O presente estudo teve como objetivos comparar: (i) modelos de regressão aleatória ajustados por polinômios de Legendre considerando diferentes de registros de produção no dia do controle por lactação, (ii) qualidade do ajuste dos modelos de regressão aleatória e modelos de lactação aos 305 dias para produção de leite(iii) qualidade do ajuste dos modelos de regressão aleatória e modelos de lactação aos 305 dias para produção de gordura e proteína. Foram usados dados de produção de vacas de primeira lactação coletados pelos Serviços de Controle Leiteiro e Genealógico da Associação Brasileira de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa (ABCBRH) compreendidos entre 1990 e 2011. Foram formadas quatro estruturas de dados ao restringir vacas com pelo menos 4, 6, 8 e 10 e máximo de 11 registros de produção de leite no dia do controle por lactação. Nessas estruturas foram usados modelos de regressão aleatória com polinômios de Legendre de terceira a quinta ordem. Paralelamente, uma base ou estrutura com pelo menos 6 registros de produção de leite, de gordura e proteína por lactação e uma base com registro de produção de leite, gordura e proteína em até 305 dias da lactação foram formados, sendo usados modelos de regressão aleatória de quarta e quinta ordem e modelos de lactação aos 305 dias, respectivamente.Todas as análises foram realizadas por meio da máxima verossimilhança restrita pelo programa REMLF90 nos sistemas IBM, ICE e SGI do CENAPAD-SP. Os valores de AIC, BIC, -2LogL e variância residual foram menores para os modelos de quinta ordem, porém os primeiros três ou quatro autovalores explicaram mais de 99% da variação total nos modelos com quarta e quinta ordem, conforme a estrutura de dados. Correlações de Spearman dos valores genéticos para P305 entre modelos com diferentes ordens polinomiais variaramde 0,99 a 1,00. Confiabilidades médias de valores genéticos de touros foram de 0.82, 0.80, 0.80 e 0.64 para estruturas com 4, 6, 8 e 10 registros. O ganho médio na confiabilidade dos valores genéticos para touros foi de 4% a 17% (leite), de 3% a 16% (gordura), e de 6 a 26% (proteina) maiores do que aqueles estimados pelo modelo de lactação. A diferenciação nas estruturas de dados alterou a confiabilidade dos valores genéticos de touros, conforme aumentou a restrição nos dados. Modelos de regressão aleatória são mais acurados que modelos de lactação para ajustar registros de produção de leite, gordura e proteína de animais da raça Holandesa no Brasil. / This study aimed to compare: (i) random regression models adjusted for Legendre polynomials considering different test day records by lactation, (ii) goodness of fit of random regression and lactation models for estimating breeding values for 305day milk yield, (iii) goodness of fit of random regression models and lactation models for estimating breeding values for 305day fat and protein yield.Thus data consisted of milk yield collected by the technicians of the Milk Control and Genealogy of the Brazilian Association of Holstein Breeders (ABCBRH) between 1990 and 2011.Four structures of subsets were formed by restricting cows with at least 4, 6, 8 and 10 test day milk yield records in lactation.For these structures, random regression models with Legendre polynomials of third to fifth orders were used. At same time, a base with 6 test day milk yield records for fat and protein in lactation and a base with records of total lactation yield of milk, fat and protein yields at 305 days. For these bases, random regression models of fourth and fifth order Legendre polynomials and 305 day-lactation models were used, respectively. All analyzes were performed using restricted maximum likelihood by REMLF90 program in IBM, ICE and SGI CENAPAD-SP systems. The values of AIC, BIC, -2LogL and residual variance were lower for fifth order Legendre polynomials but three or four eigenvalues explained over 99% of total variation in models of fifth and fourth orders, according to the structures of data. Spearman correlations of beeding values for Y305 between models with different polynomial orders were 0.99 and 1.00. The average reliability of breeding values of bulls was 0.82, 0.82, 0.80 and 0.64 for structures 4, 6, 8 and 10 test-days, respectively. The average gain in reliability of breeding values of bulls was between 4% and 17% (milk), 3% and 16% (fat), 6 and 26% (protein) higher than that estimated for the 305-day lactation model. The differentiation in the structures of data influenced the reliability of breeding values of bulls, according to the increasing in the restriction of test days. Random regression models are more accurate than lactation models to adjust milk, fat and protein yield records of Holstein cattle in Brazil.

