As vias suprabulbares assim como núcleos bulbares são de vital importância na modulação cardiovascular. As informações aferentes que chegam ao NTS ascendem a áreas suprabulbares por neurônios noradrenérgicos (NORérgicos) projetando-se principalmente a neurônios pré-autonômicos do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) em sua maioria ocitocinérgicos (OTérgicos) e vasopressinérgicos (VPérgicos), os quais se projetam a áreas bulbares, fechando um pronto circuito modulatório. É nossa hipótese de trabalho que a hipertensão e/ou o treinamento possam alterar a plasticidade de vias NORérgicas ascendentes as quais, modificando a sinalização aferente, desencadeariam respostas plásticas e funcionais nos neurônios pré-autonômicos do PVN, alterando a modulação cardiovascular nestas situações. Objetivo: estudar o funcionamento da alça suprabulbar de modulação autonômica, avaliando os efeitos sequenciais da hipertensão e do treinamento sobre a sinalização NORérgica ascendente e sobre a plasticidade/atividade de neurônios OTérgicos e VPérgicos do PVN que se projetam a áreas bulbares de controle cardiovascular. Material e Métodos: Protocolo I - Ratos Wistar adultos foram submetidos a T de baixa intensidade (50-60% da capacidade máxima, 5 dias/semana, 1h/dia) ou foram mantidos sendentários (S) por 8 semanas. Após registros da hemodinâmica basal nas semanas 0 (S0=T0), 1 (T1), 2 (T2), 4 (T4) e 8 (T8 e S8) [protocolo Análise Temporal do Treinamento], após 8 semanas de T ou S [para protocolo de lesão seletiva dos neurônios NORérgicos ascendentes pela saporina], e, após 12 semanas de T ou S [para os protocolos SHAM & DAS] os ratos foram eutanasiados para perfusão e fixação do encéfalo. Cortes (30 &um;m) do PVN foram processados para imuno-histoquímica de dupla marcação para OT e dopamina beta-hidroxilase (DBH); imagens foram adquiridas pelo microscópio de fluorescência e confocal e analizadas pelo ImageJ e pelo Imaris, respectivamente. Protocolo II - SHR e WKY (4 semanas de idade no início dos protocolos) foram mantidos sedentários (S) por 8 semanas. Nas semanas experimentais 0, 1, 2, 4 e 8 avaliamos os parâmetros funcionais (valores basais PA e FC) e a imunoistoquímica para VP e DBH; em outro protocolo, realizamos cirurgia Sham ou DAS em animais SHR e Wistar de 41 dias e, após a 13ª semana realizamos estudos funcionais e a análise imunoistoquímica para DBH e VP. Resultados: S determinou no PVN diminuição idade-dependente da OTir em todos os subnúcleos magnocelular (mg), dorsal cap (dc), ventromedial (vm) e posterior (Po), sem alterações significativas de DBHir, e e sem alteração de OTir em aréas bulbares, como DMV, NTS, BVLc e BVLr. T induziu aumento a partir de T2 da síntese de DBH no NTS caudal, intermediário e BVLc, e o T induziu uma diminuição da de DBH no BVLr. No PVNvm e Po houve pronto aumento da OTir em T2 vs S0, e DBHir em T2 vs S0, e aumento de botões sinápticos NORérgicos em neurônios OTérgicos, e bradicardia de repouso entre T4 e T8, sem alterar a pressão arterial. A remoção dos barorreceptores diminuiu a densidade das projeções OTérgica no NTS intermediário, BVLr e no PVN mg, dc, vm e Po, além disso a desnervação sino-aórtica bloqueiou todos os efeitos induzidos pelo treinamento, como o aumento de DBHir no NTS caudal e intermediário, no caudal e rostral VLM e em todo PVN (mg, dc, vm e Po) e impediu o aumento de OTir em ambas as aréas do bulbo quando comparamos DAS -T vs. SHAM-T. No protocolo de saporina, a marcada redução das projeções NORérgicas induziu um significativa queda na síntese de OT em todo o PVN medial e posterior, e o T não foi capaz em aumentar a OTir. Em áreas bulbares, observamos que a DBHx induziu redução na DBHir e de neurônios NORérgicos no NTS caudal e intermediário e BVLc, porém não houve alteração no BVLr em animais S. No grupo DBHx-T houve aumento na síntese proteíca de DBH em todo o bulbo, com exceção do BVLr. Houve uma marcada redução das projeções Otérgicas em todo bulbo, mas não houve alteração da OTir em DBHx, e não foi observado bradicardia de repouso. No protocolo II, WKY e SHR, de 28 dias, possuem PA semelhantes, qual aumentou a partir de S2 apenas em SHR. Animais SHR em fase pré-hipertensiva já possuem FC aumentada, comparado com os WKY, permanecendo com valores superiores até o final do protocolo, em ambas as linhagens houve uma diminuição da FC basal idade depende. Com a técnica de imunoistoquímica de fluorescência, observamos que a VPir é maior em SHR (vs. WKY) durante as 8 semanas de avaliação apenas no PVNmg, no PVNvm e posterior o conteúdo de VP é semelhante entre as duas linhagens em S0 (4 semanas de vida), porém há um aumento significativo e progressivo a partir da S1, apenas em animais SHR. Com os experimentos DAS, observamos a eficácia da cirurgia da remoção dos barorreceptores, devido a ausência da resposta reflexa bradicardica e taquicardia em animais DAS. A DASimpediu o desenvolvimento da hipertensão em animais SHR, assim como houve um bloqueio do aumento de VP em todo PVN medial (mg, vm e dc) e PVN posterior. Conclusão: A observação de que a instalação da bradicardia de repouso (a partir de T4) ocorria após o aumento da densidade de neurônios OTérgicos do PVN que se projetam ao complexo solitário-vagal sugere que alterações induzidas pelo T no controle autonômico do coração são dependentes da maior modulação OTérgica ao complexo solitário-vagal desencadeado pela sinalização NORérgica ascendente. O bloqueio destes efeitos sugere ainda que a sinalização carreada pelos barorreceptores e quimirreceptores periféricos é um fator decisivo em desencadear os efeitos benéficos do T ao sistema cardiovascular. Podemos concluir também que o aumento da PA é acompanhado pelo aumento do conteúdo de VP em áreas que contém neurônios pré-autonômicos, e que os baro e quimiorreceptores desempenham papel chave no desenvolvimento