36 5.4 Immunologische Methoden 37 Antikörperfärbung des Western Blots 37 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 37 5.5 Statistische Methoden 38 Mann-Whitney-Test 38 Bestimmung der Cut-Off Werte mithilfe einer Receiver-Operating Curve 39 Ermittlung von Sensitivität und Spezifität 39 6. Ergebnisse 40 6.1 Vergleich ZIKV Equad und ZIKV NS1 40 Insektenzell-Expression von ZIKV NS1 40 IgM Assays 48 IgG Assays 54 6.2 Vergleich der Expression von ZIKV NS1 in Insektenzellen und in E. coli 59 ZIKV NS1 Expression in E. coli 59 Vergleich der Rückfaltung des NS1 Protein vor und nach PBS Dialyse 64 Vergleich der NS1 Expression durch SDS PAGE 66 Vergleichender ELISA der ZIKV NS1 Insektenzell-Expression mit der E. coli-Expression 67 7. Diskussion 69 7.1 Vergleich ZIKV NS1 und ZIKV Equad 69 Ausblick 73 7.2 Vergleich der ZIKV NS1 Expressionsmethoden 73 Ausblick 74 8. Zusammenfassung der Arbeit 75 9. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 78 10. Danksagung 79 11. Abbildungsverzeichnis 80 12. Tabellenverzeichnis 81 13. Quellenverzeichnis 82

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid und ZIKV-Kapsid selbst geeignete Biomarker für den Nachweis einer ZIKV-Infektion sind. Sie kann damit als erste Phase einer Studie zur Entwicklung neuer ZIKV-Diagnostika angesehen werden. Der Aufbau, das klinische Erscheinungsbild, die Epidemiologie und der Nachweis von ZIKV, bzw. einer ZIKV-Infektion, wurden erörtert. Die Möglichkeiten und Limitationen aktueller ZIKV-Diagnostika wurden beschrieben, insbesondere hinsichtlich der Spezifität. Durch Analyse des Genoms von ZIKV und anderen Flaviviren wurde gezeigt, dass die Aminoäuresequenzidentität zwischen den einzelnen Flaviviren für flavivirales Kapsid geringer ist als für andere Bestandteile und potenzielle Antigene von Flaviviren. Relevant ist insbesondere die Abgrenzung zu DENV, da eine akute oder abgelaufene DENV-Infektion eine häufige Ursache von Kreuzreaktivität beim Nachweis einer ZIKV-Infektion darstellt. Mittels webserverbasierten In-silico-Analysen konnten immunogene Regionen innerhalb des ZIKV-Kapsid-Proteins kartiert und mit den immunogenen Regionen, welche für ZIKV-Kapsid anderer Flaviviren In-silico oder experimentell ermittelt wurden, verglichen werden. Auf Basis dieser Analysen war die Erwartung, dass bei einer ZIKV-Infektion humane Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gebildet werden, welche sich in ihren Paratopen von Antikörpern, die gegen Kapsid-Proteine anderer Flaviviren gebildet werden, unterscheiden. Der Umfang der humanen Antikörperantwort auf ZIKV-Kapsid wurde in dieser Arbeit anschließend untersucht. Dazu wurde das Antigen ZIKV-Kapsid eines ZIKV-Stamms aus der afrikanischen Linie (hier: Stamm MR766) rekombinant hergestellt. Rekombinantes ZIKV-Kapsid eines Stammes der asiatischen Linie (hier: Stamm Z1106033) wurde erworben. In 11 humanen Seren und einem Pool-Serum (WHO-Referenzserum) wurde versucht Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper mittels ELISAs und Western Blots nachzuweisen. Es fanden sich keine bis schwache Hinweise auf das Vorhandensein von Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern in diesen Seren. Im direkten Vergleich mit 10 Seren von ZIKV-negativen Blutspendern zeigten sich für die Seren des ZIKV-Serumpanels keine höheren ELISA-Extinktionswerte. Dies galt sowohl für den Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der afrikanischen Linie als auch beim Einsatz von ZIKV-Kapsid des Stammes der asiatischen Linie. Im Sinn der Ermittlung der Paralleltestreliabilität fand sich für