No Brasil, o câncer de mama é considerado um problema significativo de saúde pública, devido a suas altas taxas de incidência e mortalidade. No Rio Grande do Sul, os índices de incidência e mortalidade situam-se entre os maiores do país. É sabido que 5-10% de todos os casos de câncer de mama são hereditários, ou seja, causados principalmente por mutações germinativas em genes de predisposição. A identificação dos casos hereditários de câncer de mama é importante por várias razões. Primeiro, porque indivíduos afetados apresentam risco cumulativo vital muito superior ao da população para o desenvolvimento de outros tipos de câncer. Segundo, porque outros familiares de um indivíduo afetado podem estar em risco para o câncer hereditário, tornando a família informada dos riscos e cuidados que devem ter ao longo da vida e, terceiro pelas medidas de rastreamento intensivo e intervenção preventiva (cirurgias profiláticas e quimioprofilaxia) que podem diminuir, significativamente, o risco de câncer em portadores de mutação. A síndromes de predisposição hereditária ao câncer de mama mais importante em número relativo de casos é a síndrome de predisposição hereditária ao câncer de mama e ovário (HBOC do inglês Hereditary Breast and Ovarian Cancer Syndrome), associada a mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2. O diagnóstico molecular da síndrome HBOC é laborioso e caro devido à heterogeneidade molecular da doença que torna necessária a análise de toda a seqüência codificadora de ambos genes na maioria das populações. Alguns estudos recentes de caracterização molecular em pacientes HBOC no mundo e no Brasil sugeriram que determinadas mutações podem aparecer em maior freqüência o que justificaria uma abordagem inicial simplificada de rastreamento para estas alterações específicas. Os objetivos deste trabalho incluíram a verificação da prevalência de rearranjos gênicos em BRCA1 e de determinadas mutações fundadoras em BRCA1 e BRCA2 em famílias brasileiras de alto risco para a síndrome HBOC. Em um grupo de 175 indivíduos em risco nãorelacionados e de descendência não-judaica rastreados para as mutações 185delAG e 5382insC (BRCA1) e 6174delT (BRCA2) foram encontrados 7 portadores da mutação 5382insC (prevalência de 4%). Em um grupo de 90 indivíduos de risco nãorelacionados rastreados para rearranjos gênicos em BRCA1 pela técnica de MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) foram identificados 7 portadores de rearranjos gênicos (7.8%), os quais estão sendo caracterizados detalhadamente quanto aos exatos pontos de quebra e ocorrência prévia em outras populações. Os resultados apresentados indicam que os rearranjos gênicos em BRCA1 são relativamente freqüentes em famílias brasileiras com o fenótipo HBOC e estudos adicionais de rastreamento de rearranjos no gene BRCA2 poderão complementar essa análise e definir a validade e aplicabilidade do rastreamento de rearranjos gênicos como primeira abordagem nos indivíduos e famílias com a síndrome HBOC.

O gênero Drosophila abrange pelo menos 1.149 espécies, subdivididas em oito subgêneros, muitas das quais vêm desempenhando um papel fundamental no desenvolvimento do conhecimento biológico, principalmente nos âmbitos genético e evolutivo. Toda esta diversidade, entretanto, ao mesmo tempo em que gera inúmeras oportunidades de pesquisa, impõe uma série de desafios taxonômicos e filogenéticos. Desta forma, apesar de Drosophila compor um dos organismos experimentais mais bem estudados, muitas questões acerca de sua evolução permanecem irresolvidos ao longo do tempo. A presente tese foi, portanto, desenvolvida com o objetivo de auxiliar na resolução de aspectos particulares relacionados à história evolutiva deste complexo grupo de espécies. Neste sentido, os Capítulos II e III foram designados com o intuito de elucidar as relações filogenéticas entre espécies e grupos tradicionalmente situados no subgênero Drosophila, com ênfase naqueles de distribuição primariamente Neotropical. A inclusão de outros gêneros pertencentes à família Drosophilidae levou, porém, a definições parafiléticas para o gênero e para o subgênero Drosophila. Mesmo assim, níveis adicionais de resolução foram acrescentados à filogenia do subgênero Drosophila, que se apresentou subdividido em duas (Capítulo II) ou três (Capítulo III) grandes radiações. Os Capítulos IV e V, por outro lado, buscaram a inferência de cenários evolutivos mais restritos. No Capítulo IV o foco foi um pequeno grupo de espécies pertencente ao subgênero Drosophila, o grupo mesophragmatica, para o qual se obteve descrições evolutivas confiáveis. No Capítulo V, por outro lado, o grupo willistoni, pertencente ao subgênero Sophophora teve sua complexidade evolutiva mais uma vez reiterada. Em cada um destes casos, entretanto, novos estudos são incentivados para que um dia realmente nos aproximemos da história evolutiva verdadeira do gênero Drosophila. / The genus Drosophila encompasses at least 1.149 species subdivided into eight subgenera, many of which presented a central role in the development of the biological knowledge, mainly in the genetical and evolutionary areas. However, at the same time that this diversity provides numberless opportunities of research, it imposes a set of taxonomic and phylogenetic challenges. Thus, although Drosophila composes one of the best studied experimental organisms, many questions concerning its evolution remain unsolved through time. This thesis was developed with the aim of helping to solve particular questions related to the evolutionary history of this complex group of species. In this sense, Chapters II and III were designed with the aim of elucidating the phylogenetic relationships within and between species groups traditionally placed in the Drosophila subgenus, with an emphasis in those mainly Neotropical in distribution. The inclusion of other Drosophilidae genera, nevertheless, led the Drosophila genus and subgenus entirely paraphyletic. Even so, improved levels of resolution were provided to the subgenus Drosophila phylogeny, which was subdivided into two (Chapter II) or three (Chapter III) major radiations. Chapters IV and V, on the other hand, addressed more restricted evolutionary scenarios. In Chapter IV the focus was a small group of species included in the Drosophila subgenus, the mesophragmatica group, for which a confident evolutionary description was attained. In Chapter V, otherwise, the willistoni group, included in the Sophophora subgenus, had its evolutionary complexity once again reiterated. In each of these cases, nevertheless, new studies are encouraged in order to approach the genus Drosophila real evolutionary history.

