Resumo não disponível.

Óxido nítrico (NO) é uma molécula que exerce uma multiplicidade de funções fisiológicas importantes que vêm sendo estudadas em diversos tecidos. No entanto, o papel do NO em processos fisiológicos e patológicos no músculo estriado é pouco conhecido, apesar de algumas evidências apontarem para uma função de regulação redox e interação com células satélites progenitoras. Neste estudo avaliamos a participação do NO na regeneração muscular em um modelo de inflamação aguda in vivo. O trauma muscular foi induzido por um aparelho similar a uma prensa com impacto direto sobre o gastrocnêmio. Foram utilizados 40 ratos, Wistar, divididos em quatro grupos: (i) controle (CO); (ii) falso (sham) trauma; (iii) trauma; (iv) trauma com exposição ao nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), um inibidor da sintase do óxido nítrico, em dois tempos experimentais: 24 horas e 7 dias após lesão. Vinte e quatro horas após o trauma, o músculo lesionado apresentava intensa vasodilatação e reação inflamatória na análise histológica, lipoperoxidação tecidual e estresse nitrosativo, aumento do mRNA das citocinas próinflamatórias (IL-1β, IL-6, iNOS), metaloproteinase-2, expressão proteica de iNOS e MMP-2, ativação do NF-κB e intensa atividade proliferativa. O tratamento com LNAME diminuiu significativamente os achados das alterações histológicas e moleculares em 24 horas após a lesão e, sete dias após o trauma, houve um aumento na expressão do TGF-β, na deposição de colágeno e proliferação celular. Entretanto, o grupo tratado com L-NAME apresentou uma maior expressão de TGF-β e de deposição de colágeno quando comparado ao grupo trauma e proliferação celular semelhante. Estes resultados indicam que a lesão muscular é associada com a ativação do sistema NO, o qual parece estar envolvido no equilíbrio entre os processos de regeneração e fibrose durante o reparo. / Nitric oxide (NO) is a molecule that carries a variety of important physiological functions that have been studied in various tissues. However, the role of NO in physiological and pathological processes in striated muscle is poorly known, although some evidence suggests a role of redox regulation and interaction with progenitor satellite cells. We evaluated the role of NO in muscle regeneration in a model of acute inflammation in vivo. The muscle trauma was induced by a device similar to a press with a direct impact on the gastrocnemius. A total of 40 rats were divided into four groups: (i) control (CO), (ii) sham trauma, (iii) trauma, (iv) trauma + L-NAME, an inhibitor of nitric oxide synthase in two experimental phases: 24 hours and 7 days after injury. Twenty-four hours after the trauma, the injured muscle showed intense vasodilatation and inflammation in the histological analysis, tissue lipid peroxidation and nitrosative stress, activation of NF-κB, increased mRNA of pro-inflammatory, (IL- 1β, IL-6, iNOS), metalloproteinase-2 and HGF, and increased total cell proliferation. The administration of the L-NAME significantly reduced iNOS, MMP-2 and activation of NF-κB reduced the histological and molecular findings 24 hours after injury, and 7 days after injury, there was an increase in the expression of TGF-β, collagen deposition, and total cell proliferation. However, the L-NAME group showed increased expression and collagen deposition when compared to the trauma and similar total cell proliferation. These results indicate that muscle injury is associated with activation of the NO, which seems to be involved in the balance between the processes of regeneration and fibrosis during the repair.

O óxido nítrico (NO) é um gás produzido através da ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS), e age como um neurotransmissor no sistema nervoso de moluscos gastrópodos adultos. Não há informações, até o momento, da presença de neurônios contendo NOS em caracóis da espécie Megalobulimus abbreviatus, tanto jovens quanto adultos. Consequentemente, foi utilizada a técnica histoquímica da NADPH-d para mapear a distribuição nitrérgica no sistema nervoso central (SNC) de animais adultos e jovens. A reação foi observada em neurônios e fibras em todos os gânglios (pedais, pleural direito, pleural esquerdo, parietal direito, parietal esquerdo, visceral, cerebral e bucal) do SNC de caracóis jovens e adultos, e foi particularmente forte nos gânglios pedais e cerebral, onde neurônios positivos foram encontrados agrupados simetricamente nos gânglios pareados. Estes resultados fornecem evidência da existência de um sistema nitrérgico em M. abbreviatus jovens e adultos, onde a NOS foi encontrada em regiões específicas do SNC. Para estabelecer um possível envolvimento do NO no circuito nociceptivo neste caracol, usando