Sepse induz exagerada produção de mediadores inflamatórios, como o óxido nítrico (NO), e causa alterações cardiovasculares, neuroendócrinas e de temperatura corporal (Tc). Na fase tardia da sepse existe liberação basal de vasopressina (AVP), apesar da hipotensão persistente. Uma hipótese para isso seria a inibição da síntese de AVP pelo aumento da produção de NO. Nosso objetivo foi investigar a possível participação do NO, produzido centralmente pelas isoformas de NO sintase (NOS), na expressão de AVP e ocitocina (OT), na resposta cardiovascular e de Tc durante sepse experimental. Ratos Wistar receberam injeção i.c.v. de L-NAME, inibidor não seletivo de NOS (250g/L), ou de aminoguanidina (AG,250g/L), inibidor seletivo da isoforma induzida (NOSi). Outro grupo recebeu inibidor da guanilato ciclase solúvel (ODQ,0,25g/L). Grupos controles receberam veículos (salina ou DMSO1%). Trinta minutos após as injeções, foi induzido sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP) ou operação fictícia. Os animais foram divididos em 4 grupos: 1) avaliação da sobrevida, 2) determinação da Tc, 3) aferição da pressão arterial (PAM) e frequência cardíaca (FC) e 4) avaliação de parâmetros hidroeletrolíticos e secreção de AVP e OT. A CLP promoveu alta mortalidade, aumentou NO progressivamente, diminuiu PAM e aumentou FC. A concentração plasmática de AVP (AVPp) aumentou na fase inicial da sepse e por seu efeito antipirético pode ter contribuído para a hipotermia observada. A razão de expressão para ambos os hormônios diminuiu nos núcleos supraóticos (SON) e paraventriculares (PVN). Na fase tardia AVPp estava basal e sua expressão nos SON e PVN mais diminuída do que na fase inicial. A expressão de OT diminuiu somente no SON. O pré-tratamento com L-NAME aumentou a sobrevida, reduziu a produção de NO até 20h, aumentou PAM e Tc, e manteve a FC semelhante ao grupo veículo. AVPp aumentou simultaneamente à diminuição da razão de expressão em ambos os núcleos. Na fase tardia, o grupo L-NAME apresentou NO aumentado e expressão de AVP diminuída, aparentemente contribuindo para AVPp basal e hipotensão. O L-NAME diminuiu a razão de expressão de OT na fase inicial, mas aumentou na fase tardia. A inibição de NOSi pela AG aumentou ainda mais a sobrevida e Tc. Apesar de não bloquear a produção de NO a AG aumentou a expressão de AVP e OT e manteve AVPp constante e acima da basal. Injeção i.c.v de AG aumentou PAM somente na fase inicial da sepse. O pré-tratamento com ODQ foi o mais eficiente em aumentar a sobrevida e Tc após CLP. Entretanto, não alterou o aumento progressivo de NO, e ainda diminuiu a expressão de AVP e OT. A AVPp basal após ODQ contribuiu para a hipotensão observada durante todo o período. Esses resultados mostram que aumento central de NO após CLP inibe a expressão de AVP e OT independente de GMPc no SON e parcialmente dependente no PVN. A inibição da expressão de AVP na fase tardia da sepse resulta em concentração basal do hormônio contribuindo para a hipotensão. Em nossos experimentos o controle da temperatura corporal teve maior contribuição no aumento da sobrevida durante sepse polimicrobiana do que a regulação neuroendócrina e/ou cardiovascular. / Sepsis induces massive production of inflammatory mediators, such as nitric oxide (NO), and causes cardiovascular, neuroendocrine and body temperature (Tb) alterations. In the late phase of sepsis there is a basal vasopressin (AVP) release despite the persisting hypotension. One reason could be the inhibition of AVP synthesis by the increase in NO production. Our aim was to investigate the possible involvement of NO, produced centrally by NO synthase (NOS) isoforms, on AVP and oxytocin (OT) expression, cardiovascular response and Tb during experimental sepsis. Male Wistar rats received an i.c.v. injection of the non-selective NOS inhibitor L-NAME (250g/L), or of aminoguanidine (AG,250g/L), a selective inhibitor of its inducible isoform (iNOS). Another group received soluble guanylate cyclase inhibitor (ODQ,0.25µg/L). Control groups received vehicles (saline or DMSO1%). Thirty minutes after the injections, sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP), or the rats were sham operated. The animals were divided into 4 groups for: 1) assessment of survival, 2) determination of Tb, 3) measurement of blood pressure (MAP) and heart rate (HR), and 4) evaluation of hydroelectrolytic parameters and AVP and OT secretion. The CLP promoted high mortality and progressive increase in NO levels. It also decreased MAP and increased HR. The AVP plasma concentration (AVPp) increased in the early phase of sepsis and its antipyretic effect may have contributed to the observed hypothermia. The expression ratio of both hormones was reduced in the supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei. In the late phase, AVPp was basal and its expression decreased in both nuclei more than in the initial phase. The OT expression decreased only in the SON. L-NAME pretreatment increased the survival and reduced the NO production until 20h. MAP and Tb were increased, while HR remained similar to that observed in the vehicle control group. AVPp increased simultaneously to the decrease of its expression ratio in both nuclei. In the late phase, the L-NAME group showed NO levels increased and decreased AVP expression, apparently contributing to basal AVPp and hypotension. The L-NAME decreased OT expression ratio in the initial phase, but increased in the late phase. Inhibition of iNOS by AG further increased the survival and Tb. Even though AG did not block NO production, it increased AVP and OT expression and kept AVPp constant and above the baseline. AG pretreatment increased MAP only in the initial phase of sepsis. The ODQ pretreatment was more efficient to increase survival and Tb after CLP. However it neither altered the progressive NO increase nor the decrease in AVP and OT expression ratio. The basal AVPp after ODQ contributed to hypotension observed during the studied period. These results show that the increased central NO levels observed after CLP inhibit cGMP-independent hormone expression in the SON and partially dependent in the PVN. Inhibition of AVP expression, in the late phase of sepsis, results in basal concentrations of this hormone further contributing to hypotension. In our experiments the control of body temperature during polymicrobial sepsis had greater contribution in survival than the neuroendocrine and/or cardiovascular regulation.

