The main focus of my PhD studies was aimed at understanding the general mechanism of nuclear translocation and isolating novel components of the nuclear translocation pathway in neurons. Using the Drosophila visual system as an in vivo model to study nuclear motility in developing photoreceptor cells (R-cells), I have identified a novel role for the Ser/Thr kinase Misshapen (Msn) and the endocytic trafficking pathway in regulating the nuclear translocation process. / The development of R-cells in the Drosophila eye disc is an excellent model system for the study of nuclear motility owing to its monolayer organization and the stereotypical translocation of its differentiating R-cell nuclei along the apical-basal plane. Prior to my thesis work, several laboratories had identified dynein and its associating proteins in R-cell nuclear translocation, however nothing was known about the signalling pathway that controlled their function in nuclear migration. Thus, one of my thesis goals was to elucidate the signalling mechanism controlling nuclear translocation in R-cells. / Using a combination of molecular and genetic approaches, I identified Msn as a key component of a novel signalling pathway regulating R-cell nuclear translocation. Loss of msn causes a failure of R-cell nuclei to migrate apically. Msn appears to control R-cell nuclear translocation by regulating the localization of dynein and Bicaudal-D (Bic-D). My results also show that Msn enhances Bic-D phosphorylation in cultured cells, suggesting that Msn regulates R-cell nuclear migration by modulating the phosphorylation state of Bic-D. Consistently, my results show that a Bic-D-phosphorylation-defective mutation disrupted the apical localization of both Bic-D and dynein. I propose a model in which Msn induces the phosphorylation of Bic-D, which in turn modulates the activity and/or subcellular localization of dynein leading to the apical migration of R-cell nuclei. / In addition to studying Msn, I have also searched for additional players in R-cell nuclear migration. From a gain-of-function approach, I found that the misexpression of the GTPase-activating-protein (GAP) RN-Tre caused a severe defect in R-cell nuclear migration. Since mammalian RN-Tre is involved in negatively regulating Rab protein activity, I speculated that the RN-Tre misexpression phenotype reflected a role for Rab-mediated vesicular transport in regulating R-cell nuclear migration. I systematically examined the potential role of Rab family proteins in R-cell nuclear migration and found that interfering with the function of Rab5, Rab11 or Shibire caused a similar nuclear migration phenotype. I propose that an endocytic pathway involving these GTPases is required for the targeting of determinants to specific subcellular locations, which in turn drive the apical migration of R-cell nuclei during development.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / ABSTRACT - CHAPTER I Actomyosin from rat testis was obtained by freezing the soluble fraction and myosin II was isolated from this actomyosin. Testis was homogenized in a buffer extract, centrifuged, and the 40,000g x 40 supernatant frozen at -20°C for 48 hours. The supernatant was thawed at 4°C, centrifuged at 45.000g x 45 and the precipitate washed twice with imidazole buffer (pH 7.0 and 9.0, respectively). The resulting precipitate was enriched in 3 polypeptides: p205, p43 and one that migrated together with the front of the gel. These polypeptides were solubilized in pH 10.8 buffer at 27°C. When isolated in a Sephacryl S-400 column, p205 cosedimented with F-actin in the absence, but not in the presence, of ATP and was marked with anti-myosin II. Although the testis preparation expressed low K/EDTA-ATPase activity, a similar preparation obtained from skeletal muscle exhibited high K/EDTA-ATPase activity. In this study, myosin II was isolated from an actomyosin preparation obtained by freezing the soluble fraction of testis. ABSTRACT - CHAPTER II Actomyosin from swine, bovine and chicks brain was obtained by freezing the soluble fraction and myosin II and V was precipitate together, and myosin II from swine brain was partially isolated from this actomyosin. Brain was homogenized in a buffer extract, centrifuged, and the 40,000g x 40 supernatant frozen at -20°C for 48 hours. The supernatant was thawed at 4°C, centrifuged at 45.000g x 45 and the precipitate washed twice with imidazole buffer (pH 7.0 and 10.0, respectively). The resulting precipitate was enriched in 3 polypeptides: p205, p53, p43 and own high Mg2+-ATPase activity. These polypeptides were solubilized in pH 10.2 buffer at 27°C, with addition of ATP, Mg and NaCl. The p205 from swine brain was partially isolated in a Sephacryl S-500 column. This polypeptide of 205 kDa was marked with antibody anti-myosin II and V. Although the brain preparation expressed low K/EDTA-ATPase activity, we observed Co2+- ATPase activity and a stimulation of the Mg2+-ATPase activity by Tween 20. In this study, showed a precipitation together of myosin II and V, and partially isolated this myosin from swine brain from actomyosin preparation obtained by freezing the soluble fraction of brain. / RESUMO GERAL - Miosinas são proteínas motoras que translocam sobre filamentos de actina e atualmente constituem uma superfamília com 20 classes. Algumas são conhecidas apenas a estrutura primária através de seqüência gênica, outras já estão bem caracterizadas bioquimicamente, como as miosinas I, II e V. São amplamente distribuídas em todas as células eucarióticas. Apresentam como características bioquímicas: alta atividade ATPase na presença de EDTA e alta concentração de potássio (atividade K/EDTA-ATPase) e uma baixa atividade Mg2+-ATPase, que é estimulada por F-actina. Preparação de actomiosina é obtida a partir da precipitação de fração solúvel de cérebro tanto em baixa quanto em alta força iônica e esse processo de precipitação constitui um passo importante para purificar e caracterizar miosina II e V a partir de fração solúvel de cérebro. Miosina II é precipitada quando a fração solúvel de cérebro é dializada contra tampão de baixa força iônica, enquanto que, miosina V é precipitada seletivamente em relação à miossina II, quando a fração solúvel de cérebro é tratada com alta força iônica, sendo postulado que essa precipitação de miosina (II e V) seja resultado de sua interação com actina e vesículas. Recentemente temos obtido a precipitação de actomiosina a partir do congelamento de fração solúvel de cérebro ou testículo de rato. Neste trabalho mostramos a purificação de miosina II de testículo de rato e a obtenção de actomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho através do congelamento de fração solúvel de cérebro e testículo. RESUMO - CAPÍTULO I Actomiosina de testículo de rato foi obtida através do congelamento de fração solúvel e miosina II foi isolada a partir dessa actomiosina. Testículos foram homogeneizados em tampão de extração, centrifugado e o sobrenadante 40.000g x 40 foi congelado a -20oC por 48 horas. O sobrenadante foi descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45 e o precipitado foi lavado duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 9,0, respectivamente). O precipitado resultante é enriquecido em três polipeptídeos: p205, p43 