histoquímica para NADPH-d e análise semiquantitativa de densidade óptica, foram caracterizados os neurônios produtores de NO nos gânglios pedais de M. abbreviatus jovens e adultos, sujeitos a estímulo térmico aversivo. Os animais foram sacrificados em diferentes tempos (3, 6, 12 e 24h) após o estímulo. A atividade enzimática foi detectada em diferentes grupos celulares e processos neuronais. Em todas as sub-regiões dos gânglios pedais estudadas, a densidade óptica de neurônios positivos (p<0,05) e da área neuropilar 1 (p<0,01) foi significativamente diferente em animais tratados quando comparados com os controles. O aumento na atividade nitrérgica induzida por estímulo nociceptivo sugere o envolvimento do NO no circuito nociceptivo de M. abbreviatus, o que foi verificado através do estudo da ação do NO na resposta de latência do caracol M. abbreviatus após estímulo térmico e químico, e na atinocicepção mediada por opióides. Doses do inibidor da NOS NG-nitro-L-arginina-metil ester, L-NAME (1 μg/kg, 10 μg/kg e 25 μg/kg) e do agente liberador de NO S-nitro-Nacetilpenicilamida, SNP (1 μg/kg, 10 μg/kg e 25 μg/kg) foram administradas para determinar o efeito do NO nas respostas de latência. Com a dose mais alta de L-NAME (25 μg/kg), a resposta de latência foi significativamente maior (p<0,001) e com a dose mais alta de SNP (25 μg/kg) a resposta de latência foi significativamente menor (p<0,001) quando comparadas com as outras doses, e com os grupos controle e salina. A dose de 25 μg/kg de L-NAME produziu um efeito analgésico similar ao da morfina. Também foi observado que a antinocicepção induzida por morfina foi significativamente potencializada por L-NAME (p<0,05) e reduzida, mas não bloqueada, por SNP (p<0,05) em animais submetidos aos estímulos térmico e químico, demonstrando que o NO apresenta um efeito pró nociceptivo neste modelo animal. / Nitric oxide (NO) is a gas produced through the action of the enzyme nitric oxide synthase (NOS) and acts as a neurotransmitter in the nervous system of adult gastropod molluscs. There appears to be no information on the presence of NOS-containing neurons in adult and young Megalobulimus abbreviatus. Accordingly, we used NADPH-d histochemistry to map the nitrergic distribution in the central nervous systems (CNS) of young and adult animals. The reaction was observed in neurons and fibers in all CNS ganglia of both young and adult snails (pedal, right pleural, left pleural, right parietal, left parietal, visceral, cerebral and buccal), and was particularly strong in the pedal and cerebral ganglia where positive neurons were found clustered symmetrically in the paired ganglia. These results provide evidence for the existence of a nitrergic signaling system in young and adult M. abbreviatus where NOS was found in specific regions of the CNS. In order to establish a probably involvement of NO in the nociceptive circuit in M. abbreviatus, using NADPH-d histochemistry and semi-quantitative optical densitometry, were characterized the NO-producing neurons in the pedal ganglia of young and adult Megalobulimus abbreviatus, subjected to aversive thermal stimulus. The animals were sacrificed at different times (3, 6, 12 and 24h) following stimulus. The enzymatic activity was detected in different cellular subsets and neuronal processes. In all the studied pedal ganglia subregions, the optical density of positive neurons (p<0.05) and neuropilar area 1 (p<0.01) was significantly different in treated animals when compared to controls. The increase in nitrergic activity induced by nociceptive stimulus suggests the involvement of NO in the nociceptive circuit of M. abbreviatus, which was verified through the study of the action of NO in the latency response of the snail M. abbreviatus after thermal and chemical stimuli, and in the antinociception mediated by opioid. Doses of the NO synthase inhibitor NG-nitro-L-argininemethyl ester, L-NAME (1 μg/kg, 10 μg/kg and 25 μg/kg) and the NO-releasing agent S-nitro-Nacetylpenicillamide, SNP (1 μg/kg, 10 μg/kg and 25 μg/kg) were administered to determine the effect of NO on latency responses. With the highest L-NAME dose (25 μg/kg), the response latency was significantly longer (p<0.001) and with the highest SNP dose (25 μg/kg) the response latency was significantly shorter (p<0.001) when compared with the other doses, control and saline groups. The 25 μg/kg dose of L-NAME produced an analgesic effect similar to that of morphine. We also observed that morphine-induced antinociception was significantly potentiated by L-NAME (p<0.05) and reduced, but not blocked, by SNP (p<0.05) in animals submitted to thermal and chemical stimuli, showing that NO presents a pronociceptive effect in this animal model.

INTRODUÇÃO: Pacientes com vias aéres hiperresponsivas têm uma resposta exarcebada das vias aéreas a vários estímulos. Nestes pacientes, a simples intubação é a causa mais freqüente do broncoespasmo, levando a complicações no peri-operatório. O óxido nítrico está envolvido na regulação da função fisiológica bem como em doenças das vias aéreas e nos últimos anos seu papel vem sendo constantemente estudado na modulação da broncoconstrição. OBJETIVO: Estudar a possibilidade da medida de óxido nítrico exalado (NOex) ser um marcador de episódios de broncoespasmo no intra-operatório. MÉTODOS: 146.358 fichas anestésicas foram analisadas no período de 1999/2004. Ocorreram registros de broncoespasmos em 863 pacientes neste período. Destas, nove sujeitos foram identificados como não asmáticos (grupo broncoespasmo), 12 sujeitos foram diagnosticados como asmáticos (grupo asma) e 10 indivíduos sem história prévia de doença foram selecionados aleatoriamente como grupo controle. Todos os sujeitos foram submetidos à medida de óxido nítrico exalado (partes/bilhão), espirometria e coleta de escarro induzido com salina hipertônica. Os dados foram comparados utilizando ANOVA seguido do teste de Tukey e Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn\'s. RESULTADOS: Os grupos broncoespasmo e controle apresentaram espirometria normal, com medidas estatísticamente diferentes do grupo asma (p <0,05). As porcentagens de eosinófilos (mediana) no escarro induzido foram maiores no grupo asma [2,5 (0,4-6,8)], menores no grupo broncoespasmo [0,5 (0-1,3), e grupo controle [0,0 (0)]. A medida de óxido nítrico exalado foi maior no grupo dos asmáticos [81,5 (57,6-86,8)] em relação aos controles [18,7 (16,0-24,7)] (p=0,001). Não houve diferença entre grupos broncoespasmo e asma, ambos significantemente diferentes do grupo controle (p <0,05). CONCLUSÃO: Pacientes não asmáticos que apresentaram broncoespasmo no intra-operatório durante a anestesia e manipulação da traquéia, possuem níveis de óxido nítrico no ar expirado exalado elevado. / INTRODUCTION: Airways of patients with bronchial hyperreactivity are characterized by exaggerated bronchoconstriction in response to a variety of stimuli. Henceforth, bronchospasm may occur during induction of anaesthesia. Nitric Oxide is part of either physiologic or pathophysiologic airway regulation and its role has been investigated as a bronchoconstrictior modulator. OBJECTIVE: to address the possibility of exhaled nitric oxide measurement (NOex) as a marker of intraoperative bronchospasm. METHODS: 146.358 anesthesia registered forms were revised (period: 1999/2004). Bronchospasm occurrence appeared registered in 863. From those, nine were identified as non-asthmatics patients (Bronchospasm group). Also, 12 asthmatics constituted one additional group (Asthma group) and 10 subjects with no previous airway disease or symptoms were randomly selected as control group. All subjects were submitted to exhaled nitric oxide measurements (parts/billion), spirometry and induced sputum. The data were compared by ANOVA followed by the Tukey test and Kruskal- Wallis followed by Dunn\'s test. RESULTS: Both bronchospasm and control groups had normal lung function test, different from asthma group (p <0.05). The percentage of eosinophils (median) in induced sputum was higher for asthma [2.5 (0.4-6.8)] lower for bronchospasm [0.5 (0-1.3)] and control group [0.0 (0)]. Exhaled Nitric Oxide was higher for asthmatic patients [81.5 (57.6-86.8)], compared to control group [18.7 (16.0-24.7)] (p=0.001). There was no difference between bronchospasm and asthma groups both different from control (p <0.05). CONCLUSION: non-asthmatics patients with intraoperative bronchospasm detected during anesthesia after airway manipulation showed higher nitric oxide expired levels.

A injeção de doses repetidas de lipopolissacarídeo (LPS) resulta em atenuação da resposta febril, que é chamada de tolerância a endotoxina. Esta resposta já foi caracterizada em ratos por meio de injeções sistêmicas. No presente estudo, nós testamos a hipótese que a tolerância a endotoxina ocorre localmente nos tecidos periodontais de proteção de ratos e que o óxido nítrico participa desta tolerância. Ratos machos Wistar foram injetados nos tecidos periodontais de proteção com solução salina ou LPS de Escherichia coli na dose de 100 &mu;g/kg em 3 dias consecutivos com 24 horas de intervalo. A temperatura corporal (Tc) foi medida por meio de datalogger 1 h antes e 6 h após as injeções. Outro grupo experimental recebeu injeção intracerebroventricular (i.c.v.) de L-NMMA (500 &mu;g/rato) 30 min antes da injeção de LPS no terceiro dia. Além disto, foi realizada a imunohistoquímica para proteína Fos para verificar a ativação neuronal na Área Pré-óptica do hipotálamo (POA) e no subnúcleo caudal do núcleo trigeminal espinhal no primeiro dia (animais não tolerantes) e terceiro dia (animais tolerantes) do tratamento com LPS, e também em animais que receberam L-NMMA ou salina i.c.v. no terceiro dia, antes do LPS. No dia, 1 após a injeção de LPS, foi observado uma resposta febril polifásica, no dia 2 houve uma alteração no padrão desta resposta e no dia 3 a resposta febril foi completamente abolida, caracterizando