A identificação de alelos e genótipos associados a características reprodutivas, somente foi possível a partir do desenvolvimento e da localização de marcadores moleculares polimórficos no genoma, especialmente os short tandem repeated (STRs) e os single nucleotide polymorphysm (SNPs). A termografia infravermelho tem sido amplamente empregada como um método não invasivo na determinação da temperatura da superfície corporal, mostrando-se uma técnica promissora na avaliação da adaptação a efeitos ambientais. Portanto, O objetivo geral deste estudo foi identificar marcadores moleculares relacionados à fertilidade de touros e utilizar a termografia infravermelho na avaliação adicional ao exame da aptidão reprodutiva desses animais, medindo-se a temperatura da superfície escrotal. A amostra constou de 87 touros submetidos à analise e acompanhamento da mensuração do perímetro escrotal (PE), dos 7 aos 24 meses de idade. Esses touros foram analisados andrologicamente aos 24 meses pela Classificação Andrológica por Pontos (CAP). Subsequentemente, 17 reprodutores da amostra tiveram seu PE medido e foram examinados e pontuados pelo CAP aos 28, 32 e 36 meses de idade. Não foi verificada associação entre os marcadores STRs BMS3004, HEL5, AFZ1, IDVGA51 e ILSTS002 e a desempenho reprodutivo em ambos os experimentos. O SNP FSHR mostrou significativa relação com o genótipo GG para menor PE aos 24 meses. Os genótipos CG e GG foram significativos para identificação do PE inferior a 29 cm e o genótipo CC para maior pontuação no CAP. Durante o experimento II no SNP FSHR foi encontrada relação ao maior PE aos 7meses, 24meses, 28 meses, 32 meses e 36 meses de idade com o genótipo CC, mas nada foi encontrado de relação com o CAP em ambos os marcadores. Em conclusão, observamos uma forte associação do SNP FSHR com o genótipo GG para PE reduzido e CAP superior no genótipo CC, e a possibilidade de quando encontrado os genótipos CG e GG, encontrar um PE inferior a dois desvios a menos da média da raça. Durante o experimento II também foram avaliados os efeitos sazonais do ambiente sobre a qualidade do sêmen em reprodutores, utilizando-se termografia infravermelho. Variações de gradiente de temperatura escrotal foram significativamente maiores no outono (4.5°C) e inverno (4.0°C) do que na primavera (2.9°C) e verão (0.9°C) (P<0,05). Temperaturas do globo ocular foram mais baixas no inverno (27.6°C) e outono (26.8°C) em relação ao verão (33.9°C) e primavera (31.1°C) (P<0,05). Motilidade do sêmen,movimento de massa e vigor diminuíram no verão em comparação com as outras estações. Concluiu-se que a termografia infravermelho pode ser adotada como um método indireto para avaliar gradiente testicular e suas consequências aos aspectos físicos seminais. / The identification of alleles and genotype associated with these features was only possible through the development and localization of polymorphic molecular markers in the bovine genome, especially the short tandem repeated (STR) and single nucleotide polymorphysm (SNP). Infrared thermography has been widely used as a noninvasive method for determining the temperature of the body surface. This tecnhique shows a promising method to assess the adaptation of environmental effects. Therefore, the aim of this study was to identify molecular markers that are linked to bulls fertility. We also evaluted the uses of infrared thermography to evaluate the reproductive performance of bulls, measuring the surface temperature of the scrotum. Samples were collected from of 87 bulls submitted to analysis from 7 to 36 mo of age measurement of scrotal circumference and analyzed by BBSE. Subsequently, 17 bulls the previous sample measured and had their PE and was examined by BBSE at 28, 32 and 36 mo old. There was no significant association between markers BMS3004 STRs, HEL5, AFZ1, IDVGA51 ILSTS002 and reproductive performance in both experiments. The FSHR SNP showed a significant association with the GG genotype for low SC at 24 mo. The CG and GG genotypes were different for identification of SC less than 29 cm and CC genotype for highest score the BBSE. During the second experiment, in relation to the SNP FSHR at 7, 24, 28, 32 and 36 mo of age were found different with the CC genotype, but no correlation was found in relation to the BBSE in both markers. In conclusion, we observed a strong association of FSHR SNP genotype GG higher for SC and BBSE reduced the possibility of CC genotype and when found the CG and GG genotypes. During the second experiment also, we evaluated the seasonal effects of the environment on semen quality in breeding using infrared thermography images data that were collected using an infrared camera. Changes in temperature scrotal gradient were significantly higher in autumn (4.5° C) , winter (4.0°C) and spring (2.9°C) compared to the summer (0.9°C) (P < 0.05). Ocular temperatures were lower in winter (27.6°C) and autumn (26.8°C) compared to summer (33.9°C) and spring (31.1°C) (P < 0.05). Sperm motility, mass motion and vigor decreased in the summer compared with other seasons. It was concluded that infrared thermography can be used as an indirect method to assess testicular gradient and its consequences to the seminal physical aspects.