da hipertensão. / Suprabulbar pathways as well as brainstem nuclei are of vital importance in cardiovascular modulation. The afferent information arriving at the NTS ascends to suprabulbar areas by noradrenergic (NORergic) neurons projecting mainly to ocitocinergics (OTergics) and vasopressinergic (VPergicos) pre-autonomic neurons of the Paraventricular Nucleus of Hypothalamus (PVN), which they project to brainstem areas, closing a modulatory circuit. It is our hypothesis that hypertension and / or training may alter the plasticity of ascending NORergic pathways which, by modifying afferent signaling, would trigger plastic and functional responses in pre-autonomic PVN neurons, altering cardiovascular modulation in these situations. Aim: To study the functioning of suprabulbar pathway in autonomic modulation, evaluating the sequential effects of hypertension and training on ascending NORergic signaling and on the plasticity / activity of OTergic and VPergic neurons projecting to cardiovascular control brainstem areas. Methods: Protocol I -Adult Wistar rats were submitted to training (T) of low intensity (50-60% of the maximum capacity, 5 days / week, 1h / day) or were kept in the sententary (S) for 8 weeks. After recording baseline hemodynamics at weeks 0 (S0 and T0), 1 (T1), 2 (T2), 4 (T4) and 8 (T8 and S8) [Time course protocol]; after 8 weeks of T or S [ for protocol of selective lesion of ascending NORergic neurons by saporin]; and after 12 weeks of T or S [for the SHAM & Sino aortic denervation (SAD) protocols] the rats were euthanized for perfusion and fixation of the brain. Slices (30 m) of the PVN were processed for immunohistochemistry double-labelling for OT and dopamine beta-hydroxylase (DBH); images were acquired by fluorescence and confocal microscopy and analyzed by ImageJ and Imaris, respectively. Protocol II - SHR and WKY (4 weeks old at the beginning of protocols) were kept sedentary (S) for 8 weeks. In the experimental weeks 0, 1, 2, 4, 8 we evaluated the functional [parameters baseline arterial pressure (AP) and heart rate (HR)] and immunohistochemistry for VP and DBH; in another protocol, we performed Sham or SAD surgery in SHR and Wistar animals of 41 days. After the 13th week we performed functional studies and immunohistochemical analysis for DBH and VP. Results: Within PVN, there was age-dependent reduction in S group of OT immunoreactivity (ir) all magnocellular (mg), dorsal cap (dc), ventromedial (vm) and posterior (Po) subnuclei, without significant changes in DBHir, and a decrease of OTir in brainstem areas such as DMV, caudal and intermediate NTS, CVLM and RVLM. T induced increase from T2 in the synthesis of DBH in the NTS caudal, intermediate and CVLM, and T induced a decrease in DBH in RVLM. In PVNvm and Po, there was a rapid increase of OTir in T2 vs S0, and DBHir in T2 vs S0, an increase of NORergic synaptic boutons in OTergic neurons and resting bradycardia between T4 and T8, without altering blood pressure. Removal of the baroreceptors decreased the density of the OTergic projections in the NTS intermediate, RVLM and in the PVN mg, dc, vm and Po. Furthermore sino-aortic denervation blocked all training-induced effects, such as increased DBHir in the caudal and intermediate NTS, within caudal and rostral VLM and in the whole PVN (mg, dc, vm and Po) and prevented the increase of OTir in both areas of the brainstem when we compared SAD-T vs. SHAM-T. In the saporin protocol, the marked reduction of the NORergic projections induced a significant decrease in OT synthesis throughout the medial and posterior PVN, and the T was not able to increase the OTir. In the S group on the brainstem areas, we observed that DBHx induced reduction in DBHir and NORergic neurons in the caudal and intermediate NTS and CVLM, but there was no change in RVLM. In the DBHx-T group there was an increase in protein synthesis of DBH in the whole brainstem, with the exception of RVLM. There was a marked reduction of the OTergics projections in every brainstem, but there was no change of OTir in DBHx, and there was no resting bradycardia. In protocol II, WKY and SHR, of 28 days, have similar PA, which increased from S2 only in SHR. SHR animals in the prehypertensive phase already have HR increased, compared with WKY, remaining with higher values until the end of the protocol, in both strain there was a decrease in HR baseline age dependent. With the fluorescence immunohistochemistry technique, we observed that VPir is higher in SHR (vs. WKY) during the 8-week evaluation only in PVNmg, in PVNvm and posterior the VP content is similar between the two strains in S0 (4 weeks of life), but there is a significant and progressive increase from S1, only in SHR animals. With the SAD experiments, we observed the efficacy of baroreceptor removal surgery, due to the absence of bradycardic and tachycardia reflex response in SAD animals. SAD prevented the development of hypertension in SHR animals, as well as a blockade of the increase of VP in all medial PVN (mg, vm and dc) and posterior PVN. Conclusion: The observation that the installation of resting bradycardia (from T4) occurred after increasing the density of PVN OTergic neurons projecting to the solitary-vagal complex suggests that T-induced changes in the autonomic control of the heart are dependent of the greater modulation OTergic to the solitary-vagal complex triggered by ascending NORergic signaling. The blockade of these effects also suggests that the signaling carried by the baroreceptors and peripheral chemoreceptors is a decisive factor in triggering the beneficial effects of T on the cardiovascular system. We can also conclude that increased BP is accompanied by increased VP content in areas containing pre-autonomic neurons, and that baro and chemoreceptors play a key role in the development of hypertension.