o desenvolvimento de tolerância a endotoxina na cavidade oral. Esta tolerância foi revertida com o pré-tratamento com L-NMMA no terceiro dia e os animais voltaram a apresentar febre. A imunohistoquímica detectou um aumento na expressão da proteina Fos no subnúcleo caudal do núcleo trigeminal espinhal e na POA no dia 1 em animais que receberam LPS, aumento este que foi abolido no dia 3 de tratamento com LPS. Da mesma forma que observamos a reversão do mecanismo de tolerância com o desenvolvimento da resposta febril no terceiro dia, o pré-tratamento com L-NMMA aumentou o número de células Fos positivas em ambas às áreas estudadas. Estes resultados indicam que ratos desenvolvem tolerância ao LPS nos tecidos periodontais e que o óxido nítrico participa desse mecanismo de tolerância induzido por LPS no periodonto de ratos. / Systemic injection of repeated doses of Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) results in attenuation of the febrile response, i.e. endotoxin tolerance, which has been well characterized systemically in rats. In the present study, we tested the hypothesis that endotoxin tolerance also occurs after repeated local injection of LPS into periodontal protection tissue of rats and that nitric oxide plays a role in this mechanism. Male Wistar rats were given a gingival injection of sterile saline or LPS at a dose of 100 &mu;g/kg on three consecutive days with 24 hours break. Body core temperature (Tb) was measured with a miniature datalogger 1 hour before and 6 hours after the injections. Another group received L-NMMA (500 &mu;g/rat) intracerebroventricular (i.c.v.), 30 minutes before LPS, in the third day. Besides it, was performed the Fos immunohistochemistry to verify the neuronal activation in the preoptic area of hypothalamus (POA) and in the subnucleus caudalis of spinal trigeminal nucleus in the first day (non-tolerant animals), in the third day of LPS treatment (tolerant animals) and in the animals that received L-NMMA or saline i.c.v. in the third day, before LPS. On day one we observed a polyphasic febrile response after LPS injection. On day two this response was sensitized and on day three the febrile response was completely abolished, characterizing the development of the endotoxin tolerance in the oral cavity. This tolerance was reverted with the pretreatment with L-NMMA in the third day and the animals develop the febrile response. The immunohistochemistry detected an increase in Fos protein expression in the subnucleus caudalis of spinal trigeminal nucleus and in the POA on day one in animals that received LPS and a reduction in Fos expression was observed on day three. Similarly to the reversion of the tolerance mechanism by the development of the febrile response in the third day, the pretreatment with L-NMMA, increased the number of Fos positive cells in both studied areas. These results indicate that rats develop endotoxin tolerance in periodontal tissues and that nitric oxide plays a role in this mechanism.

Submitted by Caroline Periotto (carol@ufscar.br) on 2016-09-09T19:32:42Z No. of bitstreams: 1 DissMPF.pdf: 1108995 bytes, checksum: 73f17316251dcc29a83fa1335bba4505 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-13T14:03:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMPF.pdf: 1108995 bytes, checksum: 73f17316251dcc29a83fa1335bba4505 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-13T14:03:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMPF.pdf: 1108995 bytes, checksum: 73f17316251dcc29a83fa1335bba4505 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T14:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMPF.pdf: 1108995 bytes, checksum: 73f17316251dcc29a83fa1335bba4505 (MD5) Previous issue date: 2015-05-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / It has been shown that the bed nucleus of the stria terminalis (BNST) of rats contains nitrergic neurons, which are activated during animal exposure to aversive stimuli. BNST is also populated by glutamatergic and corticotrophin releasing factor (CRFergic) neurons, which in turn, are also activated under stressful situations. Here we investigated the anxiogenic-like effects of intra-BNST injections of a nitric oxide (NO) donor, NOC-9, in mice. The role of CRFergic and glutamatergic systems on defensive behavior induced by NOC-9 was investigated with previous intra-BNST infusion of CP376395 (0, 0.75, 1.50 or 3.00 nmol), a CRF type 1 receptor antagonist (CRF1), or AP-7 (0, 0.05, 0.10 or 0.20 nmol), a NMDA receptor antagonist, respectively. Defensive behavior was assessed immediately and 5 minutes after intra-BNST drug injection, exposing mice to an arena (a neutral situation) and to the elevated plus-maze (EPM; an anxiogenic situation), respectively. Results showed that NOC-9 (all doses) provoked immobility assessed in the arena and increased anxiety in the EPM (e.g., decrease in the percentage of open-arm exploration). Despite failing to produce effects on basal levels of anxiety when injected alone (all doses), pretreatment with CP (3.00 nmol) prevented the anxiogenic-like effect of NOC-9 (75.00 nmol) without changing the immobility behavior. Pretreatment with AP-7 (0.05 nmol) produced similar