Há evidências que o treinamento induz alterações plásticas e funcionais na alça suprabulbar do controle autonômico cardiovascular, mediados pelos barorreceptores arteriais. O presente estudo objetivou verificar os efeitos da desnervação sino-aórtica associada ou não ao treinamento (T) na expressão de neurônios noradrenérgicos, ocitocinérgicos e vasopressinérgicos, assim como o efeito temporal induzido pelo T. Foi possível constatar que o T aumenta a expressão de dopamina beta-hidroxilase e ocitocina, sem alteração a expressão de vasopressina, e que essas alterações neuropeptídicas precedem ao surgimento das alterações benéficas induzidas pelo T como o aumento da sensibilidade barorreflexa e bradicardia de repouso. Foi possível observar que a desnervação sino-aórtica bloqueia todos esses efeitos benéficos induzidos pelo T, diminuindo a expressão de dopamina beta hidroxilase, vasopressina e ocitocina no PVN. Contudo, esses dados sugerem que a via aferente Noradrenérgica, via barorreceptor, é essencial para ajustes benéficos cardiovasculares. / There is evidence aerobic training (T) determines plastic and functional changes in the suprabulbar modulatory loop of the cardiovascular autonomic control, many of them mediated by arterial baroreceptors. The present study aim to investigate the effects of sinoaortic denervation associated or not to T on noradrenergics, oxitocinergics, vasopressinergics neurons expression, as temporal effects induced by T. It was possible find augment on dopamine beta-hydroxilase and oxytocin expression, without changes on vasopressin expression, and that neuropeptidergic changes preceding appearance of beneficial training-induced, as well the increases baroreflex sensitivity and resting bradycardia. Data also indicate that sinoaortic denervation blocks all of these effects training-induced, decreases of dopamine beta-hidroxylase, vasopressin and oxytocin on the PVN. Therefore, those data suggests that noradrenergic afferents driven by barorreceptors are essencial to trigger beneficial training-induced cardiovascular adjustments.

Animal and human studies have consistently demonstrated that recurrent hypoglycaemia (RH) blunts both hormonal and behavioral counter regulatory responses (CRR) to further episodes of hypoglycaemia. It is now well established that the brain is involved in regulating whole-body glucose homeostasis, including the CRR to hypoglycaemia. The aim of the current study was to investigate if adaptations occur, following RH, which are intrinsic to glucose-sensing neurons in the absence of synaptic/glial inputs or signals from the periphery. Utilising the GT1-7 hypothalamic mouse cell line as an in vitro model of homogenous glucose-excited neurons, the current study has demonstrated that recurrent low glucose exposure reprograms intracellular metabolism towards a “hypometabolic state”. This result occurs in conjunction with an attenuated ability of the cells to hyperpolarise in response to low glucose and a reduction in the sensitivity of the KATP channel to activation by MgADP. In an attempt to reverse the changes observed in KATP channel activity, the SUR1-selective KATP channel opener, NN414, was applied chronically to GT1-7 cells. However, chronic KATP channel activation severely reduced channel conductance and sensitivity to activation by MgADP and further NN414 application. These results suggest that chronic activation of the KATP channel leads to the induction of a negative feedback mechanism to reduce channel activity. This may be in an attempt to maintain neuronal membrane potential within a physiological range. These results also suggest activation of central KATP channels during RH may be driving the resulting defective CRR. However, adaptations in metabolism following RH may also be altering the function of central KATP channels.

Ocitocina (OT) é um nonapeptídeo neurosecretório sintetizado nas células hipotalâmicas que se projetam para a neurohipófise e para locais extensamente distribuídos no sistema nervoso central. As microinjeções centrais de OT induzem uma variedade de comportamentos em animais no âmbito cognitivo, sexual, reprodutivo, de autolimpeza e afiliativo. O transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) inclui uma escala dos sintomas cognitivos e comportamentais que tem alguma relação com dimensões de comportamento associadas com a OT. A administração de OT no núcleo central da amígdala (CeA) induz autolimpeza exacerbada, considerada um sintoma de TOC. Neste trabalho, nós estudamos os substratos neuroanatômicos e celulares deste comportamento. Nossos dados sugerem uma ligação entre o CeA e a “área hipotalâmica de grooming" (HGA). A HGA inclui parte do núcleo paraventricular do hipotálamo e a área hipotalâmica dorsal. Nossos dados mostrando co-localização de OT (imunohistoquímica para peptídeo), receptor para OT (ensaio de binding) e marcação de células retrogradamente depois da injeção de Fluoro-Gold no CeA sugerem que o CeA e conexões são substratos importantes nos circuitos subjacentes de comportamento normal e de quadro patológico tal como o TOC dependente de OT descrito neste trabalho. / Oxytocin (OT) is a neurosecretory nonapeptide synthesized in hypothalamic cells that project to the neurohypophysis as well as to widely distributed sites in the central nervous system. Central OT microinjections induce a variety of cognitive, sexual, reproductive, grooming and affiliative behaviors in animals. Obsessive-compulsive disorder (OCD) includes a range of cognitive and behavioral symptoms that bear some relationship to dimensions of behavior associated with OT. The administration of OT into central nucleus of amygdala (CeA) induces hypergrooming, considered a symptom of OCD. Here, we study the neuroanatomical and cellular substrates of this behavior. Our data suggest a link between the CeA and the “hypothalamic grooming area" (HGA). The HGA includes parts of the paraventricular hypothalamic nucleus and the dorsal hypothalamic area. Our data on co-localization of OT (immunohistochemistry for peptide), OT receptor (binding assay) and retrogradely labeled cells after Fluoro Gold injection in CeA suggest that CeA and connections are an important substrate of the circuit underlying this OCD-like OT-dependent behavior.