e um que migra junto com a frente do gel. Esses polipeptídeos foram solubilizados em tampão pH 10,8 a 27oC. O p205, isolado em Sephacryl S-400, co-sedimenta com F-actina na ausência, mas não na presença, de ATP e foi marcado com anti-miosina II. Embora a preparação de testículo, praticamente, não expressou atividade K/EDTA-ATPásica, uma preparação similar obtida a partir de músculo esquelético apresentou alta atividade K/EDTA-ATPásica. Nesse trabalho, miosina II foi isolada a partir de uma preparação de actomiosina obtida pelo congelamento de fração solúvel de testículo. RESUMO - CAPÍTULO II Actomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho foi obtida através do congelamento de fração solúvel e miosina II e V foram precipitadas conjuntamente, sendo que miosina de cérebro de suino foi parcialmente isolada a partir dessa actomiosina. Os cérebros foram homogeneizados em tampão de extração, centrifugado e o sobrenadante 40.000g x 40 foi congelado a -20oC por 48 horas. O sobrenadante foi descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45 e o precipitado foi lavado duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 10, respectivamente). O precipitado resultante é enriquecido em três polipeptídeos: p205, p53, p43 e possui alta atividade Mg2+-ATPase. Esses polipeptídeos foram solubilizados em tampão pH 10,2 a 27oC, com adição de ATP, Mg e NaCl. O p205 de cérebro de suino foi parcialmente isolado em Sephacryl S-500. Esse polipeptídeo de 205 kDa foi marcado com anticorpos anti-miosina II e V. Embora a preparação de cérebro, praticamente, não expressou atividade K/EDTAATPásica, apresentou atividade Co2+-ATPase e uma estimulação da atividade Mg2+-ATPase por Tween 20. Nesse trabalho mostramos a precipitação conjunta de miosina II e V e o isolamento parcial dessas miosinas de cérebro de suino a partir de uma preparação de actomiosina obtida pelo congelamento de fração solúvel de cérebro. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / The compound 2,2 -dithienyl diselenide (DTDS), an organoselenium compound with thiophene moieties, has been proven to be a promising antioxidant in vitro and in vivo, as well as an antifungal and antimicrobial agent. However, its toxicity, an important point to be investigated, has not been evaluated. The objective of this study was to evaluate whether DTDS has potential toxicity in vitro or in vivo. For this reason, sulfhydryl enzyme activities, such as δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) and Na+, K+-ATPase were assessed to predict in vitro DTDS toxicity in rat brain homogenate, in addition to its thiol oxidase-like activity. In other section of experiments, DTDS was administered to rats (50 or 100 mg/kg; per orally) in order to determine toxicological parameters in vivo. Plasma samples were collected in order to measure the biochemical parameters: alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase activities and urea and creatinine levels. Besides, in brain homogenates, it was determined the activity of the enzymes δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase, as well as lipid peroxidation levels and antioxidant defenses (catalase and superoxide dismutase activities and ascorbic acid and reduced glutathione levels). The compound DTDS inhibited in vitro both δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities (IC50 2 μM and 17 μM, respectively). The DTDS inhibitory effect on δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities was restored by dithiol dithiothreitol. In addition, DTDS (5-25 μM) showed a thiol oxidase-like activity. In vivo, DTDS (50 and 100 mg/kg) caused a decrease in food and water intakes and the loss of body weight, indicating systemic toxicity, even causing death of the animals. At a dose of 100 mg/kg, DTDS decreased urea levels and increased plasma alanine and aspartate aminotransferase activities. Lipid peroxidation was increased in both administered doses. Moreover, in the highest dose, DTDS inhibited δ-ALA-D activity. By contrast, neither Na+, K+-ATPase activity nor antioxidant defenses were altered in the brain of rats exposed to DTDS. In conclusion, the interaction with thiol groups of sulfhydryl enzymes seems to mediate the inhibitory effect of DTDS against δ-ALA-D and Na+, K+-ATPase activities in vitro. Furthermore, in the administered doses, DTDS causes cerebral and systemic toxicity in rats. Although other studies are necessary to give more information about this specific compound, our findings contribute to the knowledge on the toxicology of DTDS, a compound with pharmacological properties. / O composto 2,2 -disseleneto de ditienila (DSDT), um composto orgânico de selênio com grupamento tiofeno, fora comprovado como um promissor antioxidante in vitro e in vivo, assim como um agente antifúngico e antimicrobiano. Entretanto, sua toxicidade ainda não fora avaliada, representando um importante ponto a ser investigado. O objetivo deste estudo foi avaliar se o DSDT apresenta potencial toxicidade in vitro ou in vivo. Para este fim, a atividade de enzimas sulfidrílicas, como δ-aminolevulato desidratase (δ-ALA-D) e Na+, K+-ATPase fora testada para predizer a toxicidade in vitro do DSDT em homogeneizado de cérebro de ratos, bem como a sua atividade tipo-tiol oxidase. Em outra seção de experimentos, o DSDT foi administrado em ratos (50 ou 100 mg/kg; oralmente) com o intuito de determinar parâmetros toxicológicos in vivo. Amostras de plasma foram retiradas para dosagem dos parâmetros bioquímicos: atividade das enzimas alanina (ALT) e aspartato (AST) aminotrasferase e níveis de ureia e creatinina. Além disso, em homogeneizado de cérebro foram dosadas a atividade das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase, assim como os níveis de peroxidação lipídica e as defesas antioxidantes (atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase e níveis de ácido ascórbico e glutationa reduzida). O composto DSDT inibiu in vitro, tanto a atividade da δ-ALA-D quanto da Na+, K+-ATPase (IC50 2μM e 17μM, respectivamente). O efeito inibitório do DSDT sobre a atividade das enzimas δ-ALA-D e Na+, K+-ATPase foi restaurado pelo ditiol ditiotreitol. Adicionalmente, DSDT (5-25μM) apresentou atividade do tipo-tiol oxidase. In vivo, o DSDT (50 e 100 mg/kg) causou uma diminuição no consumo de comida e água e perda de peso corporal, evidenciando toxicidade sistêmica, causando inclusive morte de ratos. Quando administrado na dose de 100 mg/kg, DSDT diminui os níveis de ureia e aumentou a atividade plasmática da ALT e da AST. Os níveis de peroxidação lipídica encontraram-se aumentados em ambas as doses administradas. Na maior dose, o DSDT inibiu a atividade da δ-ALA-D. Em contrapartida, nem a atividade da Na+, K+-ATPase nem as defesas antioxidantes foram alteradas no cérebro de ratos expostos ao DSDT. Em conclusão, a interação com grupos tióis de enzimas sulfidrílicas parece mediar o efeito inibitório do DSDT em relação a atividade da δ-ALA-D e da Na+, K+-ATPase in vitro. Além disso, nas doses administradas, o DSDT induz toxicidade cerebral e sistêmica em ratos. Embora outros estudos sejam necessários para fornecer mais informações sobre este composto em específico, estes dados contribuem para o conhecimento sobre a toxicologia do DSDT, um composto com propriedades farmacológicas.