effects, however, when injected alone 0.20 nmol AP-7 attenuated anxiety-like behavior. These results suggest that the CRF1 and NMDA receptors located within the BNST differentially modulate the aversive effects induced by NO production in this limbic forebrain structure. / Os confrontos dos animais com situações que induzem medo e ansiedade resultam em uma série de respostas comportamentais defensivas (ex. luta, fuga, imobilidade, vocalização, etc.), ativação neurovegetativa (ex. taquicardia, elevação da pressão arterial, etc.) e neuroendócrina (ex., liberação de corticosterona). O labirinto em cruz elevado (LCE), um modelo animal de ansiedade, é uma situação que induz várias reações de defesa. Vários estudos têm investigado os substratos neurais e a neurotransmissão envolvidos na neurobiologia das reações de defesa, e o núcleo intersticial da estria terminal (BNST) tem sido uma das estruturas-alvo. Com base no potencial efeito ansiogênico dos neurotransmissores glutamato (via ativação do complexo receptor NMDA-óxido nítrico) e fator liberador de corticotropina (via receptores CRF1), este estudo investigou o papel desses mediadores, através de injeções intra-BNST. Camundongos Suícos machos receberam microinjeção intra-BNST de um doador de óxido nítrico, NOC-9 (0, 18,75, 37,30 e 75,00 nmol) e foram expostos a uma caixa de vidro seguida pelo LCE. Todas as doses provocaram imobilidade registrada na caixa de vidro. No LCE, NOC-9 (37,50 e 75,0 nmol) diminuiu o tempo gasto nos braços abertos, indicando um efeito ansiogênico. NOC-9 também aumentou ansiedade por diminuir frequência de mergulhos e de exploração das extremidades dos braços abertos (medidas complementares). A injeção intra-BNST do antagonista de receptores CRF1, o CP 376395 (0, 0,75, 1,50 e 3,00 nmol) não provocou efeito algum nos índices de ansiedade avaliados pelo LCE. Porém, quando injetado previamente ao NOC-9 este antagonista preveniu seus efeitos ansiogênicos. Contudo, CP 376396 não modificou o tempo de imobilidade causado pelo NOC-9. A injeção intra-BNST do antagonista de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, o AP-7 (0, 0,05, 0,10 e 0,20 nmol), na maior dose, provocou um efeito ansiolítico, aumentando a exploração dos braços abertos e atenuando algumas medidas complementares defensivas (ex., aumentando mergulhos da cabeça e a exploração das extremidades dos braços abertos do LCE. O antagonista NMDA bloqueou os efeitos ansiogênicos eliciados pelo doador de NO, sem, contudo, alterar a imobilidade. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem uma relação importante entre a neurotransmissão nitrérgica, CRFérgica e glutamatérgica no BNST na modulação das reações de defesas em camundongos. Ainda, os mecanismos farmacológicos envolvidos nessa modulação eliciados pela facilitação da transmissão nitrérgica parecem ser dissociados.

Submitted by Bruna Rodrigues (bruna92rodrigues@yahoo.com.br) on 2016-10-06T11:57:20Z No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:21:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T16:21:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T16:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissTCB.pdf: 621997 bytes, checksum: 8cab00b1c1a31c02e38fc9add399fd28 (MD5) Previous issue date: 2016-04-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Endothelial dysfunction has been considered a marker for the presence of cardiovascular disease. It is characterized by decreased release of vasodilatory factors and increased of vasoconstrictors factors. Nitric oxide (NO) is the main endogenous vasodilator molecule that regulates the vascular tone and homeostasis. Decrease in the bioavailability of NO can be caused by a variaty of factors, including the increase in the production of superoxide radical O2 •-. The production of O2 •- can be stimulated by angiotensin II, by the enzyme complex of the NADPH oxidase activation. Thus, the objective of this work was to study the effects induced by ruthenium complex cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO2 -)] (DCBPY) and sodium nitroprusside (SNP) in endothelial dysfunction model, as well as perform the pharmacological characterization of the dependent effects removal of O2 •- and release of nitric oxide (NO) induced by these drugs. Normotensive (2K) and hypertensive (2K-1C) wistar rats were used. Aortic rings with intact endothelium were placed in a myograph and incubated with DCBPY: 0.1; 1.0 ou 10 μM ou com SNP: 0.1; 1.0 ou 10 nM during 30 minutes. Curves concentration-effect of acetylcholine (ACh) were built where it was possible to analyze all concentrations DCBPY and NPS improved relaxation induced by ACh. NO was measured intracellular (for DAF-2DA probe) in HUVEC treated with 0.1 μM of DCBPY, 0.1 nM a SNP and 0.1 μM DETA-NO. It was not detected NO release of the compounds DCBPY [0.1 μM] and SNP [0.1 nM]. It also evaluated the release of NO compound DCBPY using an electrode selective for NO. The compound DCBPY spontaneously release NO in solution form concentrationdependent, starting from 10 μM concentration. DCBPY released more NO in the presence of cells. This could be due to the reduction of the compound by reducing cell. Intracellular detection of superoxide