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-08-29T11:55:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2457163 bytes, checksum: bce7b329e84101c7a66a1aba52f14b85 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-29T11:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2457163 bytes, checksum: bce7b329e84101c7a66a1aba52f14b85 (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A citogenética compreende o estudo do cariótipo das espécies por meio de técnicas clássicas (número e morfologia dos cromossomos e bandamentos) e moleculares (por exemplo hibridização in situ fluorescente - FISH). Os estudos citogenéticos, clássicos e moleculares, em formigas têm grande aplicabilidade em áreas como evolução, conservação de espécies e na taxonomia. O conceito de taxonomia integrativa evidencia a importância da integração de dados de diversas áreas da ciência para auxiliar na delimitação de espécies. Dados citogenéticos moleculares empregando FISH para localização de genes ribossomais em formigas neotropicais são escassos e disponíveis apenas para 25 espécies. A maioria das espécies apresentou um par cromossômico carreador desses genes, exceto Dinoponera gigantea e Camponotus renggeri. Esses genes mostraram-se ricos em pares de bases GC em praticamente todas as espécies, com exceção de Dolichoderus voraginosus. A aplicação dos estudos citogenéticos moleculares para a compreensão da evolução cromossômica e auxilio a resolução taxônomica demonstrado até o momento em Formicidae, mostra a relevância da extensão de estudos que visem o mapeamento físico de genes rDNA nas diferentes espécies de formigas. Assim, no primeiro capítulo foi realizado a FISH para mapeamento físico de genes ribossomais 18S em 10 espécies de formigas neotropicais com representantes em três subfamílias (Ponerinae, Formicinae, Myrmicinae), além do emprego da técnica de coloração com o fluorocromo CMA 3 , com o intuito de verificar a composição de bases desses genes. No segundo capítulo, seguindo a proposta da taxonomia integrativa, foram estudadas por meio da citogenética clássica e molecular quatro espécies de Gnamptogenys (Ectatominae), sendo uma delas, a Gnamptogenys striatula, uma espécie de ampla complexidade taxonômica. Todas as quatorze espécies estudadas apresentaram um par carreador dos genes rDNA 18S que coincidiram com as regiões ricas em pares GC, semelhante a maioria das espécies estudadas. Em Wasmannia auropunctata e Camponotus atriceps foi observado um heteromorfismo sutil do tamanho das regiões de rDNA 18S que pode ter origem por duplicações/deleções devido à crossing-over desigual. Polimorfismos cromossômicos envolvendo regiões de genes ribossomais 18S foram observados em Odontomachus bauri e Gnamptogenys regularis, que podem ter origem por duplicações/deleções dessas sequências gênicas repetitivas. Esses dados são inéditos em formigas. Os genes rDNA 18S localizados na região pericentromérica de um par metacêntrico na formiga cultivadora de fungo Myrmicocrypta sp. pode indicar uma característica ancestral nesse grupo. A localização dos genes rDNA 18S observada em Acromyrmex echinatior representa uma evidência de uma inversão cromossômica em Acromyrmex. Os números cromossômicos e fórmulas cariotípicas observadas nas quatro Gnamptogenys spp. foram: 2n=24 (18m+6sm) em G. triangularis de Araponga-MG, 2n=26 (24m+2sm, 25m+1sm) em G. regularis de Ponte Nova-MG, 2n=32 (20m+10sm+2st) em G. striatula do Rio de Janeiro-RJ, 2n=34 (18m+8sm+8st, 18m+7sm+9st) em G. striatula de Petrópolis-RJ, 2n=34 (18m+8sm+8st) em G. moelleri de Viçosa-MG e Petrópolis-RJ e 2n=44 (22m+14sm+8st) em G. moelleri de Açailândia-MA. Em G. striatula de Petrópolis foi observado um polimorfismo cromossômico no par cromossômico 17, que pode ter sido originado de duplicações devido à crossing-over desigual ou translocações. Embora G. moelleri apresente caracteres morfológicos bem estabelecidos, a população de Açailândia apresentou nítidas variações cromossômicas em relação às populações de Viçosa e Petrópolis, sugerindo que essas podem ser espécies crípticas e isso deve ser melhor investigado. Diferenças cariotípicas foram observadas entre as populações de G. striatula do Rio de Janeiro e Petrópolis demonstrando que a citogenética pode ser uma ferramenta útil na resolução dos problemas taxonômicos dessa espécie. / Cytogenetics includes the study of the karyotype of the species through classical techniques (number, morphology of chromosomes, and banding) and molecular techniques (e.g. fluorescence in situ hybridization - FISH). The classical and molecular cytogenetics studies have widely applied in evolution, species conservation and taxonomy. The definition of integrative taxonomy highlights the importance of integrating data from different areas of science to assist the delimitation