A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é o distúrbio endócrino mais frequente em mulheres em idade reprodutiva. Sua etiologia é desconhecida, mas recentemente, fatores ambientais, como o excesso esteróides sexuais em fases precoces da vida, têm sido implicados na origem da SOP. Em ratas, o excesso de androgênios ou estrogênios na vida neonatal altera a função do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e induz alterações reprodutivas e metabólicas similares às observadas na SOP em humanos. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos genes relacionados ao controle da secreção de GnRH (Gnrh, Gnrhr, Kiss1, Kiss1r e Ar) no hipotálamo de modelos animais de SOP e avaliar a correlação com a morfologia ovariana, níveis séricos de gonadotrofinas e esteróides sexuais, e a expressão de genes chaves na esteroidogênese ovariana (Cyp17a1 e Lhr). Foram utilizadas 30 ratas alocadas em igual número em três grupos. De acordo com os grupos, os animais receberam por injeção subcutânea, entre 0-3 dias de vida, os seguintes compostos: propionato de testosterona (1,25 mg) (grupo Testosterona); benzoato de estradiol (0,5 mg) (grupo Estradiol); e veículo (0,1 mL) (grupo Controle). Os animais foram pesados semanalmente a partir do nascimento até os 90 dias de vida. Ao completarem 90 dias, os animais foram eutanasiados e tiveram coletados o hipotálamo, os ovários e o sangue. Foi avaliada a expressão dos genes Gnrh, Gnrhr, Kiss1, Kiss1r e Ar no hipotálamo e Cyp17a1 e Lhr no ovário por PCR quantitativo em Tempo Real. O ovário também foi analisado morfológica e morfometricamente após coloração com hematoxilina e eosina (H.E.) e o sangue foi utilizado para a dosagem sérica dos hormônios LH, FSH, estradiol, progesterona e testosterona. A análise estatística foi realizada utilizando a análise de variância (ANOVA) complementada pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Os animais dos grupos Estradiol e Testosterona apresentaram 11 anovulação e maior peso corporal em relação ao grupo Controle. O gene Kiss1 encontrou-se hipoexpresso nos grupos Estradiol e Testosterona em relação ao grupo Controle (p<0,0001). No grupo Estradiol, o gene Kiss1r apresentou expressão aumentada em relação ao grupo Controle (p<0,01). O gene Gnrh não exibiu variações de expressão entre os grupos. A expressão de Gnrhr exibiu aumento no grupo Testosterona em relação ao grupo Estradiol (p<0,004). No grupo Testosterona, o gene do receptor de androgênio (Ar) apresentou expressão aumentada em relação ao grupo Controle (p<0,04). Quanto ao nível sérico de LH, o grupo Testosterona exibiu aumento em relação aos grupos Estradiol e Controle (p<0,001). O grupo Estradiol exibiu maior concentração sérica de estradiol em relação ao grupo Testosterona (p<0,01). Os níveis séricos de FSH, progesterona e testosterona não exibiram diferenças significativas entre os grupos. A expressão do gene Lhr apresentou-se aumentada nos grupos Estradiol e Testosterona em comparação ao Controle (p<0,003). O gene Cyp17a1 apresentou-se hiperexpresso no grupo Estradiol em relação aos grupos Controle e Testosterona (p<0,0001 e p<0,001, respectivamente). A contagem diferencial de folículos pré-antrais e antrais não diferiu significativamente entre os grupos. Os ovários dos grupos Estradiol e Testosterona apresentaram ausência de corpos lúteos e exibiram aumento da área intersticial e diminuição do volume do núcleo das células intersticiais, sendo todas essas alterações estatisticamente significativas (p<0,0001). Conclui-se que o excesso de estradiol ou testosterona na vida neonatal altera a fisiologia do hipotálamo e do ovário e leva a anovulação de ratas na vida adulta / Polycystic ovary syndrome (PCOS) is the most common endocrine disorder in women at reproductive age. Its etiology is unknown, but recently, environmental factors, such as excess of sex steroids in early life, have been compared to PCOS origin. In female rats, the excess of androgens or estrogens in neonatal life alters the hypothalamus-pituitary-gonadal axis function and induces to reproductive and metabolic alterations like those observed in human PCOS. The aim of this study is to analyze the expression of genes compared to GnRH secretion control (Gnrh, Gnrhr, Kiss1, Kiss1r e Ar) in the hypothalamus of animal models of PCOS and to evaluate the correlation with ovarian morphology, serum levels of gonadotropins and sex steroids and expression of key genes in ovarian steroidogenesis (Cyp17a1 e Lhr). 30 rats were used and allocated equally into three groups. According to the groups, animals received a subcutaneous injection, between 0-3 days old, of the following compounds: testosterone propionate (1.25 mg) (Testosterone group); estradiol benzoate (0.5 mg) (Estradiol group) and vehicle (0.1 mL) (Control group). Animals were weighed weekly from birth until 90 days of life. At 90 days, the animals were euthanized and were collected the hypothalamus, the ovaries and blood. We evaluated the expression of genes Gnrh, Gnrhr, Kiss1, Kiss1r and Ar in hypothalamus and Lhr and Cyp17a1 in ovary, both by quantitative Real-Time PCR. The ovary was also analyzed morphologically and morphometrically after staining with hematoxylin and eosin (H.E.) and the blood was used for evaluation of serum levels of LH, FSH, estradiol, progesterone and testosterone. Statistical analysis was performed using analysis of variance (ANOVA) complemented by Tukeys multiple comparisons test. The animals of the Testosterone and Estradiol groups had anovulation and had higher body weight compared to the Control group. The Kiss1 gene was downregulated in Estradiol and 13 Testosterone groups in relation to the Control group (p<0.0001). In Estradiol group, Kiss1r gene expression was increased in relation to the control group (p<0.01). The Gnrh gene expression did not show variations between groups. The Gnrhr expression was increased in Testosterone group in relation to Estradiol group (p<0.004). In Testosterone group, the androgen receptor gene (Ar) showed an increased expression compared to the Control group (p<0.04). Testosterone group exhibited increased serum levels of LH in comparison to Control and Estradiol groups (p<0.001). Estradiol group exhibited higher serum levels of estradiol compared to Testosterone group (p<0.01). Serum levels of FSH, progesterone and testosterone exhibited no significant differences between groups. Lhr gene expression was increased in Estradiol and Testosterone groups in comparison to the control (p<0.003). The Cyp17a1 gene was upregulated in Estradiol group compared to Testosterone and Control groups (p<0.0001 and p<0.001, respectively). The differential counting of preantral and antral follicles did not differ significantly between groups. Ovaries of the animals of Estradiol and Testosterone groups showed absence of corpora lutea and exhibited increased interstitial area and reduced interstitial cells nuclear volume, and all of these changes were statistically significant (p<0.0001). It was concluded that excess of estradiol or testosterone in neonatal life alters the hypothalamic and ovarian physiology and leads to anovulation in rats at adulthood

As alterações nutricionais no período neonatal são capazes de comprometer o controle hipotalâmico da ingestão alimentar e o metabolismo do indivíduo em fases posteriores do desenvolvimento. Avaliamos as alterações decorrentes do modelo de programação nutricional neonatal em células gliais hipotalâmicas, devido ao seu importante papel na homeostase energética. Os astrócitos possuem função metabólica ativa, e por sua vez, fornecem substrato energético aos neurônios por meio das conexinas 30 (CX30) e 43 (CX43). A CX30, por sua vez, exerce função, também, na manutenção morfológica astrocitária, contribuindo na inserção astrocitária na fenda sináptica, portanto interferindo na neurotransmissão. A TCPTP (T-cell protein tyrosine phosphatase) proteína contra-reguladora da sinalização celular da leptina e a insulina participam nos mecanismos de resistência a esses hormônios e está presente em células da glia e possui ação moduladora na atividade de CX43. Sendo assim, a hipótese do presente trabalho é de que alterações em células da glia no hipotálamo participam nos efeitos da programação nutricional neonatal na modulação do balanço energético na vida juvenil e adulta. Para investigarmos essa hipótese, utilizamos o modelo de programação nutricional neonatal de alteração do tamanho da ninhada, sendo a quantidade de filhotes por lactante formada da seguinte maneira: 3 filhotes, ninhada pequena (SL), 10 filhotes, ninhada normal (NL) e de 16 filhotes, ninhada grande (LL). O peso corporal da ninhada foi verificado semanalmente até o desmame, realizado no 21º dia de vida (PN21). Após o desmame, o peso corporal foi verificado a cada cinco dias até o 60º dia de vida (PN60). A ingestão alimentar individual foi determinada entre o PN50 e PN60. Os animais SL apresentaram maior peso corporal (72,3 ± 2,08g) ao desmame, quando comparados aos grupos NL (57,2 ± 3,5g) e LL (36,3 ± 1,8g) e essa diferença entre os grupos foi mantida até o PN60. Observou-se, porém, que a ingestão alimentar dos animais adultos SL, não foi diferente do grupo NL. Todavia, os animais LL apresentaram um ganho de peso reduzido ao desmame, porém, esses animais alcançaram o ganho de peso corporal dos animais NL (NL: 165 ± 3,97g; LL: 145,4 ± 4,5g), a partir do PN35, fenômeno esse associado ao comportamento hiperfágico. No PN21, observou-se no grupo SL um aumento nas concentrações plasmáticas de leptina (6,4 ? 0,9ng/ml) e insulina (1,9 ? 0,15 ng/ml), quando comparado aos grupos NL (leptina: 3,8 ? 0,3ng/ml; insulina: 1,3 ? 0,2 ng/ml) e LL (leptina: 1,2 ? 0,1ng/ml; 9 insulina: 1,0 ? 0,1ng/ml). No PN60, ambos os grupos SL (leptina: 5,2 ? 1,15ng/ml; insulina: 2,5 ? 0,4ng/ml) e LL (leptina: 4,3 ? 0,5ng/ml; insulina: 3,4 ? 0,5ng/ml) apresentaram aumento nas concentrações plasmáticas de leptina e insulina, comparados ao grupo NL (leptina: 1,8 ? 0,4ng/ml; insulina: 1,2 ? 