O objetivo deste trabalho foi ampliar o estudo do mecanismo de ação antidepressivo de Hypericum polyanthemum (POL) e de seu composto derivado da classe dos floroglucinóis uliginosina B (ULI). Considerando o potencial desta planta para o desenvolvimento de novos fármacos, realizou-se um estudo pré-clínico de toxicidade aguda e doses repetidas de POL em camundongos. A administração via oral (v.o.) do extrato ciclo-hexano de POL (90 mg/kg) foi capaz de reduzir significativamente o tempo de imobilidade de ratos e camundongos no teste de natação forçada (TNF). A administração de ULI (10 mg/kg, v.o.) igualmente reduziu o tempo de imobilidade no TNF e também no teste de suspensão pela cauda (TSC). A administração simultânea (v.o), das subdoses de POL (45 mg/kg) e ULI (5 mg/kg) foram capazes de potencializar o efeito antidepressivo das subdoses de imipramina (10 mg/kg), bupropiona (3 mg/kg) e fluoxetina (15 mg/kg), no TNF em camundongos. O pré- tratamento de camundongos, pela via intraperitoneal, com SCH 23390 (antagonista de receptor dopaminérgico D1); sulpirida (antagonista de receptor dopaminérgico D2); prazosin (antagonista de receptor α1-adrenérgico); ioimbina (antagonista de receptor α2-adrenérgico) e p-clorofenilalanina metil éster (pCPA- inibidor da síntese de serotonina (5-HT), preveniu o efeito anti-imobilidade de ULI no TNF. In vitro, ULI inibiu a recaptação sinaptossomal de dopamina ([3H]-DA), noradrenalina ([3H]-NA) e serotonina ([3H]-5-HT), sem ligação aos transportadores, e isto foi demonstrado através das diferentes concentrações de ULI que não afetaram a ligação de [3H]- mazindol, [3H]-nisoxetina e [3H]-citalopram aos sítios de recaptação de DA, NA e 5- HT, respectivamente. Estes resultados sugerem que ULI tem ação não-seletiva sobre o sistema monoaminérgico, o que pode representar um novo composto com inibição tripla da recaptação; além disso possui mecanismo de ação diferente dos antidepressivos clássicos, inibindo a recaptação das monoaminas sem se ligar aos respectivos sítios específicos dos transportadores. Também realizou-se estudo bioquímico da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de camundongos. O tratamento agudo e repetido por via oral (3 dias, 1 x ao dia) aumentou a atividade desta enzima em córtex cerebral de camundongos em diferentes tempos. ULI não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase em hipocampo dos camundongos, e esse resultado corrobora com a hipótese de que ULI pode estar contribuindo para a manutenção da excitabilidade neuronal estimulando esta enzima, e agindo seletivamente no córtex cerebral. Além disso, investigou-se o papel de ULI sobre os canais de sódio dependentes de voltagem (Na+), através da pré-administração de veratrina (ativador de canal de Na+). A veratrina bloqueou o efeito antidepressivo de ULI no TNF e este resultado indica a possibilidade de ULI estar bloqueando os canais de Na+ alterando o gradiente iônico através da estimulação da atividade da Na+,K+-ATPase e, prejudicando ou inibindo a recaptação das monoaminas. Nos experimentos de toxicidade, as mudanças fisiológicas, bioquímicas e histopatológicas mais pronunciadas foram observadas nos camundongos que receberam POL nas doses 5 e/ou 10 vezes maiores que a dose efetiva no TNF em camundongos. Entretanto, POL apresenta constituição química diferente de H. perforatum, sugerindo baixo risco desta espécie em relação à fototoxicidade (ausência de hipericina). Através dos dados obtidos neste estudo, acredita-se que POL pode se tornar uma espécie promissora no desenvolvimento de um novo fitoterápico com ação neuroativa. A inibição da recaptação das monoaminas pode estar relacionada a uma alteração do gradiente iônico de Na+, através da estimulação da atividade da Na+,K+-ATPase, o que leva a crer que ULI possui um perfil de ação lamotrigina-like. Dessa forma, ULI torna-se um novo e promissor padrão molecular de substância com atividade no sistema nervoso central. / The aim of this work was to continue studying the antidepressant mechanism of Hypericum polyanthemum (POL) and its compound derived from phloroglucinols class uliginosin B (ULI). Considering the potential for development of new drugs with this plant, a preclinical study of toxicity with POL was accomplished, administering acute and repeated-doses in mice. The cyclo-hexane extract administration by oral route (p.o.) of POL (90 mg/kg) was able to significantly reduce the immobility time of rats and mice in the forced swimming test (FST). ULI (10 mg/kg, p.o.) also produced a reduction in immobility time in two models predictive of antidepressant activity in mice, FST and the tail suspension test (TST). Simultaneously administration (p.o) of subeffective doses of POL (45 mg/kg) and ULI (5 mg/kg) were able to potentiate the antidepressant effect of subeffective dose of imipramine (10 mg/kg), bupropion (3 mg/kg ) and fluoxetine (15 mg/kg), in the mouse FST. The pretreatment of mice, by i.p. route, with SCH 23390 (dopamine D1 receptor antagonist); sulpiride (dopamine D2 receptor antagonist); (α1 adrenoceptor antagonist); yohimbine (α2 adrenoceptor antagonist) and p-chlorophenylalanine methyl ester (pCPA- an inhibitor of serotonin (5-HT) synthesis) prevented anti- immobility effect of ULI in FST. In vitro, ULI inhibited synaptosomal uptake of dopamine ([3H]-DA), noradrenaline ([3H]-NA) and 5-HT ([3H]-5-HT), without binding with monoaminergic transporters, and this was demonstrated by different concentrations of ULI that did not affect the binding of [3H]-mazindol, [3H]-nisoxetine and [3H]-citalopram to DA, NA and 5-HT uptake sites, respectively. These results suggest that ULI has non-selective action on the monoaminergic system, which may represent a new compound with triple reuptake inhibition; furthermore, ULI has a mechanism of action different from the classical antidepressants by inhibiting monoamine reuptake without bind to respective neurotransporters. In addition we have performed a biochemical study for activity of Na+, K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of mice. Acute and repeated oral treatment (3 days, 1 x per day) increased enzyme activity in cortex at different times. ULI did not alter Na+, K+- ATPase activity in hippocampus, and this result confirms the hypothesis that ULI can be contributing to the maintenance of neuronal excitability by stimulating this enzyme, and acting selectively in cerebral cortex. Moreover, we investigated the role of ULI on voltage-gated sodium channels (Na+), through pre-administration of veratrine ( Na+ channel oppener). Veratrine was able to abolish the antidepressant effect of ULI in TNF and this result indicates the possibility that ULI blocks the Na+ channels by altering the ionic gradient through the stimulation of Na+, K+-ATPase and impairing or inhibiting the reuptake of monoamines. In toxicity experiments, the more pronounced physiological, biochemical and histopathological changes were observed in mice that received POL at doses 5 and/or 10 fold higher than the effective dose in TNF. However, POL has chemically different from H. perforatum, suggesting low risk of this species in relation to phototoxicity (absence of hypericin). Considering all results, we supposed that POL could be a product with potential for the development of new drugs. The monoamine reuptake inhibition can be related to a change on the gradient of Na+ ion, by stimulation of Na+, K+-ATPase, which suggests that ULI has a lamotrigine-like profile. Therefore, we suggest that phloroglucinol derivative ULI represents a promising new molecular pattern with central nervous system activity.

O envelhecimento é um processo no qual ocorrem alterações estruturais e funcionais da maioria dos órgãos, que podem levar ao aumento da susceptibilidade a várias doenças associadas à idade. Assim, várias estratégias têm sido investigadas a fim de se reduzir os sintomas relacionados à idade e o exercício físico tem demonstrado efeito neuroprotetor em diferentes modelos experimentais. Nesta tese, investigamos os efeitos do exercício físico moderado sobre a memória e sobre parâmetros bioquímicos no hipocampo e no músculo sóleo de ratos Wistar de 3, 6 e 22 meses de idade. Para isso, foram realizados três experimentos distintos que deram origem aos três capítulos apresentados na tese. No primeiro experimento, estudamos o efeito do exercício físico em ratos de 3 e 22 meses de idade. Neste experimento, o exercício preveniu o déficit de aquisição da memória de referência relacionado à idade. Além disso, preveniu o aumento do estresse oxidativo no hipocampo de ratos envelhecidos e também promoveu o aumento da expressão dos fatores neurotróficos BDNF, NT-3 e IGF-1 no hipocampo destes animais. É importante ressaltar que houve uma correlação positiva entre a redução do estresse oxidativo e a latência para encontrar a plataforma no 5º dia de treino na tarefa de memória de referência, ou seja, a redução do conteúdo de espécies reativas e da lipoperoxidação pelo exercício está correlacionada com a melhora do desempenho de memória dos ratos envelhecidos. No segundo experimento, avaliamos o efeito do exercício físico em ratos de 3, 6 e 22 meses de idade. Corroborando com os resultados apresentados no experimento anterior, foi demonstrado que o exercício físico moderado preveniu os déficits de memória espacial de referência e de trabalho relacionados à idade. O treinamento cognitivo no Water maze aumentou a atividade das enzimas Na+,K+- ATPase e AChE no hipocampo de ratos adultos e envelhecidos. O aumento na atividade da Na+,K+-ATPase foi ainda maior nos ratos envelhecidos submetidos ao exercício físico combinado com o treinamento cognitivo. Além disso, foi observada uma correlação positiva entre a atividade da Na+,K+-ATPase no hipocampo dos ratos envelhecidos exercitados e a latência para encontrar a plataforma no 5º dia de treino na tarefa de memória de referência, ou seja, o aumento da atividade da Na+,K+-ATPase está associado com a melhora do desempenho de memória relacionado ao exercício físico. De acordo com esses dados, também foi observada uma correlação negativa entre a atividade da Na+,K+-ATPase e a diferença (delta) entre a média das latências entre os trials 1 e 4 na tarefa de memória de trabalho, o que demonstra que os ratos envelhecidos exercitados apresentaram um melhor desempenho na tarefa de memória de trabalho associado com o aumento na atividade da Na+,K+-ATPase. No terceiro experimento, investigamos o efeito do exercício físico em ratos de 3 e 22 meses de idade. O exercício aumentou o conteúdo de espécies reativas e a lipoperoxidação no músculo sóleo de ratos jovens. Ratos envelhecidos apresentaram um aumento da lipoperoxidação e uma redução na atividade da enzima catalase. O exercício induziu um aumento dos níveis de espécies reativas, uma redução no conteúdo de sulfidrilas e o aumento de proteínas carboniladas; contudo, promoveu o aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase no sóleo dos ratos envelhecidos. Assim, os resultados do primeiro e do segundo experimento demonstram que o exercício físico preveniu o declínio da memória espacial relacionado à idade e que esse efeito pode ser mediado por fatores que incluem a redução do estresse oxidativo, o aumento da expressão de fatores neurotróficos e o aumento da atividade da enzima Na+,K+-ATPase no hipocampo de ratos envelhecidos. Os resultados do músculo demonstram que o sóleo dos ratos jovens, embora susceptível ao aumento das espécies reativas e lipoperoxidação, não apresentou dano às proteínas, sugerindo que outros mecanismos, como o sistema de defesa antioxidante não enzimático, possam estar atuando para compensar os efeitos do exercício. Além disso, o músculo dos ratos envelhecidos parece ser mais sensível que o dos ratos jovens às alterações do estado oxidativo celular induzidas pelo exercício físico, porque apesar dos animais envelhecidos exercitados apresentarem um aumento na atividade das enzimas antioxidantes, não houve uma redução do dano oxidativo. / Aging is a process in which structural and functional changes occur in most organs and may lead to increased susceptibility to various age-related diseases. Several approaches have been investigated with the aim of reducing age-related symptoms and physical exercise is a therapeutic strategy that has presented neuroprotective action in different experimental models. In this context, some studies show that regular physical exercise is related to the improvement of quality of life and to the prevention of age-related cognitive decline. In the present thesis, we investigated the effect of moderate physical exercise on memory and on biochemical parameters in the hippocampus and soleus muscle in 3, 6 and 22 months-old rats. For that, three different experiments were carried out, which gave rise to the three chapters presented in this thesis. In the first experiment, we studied the effect of physical exercise in 3 and 22 months-old rats. In this experiment, the exercise prevented the age-related acquisition deficit of reference memory. In addition, exercise prevented the increased in oxidative stress and also was able to increase the expression of neurotrophic factors BDNF, NT-3 and IGF-1 in the hippocampus of aged rats. It is important to note that there was a positive correlation between the reduction of oxidative stress and latency to find the platform on the 5th day of training in the reference memory task, i.e., reduction of reactive species levels and lipid peroxidation, might be associated with the exercise-related memory improvement. In the second experiment, we evaluated the effect of physical exercise in 3, 6 and 22 months-old rats. Corroborating with the results presented in the previous experiment, it was demonstrated that moderate physical exercise prevented age-related spatial reference and working memory deficits. It has also been shown that the cognitive training in Water maze increased the activity of the Na+,K+-ATPase and AChE enzymes in the hippocampus of adult and aged rats. The increase in Na+,K+-ATPase activity was even further increased in aged rats that were submitted to physical exercise combined with cognitive training. In addition, a positive correlation was observed between the Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus of aged exercised rats and the latency to find the platform on the 5th day of training in the reference memory task, i.e., the increase in Na+,K+-ATPase activity is associated with the exercise-related memory improvement in aged rats. Consistently, a negative correlation between the Na+,K+-ATPase activity and the difference (delta) between the mean latencies of trials 1 and 4 in the working memory task was also found, i.e., the exercised aged rats showed better performance in the working memory task associated with the increase in Na+,K+-ATPase activity. In the third experiment, we investigated the effect of physical exercise in 3 and 22 months-old rats. Exercise increased the reactive species content and lipid peroxidation in soleus muscle of young rats. Aged rats showed an increase in lipid peroxidation and a reduction in the catalase activity. Exercise induced an increase in reactive species levels, a reduction in sulfhydryl content and an increase in carbonyl proteins; however, the exercise was able to increase the superoxide dismutase and catalase activities in the soleus of aged rats. Thus, the results of first and second experiments demonstrate that physical exercise prevents the age-related decline of spatial memory and this effect might be related to the reduction of oxidative stress, increased expression of neurotrophic factors and the increase in the Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus of aged rats. The muscle results demonstrate that soleus of young rats, although susceptible to the increased in reactive species and lipid peroxidation, showed no damage to proteins, suggesting that other mechanisms, such as the non-enzymatic antioxidant defense system, may be acting to compensate the effects of exercise. In addition, the muscle of the aged rats seems to be more sensitive than the young rats to changes in the cellular oxidative state induced by exercise, since aged exercised animals showed an increase in the activity of antioxidant enzymes, but there was no reduction of oxidative damage.

A hipoxantina, principal oxipurina envolvida na via de salvação das purinas no cérebro, acumula-se na doença de Lesch-Nyhan, um erro inato do metabolismo das purinas. Os sintomas clínicos manifestam-se precocemente na vida dos pacientes, incluindo alterações motoras e cognitivas, retardo mental e automutilação. Embora os mecanismos subjacentes da disfunção cerebral na doença de Lesch-Nyhan sejam pouco compreendidos, o acúmulo de hipoxantina parece contribuir para os danos neurológicos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração intraestriatal de hipoxantina em ratos infantis e adultos jovens submetidos à cirurgia estereotáxica. Neste estudo, analisamos primeiramente o efeito da hipoxantina sobre os parâmetros neuroinflamatórios e oxidativos em estriados de ratos infantis e adultos jovens. Foram avaliados também alguns parâmetros neuroenergéticos. Ratos Wistar de 21 e 60 dias de vida foram submetidos à cirurgia estereotáxica e foram divididos em dois grupos: controle (infusão de solução salina 0,9%) e hipoxantina (10 IJM). A administração intraestriatal de hipoxantina aumentou os níveis de IL-6 e TNF-a e o imunoconteúdo da subunidade NF-kB I p65 nuclear em estriado de ambas as idades de ratos. A ativação microglial e astrocitária foram observadas pelo aumento do imunoconteúdo de lba1 e GFAP, respectivamente, no estriado de ratos de 21 dias. Todos os parâmetros oxidativos foram alterados, sugerindo uma forte relação neurotóxica de hipoxantina e estresse oxidativo. Em ratos de 60 dias de vida, a hipoxantina aumentou a atividade da succinato desidrogenase e do complexo 11 e diminuiu a atividade da citocromo c oxidase e seu imunoconteúdo. A injeção de hipoxantina diminuiu a porcentagem marcação de membrana mitocondrial e aumentou marcação de potencial mitocondrial. A hipoxantina também diminuiu o número de células vivas e aumentou o número de células apoptóticas. Em ratos de 21 dias de vida, a hipoxantina alterou alguns parâmetros do metabolismo energético e diminui a atividade de Na+,K+-ATPase, provavelmente por danos às proteínas, visto pela redução de conteúdo de sulfidrilas. Nossos achados mostram que a administração de hipoxantina alterou parâmetros neuroinflamatórios e neuroenergéticos, possivelmente por meio de desequilíbrio oxidativo, sugerindo que esses processos podem estar envolvidos, pelo menos em parte, com os distúrbios neurológicos encontrados em pacientes com doença de Lesch-Nyhan. / Hypoxanthine, the major oxypurine metabolite involved in purine's salvage pathway in the brain, is accumulated in Lesch-Nyhan disease, an in bom errar of metabolism of purine. The clinicai symptoms manifest early in the patients' lives, including motor and cognitiva alterations, mental retardation and self-mutilation. Although the underlying mechanisms of brain dysfunction in Lesch-Nyhan disease are poorly understood, the accumulation of hypoxanthine appears to contribute to neurological damage. The purpose of this study was to investigate the effects of hypoxanthine intrastriatal administration in infant and young adult rats submitted to stereotactic surgery. We firstly analyzed the effect of hypoxanthine on neuroinflammatory and oxidative parameters in striatum of infant and young adult rats. We also evaluated some neuroenergetic parameters. Wistar rats of 21 and 60 days of life underwent stereotactic surgery and were divided into two groups: contrai (infusion of saline 0.9%) and hypoxanthine (10 IJM). lntrastriatal administration of hypoxanthine increased IL- 6 and TNF-a leveis and nuclear immunocontent of NF-KB/p65 subunit in striatum of rats of both ages. Microglial and astrocyte activation was seen by the increase in lba1 and GFAP immunocontent, respectively, in striatum of infant rats. Ali oxidative parameters were altered, suggesting a strong neurotoxic hypoxanthine role on oxidative stress. In 60-day-old rats hypoxanthine increased succinate dehydrogenase and complex 11 activities and diminished cytochrome c oxidase activity and immunocontent. Hypoxanthine injection decreased the percentage of cells with mitochondrial membrana label and increased mitochondrial mass potential labeling. Hypoxanthine also diminished the number of live cells and increased the number of apoptotic cells. In 21-days-old rats hypoxanthine altered some energy metabolism parameters and decreased Na•,K•-ATPase activity probably by protein damage, seen in the reduction of sulfhydryl content. Our findings show that the administration of hypoxanthine altered neuroinflammatory and neuroenergetic parameters, possibly through oxidative imbalance, suggesting that these processes may be involved, at least in part, with the neurological disorders found in patients with Lesch-Nyhan disease.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Na+,K+-ATPase is ubiquitously expressed in the plasma membrane of all animal cells where serves as the principal regulator of intracellular ion homeostasis. Na+,K+-ATPase activity is activated by Na+ and K+ and current evidence indicates that total Na+,K+-ATPase activity is, in general, inhibited by anions. However, the effect of pharmacologically-induced Cl- flux on α1- and α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase activity is not established. In this study we investigated the effect of diazepam, a GABAA receptor positive allosteric modulator, on α1- and α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase activity. Hippocampal and cortical slices were incubated with diazepam (0, 0.05, 0.15 or 0.5 μM) and/or flumazenil (0, 0.005, 0.015, 0.05, 0.15, 0.5 or 1.5 μM) for 10 minutes. After incubation the slices were homogenized and α1 and α2/3 Na+,K+-ATPase activity were assayed using ouabain 3 μM (that inhibits α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase) and 4 mM (that inhibits both isoforms). Diazepam caused a 50% decrease of α2/3-subunit containing Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus, but did not alter enzyme activity in the entorhinal cortex. The effect of diazepam was prevented by flumazenil, indicating that the decrease of Na+,K+-ATPase was involved GABAA receptors. Furthermore, a low chloride medium abolished the diazepam-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity. Our data suggests that Na+,K+-ATPase in the hippocampus is sensitive to the pharmacological effects of a benzodiazepine by GABAA receptor-mediated mechanisms. Keywords: sodium pump. GABAA receptor. diazepam. flumazenil. chloride ion. hippocampus. entorhinal córtex. / A enzima Na+,K+-ATPase, ou bomba de sódio, é expressa na membrana plasmática de células eucarióticas, onde atua como principal regulador da homeostase iônica intracelular. A enzima Na+,K+-ATPase é ativada pelos íons Na+ and K+ e evidências indicam que a atividade total da enzima Na+,K+-ATPase é inibida por ânions. Entretanto, o efeito do fluxo de cloreto induzido farmacologicamente sobre a atividade das subunidades α1 e α2/3 da enzima Na+,K+-ATPase ainda não foi investigado. Neste estudo, nós investigamos o efeito do diazepam, um modulador alostérico positivo do receptor GABAA na atividade específica das subunidades α1 e α2/3 da Na+,K+-ATPase. Fatias de hipocampo e de córtex entorrinal foram incubadas com diazepam (0; 0,05; 0,15 ou 0,5 μM) e/ou flumazenil (0; 0,005, 0,015; 0,05; 0,15; 0,5 ou 1,5 μM) por 10 minutos. Após a incubação, as fatias foram homogeneizadas e a atividade das subunidades α1 e α2/3 da enzima Na+,K+-ATPase foi determinada. Diazepam diminuiu 50% a atividade da subunidade α2/3 da Na+,K+-ATPase no hipocampo, mas não alterou a atividade da enzima em córtex entorrinal. O efeito do diazepam foi prevenido por flumazenil, indicando que a diminuição da atividade da Na+,K+-ATPase envolveu a ativação dos receptores GABAA. Além disso, a baixa concentração de cloreto no meio de incubação aboliu a diminuição da atividade enzimática induzida por diazepam. Nossos dados sugerem que a enzima Na+,K+-ATPase no hipocampo é sensível a efeitos farmacológicos dos benzodiazepínicos por meio de mecanismos ativados por receptores GABAérgicos.

O envelhecimento é um processo no qual ocorrem alterações estruturais e funcionais da maioria dos órgãos, que podem levar ao aumento da susceptibilidade a várias doenças associadas à idade. Assim, várias estratégias têm sido investigadas a fim de se reduzir os sintomas relacionados à idade e o exercício físico tem demonstrado efeito neuroprotetor em diferentes modelos experimentais. Nesta tese, investigamos os efeitos do exercício físico moderado sobre a memória e sobre parâmetros bioquímicos no hipocampo e no músculo sóleo de ratos Wistar de 3, 6 e 22 meses de idade. Para isso, foram realizados três experimentos distintos que deram origem aos três capítulos apresentados na tese. No primeiro experimento, estudamos o efeito do exercício físico em ratos de 3 e 22 meses de idade. Neste experimento, o exercício preveniu o déficit de aquisição da memória de referência relacionado à idade. Além disso, preveniu o aumento do estresse oxidativo no hipocampo de ratos envelhecidos e também promoveu o aumento da expressão dos fatores neurotróficos BDNF, NT-3 e IGF-1 no hipocampo destes animais. É importante ressaltar que houve uma correlação positiva entre a redução do estresse oxidativo e a latência para encontrar a plataforma no 5º dia de treino na tarefa de memória de referência, ou seja, a redução do conteúdo de espécies reativas e da lipoperoxidação pelo exercício está correlacionada com a melhora do desempenho de memória dos ratos envelhecidos. No segundo experimento, avaliamos o efeito do exercício físico em ratos de 3, 6 e 22 meses de idade. Corroborando com os resultados apresentados no experimento anterior, foi demonstrado que o exercício físico moderado preveniu os déficits de memória espacial de referência e de trabalho relacionados à idade. O treinamento cognitivo no Water maze aumentou a atividade das enzimas Na+,K+- ATPase e AChE no hipocampo de ratos adultos e envelhecidos. O aumento na atividade da Na+,K+-ATPase foi ainda maior nos ratos envelhecidos submetidos ao exercício físico combinado com o treinamento cognitivo. Além disso, foi observada uma correlação positiva entre a atividade da Na+,K+-ATPase no hipocampo dos ratos envelhecidos exercitados e a latência para encontrar a plataforma no 5º dia de treino na tarefa de memória de referência, ou seja, o aumento da atividade da Na+,K+-ATPase está associado com a melhora do desempenho de memória relacionado ao exercício físico. De acordo com esses dados, também foi observada uma correlação negativa entre a atividade da Na+,K+-ATPase e a diferença (delta) entre a média das latências entre os trials 1 e 4 na tarefa de memória de trabalho, o que demonstra que os ratos envelhecidos exercitados apresentaram um melhor desempenho na tarefa de memória de trabalho associado com o aumento na atividade da Na+,K+-ATPase. No terceiro experimento, investigamos o efeito do exercício físico em ratos de 3 e 22 meses de idade. O exercício aumentou o conteúdo de espécies reativas e a lipoperoxidação no músculo sóleo de ratos jovens. Ratos envelhecidos apresentaram um aumento da lipoperoxidação e uma redução na atividade da enzima catalase. O exercício induziu um aumento dos níveis de espécies reativas, uma redução no conteúdo de sulfidrilas e o aumento de proteínas carboniladas; contudo, promoveu o aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase no sóleo dos ratos envelhecidos. Assim, os resultados do primeiro e do segundo experimento demonstram que o exercício físico preveniu o declínio da memória espacial relacionado à idade e que esse efeito pode ser mediado por fatores que incluem a redução do estresse oxidativo, o aumento da expressão de fatores neurotróficos e o aumento da atividade da enzima Na+,K+-ATPase no hipocampo de ratos envelhecidos. Os resultados do músculo demonstram que o sóleo dos ratos jovens, embora susceptível ao aumento das espécies reativas e lipoperoxidação, não apresentou dano às proteínas, sugerindo que outros mecanismos, como o sistema de defesa antioxidante não enzimático, possam estar atuando para compensar os efeitos do exercício. Além disso, o músculo dos ratos envelhecidos parece ser mais sensível que o dos ratos jovens às alterações do estado oxidativo celular induzidas pelo exercício físico, porque apesar dos animais envelhecidos exercitados apresentarem um aumento na atividade das enzimas antioxidantes, não houve uma redução do dano oxidativo. / Aging is a process in which structural and functional changes occur in most organs and may lead to increased susceptibility to various age-related diseases. Several approaches have been investigated with the aim of reducing age-related symptoms and physical exercise is a therapeutic strategy that has presented neuroprotective action in different experimental models. In this context, some studies show that regular physical exercise is related to the improvement of quality of life and to the prevention of age-related cognitive decline. In the present thesis, we investigated the effect of moderate physical exercise on memory and on biochemical parameters in the hippocampus and soleus muscle in 3, 6 and 22 months-old rats. For that, three different experiments were carried out, which gave rise to the three chapters presented in this thesis. In the first experiment, we studied the effect of physical exercise in 3 and 22 months-old rats. In this experiment, the exercise prevented the age-related acquisition deficit of reference memory. In addition, exercise prevented the increased in oxidative stress and also was able to increase the expression of neurotrophic factors BDNF, NT-3 and IGF-1 in the hippocampus of aged rats. It is important to note that there was a positive correlation between the reduction of oxidative stress and latency to find the platform on the 5th day of training in the reference memory task, i.e., reduction of reactive species levels and lipid peroxidation, might be associated with the exercise-related memory improvement. In the second experiment, we evaluated the effect of physical exercise in 3, 6 and 22 months-old rats. Corroborating with the results presented in the previous experiment, it was demonstrated that moderate physical exercise prevented age-related spatial reference and working memory deficits. It has also been shown that the cognitive training in Water maze increased the activity of the Na+,K+-ATPase and AChE enzymes in the hippocampus of adult and aged rats. The increase in Na+,K+-ATPase activity was even further increased in aged rats that were submitted to physical exercise combined with cognitive training. In addition, a positive correlation was observed between the Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus of aged exercised rats and the latency to find the platform on the 5th day of training in the reference memory task, i.e., the increase in Na+,K+-ATPase activity is associated with the exercise-related memory improvement in aged rats. Consistently, a negative correlation between the Na+,K+-ATPase activity and the difference (delta) between the mean latencies of trials 1 and 4 in the working memory task was also found, i.e., the exercised aged rats showed better performance in the working memory task associated with the increase in Na+,K+-ATPase activity. In the third experiment, we investigated the effect of physical exercise in 3 and 22 months-old rats. Exercise increased the reactive species content and lipid peroxidation in soleus muscle of young rats. Aged rats showed an increase in lipid peroxidation and a reduction in the catalase activity. Exercise induced an increase in reactive species levels, a reduction in sulfhydryl content and an increase in carbonyl proteins; however, the exercise was able to increase the superoxide dismutase and catalase activities in the soleus of aged rats. Thus, the results of first and second experiments demonstrate that physical exercise prevents the age-related decline of spatial memory and this effect might be related to the reduction of oxidative stress, increased expression of neurotrophic factors and the increase in the Na+,K+-ATPase activity in the hippocampus of aged rats. The muscle results demonstrate that soleus of young rats, although susceptible to the increased in reactive species and lipid peroxidation, showed no damage to proteins, suggesting that other mechanisms, such as the non-enzymatic antioxidant defense system, may be acting to compensate the effects of exercise. In addition, the muscle of the aged rats seems to be more sensitive than the young rats to changes in the cellular oxidative state induced by exercise, since aged exercised animals showed an increase in the activity of antioxidant enzymes, but there was no reduction of oxidative damage.

A hipoxantina, principal oxipurina envolvida na via de salvação das purinas no cérebro, acumula-se na doença de Lesch-Nyhan, um erro inato do metabolismo das purinas. Os sintomas clínicos manifestam-se precocemente na vida dos pacientes, incluindo alterações motoras e cognitivas, retardo mental e automutilação. Embora os mecanismos subjacentes da disfunção cerebral na doença de Lesch-Nyhan sejam pouco compreendidos, o acúmulo de hipoxantina parece contribuir para os danos neurológicos. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração intraestriatal de hipoxantina em ratos infantis e adultos jovens submetidos à cirurgia estereotáxica. Neste estudo, analisamos primeiramente o efeito da hipoxantina sobre os parâmetros neuroinflamatórios e oxidativos em estriados de ratos infantis e adultos jovens. Foram avaliados também alguns parâmetros neuroenergéticos. Ratos Wistar de 21 e 60 dias de vida foram submetidos à cirurgia estereotáxica e foram divididos em dois grupos: controle (infusão de solução salina 0,9%) e hipoxantina (10 IJM). A administração intraestriatal de hipoxantina aumentou os níveis de IL-6 e TNF-a e o imunoconteúdo da subunidade NF-kB I p65 nuclear em estriado de ambas as idades de ratos. A ativação microglial e astrocitária foram observadas pelo aumento do imunoconteúdo de lba1 e GFAP, respectivamente, no estriado de ratos de 21 dias. Todos os parâmetros oxidativos foram alterados, sugerindo uma forte relação neurotóxica de hipoxantina e estresse oxidativo. Em ratos de 60 dias de vida, a hipoxantina aumentou a atividade da succinato desidrogenase e do complexo 11 e diminuiu a atividade da citocromo c oxidase e seu imunoconteúdo. A injeção de hipoxantina diminuiu a porcentagem marcação de membrana mitocondrial e aumentou marcação de potencial mitocondrial. A hipoxantina também diminuiu o número de células vivas e aumentou o número de células apoptóticas. Em ratos de 21 dias de vida, a hipoxantina alterou alguns parâmetros do metabolismo energético e diminui a atividade de Na+,K+-ATPase, provavelmente por danos às proteínas, visto pela redução de conteúdo de sulfidrilas. Nossos achados mostram que a administração de hipoxantina alterou parâmetros neuroinflamatórios e neuroenergéticos, possivelmente por meio de desequilíbrio oxidativo, sugerindo que esses processos podem estar envolvidos, pelo menos em parte, com os distúrbios neurológicos encontrados em pacientes com doença de Lesch-Nyhan. / Hypoxanthine, the major oxypurine metabolite involved in purine's salvage pathway in the brain, is accumulated in Lesch-Nyhan disease, an in bom errar of metabolism of purine. The clinicai symptoms manifest early in the patients' lives, including motor and cognitiva alterations, mental retardation and self-mutilation. Although the underlying mechanisms of brain dysfunction in Lesch-Nyhan disease are poorly understood, the accumulation of hypoxanthine appears to contribute to neurological damage. The purpose of this study was to investigate the effects of hypoxanthine intrastriatal administration in infant and young adult rats submitted to stereotactic surgery. We firstly analyzed the effect of hypoxanthine on neuroinflammatory and oxidative parameters in striatum of infant and young adult rats. We also evaluated some neuroenergetic parameters. Wistar rats of 21 and 60 days of life underwent stereotactic surgery and were divided into two groups: contrai (infusion of saline 0.9%) and hypoxanthine (10 IJM). lntrastriatal administration of hypoxanthine increased IL- 6 and TNF-a leveis and nuclear immunocontent of NF-KB/p65 subunit in striatum of rats of both ages. Microglial and astrocyte activation was seen by the increase in lba1 and GFAP immunocontent, respectively, in striatum of infant rats. Ali oxidative parameters were altered, suggesting a strong neurotoxic hypoxanthine role on oxidative stress. In 60-day-old rats hypoxanthine increased succinate dehydrogenase and complex 11 activities and diminished cytochrome c oxidase activity and immunocontent. Hypoxanthine injection decreased the percentage of cells with mitochondrial membrana label and increased mitochondrial mass potential labeling. Hypoxanthine also diminished the number of live cells and increased the number of apoptotic cells. In 21-days-old rats hypoxanthine altered some energy metabolism parameters and decreased Na•,K•-ATPase activity probably by protein damage, seen in the reduction of sulfhydryl content. Our findings show that the administration of hypoxanthine altered neuroinflammatory and neuroenergetic parameters, possibly through oxidative imbalance, suggesting that these processes may be involved, at least in part, with the neurological disorders found in patients with Lesch-Nyhan disease.