of species. Molecular cytogenetic data that have used FISH to physically map the ribosomal genes of Neotropical ants are scarce, and such data are available for only 25 species. Most species showed a single pair of NOR bearers, except Dinoponera gigantea and Camponotus renggeri. These genes are rich in GC base pairs in practically all species, with the exception of Dolichoderus voraginosus. The application of molecular cytogenetic studies to the understanding of chromosome evolution and aid to the taxonomic resolution demonstrated to date in Formicidae shows the relevance of the extension of studies aimed at the physical mapping of rDNA genes in the different ant species. Thus, in the first chapter, FISH was used to physical map 18S ribosomal genes in ten Neotropical ant species with representatives of three subfamilies (Ponerinae, Formicinae, Myrmicinae). In addition, the CMA 3 fluorochrome staining technique was performed, in order to verify the base composition of these genes. . In the second chapter, following integrative taxonomy proposal, four species of Gnamptogenys (Ectatominae) were studied through classical and molecular cytogenetics. One of them was Gnamptogenys striatula, which has a complex taxonomy. All fourteen studied species showed a pair of 18S rDNA bands that coincided with GC-rich regions, similar to the most of the species already studied. In Wasmannia auropunctata and Camponotus atriceps, a small heteromorphism in the size of the 18S rDNA regions was observed, which may have origin in duplications/deletions due to unequal crossing-over between homologous chromosomes. Chromosomal polymorphisms involving 18S ribosomal genes regions were observed in Odontomachus bauri and Gnamptogenys regularis, which may have origin in duplications/deletions of these repetitive genetic sequences. These data are inedited in ants. The 18S rDNA genes located in the pericentromeric region of a metacentric pair on the fungus-growing ant Myrmicocrypta sp. may indicate an ancestral characteristic in this group. The location of the 18S rDNA genes observed in Acromyrmex echinatior represents an evidence of a paracentric inversion in Acromyrmex. The karyotypes observed in the four Gnamptogenys spp. were: 2n=24 (18m+6sm) in G. triangularis from Araponga- MG, 2n=26 (24m+2sm, 25m+1sm) in G. regularis from Ponte Nova-MG, 2n=32 (20m+10sm+2st) in G. striatula from Rio de Janeiro-RJ, 2n=34 (18m+8sm+8st, 18m+7sm+9st) in G. striatula from Petrópolis-RJ, 2n=34 (18m+8sm+8st) in G. moelleri from Viçosa-MG and Petrópolis-RJ and 2n = 44 (22m + 14sm + 8st) in G. moelleri from Açailândia-MA. In G. striatula from Petrópolis, a chromosomal polymorphism was observed in pair 17, which may have origin in duplications due to unequal crossing-over or translocations. Although G. moelleri presented well defined morphological characters, the population of Açailândia presented distint chromosomal variations in relation to those of Viçosa and Petrópolis, suggesting that these may be cryptic species and which should be further investigated. Karyotype differences were observed between populations of G. striatula from Rio de Janeiro and Petrópolis, indicating that cytogenetics may be an auxiliary tool for solving taxonomic problems of this species.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T05:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MariaSileudaMoreirade_M.pdf: 4472014 bytes, checksum: c608f97693c57bd85f52a46bfd836a3d (MD5) Previous issue date: 1999 / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador : Laura Maria Mariscal Ottoboni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T10:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_EdnaLobo_M.pdf: 8817376 bytes, checksum: b4419889c5d139f715652a53bb461fa3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador: Orly Zucatto Mantovani de Assis / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Educação / Made available in DSpace on 2018-07-28T12:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barroso_LarissaMachadodeSouza_M.pdf: 1371609 bytes, checksum: 3a3880554aa05d6b52020623641e23c1 (MD5) Previous issue date: 2000 / Mestrado

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-09-12T18:53:45Z No. of bitstreams: 1 tarsilaferreiraguimaraesgoyata.pdf: 1000273 bytes, checksum: be5992580eacbf673c2b1da15204d40e (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-01T19:28:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tarsilaferreiraguimaraesgoyata.pdf: 1000273 bytes, checksum: be5992580eacbf673c2b1da15204d40e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-01T19:28:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tarsilaferreiraguimaraesgoyata.pdf: 1000273 bytes, checksum: be5992580eacbf673c2b1da15204d40e (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / A Brucelose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Brucella que infectam o homem e uma grande variedade de animais, principalmente o gado. Em humanos causa febre ondulante, endocardite, artrite e osteomielite