0,1ng/ml). Quando avaliada a expressão do RNAm de Ptpn2, gene que codifica TCPTP, e a expressão dessa proteína no núcleo arqueado (ARC), observamos um aumento no PN21 no grupo SL e em ambos os grupos no PN60, quando comparados ao grupo NL. O grupo SL apresentou aumento na imunorreatividade para GFAP no PN21 e ambos os grupos apresentaram essa mesma resposta no PN60. O mesmo resultado foi observado na imunorreatividade para a molécula adaptadora ligante de cálcio inonizado-1 (IBA-1) no PN21 e PN60 nos grupos SL e LL. Houve colocalização da TCPTP com GFAP, porém não com IBA-1. A TCPTP possui ação demonstrada na modulação de CX43, ao investigá-la observou-se no PN21, um aumento na expressão do RNAm de Gja1, gene que codifica CX43, assim como na imunorreatividade para CX43 apenas no grupo SL. No PN21 e PN60 observou-se redução da expressão do RNAm de Gja6, gene que codifica CX30, em ambos os grupos SL e LL. Observou-se redução na imunorreatividade de CX30 em ambos os grupos, SL e LL no PN60. No PN21, a expressão do RNAm de Il1b aumentou no ARC em ambos os grupos SL e LL. No entanto, no PN60, apenas o grupo LL apresentou um aumento da expressão do RNAm de Il1b. Adicionalmente, no PN60 ambos os grupos SL e LL apresentaram um aumento na expressão do RNAm de Tnfa no ARC. Na análise morfológica das células da glia, no PN21, observou-se no grupo SL um aumento na imunorreatividade do soma da microglia e do astrócito, assim como, nos processos de extensão de ambas as células. No PN60 ambos os grupos apresentaram um aumento na imunorreatividade do soma e dos processos de extensão astrocitários, no entanto, apenas o grupo SL apresentou um aumento na imunorreatividade do soma microglial. Para analisarmos o efeito da leptina na morfologia dos astrócitos e a participação da TCPTP nesse processo, realizamos a cultura primária de astrócitos hipotalâmicos de ratos neonatos que foram estimulados com leptina [1000ng/ml], [5000ng/ml] e LPS [500ng/ml]. O LPS foi utilizado como controle positivo do protocolo. Observamos que os estímulos com leptina e LPS, aumentaram a expressão do RNAm de Ptpn2, a imunorreatividade para TCPTP e a área astrocitária. O tratamento com LPS foi capaz de promover um aumento na expressão do RNAm de Gja1 e o inverso foi observado na expressão de Gja6. Todavia, tanto o tratamento com leptina e LPS promoveu aumento na imunorreatividade para CX43 e o inverso observou-se na imunorreatividade para CX30. Para avaliarmos a participação da TCPTP nos efeitos da leptina na morfologia dos astrócitos, realizamos o silenciamento de seu gene, utilizando o siRNA Ptpn2. O silenciamento de Ptpn2 foi capaz de reverter os efeitos da leptina tanto na expressão gênica, na imunorreatividade assim como na morfologia astrocitária. O silenciamento de Ptpn2 reverteu também as respostas de redução de CX30 e o aumento de CX43 promovidas pelo LPS pela leptina. De maneira inédita esses dados sugerem a importância da TCPTP na modulação das conexinas nos efeitos da leptina e LPS na morfologia astrocitária hipotalâmica. Observamos que apenas o tratamento com LPS foi capaz de promover um aumento na expressão do RNAm de Ptpn1, e o silenciamento de Ptpn2 intensificou esse aumento da expressão de Ptpn1, demonstrando de forma inédita 10 que a TCPTP exerce ação contra regulatória sobre a PTP1B. Como esperado o estímulo dos astrócitos com LPS aumentou a expressão do RNAm de Il6, Il1b e Tnfa. Interessantemente, o silenciamento de Ptpn2 intensificou esse aumento da expressão do RNAm de Il6, Il1b e Tnfa, demonstrando desse modo que a TCPTP possui ação contra regulatória na secreção dessas citocinas. O conjunto de dados demonstra que a alteração nutricional neonatal é capaz de promover alterações no balanço energético na vida juvenil e adulta. Estas alterações estão associadas a modificações morfológicas das células da glia e ao aumento de citocinas inflamatórias, caracterizando um estado reativo glial. Adicionalmente, demonstramos em cultura primária de astrócitos hipotalâmicos que a leptina altera a morfologia destas células e pela primeira vez demonstramos, também, que a TCPTP modula esses efeitos da leptina, por meio de suas ações na conexina CX30. A CX30 participa na modulação da morfologia dos astrócitos e sua redução está associada ao aumento na área e nos processos de extensão destas células. Em conclusão, o presente estudo demonstra que alterações na disponibilidade nutricional na vida neonatal acarretam alterações no comportamento alimentar e no peso corporal na vida juvenil e adulta em ratos. Demonstramos, também, que tais alterações nutricionais neonatais estão associadas a alterações em células da glia. A leptina induz alterações morfológicas em astrócitos, sendo este efeito mediado pela TCPTP e sua regulação sobre a expressão da proteína CX30. O conjunto dos dados indica a importância das células não neuronais no controle central da homeostase energética em modelo de programação nutricional neonatal. / Nutritional changes in the neonatal period can affect the hypothalamic control of food intake and metabolism in later life. We evaluated the influence of the neonatal nutritional programming on hypothalamic glial cells, known to play an important role in the energy homeostasis. Astrocytes have active metabolic function and provide energy substrate for the neurons through connexin 43 (CX43). CX30 is important in the maintenance of astrocyte morphology, contributing to the insertion of its process into the synaptic cleft. The TCPTP (T-cell protein tyrosine phosphatase) is a counterregulator of cellular signaling of leptin and insulin, contributing to the molecular mechanisms of resistance to these hormones and it is expressed in glial and modulates CX43 activity. We hypothesized that alterations in the hypothalamic glial cells participate in the long-lasting effects on energy balance induced by neonatal nutritional programming. For this purpose, we used the model of neonatal nutritional programming induced by changing the litter size, according to the number of offspring per dam: 3 offsprings, small litter (SL), 10 offsprings, normal litter (NL) and 16 offsprings, large litter (LL). The body weight of the litter was determined weekly until weaning on the 21st day of life (PN21). After weaning, body weight was determined every five days until the 60th day of life (PN60). Individual dietary intake was determined between PN50 and PN60. The SL animals presented higher body weight (72.3 ± 2.08g) at weaning, when compared with the NL (57.19 ± 3.49g) and LL (36.27 ± 1.79g) groups and the difference between these groups were maintained until the PN60. However, the food intake of adult SL animals was not different from the NL group. On the other hand, LL animals presented a reduced weight gain at weaning but they had a catch up of reaching the vody weight of NL animals (NL: 165 ± 3.97g; LL: 145.42 ± 4.55g) from PN35 on, and this response was associated with higher food inatke. At PN21, there was an increase in plasma leptin (6.41 ± 0.90 ng/ml) and insulin (1.97 ± 0.11ng/ml) concentrations in the SL group, when compared with the NL group (leptin: 3.79 ± 0,35ng/ml; insulin: 1.32 ± 0.21ng/ml) and LL (leptin: 1.23 ± 0.10ng/ml; insulin: 0.99 ± 0.10 ng/ml). At PN60, both SL (leptin: 5,26 ± 1.15ng/ml, insulin: 2,53 ± 0,36ng/ml) and LL (leptin: 4.30 ± 0.51ng/ml, insulin: 3.39 ± 0.47ng/ml) groups presented increased plasma leptin and insulin concentrations compared with the group NL (leptin: 1.79 ± 0.41ng/ml; insulin: 1.19 ± 0.09ng/ml). The mRNA expression of Ptpn2 mRNA, gene encoding TCPTP, and its protein in the arcuate nucleus (ARC) was increase at PN21 in the SL group and in both groups at PN60, compared with the NL group. The SL group showed an increased immunoreactivity for GFAP at PN21 and 12 both groups showed this increased response at PN60. Similar response was observed for ionized calcium binding adaptor molecule 1 (IBA-1) immunoreactivity at PN21 and PN60. There was an overlap of TCPTP with GFAP immunoreactivity, but not with IBA-1. At PN21 there was an increase in the mRNA expression of Gja1, gene coding for CX43, as well as in the immunoreactivity of CX43 in the SL group only. At PN21 and PN60, mRNA expression of the Gja6, gene encoding for CX30, was reduced in both SL and LL groups. However, at PN60 it was reduction of CX30 immunoreactivity in both groups, SL and LL. At PN21, Il1b mRNA expression was increased in the ARC in both SL and LL groups. However, at PN60, only the LL group showed an increased Il1b mRNA expression. Additionally, at PN60 both SL and LL groups showed an increase in the Tnfa mRNA expression in the ARC. In the morphological analysis of glia cells, at PN21, there was an increase in the immunoreactivity of the microglia and astrocyte in the SL group, as well as in the extension processes of both cells. At PN60, both groups showed an increase in the soma immunoreactivity and astrocytic processe extension, however, only the SL group showed an increase in the immunoreactivity of the microglial soma. To analyze the effect of leptin on astrocyte morphology and the participation of TCPTP in this process, we performed the primary culture of hypothalamic astrocytes from neonatal rats that were stimulated with leptin [1000ng/ml], [5000ng/ml] and LPS [500ng /ml]. The LPS was used as a positive control of the protocol. We observed that the leptin and LPS stimuli increased the Ptpn2 mRNA expression, the TCPTP immunoreactivity and the astrocyte area. The LPS treatment increased the Gja1 mRNA expression and the opposite was observed in the Gja6 expression. On the other hand, both treatment with leptin and LPS increased the immunoreactivity for CX43 and the opposite was observed for the CX30 immunoreactivity. In order to evaluate the participation of TCPTP in the effects of leptin on the astrocyte morphology, we performed the silencing of its gene using the siRNA Ptpn2. The silencing of Ptpn2 was able to reverse the effects of leptin and LPS on gene expression, immunoreactivity as well as astrocyte morphology. The silencing of Ptpn2 was able to revert the reduction of CX30 and the increase of CX43 immunoreactivity and the its gene expression promoted by LPS leptin. These data are the first to show the importance of TCPTP in the modulation of connexins on the leptin and LPS effects on the morphology of hypothalamic astrocytes. Additionally, only LPS treatment was able to promote an increase in the Ptpn1 mRNA expression and Ptpn2 silencing enhanced this increase in Ptpn1 mRNA expression.These data demonstrate an unprecedented way that Ptpn2 exerts regulatory action against Ptpn1. As expected, the stimulation with LPS increased the mRNA expression of the Il6, Il1b and Tnfa. The silencing of Ptpn2 amplified this effect of LPS on cytokine gene expression, demonstrating that TCPTP has a counterregulatory action on the secretion of IL6, IL1? and Tnf?. Taken together these data demonstrate that the neonatal nutritional changes are able to promote alterations in the energy balance in the juvenile and adult life. These effects are associated with morphological changes in glial cells and increase of inflammatory cytokines, characterizing a glial reactive state. Additionally, using primary cell culture, we demonstrated that leptin alters the morphology of hypothalamic astrocytes. We also demonstrate for the first time that TCPTP modulates these effects of 13 leptin, through its actions regulating the expression of CX30. The data shown indicate the importance of non-neuronal cells in the central control of energy homeostasis in a model of neonatal nutritional programming.

Em machos, tanto o envelhecimento quanto a obesidade induzida por dieta hiperlipídica (DHL) apresentam defeitos na ação insulínica, no entanto há carência de informações sobre fêmeas. Avaliamos a sensibilidade à insulina, tolerância à glicose, o padrão estral e a expressão de proteínas da via insulínica em hipotálamo e músculo de fêmeas C57BL6. Camundongos com 10 meses de vida e com 4 meses alimentados com DHL apresentaram aumento de coxins gordurosos, resistência à insulina e intolerância à glicose em relação a seus controles. A DHL induziu redução no número de corpos lúteos, precedido de alteração do padrão estral; aumento da expressão do IR e PI3K no hipotálamo e de PI3K/AKT1 e IL-6 em músculo gastrocnêmio. No hipotálamo dos animais com 10 meses foi detectada redução na expressão do IR e TNF alpha. Confirmamos a associação entre obesidade, resistência à insulina e intolerância a glicose induzidas por dieta hiperlipídica e envelhecimento em fêmeas. Além disso, nestes modelos foi detectada modificação na expressão do IR hipotalâmico de modo distinto. / In males, aging and obesity induced by high-fat diet (HFD) show defects in insulin action, but there is a lack of information about females. We evaluated the insulin sensitivity, glucose tolerance, estrous cycle and proteins expression of the intracellular insulin pathway in the hypothalamus and skeletal muscle of female C57BL6. Ten month-old mice and 4 mo HFD fed mice had increased fat pads, insulin resistance and glucose intolerance. The HFD fed group showed impaired estrous cycle pattern followed by reduced number of corpora lutea. There were also, increased IR and PI3K protein levels in the hypothalamus and increased PI3K/AKT1 and IL-6 proteins in skeletal muscle. In hypothalamus of 10 month-old mice there was a decreased IR and TNF alpha proteins level. Thus, our data confirm the association between obesity, insulin resistance and glucose intolerance induced by HFD and aging in female mice. Moreover, there were distinct change proteins in expression of the hypothalamic IR in both animal models.

Humanos e camundongos deficientes tanto na produção da leptina quanto na expressão do seu receptor (LepR) são obesos, hiperfágicos e inférteis; o tratamento com reposição de leptina em indivíduos deficientes na produção desse hormônio garante que haja redução no peso corporal, seja retomada ciclicidade estral e a fertilidade. Ainda, o tratamento com leptina em fêmeas prépúberes normais acelera o início da puberdade, sugerindo que esse hormônio tem papel crucial no tempo de início da puberdade. Ao relacionarmos leptina e puberdade, uma informação interessante é que, neurônios que secretam hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), localizados na área pré-óptica medial (MPO) não coexpressam o LepR. Além disso, embora poucos neurônios que expressam o RNAm que codifica o gene Kiss1 do núcleo arqueado sejam responsivos à leptina, a sinalização da leptina nesses neurônios só ocorre após a puberdade e, a inativação do LepR nesses neurônios não afeta a reprodução. Por esses motivos, acredita-se que a leptina atue de forma indireta no controle da reprodução. Além dos núcleos MPO e ARH, o núcleo pré-mamilar ventral (PMv), que apresenta uma parcela de neurônios que expressam o LepR, também está envolvido na regulação neuroendócrina da reprodução. Estudos anteriores demonstraram que alterações nos níveis circulantes de estrógeno alteram características biofísicas e morfológicas de neurônios que expressam o gene Kiss1. Embora a leptina seja fundamental na maturação sexual não sabemos se os neurônios que expressam o LepR são suscetíveis a essas alterações durante a maturação sexual. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar se neurônios LepR presentes nos núcleos MPO, ARH e PMv sofrem alterações morfológicas durante a maturação sexual e mediante ausência de hormônios gonadais. Foram utilizados camundongos (fêmeas) LepR-Cre tdTomato, divididas em 4 grupos experimentais: pré-púberes, púberes, adultas e ovarectomizadas (OVX). A maturação sexual foi avaliada, para determinação do dia da abertura vaginal e primeiro estro. Nas idades específicas os encéfalos foram processados e coletados para posterior quantificação e aferição da área de superfície de neurônios LepR. Realizamos, também, imunoistoquímica de fluorescência para pSTAT3 para quantificar o percentual de neurônios responsivos à leptina. Os resultados obtidos demostraram que ocorreu um aumento no número de neurônios LepR no núcleo ARH com o avanço da idade. Porém, não houveram diferenças significativas quanto ao número de neurônios nos núcleos MPO e PMv. Também não observamos alterações na área de superfície nos núcleos analisados. Em relação a ativação de neurônios LepR via marcação de pSTAT3, o núcleo MPO apresentou uma diminuição no percentual de neurônios ativos quando comparamos os grupos pré-púberes com os grupos adulta e OVX. O oposto aconteceu no núcleo ARH onde obtivemos um aumento desse percentual com o avanço da idade. Em ambos os núcleos (MPO e ARH) o percentual de neurônios LepR ativados no grupo OVX foi estatisticamente semelhante ao grupo adulta, diferindo somente do grupo pré-púbere. O núcleo PMv não apresentou diferenças estatísticas entre os grupos analisados. Nossos dados sugerem que estrógeno e leptina podem interagir de formas distintas em diferentes regiões hipotalâmicas. / Leptin or leptin receptor (LepR) deficient humans and mice are obese, hyperphagic and infertile; leptin replacement in leptin deficient subjects is capable of reducing body mass and restores estrous cyclicity and fertility. In