Vários estudos clínicos e experimentais relatam o aumento das concentrações plasmáticas de vasopressina (AVP) na fase inicial da sepse, como tentativa de restabelecer a pressão sanguínea que nesta fase começa a diminuir. Porém em uma fase mais tardia da doença, as concentrações do hormônio estão reduzidas mesmo sob um quadro de hipotensão progressiva, um dos principais estímulos para aumento da secreção deste hormônio. Este padrão de secreção hormonal alterada também parece ocorrer com o outro hormônio neurohipofisário, ocitocina (OT). O objetivo deste trabalho foi analisar a secreção dos hormônios AVP e OT, após estímulos osmótico e hipovolêmico em animais sobreviventes à sepse. A sepse foi induzida pelo método de ligação cecal e punção (CLP) (1 perfuração com agulha 14G) e os animais observados por 10 dias. Os sobreviventes foram submetidos à estímulo osmótico por desidratação (retirada de água para beber da gaiola) por dois dias, ou hipovolêmico por injeção intraperitoneal (i.p) de Polietileno glicol (PEG) (PEG-4000, 200mg/ml de PBS) por 90 minutos. Os animais controles foram hidratados ou receberam injeção intraperitoneal de PBS 0,01M. Após os estímulos, os animais foram decapitados para coleta de sangue e neurohipófise, para as análises de hematócrito, sódio sérico, osmolalidade plasmática, e dosagem hormonal de AVP e OT plasmática e neurohipofisária. Resultados: Os animais sobreviventes à sepse mantiveram a capacidade de responder aos estímulos com relação à secreção de AVP. Porém estes animais apresentaram uma secreção diminuída de OT após desidratação embora nenhuma alteração de secreção aparente ao estímulo volêmico. Conclusão: Animais sobreviventes à sepse apresentam alterações no padrão de resposta hormonal do eixo hipotálamoneurohipofisário ao estímulo osmótico sem aparente alteração quando o estímulo é volêmico, sugerindo que seus osmorreceptores encontram-se alterados / Many clinical and experimental studies reported the increase of plasma vasopressin (AVP) concentration in the early phase of sepsis, as an attempt to restore blood pressure that begins to decrease at this stage. However, in a later stage of the disease, the hormone concentrations are reduced even under a state of progressive hypotension, one of the major stimulus for the increase of secretion of this hormone. This pattern of impaired hormonal secretion during sepsis also seems to happen to the other pituitary hormone, oxytocin (OT). The aim of this study was to evaluate the secretion of the hormones AVP and OT after osmotic and hipovolemic stimuli in sepsis surviving animals. Sepsis was induced by cecal ligation and perforation (CLP) (1 perforation with 14G needle) and the animals observed for 10 days. The survivors were submited to osmotic stimulus by dehydration (privation of drinking water from the Cage) for two days, or hipovolemic by intraperitoneal (i.p) injection of polyethylene glycol (PEG) (PEG-4000, 200mg/ml of PBS) for 90 minutes. The control animals were hydrated or that received intraperitoneal injection of PBS 0,01M. After the stimuli, the animals were decapitated for the collection of blood and neurohypophysis, for the analysis of hematocrit, serum sodium, plasma osmolality and hormonal analysis of AVP and OT in the plasma and neurohypophysis. Results: Sepsis surviving animals maintained the capacity of answering the stimulus with AVP secretion. But these animals presented a lowered secretion of OT after dehydration, while they presented no alterations in secretion after volemic stimulus. Conclusion: Sepsis surviving animals presented alterations in the pattern of hormonal answer for the osmotic stimulus, with lowered secretion of OT, apparently there are no alterations in the pattern of a hormonal secretion after hypovolemia.