O objetivo deste trabalho foi ampliar o estudo do mecanismo de ação antidepressivo de Hypericum polyanthemum (POL) e de seu composto derivado da classe dos floroglucinóis uliginosina B (ULI). Considerando o potencial desta planta para o desenvolvimento de novos fármacos, realizou-se um estudo pré-clínico de toxicidade aguda e doses repetidas de POL em camundongos. A administração via oral (v.o.) do extrato ciclo-hexano de POL (90 mg/kg) foi capaz de reduzir significativamente o tempo de imobilidade de ratos e camundongos no teste de natação forçada (TNF). A administração de ULI (10 mg/kg, v.o.) igualmente reduziu o tempo de imobilidade no TNF e também no teste de suspensão pela cauda (TSC). A administração simultânea (v.o), das subdoses de POL (45 mg/kg) e ULI (5 mg/kg) foram capazes de potencializar o efeito antidepressivo das subdoses de imipramina (10 mg/kg), bupropiona (3 mg/kg) e fluoxetina (15 mg/kg), no TNF em camundongos. O pré- tratamento de camundongos, pela via intraperitoneal, com SCH 23390 (antagonista de receptor dopaminérgico D1); sulpirida (antagonista de receptor dopaminérgico D2); prazosin (antagonista de receptor α1-adrenérgico); ioimbina (antagonista de receptor α2-adrenérgico) e p-clorofenilalanina metil éster (pCPA- inibidor da síntese de serotonina (5-HT), preveniu o efeito anti-imobilidade de ULI no TNF. In vitro, ULI inibiu a recaptação sinaptossomal de dopamina ([3H]-DA), noradrenalina ([3H]-NA) e serotonina ([3H]-5-HT), sem ligação aos transportadores, e isto foi demonstrado através das diferentes concentrações de ULI que não afetaram a ligação de [3H]- mazindol, [3H]-nisoxetina e [3H]-citalopram aos sítios de recaptação de DA, NA e 5- HT, respectivamente. Estes resultados sugerem que ULI tem ação não-seletiva sobre o sistema monoaminérgico, o que pode representar um novo composto com inibição tripla da recaptação; além disso possui mecanismo de ação diferente dos antidepressivos clássicos, inibindo a recaptação das monoaminas sem se ligar aos respectivos sítios específicos dos transportadores. Também realizou-se estudo bioquímico da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral e hipocampo de camundongos. O tratamento agudo e repetido por via oral (3 dias, 1 x ao dia) aumentou a atividade desta enzima em córtex cerebral de camundongos em diferentes tempos. ULI não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase em hipocampo dos camundongos, e esse resultado corrobora com a hipótese de que ULI pode estar contribuindo para a manutenção da excitabilidade neuronal estimulando esta enzima, e agindo seletivamente no córtex cerebral. Além disso, investigou-se o papel de ULI sobre os canais de sódio dependentes de voltagem (Na+), através da pré-administração de veratrina (ativador de canal de Na+). A veratrina bloqueou o efeito antidepressivo de ULI no TNF e este resultado indica a possibilidade de ULI estar bloqueando os canais de Na+ alterando o gradiente iônico através da estimulação da atividade da Na+,K+-ATPase e, prejudicando ou inibindo a recaptação das monoaminas. Nos experimentos de toxicidade, as mudanças fisiológicas, bioquímicas e histopatológicas mais pronunciadas foram observadas nos camundongos que receberam POL nas doses 5 e/ou 10 vezes maiores que a dose efetiva no TNF em camundongos. Entretanto, POL apresenta constituição química diferente de H. perforatum, sugerindo baixo risco desta espécie em relação à fototoxicidade (ausência de hipericina). Através dos dados obtidos neste estudo, acredita-se que POL pode se tornar uma espécie promissora no desenvolvimento de um novo fitoterápico com ação neuroativa. A inibição da recaptação das monoaminas pode estar relacionada a uma alteração do gradiente iônico de Na+, através da estimulação da atividade da Na+,K+-ATPase, o que leva a crer que ULI possui um perfil de ação lamotrigina-like. Dessa forma, ULI torna-se um novo e promissor padrão molecular de substância com atividade no sistema nervoso central. / The aim of this work was to continue studying the antidepressant mechanism of Hypericum polyanthemum (POL) and its compound derived from phloroglucinols class uliginosin B (ULI). Considering the potential for development of new drugs with this plant, a preclinical study of toxicity with POL was accomplished, administering acute and repeated-doses in mice. The cyclo-hexane extract administration by oral route (p.o.) of POL (90 mg/kg) was able to significantly reduce the immobility time of rats and mice in the forced swimming test (FST). ULI (10 mg/kg, p.o.) also produced a reduction in immobility time in two models predictive of antidepressant activity in mice, FST and the tail suspension test (TST). Simultaneously administration (p.o) of subeffective doses of POL (45 mg/kg) and ULI (5 mg/kg) were able to potentiate the antidepressant effect of subeffective dose of imipramine (10 mg/kg), bupropion (3 mg/kg ) and fluoxetine (15 mg/kg), in the mouse FST. The pretreatment of mice, by i.p. route, with SCH 23390 (dopamine D1 receptor antagonist); sulpiride (dopamine D2 receptor antagonist); (α1 adrenoceptor antagonist); yohimbine (α2 adrenoceptor antagonist) and p-chlorophenylalanine methyl ester (pCPA- an inhibitor of serotonin (5-HT) synthesis) prevented anti- immobility effect of ULI in FST. In vitro, ULI inhibited synaptosomal uptake of dopamine ([3H]-DA), noradrenaline ([3H]-NA) and 5-HT ([3H]-5-HT), without binding with monoaminergic transporters, and this was demonstrated by different concentrations of ULI that did not affect the binding of [3H]-mazindol, [3H]-nisoxetine and [3H]-citalopram to DA, NA and 5-HT uptake sites, respectively. These results suggest that ULI has non-selective action on the monoaminergic system, which may represent a new compound with triple reuptake inhibition; furthermore, ULI has a mechanism of action different from the classical antidepressants by inhibiting monoamine reuptake without bind to respective neurotransporters. In addition we have performed a biochemical study for activity of Na+, K+-ATPase in cerebral cortex and hippocampus of mice. Acute and repeated oral treatment (3 days, 1 x per day) increased enzyme activity in cortex at different times. ULI did not alter Na+, K+- ATPase activity in hippocampus, and this result confirms the hypothesis that ULI can be contributing to the maintenance of neuronal excitability by stimulating this enzyme, and acting selectively in cerebral cortex. Moreover, we investigated the role of ULI on voltage-gated sodium channels (Na+), through pre-administration of veratrine ( Na+ channel oppener). Veratrine was able to abolish the antidepressant effect of ULI in TNF and this result indicates the possibility that ULI blocks the Na+ channels by altering the ionic gradient through the stimulation of Na+, K+-ATPase and impairing or inhibiting the reuptake of monoamines. In toxicity experiments, the more pronounced physiological, biochemical and histopathological changes were observed in mice that received POL at doses 5 and/or 10 fold higher than the effective dose in TNF. However, POL has chemically different from H. perforatum, suggesting low risk of this species in relation to phototoxicity (absence of hypericin). Considering all results, we supposed that POL could be a product with potential for the development of new drugs. The monoamine reuptake inhibition can be related to a change on the gradient of Na+ ion, by stimulation of Na+, K+-ATPase, which suggests that ULI has a lamotrigine-like profile. Therefore, we suggest that phloroglucinol derivative ULI represents a promising new molecular pattern with central nervous system activity.