addition, leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice, suggesting that this hormone plays a critical role in the timing of puberty. Interestingly, the gonadotropin releasing hormone neurons, located at the medial pre-optic área (MPO) does not coexpress the LepR. Although few kisspeptin neurons in the arcuate nucleus (ARH; 15%) are responsive to leptin, leptin signaling in kisspeptin neurons arises only after pubertal development and leptin receptor inactivation in kisspeptin cells did not affect reproduction. Therefore, the effects of leptin on reproduction is believed to occur indirectly. In addition to ARH and MPO, the ventral premammillary nucleus (PMv) is also involved in the neuroendocrine regulation of reproduction and a fraction of PMv neurons coexpress LepR. Curiously, previous studies have shown that changing levels of estrogen alters the biophysical properties and morphology of hypothalamic neurons, such as expressing the ones expressing the Kiss1 gene. Although leptin has an important role on the puberty onset, it is not known whether LepR-expressing neurons are also susceptible to changes in their morphology during sexual maturation. Therefore, our goal was to investigate whether LepR-expressing neurons in the MPO, ARH and PMv nuclei are susceptible to cell morphology modifications throughout the sexual maturation and after manipulation of estrogen levels. LepR-Cre tdTomato mice (females) were divided into 4 experimental groups: prepubertal, pubertal, adult and ovarectomized (OVX). The sexual maturation was evaluated to determine the day of vaginal opening and first estrus. At specific ages the brains were processed and collected for further quantification and measurement of the surface area of LepR neurons. We also performed fluorescence immunohistochemistry for pSTAT3 to quantify the percentage of neurons responsive to leptin. The results showed that there is an increase in the number of LepR neurons in the ARH nucleus with advancing age. However, there were no significant differences in the number of neurons in the MPO and PMv nuclei. We also did not observe changes in the surface area in the nuclei analyzed. In relation to the activation of LepR neurons via pSTAT3 labeling, the MPO nucleus showed a decrease in the percentage of active neurons when comparing the prepubertal groups with the adult and OVX groups. The opposite happened in the ARH nucleus where we had an increase of this percentage with the advancement of the age. In both nuclei (MPO and ARH) the percentage of LepR neurons activated the OVX group was statistically similar to the adult group, differing only from the pre-pubertal group. The PMv nucleus did not present statistical differences between the analyzed groups. Our data suggest that estrogen and leptin may interact differently in different hypothalamic regions.

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Les neurones exprimant l'hormone de mélano-concentration (MCH) sont observés dans l'hypothalamus postérieur de tous les vertébrés, de la lamproie à l'Homme. Ces neurones sont impliqués dans diverses fonctions comme le cycle veille/sommeil ou la prise alimentaire. Ils forment une population non homogène et au moins deux sous-populations sont reconnues, chez le rat. La première sous-population est composée de neurones nés au 11ème jour de vie embryonnaire (E11) qui projettent massivement sur les régions les plus postérieures du système nerveux central. La seconde est générée à E12/E13 et les neurones la caractérisant projettent sur les régions les plus antérieures du cerveau et expriment le peptide CART (cocaine and amphetamine regulated transcript) et le récepteur NK3 (neurokinine). L'objectif de notre travail était de comprendre l'origine de ces deux sous-populations. Pour cela, nous avons utilisé des approches histologiques, moléculaires et in vitro. Les neurones à MCH sont parmi les premiers neurones à naître et à différencier leur phénotype chimique le long d'une région longitudinale définie par une prolifération intense, appelée " cell cords " par Keyser en 1972. Cette bande longitudinale est caractérisée par l'expression de gènes comme Sonic Hedgehog (Shh), Nkx2.1, Nkx2.2 et a été récemment renommée " diagonale intrahypothalamica " ou ID. La différenciation des neurones à MCH dépend de l'expression du facteur morphogène Shh et ces neurones expriment Nkx2.1 et Nkx2.2, facteurs de transcription régulés positivement par Shh. Les neurones de la première sous-population envoient des projections le long du premier tractus longitudinal à se mettre en place, le tractus postopticus (tpoc). Ceux issus de la deuxième sous-population se différencient concomitamment au développement des régions télencéphaliques et leurs projections changent de direction pour innerver les régions antérieures du cerveau sous la dépendance de protéines de guidage axonal, Nétrine1 et Slit2. Nétrine1 permet d'attirer les axones MCH exprimant le récepteur DCC précocement vers la moelle épinière et plus tardivement vers le télencéphale alors que Slit2 contraint les axones MCH exprimant Robo2 à sortir de l'hypothalamus. L'étude du modèle " MCH " permet de mettre en lumière un changement d'organisation précocement au cours du développement dans l'axe longitudinal du prosencéphale. La bande longitudinale d'expression des facteurs de transcription Shh, Nkx2.2 peut être perçue comme une extension rostrale de la colonne neurogénique médiane déjà décrite chez des espèces d'invertébrés possédant une symétrie bilatérale. Les neurones générés le long de cette colonne le sont très tôt au cours du développement.