enquanto em animais causa aborto e infertilidade. Essa enfermidade é considerada a zoonose mais prevalente no mundo, com mais de 500.000 novos casos relatados por ano. Somente no Brasil, a Brucelose causa um impacto econômico estimado de 32 milhões de dólares ao ano. A resposta imune contra a Brucella envolve vários mecanismos da imunidade inata e adquirida entre os quais a citocina IFN-y, típica do perfil TH1, e as células T CD8+ executam um papel de destaque. IFN-y ativa macrófagos induzindo a produção de radicais derivados de oxigênio e nitrogênio essenciais no combate ao patógeno, além de ativar células NK. Já os linfócitos T CD8+ lisam as células infectadas destruindo o patógeno ou deixando-o vulnerável aos mecanismos extracelulares da imunidade. Assim, estes mecanismos são essenciais para o controle efetivo da infecção. Diversos trabalhos têm mostrado que a Talidomida, um derivado do ácido glutâmico, é capaz de induzir a formação de um perfil TH1, com elevada produção de IFN-y, além de co-estimular e induzir a proliferação e produção de citocinas por linfócitos T CD8+. De fato, trabalhos prévios de nosso grupo demonstraram que o tratamento prévio com Talidomida é capaz de aumentar a resistência de camundongos C57BL/6 contra Brucella, aliada ao aumento na produção de citocinas (IL-12 e IFN-y), óxido nítrico e células T CD8+. Assim, uma vez que a Talidomida apresenta um amplo espectro de ações, o objetivo deste estudo foi avaliar outros mecanismos imunológicos afetados pela Talidomida e que estejam associados ao aumento da resistência ao patógeno. Nosso foco não é o tratamento com a Talidomida em si, mas embasar o desenvolvimento de novos compostos ou componentes vacinais que auxiliem no combate a esta importante patologia. Como metodologia, primeiramente foi confirmada a carga bacteriana esplência uma semana após infecção, em animais previamente tratados com Talidomida. Em seguida a proliferação celular e o perfil de células regulatórias foram determinados em esplenócitos derivados de animais tratados e infectados. Em relação a imunidade inata, a ação da Talidomida foi avaliada através da produção de citocinas (IL-6 e TNF-α) e de óxido Nítrico. Por fim, avaliamos a influência da talidomida na sobrevivência de animais “Knockout” para IFN-y após a infecção por Brucella e se o tratamento com a droga é capaz de alterar a proteção induzida pela vacinação com a cepa RB51. Como resultados, foi percebida uma significativa redução na carga bacteriana de animais tratados com Talidomida em relação aos animais não tratados. Essa redução foi acompanhada de um aumento na proliferação linfocitária e da diminuição no percentual de células T regulatórias. Em relação aos macrófagos, foi percebido um aumento na produção de óxido nítrico em células tratadas com a droga após estímulo com a bacteria. Por fim, o tratamento com Talidomida não foi capaz de conferir maior nível de proteção a animais vacinados com a cepa RB51 e nem modificou o tempo de vida de animais “Knockout” para IFN-y infectados com B. abortus. Assim, o presente estudo conclui que a talidomida é capaz de potencializar a eliminação da Brucella abortus in vivo, e que esta potencialização é dependente da produção de IFN-y e óxido nítrico, bem como da redução do perfil regulatório. / Brucellosis is a zoonotic disease caused by bacteria of the genus Brucella that infects humans and a wide variety of animals, especially cattle. In humans it causes undulant fever, endocarditis, arthritis and osteomyelitis while in animals causes abortion and infertility. This disease is considered the most prevalent zoonosis in the world, with more than 500,000 new cases reported annually. Only in Brazil, Brucellosis causes an estimated economic impact of $ 32 million annually. The immune response against Brucella involves different mechanisms of innate and acquired immunity among which IFN-y cytokine, typical of TH1 profile, and CD8+ T cells have an important role. IFN-y activates macrophages by inducing the production of radicals derived from oxygen and nitrogen essential to combat the pathogen and activate NK cells. Already, CD8+ lymphocytes lyse infected cells by destroying the pathogen or leaving it vulnerable to extracellular mechanisms of immunity. So, these mechanisms are essential for an effective infection control. Several studies have shown that thalidomide, a derivative of glutamic acid, is able to induce the formation of a TH1 profile with high production of IFN-y, and to co-stimulate and induce proliferation and cytokine production by CD8 + T lymphocytes. In fact, previous studies from our group demonstrated that previous treatment with thalidomide is able to increase the resistance of C57BL/6 mice against Brucella, coupled with the increase in cytokine production (IL-12 and IFN-y), nitric oxide and CD8+ T cells. Therefore, since the Thalidomide has a broad spectrum of actions, the objective of this study was to evaluate other immune mechanisms affected by Thalidomide and which are associated with