Os efeitos dos canabinoides em algumas áreas encefálicas que expressam receptores endocanabinoides, como é o caso dos núcleos hipotalâmicos, não são ainda muito bem definidos. Vários estudos têm demonstrado o papel de alguns núcleos hipotalâmicos na organização das reações induzidas pelo medo inato e pelo pânico. As respostas de defesa induzidas pelo medo instintivo caracterizam-se por serem mais elaboradas e dirigidas para algum abrigo ou rota de fuga. O estado de pânico pode ser provocado experimentalmente em animais de laboratório através da diminuição da atividade do sistema GABAérgico. O objetivo deste trabalho foi estudar os padrões comportamentais de fuga elaborada induzidos pelo bloqueio de receptores GABAérgicos do tipo A, com microinjeções intra-hipotalâmicas de bicuculina (BIC), especificamente na divisão dorso-medial do hipotálamo ventro-medial (VMHDM), assim como estabelecer o envolvimento endocanabinoides e o papel do receptor canabinoide do tipo 1 (CB1) na modulação das respostas defensivas organizadas pelo hipotálamo medial. Os resultados mostraram que a administração prévia de doses intermediárias (5pmol) de anandamida (AEA) atenuaram as respostas defensivas induzidas pela microinjeção intra-VMHDM de bicuculina (40ng), efeito este prevenido pelo pré-tratamento intra-hipotalâmica com antagonista de receptores CB1. Os resultados indicam que a AEA pode modular os efeitos pró-aversivos da bicuculina no VMHDM por meio do recrutamento de receptores CB1. / The effects of cannabinoids in some brain areas that express endocannabinoid receptors, such as some hypothalamic nuclei, are not yet well known. Several studies have demonstrated a role of hypothalamic nuclei in the organisation of behavioural responses induced by innate fear and panic attacks. The defensive responses induced by instinctive fear are more elaborated and oriented toward a burrow or alternative route of escape. Panic-prone states are able to be experimentally induced in laboratory animals decreasing the GABAergic system activity. The aim of this work was to study panic-like elaborated defensive behaviour evoked by GABAA receptor blockade with bicuculline (BIC) in the dorsomedial division of the ventromedial hypothalamus (VMHDM), we also aimed to establish the involvement of endocannabinoids and the role of CB1 cannabinoid receptor in the modulation of elaborated defense behavioural responses organised by medial hypothalamus. The results showed that intra-hypothalamic administration of anandamide (AEA) at the intermediate dose (5pmol) attenuated defensive responses induced by intra-VMHDM microinjection of bicuculline (40ng). This effect, however, was prevented by the pre-treatment of VMHDM with the CB1 receptor antagonist AM251. These results indicate that AEA can modulate the pro-aversive effects of bicuculline into the VMHDM, recruiting CB1 receptors.

Neste trabalho elaboramos um paradigma para estudar os comportamentos de defesa ao contexto de uma derrota social e as estruturas neurais envolvidas nas respostas de defesa do animal derrotado utilizando imunohistoquímica para proteína Fos. Utilizou-se um aparato que consistia de uma caixa moradia ligada a outra caixa por um corredor. Houve uma habituação de 10 dias a esse aparato, com a outra caixa contendo apenas maravalha limpa. No 11º dia o animal foi exposto a um macho agressivo colocado na outra caixa, e derrotado por ele. Vinte e quatro horas após a derrota social, os animais derrotados foram expostos ao ambiente em que ocorreu a derrota. Eles apresentaram comportamentos de defesa tanto durante a derrota social quanto durante a exposição ao contexto. No contexto, os derrotados apresentaram comportamentos de avaliação de risco e os controles exploraram livremente o aparato. Notamos um aumento na expressão de proteína Fos no MEApd na amígdala, no LSr no septo lateral, no circuito sexualmente responsivo do hipotálamo medial, na LHAjd no hipotálamo, e no PMD. / We investigated the neural systems involved in the contextual defense to a social defeat. We established a protocol to observe contextual defensive responses in animals previously defeated by an aggressive conspecific: animals were kept ten days living in a apparatus composed by two cages (room and resident cages). On the 11th day animals were exposed to an aggressive conspecific and defeated by it. On the following day, animals were exposed to the apparatus. These defeated animals presented defensive responses, characterized by risk assessment behaviors. Increased Fos expression was found in MEApd, LSr, elements of the social responsive medial hypothalamic circuit, the juxtadorsal part of the lateral hypothalamic area and the dorsal premammillary nucleus (PDMdm). The data allowed us to outline a putative circuit involved in the expression of contextual defense to social defeat, and indicates that both innate and contextual defense to social threat apparently share the same neural circuits.

A área incerto-hipotalâmica (IHy) é uma região diencefálica que atua em funções reprodutivas através da presença do hormônio concentrador de melanina (MCH). Nosso objetivo é estudar as conexões da IHy de fêmeas com áreas relacionadas ao controle neuroendócrino reprodutivo, usando traçador anterógrado dextrana amina biotinilada (BDA) e retrógrado Fluorogold (FG). Nesse sentido, destacamos que a IHy, em fêmeas, conecta-se reciprocamente com diversos núcleos hipotalâmicos da região periventricular e pré-óptica, além das áreas hipotalâmica anterior, posterior e lateral. Nosso resultados também sugerem um dimorfismo sexual das projeções da IHy, já que a área pré-óptica medial, o núcleo anteroventral periventrciular e o núcleo arqueado são mais densamente inervadas pelas IHy em fêmeas do que em machos. / The incerto-hypothalamic area (IHy) is a diencephalic region poorly studied which is characterized by two non-colocalized neurochemical groups composed by the A13 dopaminergic group intermingled with predominantly GABAergic cells co-expressing melanin-concentrating hormone (MCH) and/or cocaine and amphetamine regulated transcript (CART). Functional studies suggest that IHy is involved in the neuroendocrine control of female reproduction in specific metabolic states mediated by MCH. In this way, our aim is to study the IHy connections in female rats related to neuroendocrine control of female reproduction using neuronal anterograde Biotin Dextran Amine (BDA) and retrograde Flurogold (FG) tracers. As a result, we found that IHy projections are the lateral septal nucleus, bed nucleus of stria terminalis, paraventricular thalamic nucleus, reuniens thalamic nucleus, medial preoptic area, medial and lateral preoptic nucleus, median preoptic nucleus, periventricular hypothalamic nucleus, anteroventral periventricular nucleus, anterior, posterior and lateral hypothalamic area and precommissural nucleus. The main afferents to the IHy, in females, are the lateral septal nucleus, median preoptic nucleus and paraventricular thalamic nucleus. These results suggest sexually dimorphic projections from the IHy, since IHy more densely innervates neuroendocrine regions in female than in male rats.

A avicultura brasileira tem alcançado altos índices de desempenho na produção de carne e ovos, como resultado da atualização constante de tecnologias no setor. A biotecnologia vem contribuindo nesse sentido, atuando especialmente em programas de seleção de animais com maior potencial de desenvolvimento e crescimento. Como toda a fisiologia animal é controlada direta e/ou indiretamente pela hipófise e hipotálamo, este trabalho propôs identificar e analisar genes expressos nestas estruturas de galinhas de duas linhagens divergentes quanto ao potencial de crescimento e avaliar a expressão dos genes correspondentes a transcritos cuja identidade não pôde ser revelada (sem similar nos bacos de dados), uma vez que estes podem representar possíveis genes novos. Para isto, foram construídas e analisadas bibliotecas a partir da hipófise e hipotálamo de aves de 21 dias de idade de uma linha macho de corte (TT) e uma linhagem de postura (CC), provenientes da Embrapa Suínos e Aves. Um total de 4.286 ESTs válidas foi obtido (no mínimo150 pb com qualidade PHRED acima de 20), correspondendo a 2.133 ESTs da biblioteca da linhagem TT e 2.153 ESTs da biblioteca da linhagem CC. O exercício de montagem, via programa Cap3, revelou 3.074 seqüências únicas, sendo 1.643 da biblioteca da linhagem TT e 1.649 da CC. Estas seqüências únicas foram automaticamente classificadas, de acordo com as categorias do GeneOntology, sendo que as seqüências de ambas as bibliotecas apresentaram uma distribuição similar entre os termos. Após montagem das ESTs e análise do padrão de expressão digital das seqüências constituintes, dos 389 contigs obtidos, 194 foram compostos por seqüências diferencialmente expressas entre as bibliotecas. Foram detectados 28 contigs contendo SNPs linhagem específicos, sendo 52 SNPs TT específicos e 25 CC específicos. Um total de 146 ESTs não pôde ter sua identidade revelada, porém destas, 133 puderam ser localizadas no genoma da galinha e apresentaram pelo menos uma fase de leitura aberta (ORF). Após análise de expressão gênica, os genes correspondentes a 78 destas ESTs sem identidade apresentaram-se diferencialmente expressos entre pelo menos dois dos tecidos de aves de uma linhagem comercial de corte de 21 dias de idade estudados: hipófise, hipotálamo, cérebro, fígado e músculo. Os resultados apresentados são promissores e merecem ser investigados em estudos futuros com o objetivo de identificar marcadores moleculares para programas de seleção e melhoramento animal. / The brazilian aviculture has reached a high development level in both meat and egg production as a result of constant technological atualization in the sector. Biotechnology can contribute in this way acting in selection programs of animals that show higher growth and development potential. The global animal physiology is direct or indirectly controlled by pituitary and hypothalamus. The aim of this work was to identify and analyse genes expressed in these structures of two divergent line chickens according to growth potential and evaluate the gene expression of corresponding transcripts classified as "no hit", once these ESTs could represent new genes. In this way, two pituitary and hypothalamus libraries of 21 days broiler (TT) and a layer (CC) chickens supplied by Embrapa Swine and Poultry National Research Center were constructed and analysed. A total of 4,286 valid ESTs was obtained (showing at least 150 bp with PHRED quality above 20) corresponding to 2,133 ESTs of TT line library and 2,153 ESTs of CC line library. The clustering process by Cap3 resulted in 3,074 unique sequences corresponding to 1,643 TT library sequences and 1,649 of CC sequences. These unique sequences were automatically annotated according GeneOntology categories and both library sequences showed a similar distribution between the terms. After ESTs clustering and northern digital analysis, 389 contigs were obtained – 194 of them showed differentially expressed sequences between the libraries. A total of 28 contigs showed line specific SNPs, corresponding to 52 TT specific SNPs and 25 CC specific SNPs. 146 ESTs were classified as "no hit" but 133 of these sequences were localized in chicken genome and showed open reading frame (ORF). After gene expression analysis, the genes of 78 "no hit" ESTs showed different expression level between the five tissues of commercial broilers with 21 days old: pituitary, hypothalamus, brain, liver and muscle. These results are promising and must be more investigated in future studies to identify molecular markers for use in animal selection and improvement programs.

The hypothalamus is the central regulator of systemic energy homeostasis, and its dysfunction can result in extreme body weight alterations. This small (3-4 mm in thickness in human) neuro-endocrine brain region, located just above the median eminence, is comprised of cell types that subserve specific metabolic and behavioral aspects of the control of body weight, as well as hepatic glucose production, body temperature, autonomic physiology, neuroendocrine axes, serum osmolarity and circadian rhythms. Insights into the complex cellular physiology of this region are critical to the understanding of obesity pathogenesis and its prevention and treatment; however, human hypothalamic cells are largely inaccessible for direct study. My thesis research focused on establishing an in vitro model for understanding the molecular neurophysiology of obesity using, as "proof-of-principle", neurons derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) derived from individuals with monogenic forms of obesity. Three related projects are described in details: I. Differentiation of hypothalamic-like neurons from human pluripotent stem cells (Chapter 2) This project was designed to establish an in vitro model for studying hypothalamic cell-molecular physiology in neurons derived from hPSCs. After screening several morphogens and other molecules affecting neuronal differentiation, we developed a protocol that combined early activation of sonic hedgehog signaling followed by timed NOTCH inhibition resulting in the generation of hypothalamic arcuate nucleus (ARC)-like neurons. Neuronal cells expressing pro-opiomelanocortin (POMC), neuropeptide-Y/agouti-related protein (NPY/AgRP) were generated from human embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) obtained from patients with monogenic forms of obesity. These hypothalamic-like neurons accounted for over 90% of differentiated cells and exhibited transcriptional profiles characteristic of specific hypothalamic neurons (and explicitly lacking pituitary markers). Importantly, these cells displayed hypothalamic neuronal characteristics, including production and secretion of neuropeptides and responsiveness to metabolic hormones such as insulin and leptin. Nkx2.1 progenitor cells at 12 days of differentiation from iPSC integrated into the hypothalamus following injection into the lateral ventricle of NSG mice. Single cell transcriptome analysis of day 27 hESC-derived hypothalamic neurons enabled us to identify specific hypothalamic cell types (e.g. POMC, NPY, MC4R) based on transcript signatures. These findings, in the aggregate, supported the utility of these cells for elucidation of aspects of the cellular/molecular neurophysiology of body weight regulation. II. Using stem cell-derived hypothalamic neurons to investigate the neurophysiology of obesity caused by prohormone convertase 1/3 deficiency (Chapter 3). My second project investigated the use the hPSC-differentiated hypothalamic neurons to assess the cellular physiology of hESC-derived hypothalamic neurons with induced knockdown or mutations of proprotein convertase subtilisin/kexin type 1 (PCSK1, encodes prohormone covertase 1/3 (PC1/3)). Congenital hypomorphism for this gene causes a rare autosomal disorder that impairs the processing of specific proproteins to their more bioactive derivatives, affecting, for example, the processing of POMC, proinsulin and proglucagon. The consequences of inactivating mutations of PCSK1 include obesity, possibly due to impaired function of anorexigenic POMC arcuate neurons. To understand the molecular neurophysiology of the obesity in PC1/3-deficient subjects, we generated PCSK1 deficient hESC lines with CRISPR or by knocking down PCSK1 with shRNA, and assessed the POMC processing in the hypothalamic ARC-like neurons made from these lines. The ratios of adrenocorticotropic hormone (ACTH)/POMC, αMSH/POMC and β endorphin (BEP)/POMC proteins were significantly decreased, while total quantities of POMC peptides were greatly increased in PCSK1-deficient hESC-derived neurons, indicating impaired POMC processing caused by reduced PC1/3 protein. These results are consistent with the elevated plasma POMC and ACTH intermediates levels of in humans segregating for hypomorphic mutations of PCSK1, and the impaired pituitary POMC processing in the PC1/3 mutant mice. Interestingly, in day 28 PC1/3-deficient neurons, in addition to upregulation of POMC gene expression and protein, we found increases in some of the "downstream" proteolytic enzymes for POMC processing and the "upstream" transcription factor that regulates PCSK1 expression. The molecular mechanisms underlying the invocation of these possibly compensatory processes are under study. These findings provide confidence that the hypothalamic neurons generated by the techniques described in Chapter 2 display molecular phenotypes consistent with a mutation in one of the important neuropeptide processing pathways. III. Using iPSC-derived neurons to investigate the molecular pathogenesis of obesity in Bardet-Biedl Syndrome (Chapter 4). To further investigate the use of iPSC-derived neurons in the study of the neurobiology of obesity, I analyzed structural and molecular physiologic phenotypes cells derived from patients with Bardet-Biedl Syndrome (BBS). BBS is a rare autosomal recessive disease characterized by multiorgan dysfunction, including polydactyly, hyperphagic obesity, retinal degeneration, renal cysts and cognitive impairments. Eighteen discrete genes have been implicated in specific instances of BBS, and all cognate proteins that have been identified encode constituents of the basal body of the primary cilium. The primary cilium has also been implicated in other clinical obesities, including the Alstrom syndrome, and the effects of a highly prevalent FTO allele on body weight. We found that ciliogenesis and neurite outgrowth were affected in both BBS1 and BBS10 mutant iPSC-derived neurons as reflected by longer primary cilia, shorter neurite length, and fewer processes. Furthermore, insulin-induced AKT phosphorylation at Thr308 was greatly reduced in both BBS1 and BBS10 mutant neurons compared to controls. Overexpression of BBS10 fully restored insulin signaling in BBS10 mutant neurons by rescue of the tyrosine phosphorylation of insulin receptor. Co-immunoprecipitation assays indicated that both BBS1 and BBS10 interacted physically with the insulin receptor. Leptin signaling was also investigated in BBS mutant fibroblasts and neurons. Both BBS mutations impaired leptin-mediated pSTAT3 activation in both cell lines by affecting either the trafficking or the quantities of leptin receptor in these cells. These data demonstrate that BBS proteins are essential for insulin and leptin signaling in neurons and fibroblasts, in a cellular context independent of the effects of obesity. These studies further confirm the ability of iPSC-derived neurons to reflect aspects of the molecular pathophysiology of the patients from whom they are obtained, and to enable studies of these phenotypes in circumstances isolated from the secondary effects of adiposity per se.

A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Foram investigados os efeitos do uso de dispositivos de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore peripúberes. Especificamente, como as diferenças na expressão de genes relativos à reprodução em duas áreas do hipotálamo. Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento): dispositivo de P4 sem estradiol (SP); dispositivo de P4 com estradiol (PE); sem dispositivo de P4 e sem estradiol (SS); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (SE). As novilhas foram alimentadas no cocho pós desmame até atingirem 295 ± 11 kg, com fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram abatidas e as porções de hipotálamo colhidas para processamento e armazenagem a -80 ºC. O RNA total do tecido hipotalâmico foi extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR). Foram formados pools de RNA para a realização de um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estradiol endógeno e das diferenças entre áreas do hipotálamo, realizado por sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. Foram encontrados genes diferencialmente expressos alterados pelos tratamentos e entre as áreas do hipotálamo relativos à obtenção da puberdade. / The understanding of the molecular mechanisms by which nutrition, genetics and hormonal treatments affect the beginning of puberty is of great importance for developing strategies aiming to reduce the age at first calving, and therefore increase the slaughter rate in Nellore cattle. The effects of progesterone device and of endogenous estradiol on the molecular mechanisms controlling the attainment of puberty in Nellore heifers were investigated. Specifically, the molecular pathways of progesterone and estradiol were studied in the hypothalamus. Thirty five non-pubertal heifers, between 13 and 14 months of age, were divided into four treatment (nine or eight per treatment): P4 device without estradiol (SP), P4 device with estradiol (PE), without P4 device and without estradiol (SS), and without P4 device and with estradiol (SE). The heifers were fed after weaning until reach 295 ± 11 Kg, with water access. At the end of the hormonal treatments all heifers were slaughtered and the hypothalamus areas were harvested, processed and then also stored at -80°C. Total RNA of hypothalamus were extracted, treated with DNase I and submitted to cDNA synthesis for gene expression quantification by real time PCR (qRT-PCR). RNA samples were pooling to realize a comprehensive study of the effects of progesterone administration and endogenous estrogen on attainment of puberty by next-generation sequencing (RNA-Seq), in order to identify possible candidate genes in the hypothalamus. Genes diffentially expressed between hypothalamic areas and affected by treatments were found.

A anóxia neonatal considerada relevante condição clínica mundial e vem sendo estudada no laboratório de Neurociências, ICB-USP, desde 2008. Agressões em períodos críticos de maturação do organismo, em especial do sistema nervoso, devido à sua alta demanda metabólica, podem modificar ou mesmo comprometer eventos ontogenéticos com complicações persistentes na vida adulta, sendo relacionada a retardo cognitivo e comportamental, tais como: epilepsia, déficit de atenção, hiperatividade, problemas de aprendizado, entre outros. Em ratos adultos ocorreu morte neuronal por apoptose e necrose, decréscimo da neurogênese e do volume no hipocampo após anóxia neonatal. Experimentos comportamentais evidenciaram alterações também na capacidade de aprendizagem, navegação espacial e ansiedade. Foi observado, que esse estímulo provoca retardo no desenvolvimento sensório-motor, além de ganho de peso em relação ao controle, e aumento do diâmetro rostro-caudal e naso-anal. A fim de avaliar as causas de alterações somáticas e de desenvolvimento, decidiu-se aprofundar, neste estudo, a análise da relação do hipotálamo e da leptina com as mesmas, e com o metabolismo energético assim como, com o crescimento do organismo. Para tanto, foram utilizados camundongos leptin reporters, os quais apresentam os receptores para leptina naturalmente fluorescentes. Foi adaptado modelo para indução de anóxia em camundongos machos por meio de testes de avaliação da ontogenia de reflexos; da pressão de oxigênio no sangue; da frequência cardíaca e dos níveis na Escala de Apgar. Tais testes evidenciaram prejuízos dos animais anoxiados no aparecimento dos reflexos de aceleração, geotaxia negativa, recuperação de decúbito e resposta ao susto; diminuições significativas de pressão de oxigênio e batimentos cardíacos durante período de exposição ao ambiente anóxico, além de níveis indicativos de ausência de oxigênio quando avaliados os fatores que compõe a escala de Apgar, em relação aos animais controle, validando o modelo para este estudo. Em seguida, foram analisados grupos anóxia macho e fêmea e controle macho e fêmea com relação a parâmetros corpóreos durante 60 dias de vida dos animais. Foi evidenciado que a anóxia neonatal afeta os parâmetros de maneiras distintas, porém em todas as análises, o grupo anóxia macho apresentou dimensões aumentadas em relação aos outros grupos. Quando comparada a co-localilzação de fos com receptores de leptina fluorescentes ativados, os resultados obtidos sugerem que apesar de não ter sido detectado diferença de valores de leptina circulante no sangue, houve alteração de peso corpóreo nos animais anóxia, em relação ao seu controle, o que se atribui a possível resistência dos receptores de leptina dos núcleos arqueado e dorsomedial, hipótese que deve ser explorada em experimentos futuros. / Neonatal anoxia is considered a relevant clinical condition and has been studied in the Neuroscience Laboratory, ICB-USP, since 2008. Damage caused to an organism during its maturation, particularly the damage that affects the high-metabolic nervous system, can modify or even compromise ontogenetic events with persistant complications in adulthood. Such complications are related to cognitive and behavioral retardation, and some known examples are: epilepsy, attention deficit, hyperactivity and learning problems. In adult rats, neuronal death occurs due to apoptosis, necrosis, decreased neurogenesis and decreased volume in the hippocampus after neonatal anoxia. Behavioral experiments also revealed changes in learning ability, spatial navigation and anxiety. It was also observed that neonatal anoxia causes delay in sensorimotor development, besides weight gain in relation to the control, and increase in the rostrocaudal and naso-anal diameter. In order to evaluate the causes of such somatic and developmental changes, this study analyzed the relationship between the hypothalamus and leptin, as well as their relationship with energy metabolism and the growth of the organism. Leptin reporter mice were used, which present naturally fluorescent leptin receptors. The anoxia model was adapted for male mice by means of the following tests: evaluation of the ontogeny of reflexes, the oxygen pressure in the blood, the heart rate and the levels on the Apgar Scale. These tests revealed damages to the anoxic animals by the appearance of different reflexes: acceleration, negative geotaxis, recovery of decubitus and response to scare; there was significant decrease in oxygen pressure and heart rate during exposure to the anoxic environment, in addition to levels in the Apgar scale which are indicative of oxygen absence when contrasted with control. Male and female anoxic groups and control were analyzed with respect to body parameters for a period of 60 days, and evaluated of leptin levels, Nissl staining and c-fos cell count by stereology performed. It was verified that neonatal anoxia affected the parameters in different ways, but overall the male anoxic group presented increased dimensions in relation to the other groups. Results obtained from the co-localization of fos and activated fluorescent leptin receptors suggest that, although it is not possible to observe differences in leptin values in the blood, the change in body weight of anoxic animals was due to a lack of activation of leptin receptors in arched and dorsomedial nuclei, suggesting a resistance to the effects of this hormone, hypothesis that should be explored in future experiments.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No presente estudo, foram investigados o mecanismo central e a termogênese pelo tecido adiposo marrom (BAT) envolvidos com a perda de massa corporal (MC) observada com a administração de liraglutida (análoga do hormônio GLP1). Camundongos machos C57BL/6, foram alimentados com dieta padrão e tratados com veículo (SC) ou com liraglutida (SC/Lir) ou com dieta hiperlipídica e tratados com veículo (HF) ou com liraglutida (HF/Lir) Nossos resultados demostram que a administração de liraglutida aumentou o neuropeptídeo anorexigênico pro-opiomelanocortina no hipotálamo e diminuiu a expressão do mRNA da proteína supressora da sinalização de citocinas-3. A administração de liraglutida melhorou os níveis plasmáticos de adiponectina e diminuiu tanto a intolerância à glicose, como a resistência à insulina. Além do mais, tanto o grupo SC como o grupo HF, consumiram a mesma quantidade de comida, já o grupo SC/Lir comeu 17,5 menos comida comparado com o grupo SC e, da mesma forma, o grupo HF/lir diminuiu o consumo alimentar em 22,5% comparado com o grupo HF. A massa corporal final foi 8,5% menor no grupo SC/Lir comparado com o grupo SC e 16% menor no grupo HF comparado com o grupo HF/Lir. Além do mais, a administração de liraglutida aumentou o consumo de oxigênio e a produção de dióxido de carbono, e diminuiu o quociente respiratório. A liraglutida aumentou ainda os níveis do receptor beta 3 adrenérgico, da proteína desacopladora mitocondrial-1, do TC10 e do transportador de glicose estimulado pela insulina (GLUT)-4 no BAT. Em conclusão, a administração de liraglutida em camundongos obesos induzidos por dieta ativou a via anorexigênica, diminuindo o consumo alimentar, atuando sinergicamente com o aumento do gasto energético.