radical (O2 •-) was obtained by using the fluorescent probe (DHE). Our results show that treatment of cells with DCBPY [0.1 μM] and SNP [0.1 nM] decreased the fluorescence intensity cells stimulated with angiotensin II. Thus, it is suggested that DCBPY and SNP at a concentration which does not release NO, inside the cells, they are capable of attenuating endothelial dysfunction by inactivating superoxide. / A disfunção endotelial tem sido considerada um marcador para a presença de doenças cardiovasculares. É caracterizada pela diminuição da liberação de fatores vasodilatadores e/ou aumento da liberação de fatores vasoconstritores. O óxido nítrico (NO) é a principal molécula vasodilatadora endógena que regula o tônus e a homeostase vascular. A diminuição na biodisponibilidade do NO pode ser causada por diversos fatores, incluindo o aumento na produção do radical superóxido O2 •-. A produção do O2 •- pode ser estimulada pela angiotensina II, pela ativação do complexo enzimático NADPH oxidase. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos induzidos pelo complexo de rutênio cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO2 -)] (DCBPY) e Nitroprussiato de Sódio (NPS) em modelo de disunção endotelial, bem como realizar a caracterização farmacológica dos efeitos dependentes da remoção do O2 •- e liberação do óxido nítrico (NO) induzidos por estas drogas. Foram utilizados ratos Wistar machos normotensos (2R) e hipertensos (2R-1C). Anéis de aortas com endotélio intacto foram colocados em um miógrafo e incubados com DCBPY: 0,1; 1,0 ou 10 μM ou com NPS: 0,1; 1,0 ou 10 nM durante 30 minutos. Curvas concentração-efeito à acetilcolina (ACh) foram construidas onde foi possível analisar que todas as concentrações de DCBPY e NPS melhoraram o relaxamento induzido pela ACh. NO intracelular foi medido (por sonda DAF-2DA) em HUVEC tratadas com 0,1 μM de DCBPY, 0,1 nM de NPS ou 0,1 μM de DETA / NO. Não foi detectada liberação de NO dos compostos DCBPY [0,1 μM] e NPS [0,1 nM]. Também foi avaliada a liberação de NO do composto DCBPY utilizando eletrodo seletivo para NO. O composto DCBPY libera NO espontaneamente em solução de forma concentração dependente a partir da concentração 10 μM. Na presença das células, houve um aumento na liberação de NO na concentração 10 μM do composto DCBPY de 1,69 vezes em comparação com a detecção sem a presença de células. Isto pode ter ocorrido devido à redução do composto por redutores celulares. A detecção intracelular do radical superóxido (O2 •-) foi obtida através da utilização da sonda fluorescente DHE. Os nossos resultados mostram que o tratamento de células com DCBPY [0,1 μM] e de NPS [0,1 nM] diminuiu a intensidade de fluorescência a DHE em células estimuladas com angiotensina II. Assim, sugere-se que DCBPY e NPS, em uma concentração que não libera NO no interior das células, são capazes de atenuar a disfunção endotelial por inativar o radical superóxido.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-02-20T12:35:56Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2158020 bytes, checksum: 21163425bf778a5e7dcea450996ed689 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-20T12:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2158020 bytes, checksum: 21163425bf778a5e7dcea450996ed689 (MD5) Previous issue date: 2016-11-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen ubiquitous often associated with individuals with pathologies that cause immunodeficiency, such as cystic fibrosis. This pathogen synthetizes a typical greenish-blue pigment, the pyocyanin, which represents its major virulence factor, inducing the generation of reactive oxygen species by host cells, in addition to inflammation in several tissues and neutrophil apoptosis. However, the protocols used to study these effects are distinct from each other and the pyocyanin mechanism of action in acute inflammation processes is unknown. The aim of this work was to understand the interactions between pyocyanin and acute inflammatory processes, evaluating in vitro effect of pyocyanin on cell viability and nitric oxide, interleukin (IL)-1β, and tumor necrosis factor (TNF)-α production by lipopolysaccharide-activated mice peritoneal macrophages. In addition, the in vivo effect of pyocyanin on zymosan-induced peritonitis in mice was evaluated. Our results show that pyocyanin 50 or 100 μM induced cell death about 90 and 95 % (p < 0.0001), respectively, while pyocyanin 1, 5, or 10 μM was not able to affect cell viability. The pigment at 5 or 10 μM reduced nitric oxide production about 26 % (p < 0.05) and 51 % (p < 0.0001), respectively, in addition to reducing IL-1β (38 %, p < 0.001) and TNF-α (48 %, p < 0.001) levels in macrophages treated with pyocyanin 5 μM. In the in vivo model, pyocyanin 5 mg/kg has not affect leukocyte migration to the inflammation site. The pyocyanin-induced reduction of nitric oxide, IL-1β, and TNF-α levels may be a pathogen-friendly escape mechanism, reducing the host's immune response at the concentrations evaluated in this work. This effect seems to be independent of interference in cell migration. / A Pseudomonas aeruginosa é um bacilo ubíquo oportunista frequentemente associado à indivíduos portadores de patologias que causam imunodeficiência, como a fibrose cística. Essa bactéria produz um pigmento típico, a piocianina, que representa o seu fator de virulência majoritário, induzindo a geração de espécies reativas de oxigênio por células do hospedeiro, além de induzir a inflamação em vários tecidos e a apoptose em neutrófilos. No entanto, os protocolos utilizados para a observação desses efeitos são distintos entre si e não se conhece o mecanismo de ação da piocianina em processos de inflamação aguda. O objetivo desse trabalho foi compreender as interações entre a piocianina e os processos inflamatórios agudos, avaliando in vitro o efeito da piocianina na viabilidade celular e na produção de óxido nítrico, interleucina (IL)-1β e fator de necrose tumoral (TNF)-α por macrófagos peritoneais de camundongo ativados por lipopolissacarídeo. Em adição, foi avaliado in vivo o efeito da piocianina no modelo de peritonite induzida por zimosan em camundongo. A piocianina nas concentrações de 50 ou 100 μM induziu a morte celular em 90 e 95% (p < 0,0001), respectivamente, enquanto a piocianina nas concentrações de 1, 5 ou 10 μM não foi capaz de afetar a viabilidade celular. O pigmento nas concentrações de 5 ou 10 μM reduziu a produção do óxido nítrico em 26 % (p < 0.05) e 51 % (p < 0.0001), respectivamente, além de diminuir os níveis da IL-1β (38 %, p < 0,001) e do TNF-α (48 %, p < 0,001) em macrófagos tratados com a piocianina na concentração de 5 μM. No modelo in vivo, a piocianina na dose de 5 mg/kg não interferiu na migração dos leucócitos para o sítio da inflamação. A redução nos níveis do óxido nítrico, da IL-1β e do TNF-α induzida pela piocianina pode ser um mecanismo de fuga favorável ao patógeno, capaz de reduzir a resposta inflamatória do hospedeiro nas concentrações avaliadas nesse trabalho, e esse efeito parece ser independente da interferência na migração celular.

Submitted by SIMONE REGINA POTJE null (simonepotje@hotmail.com) on 2017-01-20T14:12:22Z No. of bitstreams: 1 Tese Final Potje et al., 2017.pdf: 2363609 bytes, checksum: 76652ad37a98422f380b06f5e4c841b9 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-24T18:03:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 potje_sr_dr_araca.pdf: 2363609 bytes, checksum: 76652ad37a98422f380b06f5e4c841b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-24T18:03:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 potje_sr_dr_araca.pdf: 2363609 bytes, checksum: 76652ad37a98422f380b06f5e4c841b9 (MD5) Previous issue date: 2016-12-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O TERPY promove efeito hipotensor de maior magnitude em ratos hipertensos (SHR e 2R-1C) do que em ratos normotensos (Wistar e 2R). Foi demonstrado anteriormente que o endotélio prejudica o efeito vasodilatador do TERPY em aorta de Wistar. No entanto, observamos que o endotélio melhora os efeitos vasodilatadores do TERPY em aorta de SHR. Vasos sanguíneos de menor calibre, tais como as artérias de resistência, estão associadas ao controle da resitência vascular periférica e da pressão arterial. Nossa hipótese é que o TERPY induz relaxamento nas artérias mesentéricas de resistência em SHR e que as células endoteliais modulam positivamente o efeito do TERPY nestes vasos sanguíneos. Portanto, o nosso objetivo foi avaliar o efeito vasodilatador do TERPY em anéis com e sem endotélio de artéria mesentérica de ratos SHR, o seu mecanismo de relaxamento e a participação da NOS sobre esse efeito. e a Nossos resultados mostraram que o TERPY induziu um efeito vasodilatador dependente da concentração em anéis de artérias mesentéricas (2º e 3º ramos) de SHR e de ratos Wistar. A potência do TERPY foi maior em anéis intactos do que em anéis sem endotélio em artérias mesentéricas de SHR, mas em Wistar o endotélio prejudicou o efeito do TERPY. Nas artérias mesentéricas sem endotélio de SHR, o efeito do TERPY é dependente da atividade da guanilato ciclase solúvel e de canais para potássio. Nas artérias mesentéricas intactas de SHR, o efeito de TERPY depende da atividade de eNOS, mas não é dependente das atividades de nNOS, iNOS ou da via da ciclooxigenase. O TERPY promove a fosforilação da eNOS nos resíduos de serina1177 e aumenta a concentração de óxido nítrico em células endoteliais isoladas de artérias mesentéricas de SHR. Nossos resultados mostraram que a guanilato ciclase solúvel, os canais para potássio e a eNOS estão envolvidos no efeito vasodilatador estimulado pelo TERPY nas artérias de resistência mesentérica de SHR. Numa segunda parte deste estudo, avaliamos o mecanismo de ação de TERPY e seu efeito sobre a atividade da eNOS em células endoteliais. As células HUVEC, WT-HEK e HEK-eNOS foram tratadas com TERPY em diferentes tempos (0 a 60 minutos). Foram analisados por Western blotting o efeito do TERPY sobre a fosforilação de eNOS, monômero e dímero da eNOS e sobre monômero e oligômero de caveolina-1. Também foi avaliado o efeito do TERPY na interação eNOS/Cav-1 através de co-imunoprecipitação. As alterações induzidas pelo TERPY sobre as concentrações de espécies reativas de oxigênio e peroxinitrito em células endoteliais foram medidas usando sonda DHE e biossensor 7-CBA, respectivamente. A concentração de óxido