increased resistance to the pathogen. Our focus is not the treatment with thalidomide itself, but undergird the development of new compounds or vaccine components that help in combating this important disease. As methodology, firstly was confirmed the bacterial load one week after infection in animals previously treated with Thalidomide. Then the profile of regulatory cells and cell proliferation were determined in splenocytes derived from treated and infected mice. Regarding innate immunity, the action of thalidomide was evaluated by the production of cytokines (IL-6 and TNF-α) and nitric oxide. Finally, we evaluated the influence of thalidomide on survival of animals "IFN-y Knockout” after Brucella infection and if the treatment with the drug is able to change the protection induced by vaccination with strain RB51 protection. As results, it was noticed a significant decrease in bacterial load of animals treated with thalidomide compared to untreated animals. This reduction was accompanied by an increase in lymphocyte proliferation and decrease in the percentage of regulatory T cells. With regard to macrophages, an increase in nitric oxide production in cells treated with the drug was seen after stimulation with bacteria. Finally, treatment with thalidomide was not able to confer higher level of protection to animals vaccinated with RB51 strain and did not change the life of animals "Knockout" for IFN-y infected with B. abortus. So, this study concludes that thalidomide is able to enhance the elimination of Brucella abortus in vivo, and that this enhancement depends on the IFN-y and nitric oxide as well as the reduction in the regulatory profile.

Orientador : Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_PericlesMendoncaDiasda_D.pdf: 28986078 bytes, checksum: 7671ac8cbb611b4ea7ab9230a9d96ae6 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A anemia falciforme é uma alteração genética das hemácias, caracterizada por hemólise crônica e episódios de crises de oclusão vascular. O defeito genético consiste em uma mutação na posição 6 da cadeia f3da hemoglobina, que confere às hemácias alterações na sua forma e estrutura, tornando-as mais rígidas, deformadas e distorcidas, com tendência para a formação de polúneros e conseqüente obstrução do fluxo sanguíneo. Um simples ponto de mutação transforma a anemia falciforme em uma entidade clínica heterogênea, sugerindo a idéia de que diferentes mecanismos possam estar envolvidos. O mecanismo exato, pelo qual o fluxo sanguíneo normal é interrompido pelas hemácias, ainda não é totalmente esclarecido. Numa doença como a anemia falciforme, na qual a velocidade da passagem das hemácias rígidas pelos vasos sanguíneos tem importância relevante, o tônus e a regulação vascular assumem papel primordial, sendo este controle mediado, em parte, pelo óxido nítrico, cuja ação é inibidapelo superóxido. Diversos estudos têm indicado o envolvimento da lesão endotelial e do processo inflamatório subclínico no desencadeamento e progressão dos processos da oclusão vascular. A participação dos leucócitos no dano aos tecidos dos pacientes com anemia falciforme é objeto de investigação, sendo a leucocitose um fator de mau prognóstico na doença. Investigou-se inicialmente a liberação do óxido nítrico pelos leucócitos, analisando sua capacidade de inibir a agregação de plaquetas lavadas induzida pela trombina. Os resultados mostram que os granulócitos de pacientes com anemia falciforme (n=9) liberam óxido nítrico de maneira similar aos granulócitos de controles sadios (n=9), pois foi necessário um número semelhante de células para inibir a agregação plaquetária (mediana de 4,4 x 106e 4,3 x 106,respectivamente). Na ausência de SOD, não foi detectada liberação de óxido nítrico pelos leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme (n=9), pois eles não afetaram a agregação de plaquetas nesta situação. Na presença de SOD, não houve diferença na liberação do óxido nítrico entre leucócitos mononucleares de pacientes com anemia falciforme e controles, pois o número de leucócitos mononucleares necessário para inibir a agregação de plaquetas foi semelhante entre os pacientes (mediana de 3,4 x lO6ml, n=9) e os controles sadios (mediana de 3,3 x lO6ml,n=9). Os fagócitos contêm uma nicotinamida adenina inuc1eotídeofosfato (NADPH) oxidase (forma reduzida) associada à sua membrana citoplasmática, que gera superóxido e outros reativos intermediários tóxicos do oxigênio, os quais apresentam potencial de injúria aos tecidos. O sistema NADPH-oxidase é composto por cinco subunidades: p40-pho / Abstract: Sickle cell anemia is a genetic disorder of red blood cells characterized by chronic hemolysis and episodic vaso-oclusive crisis. The molecular defect is caused by a point mutation at the 6thposition ofthe f3chain ofhemoblobin, which leads erythrocytes to abnormal sickle shape, rigidity, deformability and distortion with consequent blood flow obstruction. A single point mutation leads sickle cell disease to a clínical heterogenous