Anti-ZIKV-Kapsid-IgG in einer Regressionsanalyse ein schwacher linearer Zusammenhang zu Messwerten eines gut validierten Referenztests, dem ZIKV-NS1-ELISA der Firma Euroimmun. Dies ist ein schwacher Hinweis auf die postinfektiöse Bildung von humanen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörpern. Obwohl der lineare Zusammenhang signifikant war, ist die Aussagekraft dieses Ergebnisses eingeschränkt. Es fanden sich Hinweise auf unspezifische, im Rahmen dieser Arbeit nicht vollständig identifizierte, Einflüsse auf die Testergebnisse der eigenen Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs. Es ist vorstellbar, dass der gefundene lineare Zusammenhang zum Referenztest teilweise durch diese unspezifischen Einflüsse, im Sinn von Kovariablen, verursacht wird. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper-ELISAs zeigten Hinweise für falsch-positive Messergebnisse bei der Testung von fünf DENV-positiven Seren. Mit Hilfe von Western Blots, welche verglichen mit ELISAs als spezifischer gelten, konnten in Seren des ZIKV-Serumpanels keine ZIKV-Kapsid-spezifischen Antikörper nachgewiesen werden. Auch Antikörper aus Seren von ZIKV-negativen Blutspendern und IgG-Antikörper aus gereinigten IgG-Antikörper-Lösungen verursachten positive und somit unspezifische Testergebnisse (Banden). Eine mögliche Erklärung dafür liegt in der hohen Hydrophobizität von ZIKV-Kapsid, was für die Anlagerung nichtspezifischer humaner Antikörper sorgen könnte. Es ist möglich diese Arbeit in zwei Teile zu unterteilen, wobei sich der erste Teil vor allem dem Nachweis von humanen Antikörpern gegen ZIKV-Kapsid widmet und der Nachweis von ZIKV-Kapsid in Serum von Infizierten den zweiten Teil darstellt. Für den Nachweis des Antigens wurden polyklonale und monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch Immunisierung von Mäusen mit ZIKV-Kapsid und anschließendem Einsatz der Hybridomtechnik konnten durch Dr. Sven Reiche (Friedrich-Löffler-Institut) und Prof. Christian Jassoy vier monoklonale Antikörper gegen ZIKV-Kapsid gewonnen werden. Diese Antikörper wurden in dieser Arbeit weiter charakterisiert. Sie zeigten sich als geeignet und spezifisch beim Nachweis von ZIKV-infizierten Vero-Zellen durch Immunfluoreszenzfärbungen. Durch Kompetitionstests hatte sich zuvor bereits gezeigt, dass alle Antikörper an dasselbe, oder mindestens nahe beieinander liegende Epitope binden. Da sie sich somit bei Einsatz in einem Sandwich-ELISA zum Nachweis von ZIKV-Kapsid als Antigen verdrängen würden, wurden zwei polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper erworben. Ein Sandwich-ELISA, der polyklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Fängerantikörper und monoklonale Anti-ZIKV-Kapsid-Antikörper als Detektionsantikörper nutzt, konnte erfolgreich zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in verschiedenen Lösungen, u. a. nativem ZIKV-Kapsid in Zellkulturüberstand, eingesetzt werden. Der so aufgebaute Antigen-ELISA erreichte, abhängig von der Kombination an Antikörper und Antigen, eine untere Nachweisgrenze zwischen 2 bis 345 ng/ml. Um zum Nachweis von ZIKV-Kapsid in humanem Serum eines ZIKV-infizierten Patienten eingesetzt werden zu können, müsste seine Sensitivität um etwa zwei bis drei Logstufen steigen. Möglichkeiten dazu wurden diskutiert.:1 Inhaltsverzeichnis 2 2 Abkürzungsverzeichnis 7 3 Einführung 10 4 Aufgabenstellung 47 5 Materialien und Methoden 49 6 Ergebnisse 97 7 Diskussion 131 8 Zusammenfassung 156 9 Literaturverzeichnis 158 10 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 182 11 Anlagen 187