nítrico (NO) foi avaliada por sonda DAF-FM e sensor Cooper. O TERPY promoveu desacoplamento e disfunção da eNOS, dependente de BH4. A desestabilização dos oligômeros da caveolina-1 foi induzida pelo TERPY. Consequentemente, o TERPY reduziu a interação eNOS/Cav-1 e promoveu ativação da eNOS. Nossos resultados mostraram que a atividade da eNOS pode ser regulada de duas maneiras diferentes pelo TERPY. O TERPY promove desacoplamento e fosforilação da eNOS, promovendo uma estratégia diferente para a regulação da atividade desta enzima. As moléculas químicas ou biológicas como o TERPY que regulam a atividade da eNOS e aumentam a produção e a biodisponibilidade de NO teriam ações terapêuticas importantes para o tratamento de doenças vasculares associadas a hipertensão. / CNPq: 141323/2013-2

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O risco de desenvolver doença cardiovascular aumenta com o avançar da idade, sendo exponencialmente maior em mulheres após a menopausa em relação a mulheres em idade reprodutiva. Esse aumento pode ser, em parte, explicado por uma hiperatividade plaquetária e disfunção endotelial nessas mulheres. Em plaquetas, o óxido nítrico é uma molécula essencial para a inibição da sua ativação e agregação; cuja biodisponibilidade depende de sua síntese e inativação por espécies reativas de oxigênio. Assim, o presente estudo visa determinar os efeitos da menopausa sobre a função plaquetária, biodisponibilidade de óxido nítrico e estresse oxidativo. Para tal, a amostra foi constituída por mulheres sendo elas 15 jovens entre 20 e 40 anos (grupo controle), 12 mulheres entre 45 e 60 anos pós-menopausadas há no mínimo 12 meses que não faziam uso de reposição hormonal e que não possuíam fatores de risco para doença cardiovascular. Os resultados demonstraram que mulheres pós-menopausadas apresentam uma hiperagregação plaquetária induzida por colágeno em relação a mulheres jovens. Essas mulheres também apresentaram o influxo de L-arginina aumentado em relação ao grupo controle. No entanto, a atividade da enzima óxido nítrico sintase estava diminuída nas mulheres após a menopausa, assim como os níveis plasmáticos de L-arginina. A expressão das enzimas iNOS e eNOS não diferiu significativamente entre os grupos. A expressão das subunidades &#61537;1 e &#61538;1 da enzima guanilato ciclase, e a fosfodiesterase 5 não se apresentaram diferentes entre os grupos. A expressão das enzimas glutationa peroxidase, subunidades gp91phox e p47phox da NADPH oxidase não estavam alteradas em plaquetas de mulheres pós-menopausadas, já a catalase estava mais expressa neste grupo. Em relação à atividade das enzimas antioxidantes, foi observado um aumento na superóxido dismutase em mulheres pós-menopausadas. Esse grupo apresentou ainda níveis mais elevados de grupamentos sulfidrila. Já em relação a danos proteicos não foi possível observar diferença entre os grupos. Dessa forma, esses resultados podem contribuir para uma melhor compreensão da hiperagregação plaquetária observada nas mulheres após a menopausa, o que, por sua vez, pode contribuir para a elucidação de mecanismos envolvidos na morbidade e mortalidade cardiovascular elevada nessa população. / Cardiovascular risk is exponentially increased in women after menopause compared to women in reproductive age. This may be partially explained by an increased platelet activation and endothelial dysfunction. Platelet derived nitric oxide is essential for the inhibition of its activation and aggregation, and its bioavailability depends both on its synthesis and its scavenging by reactive oxygen species. Thus, our aim was to investigate L-arginine-nitric oxide signaling in platelets from postmenopausal women and its association with oxidative stress and platelet aggregation. Fifteen young women (control group) and 12 postmenopausal women without risk factors for cardiovascular diseases consented to participate in the study. Blood was collected in the fasting state in appropriate anticoagulant tubes for platelet experiments. Platelet aggregation induced by collagen was significantly increased in postmenopausal than in young women. They also showed an increased total L-arginine transport, despite lower plasma L-arginine levels. Platelet nitric oxide synthase activity was impaired in postmenopausal women, but no difference was observed in endothelial and inducible nitric oxide synthase expression between groups. The expression of &#61537;1 and &#61538;1 subunits of guanilate cyclase and phosphodiesterase V were similar between groups. The expressions of gp91phox and p47phox subunits of NADPH oxidase and glutathione peroxidase were not modified. On the other hand, there was an up-regulation of catalase protein levels. Superoxide dismutase activity, but not catalase nor glutathione peroxidase activities, was increased in climacteric women. It was also reported that sulfhydryl group content was increased in postmenopausal women. There was no difference in protein oxidative damage between groups. These findings may contribute to a better understanding of platelet hyperaggregation in postmenopausal women, which may help to further elucidate the heightened cardiovascular morbidity and mortality in this population.