disorder, supporting the idea that a different set of mechanisms might be involved in this disease. It is still not completely understood how sickle erythrocytes interrupt blood flow. Current evidence indicate that endothelium damage, and a subclínical inflammatoryprocess take place in the initiation and progression of vascular occlusion. The role of leukocytes in the tissue injury of sickle cell anemia patients is a current subject of investigation. The NADPH-oxidase system of professional phagocytes catalyzes the production of superoxide by the one-eletron reduction of oxigen (respiratory burst). This is the starting point for the production of reactive oxidants species, which are potential tissueinjury mediators. The NADPH-oxidase system is composed by tive components: p40-Phox p4TPh°x,p6Tphoxexist in the cytosol as a complexoThe other two components gp91-phoxandp22-PhOX form the cytocrome b558in the cell membrane and function as the terminal electron carrier ofthe oxidase. Afier activation, the cytosolic complex migrate to membrane binding to citocrome b558and assemblythe active oxidase. The involvement of the leukocyte NADPH-oxidase system has not been investigated before in sickle cell anemia. The experimental approach was focused on: a) the release of nitric oxide by neutrophils and mononuclear leukocytes ITom sickle cell anemia patients. It was assayed by the ability of leukocytes to inhibit thrombin-induced washed platelet aggregation. Neutrophils ITom sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those ITomhealthy controls. The inhibition of platelet aggregation by neutrophils ftom sickle cell anemia or ftom hea1thycontrols was blocked by L-NAME (300JlM), but not by D-NAME (300JlM), and was reversed by L-arginine (lmM). Additionaly, a similar number of neutrophils ftom sickle cell anemia patients and írom healthy controIs was required to inhibit platelet aggregation. Mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients inhibited platelet aggregation only in the presence of superoxide dismutase (60 U rnl-I) b) the release of superoxide by neutrophils and mononuc1earsickle cell anemia leukocytes. lt was assassed by the SOD specific inhibition of cytochrome c reduction assay. PMA (30nM) or ZYM (100 partic1es/cell)-induced release of superoxide by mononuc1ear leukocytes :lTomsickle cell anemia patients was significant1yhigher than that observed in mononuc1ear leukocytes írom healthy controIs (p<0,001 e p<O,Ol, respectively, Mann-Whitney test). The levels of superoxide released by neutrophils írom sickle cell anemia patients was similar to those írom healthy controIs. c) the activity of SOD or cellular glutathione peroxidase in neutrophils and mononuc1ear leukocytes írom sickle cell anemia patients was assayed by the xantine-oxidase induced cytochrome c reduction and the cellular glutathione peroxidase activity was asseyed by the NADPH oxidation induces by tbuthyl hydroperoxide. The activites of SOD and GHS-Px in neutrophils and mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes were similar to those ITom healthy controIs d) the gene expression of gp91-phox, p22-phoxand p6Tphoxin mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes. Monocytes' RNA :lTom steady state sickle cell disease patients and healthy control subjects were used in a quantitativerelative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The results revealed that gp91-phoxrelative gene expression in mononucIear leukocytes írom sickle cell anemia patients (n=21) was significant1yhigher compared to healthy controIs (n=23, p=0,03, Mann-Whitney test) and that p2Tphox(n=24 patients, 24 controls) and p6Tphox(n=22 patients, 22 controls) relative gene expression in mononuc1ear sickle cell anemia leukocytes was similar to healthy controIs.e) the phosphorylation of a group of 47kDa cell proteins. It was assayed by the incorporation of 32P-Labeledby sickle cell (n=4, 4 x1O7cells/rnl) or healthy controls (n=6, 4 xl07 cells/rnl) mononuclear leukocytes, in basal state or after stimulation with PMA (30nM). We found a higher phosphorylation in 47kDa protein sickle cell mononuclear leukocytes than in healthy controls. Conclusions The results have shown that leukocytes :&om sickle cell anemia patients released nitric oxide in a similar manner to those :&omhealthy controls; sickle cell anemia mononuclear leukocytes release more superoxide, when stimulated with PMA or ZYM, than mononuclear leukocytes ITom healthy controls; gp91-PhoXgene expression is upregulated in monocytes :&omsickle cell patients compared to healthy controls, and the phosphorylation of 47kDa proteins in sickle cell anemia mononuclear leukocytes is more intense than healthy controls. The NADPH-system is activated in sickle cell anemia mononuclear leukocytes and may be responsible, at least in part, for the inactivation of nitric oxide. This may contribute to inflammationand vascular dysregulation in sickle cell disease / Doutorado / Pediatria / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente