Les récepteurs opioïde delta (DORs) sont des récepteurs couplés aux protéines G et sont fortement exprimés au niveau du bulbe olfactif, du cortex, du striatum, du noyau basolateral de l'amygdala et des noyaux du pons (Mansour et al., 1995; Le Merrer et al., 2009). Les souris mutantes de première génération (souris knockout, délétion totale du gène) ont déjà permis de démontrer que DOR joue un rôle critique dans le contrôle de la douleur chronique (Gavériaux-Ruff et al., 2011), la régulation de l’activité motrice et des réponses émotionnelles (Filliol et al ., 2000) et l’association drogue-contexte (Le Merrer et al., 2011). Le but de notre étude est d’identifier les circuits neuronaux dans lesquels les DORs contrôlent les processus émotionnels et cognitifs. Nous avons développé une lignée de souris de deuxième génération, dans laquelle les récepteurs sont supprimés spécifiquement dans les neurones GABAergiques du cerveau antérieur. Nous avons ensuite étudié le rôle des DORs exprimés par ces neurones dans les réponses émotionnelles, locomotrices et la sensibilité aux crises épileptiques. / Delta opioid receptors (DORs) are G-protein coupled receptors belonging to the opioid system, which play a central role in chronic pain and emotional responses. DORs are strongly expressed in olfactory bulb, cortex, striatum, basolateral nucleus of the amygdala and pons nuclei. Using constitutive gene knockout, we have previously demonstrated the role of DORs in reducingchronic pain (Gaveriaux-Ruff, Nozaki et al. 2011), anxiety-related behaviors and impulsivity(Olmstead,Ouagazzal et al. 2009), regulating locomotor activity (Filliol, Ghozland et al. 2000) and facilitating context learning (Le Merrer, Faget et al. 2012; Le Merrer, Rezai et al. 2013), Although these functions are well-established, neuronal networks and mechanisms underlying DOR-regulated behaviors remain poorly understood. The aim of this thesis work was to identify neuronal populations and brain circuits that support DOR functions. Recent evidence showed that DOR is highly expressed in GABAergic neurons (Scherrer et al.. 2006;Erbs et al., 2012; Rezai et al.. 2012). We therefore developed a conditional knockout mouse line (Dlx-DOR)by breeding floxed DOR gene (Oprd1) with a transgenic Dlx-5/6-Cre mouse line (Monorv et al., 2006) in order to produce a specific deletion of DOR in GABAergic neurons of the forebrain. We first determined brain distribution of delta receptors in Dlx-DOR at mRNA and protein levels. Then, behavioral analysis were performed to assess whether DORs expressed in forebrain GABAergic neurons contribute to the regulation of emotional contrai, locomotor activity as well as epileptogenic effect of SNC80, the prototypal DOR agonist. Finally, we initiated a project focused on DORs detected at the level of BLA.

Les travaux présentés ici visent à déterminer l’implication du récepteur aux opioïdes delta dans des modèles de pathologies chroniques telles que la douleur chronique et l’administration d’opiacés. Nous avons mis en oeuvre des approches génétiques, d’imagerie et comportementales afin de décrire précisément les changements de distribution neuronale du récepteur aux opioïdes delta dans un modèle de douleur neuropathique et dans l’administration chronique de morphine, dans les tissus du système nerveux central et périphérique. Nous avons étudié l’implication des récepteurs aux opioïdes delta périphériques dans l’effet thérapeutique de traitements antiallodyniques dans un modèle de douleur neuropathique, et examiné le rôle des récepteurs aux opioïdes delta dans la sensibilité viscérale et dans les effets thérapeutiques de la Prégabaline. Nos travaux ont permis de décrire précisément les changements et l’implication du récepteur aux opioïdes delta dans plusieurs modèles de pathologies chroniques, dans le but de dégager des pistes thérapeutiques futures. / In this work, we used genetic, imaging and behavioral approaches to describe the changes which the distribution of the delta opioid receptor underwent in models of clinical conditions such as neuropathic pain and chronic opioid exposure, at the peripheral and supraspinal levels. We investigated the role of peripheral delta opioid receptor populations in the antiallodynic effect of chronic treatment by antidepressant and β2 agonist molecules in a model of neuropathic pain. We also described the implication of delta opioid receptors in visceral sensitivity, and their involvement in the pain-relieving effects of Pregabalin in a model of neuropathic pain. Thus, we have brought insight as to the role of delta opioid receptors in these various clinical conditions, and thoroughly described the distribution changes; which may lead the way to therapeutic strategies to treat chronic pain or drug addiction.

UHRF1 est une protéine nucléaire responsable du maintien et de la régulation de l'épigénome des cellules. Elle favorise la prolifération cellulaire et est surexprimée dans la plupart des cancers. TIP60, l'un des partenaires le plus important d’UHRF1, est impliqué dans le remodelage de la chromatine et la régulation transcriptionnelle grâce à son activité acétyltransférase. Ensemble, les deux protéines régulent la stabilité et l'activité d'autres protéines telles que la DNMT1 et la p53. Le but de cette étude était d'explorer le mécanisme d'interaction entre UHRF1 et TIP60 en visualisant cette interaction dans les cellules. La microscopie par imagerie à temps de vie de fluorescence et d'autres techniques de biologie moléculaire ont été utilisées. Les résultats ont montré que UHRF1 interagit directement avec le domaine MYST de TIP60 et cette interaction se produit dans la phase S du cycle cellulaire. Les deux protéines ont également montré une réponse similaire aux dommages à l'ADN, ce qui prédit une cohérence dans leur fonction dans le mécanisme de réparation de l'ADN. La surexpression de TIP60 a également induit la baisse du niveau d’UHRF1 et de DNMT1 ainsi qu’une induction d'apoptose dans les cellules ce qui suggère un rôle de TIP60 dans la régulation des fonctions oncogéniques d’UHRF1. / UHRF1 is a nuclear protein maintaining and regulating the epigenome of cells. Its promotes proliferation and is found upregulated in most of cancers. TIP60 is one of the important interacting partner of UHRF1 and is involved in chromatin remodeling and transcriptional regulation through its acetyltransferase activity. Together they regulate the stability and activity of other proteins such as DNMT1 and p53. The aim of this thesis was to explore the mechanism of interaction between UHRF1 and TIP60 by visualizing this interaction in cells. Fluorescent lifetime imaging microscopy and other molecular biology techniques were employed for this purpose. Results of this study showed that UHRF1 interacts directly to the MYST domain of TIP60 and this interaction prevails in the S-phase of cell cycle. Both proteins also showed a similar response to DNA damage predicting a coherence in their function in DNA repair mechanism. Overexpression of TIP60 also downregulated UHRF1 and DNMT1 and induced apoptosis in cells suggesting a role of TIP60 in regulation of oncogenic functions of UHRF1.

Lors de la liaison d’un glucocorticoïde (GC) naturel ou synthétique (par exemple, la Dexaméthasone) au récepteur des glucocorticoïdes (GR), les GCs régulent l’expression de gènes cibles soit par (i) transactivation par liaison ‘’directe’’ à un élément de liaison à l’ADN de type ‘’(+)GRE’’, (ii) transrépression ‘’directe’’ par liaison à un élément de type ‘’nGRE’’ ou (iii) transrépression ‘’indirecte’’ par interaction physique directe avec des facteurs de transcription pro-inflammatoires tels que AP-1 et NF-κB. Les effets anti-inflammatoires bénéfiques des GCs sont généralement attribués à la transrépression indirecte, alors que nombre de leurs effets secondaires pathologiques indésirables paraissent liés à la transactivation et/ou à la transrépression directe. Notre laboratoire a récemment découvert qu’un composé non-stéroïdien dénommé CpdX ainsi que ses dérivés deutérés, ne présentent ni la fonction de transactivation, ni celle de transrépression directe du GR, tout en stimulant son activité bénéfique de transrépression indirecte. Notre projet a consisté à caractériser un composé non-stéroïdien dit CpdX, ainsi que ses dérivés, quant à leurs activités thérapeutiques et à démontrer qu’elles sont semblables à celles des glucocorticoïdes anti-inflammatoires, couramment utilisés, tout en étant débarrassés de leurs effets pathologiques secondaires, tels que l’ostéoporose, l’atrophie cutanée et le syndrome métabolique. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisés des modèles de souris présentant soit les affections cutanées (dermatites de contact ou atopique, psoriasis), l'asthme, l’arthrite rhumatismale, la colite ulcérative ou la conjonctivite allergique, associés à des études d’immunologie et de biologie moléculaire et cellulaire. Mon travail de thèse a démontré que CpdX, et certains de ses dérivés deutérés, présentent une activité anti-inflammatoire dans le traitement de ces modèles ‘’souris’’ (Partie I). Nous avons aussi montré que le traitement par CpdX et ses dérivés n’induit pas les effets secondaires pathologiques des glucocorticoïdes (Partie II), ouvrait ainsi la vue à une nouvelle ère dans le traitement à long-terme de maladies inflammatoires, sans provoquer les effets pathologiques indésirables des traitements actuels aux glucocorticoïdes. / Upon binding of natural or synthetic glucocorticoids (GCs) (e.g. Dexamethasone) to their glucocorticoid receptor (GR), GCs regulate the expression of target genes either by (i) direct transactivation through direct binding to “(+)GRE” DNA binding sites (DBS), (ii) direct transrepression through binding to “IR nGRE” DBSs or (iii) tethered indirect transrepression mediated through interaction with transactivators, such as NFkB, AP1, or STAT3 bound to their cognate DBSs. The beneficial anti-inflammatory effects of GCs have been generally ascribed to tethered transrepression, whereas many of their long-term undesirable side-effects could be due to transactivation and/or direct transrepression. Our laboratory recently reported that a non-steroidal compound, named CpdX, selectively lacks both direct transactivation and direct transrepression functions, while still exerting an indirect transrepression activity. The goal of our project was to characterize CpdX and some of its derivatives as effective anti-inflammatory drugs similar to glucocorticoids, but lacking their main deleterious side-effects, e.g. osteoporosis, skin atrophy and metabolic disorders. To this end, we have used experimental mouse model for skin disorders (atopic dermatitis, contact dermatitis, and psoriasis), asthma, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis and allergic conjunctivitis, combined with immunology, molecular and cellular biology. My thesis studies have demonstrated that in mouse models, CpdX and its derivatives exhibit anti-inflammatory activities, which are similar to those of glucocorticoids (Part I). Importantly, we further show that CpdX and its derivatives do not exhibit the long-term debilitating side-effects of glucocorticoids (Part II). Thereby paving the way to a new era in the long-term therapy of major inflammatory diseases.

Despite a rise in breast cancer incidence, mortality rates have fallen. This improvement in mortality is due to the success of anti-cancer treatments such as chemotherapy and radiotherapy. Such treatments, however, are known to be associated with a range of symptoms. A number of studies exploring patients’ chemotherapy-related symptom experiences have shown that patients consistently rate nausea and fatigue highly, not only in relation to severity, but also in relation to the associated distress they experience. The subjective and non-observable nature of both nausea and fatigue complicates their assessment. While a range of assessment tools exists to evaluate patients’ experiences of these two symptoms, there is currently no gold standard assessment tool for assessing either symptom. Moreover, while a range of pharmacological and non-pharmacological interventions have been developed for both symptoms, further evaluation is often needed to provide the level of evidence required to recommend their implementation in real life clinical environments. The SNA↔P (structured nursing assessment into practice) study arose in response to this clinical situation. The SNA↔P study was a longitudinal study that evaluated the impact of a complex evidence-based intervention, incorporating structured multidimensional symptom assessment and multiple symptom management techniques, on patients’ experiences of nausea and fatigue during a course of chemotherapy for breast cancer. Using complementary quantitative and qualitative research methods not only allowed in-depth understanding of patients’ experiences and patterns of nausea and fatigue during a course of chemotherapy, but also facilitated a rounded evaluation of the intervention, incorporating both statistical elements and those of personal significance. The use of these methods showed that the implementation of the SNA↔P intervention in routine clinical practice has significant potential for improving patients’ symptom experiences during a course of chemotherapy. In so doing, it also highlighted a number of areas in which clinical practice can be influenced, and research conducted, to further improve patients’ symptom experiences.

Ένας από τους πιο σημαντικούς στόχους της φαρμακευτικής θεραπείας είναι η ανάπτυξη φορέων φαρμάκου που θα μεταφέρουν και θα παραδίδουν εκλεκτικά το φάρμακο στις θέσεις φαρμακολογικής δράσης του αλλά και με έναν ελεγχόμενο ρυθμό χορήγησης κατάλληλα προσαρμοσμένο για την κάθε ασθένεια. Για την ελεγχόμενη χορήγηση και στόχευση βιοδραστικών ουσιών έχουν αναπτυχθεί πολλοί φορείς, όπως πολυμερικά νανοσωματίδια και λιποσώματα. Μεταξύ των πολυμερών που έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή νανοσωματιδιακών φορέων φαρμάκων ιδιαίτερη προσοχή συγκεντρώνουν τα βιοδιασπώμενα και βιοσυμβατά πολυμερή του πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού) οξέος (PLGA). Τα νανοσωματίδια που παρασκευάζονται από τα συμπολυμερή αυτά απομακρύνονται ταχύτατα από τη συστηματική κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, κυρίως μέσω της πρόσληψης τους από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα. Όταν όμως επικαλυφθούν με υδρόφιλα, μη ιονικά πολυμερή, όπως η πολυ(αιθυλενογλυκόλη), έχουμε στερεοχημική σταθεροποίηση των νανοσωματιδίων και παράταση του χρόνου παραμονής τους στην συστηματική κυκλοφορία. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της διαλυτότητας του φαρμάκου στην φόρτωση και αποδέσμευση του από PLGAmPEG νανοσωματίδια διαφορετικής πολυμερικής σύστασης (αναλογία PLGA/PEG). Ως πρότυπα φάρμακα χρησιμοποιήθηκαν τα μέλη της τάξης των μεθυλοξανθινών καφεΐνη, θεοφυλλίνη και θεοβρωμίνη. Οι μεθυλοξανθίνες αποτελούν ικανοποιητικά πρότυπα ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην μελέτη της επίδρασης της διαλυτότητας στις ιδιότητες φόρτωσης και απελευθέρωσης φαρμάκων από τα PLGAmPEG νανοσωματίδια, καθώς είναι μικρά μόρια με παραπλήσιο μοριακό βάρος και χημικές ιδιότητες ενώ η διαλυτότητα τους στο νερό είναι σημαντικά διαφορετική: καφεΐνη (1g/46 ml), θεοφυλλίνη (1 g/120 ml) και θεοβρωμίνη (1 g/2000 ml). Παρασκευάστηκαν έτσι τρεις διαφορετικές συνθέσεις νανοσωματιδίων με την μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος και το ζ δυναμικό. Στην συνέχεια μελετήθηκαν οι ιδιότητες φόρτωσης των μεθυλοξανθινών καθώς και οι ιδιότητες απελευθέρωσής τους από τα νανοσωματίδια μέσα σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και ανθρώπινο πλάσμα in vitro. Το μέσο μέγεθος των νανοσωματιδίων κυμαίνονταν από 130 έως 200 nm και το ζ δυναμικό από -7 έως -20 mV. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν τα νανοσωματίδια κατάλληλα για εφαρμογές ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των PLGAmPEG νανοσωματιδίων βρέθηκε να εξαρτάται από την σχετική διαλυτότητα του φαρμάκου στην εξωτερική υδατική φάση και στην οργανική φάση που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή των νανοσωματιδίων και όχι απλά από την υδατοδιαλυτότητά τους. Έτσι η φόρτωση των νανοσωματιδίων ήταν μεγαλύτερη στην περίπτωση της καφεΐνης απ’ ότι στην θεοβρωμίνη, και αυτής από την φόρτωση στην περίπτωση της θεοφυλλίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των μεθυλοξανθινών σε PLGAmPEG νανοσωματίδια επηρεάζεται από την αρχική φόρτωση των νανοσωματιδίων σε φάρμακο (drug input). Για όλα τα φάρμακα που δοκιμάστηκαν, αύξηση της αρχικής ποσότητας του φαρμάκου είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της φόρτωσης των νανοσωματιδίων με φάρμακο. Αντίθετα η επίδραση της αρχικής φόρτωσης στην ενκαψακίωση βρέθηκε να εξαρτάται από την υδατοδιαλυτότητα του φαρμάκου. Έτσι η αύξηση της αρχικής φόρτωσης είχε σαν αποτέλεσμα την ελάττωση της ενκαψακίωσης στην περίπτωση της καφεΐνης, δεν είχε κανένα αποτέλεσμα στην ενκαψακίωση της θεοφυλλίνης ενώ οδήγησε σε μικρή αύξηση της ενκαψακίωσης της θεοβρωμίνης. Η φόρτωση και η ενκαψακίωση των φαρμάκων που δοκιμάστηκαν δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη σύνθεση του PLGAmPEG συμπολυμερούς από το οποίο παρασκευάστηκαν τα νανοσωματίδια. Ανεξάρτητα από την πολυμερική σύνθεση των νανοσωματιδίων, ο ρυθμός απελευθέρωσης των εγκλωβισμένων στα νανοσωματίδια μεθυλοξανθινών ήταν, τόσο στο PBS όσο και στο ανθρώπινο πλάσμα in vitro, ανάλογος της υδατοδιαλυτότητας του φαρμάκου. Έτσι ο ρυθμός αποδέσμευσης ήταν μεγαλύτερος στην περίπτωση της καφεΐνης απ’ ότι στην θεοφυλλίνη, και αυτής από την θεοβρωμίνη. Με όλες τις πολυμερικές συνθέσεις που δοκιμάστηκαν, ο εγκλωβισμός των μεθυλοξανθινών στα νανοσωματίδια είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης των φαρμάκων in vitro, τόσο σε PBS όσο και σε ανθρώπινο πλάσμα. Η ελάττωση του ρυθμού αποδέσμευσης αυξάνονταν με ελάττωση της υδατοδιαλυτότητας του φαρμάκου. Ο ρυθμός απελευθέρωσης και των τριών μεθυλοξανθινών ήταν μεγαλύτερος στο PBS σε σύγκριση με το ανθρώπινο πλάσμα. Η απόδειξη της ελεγχόμενης αποδέσμευσης των φαρμάκων από τα νανοσωματίδια στο ανθρώπινο πλάσμα είναι σημαντική καθώς καταδεικνύει την καταλληλότητα των PLGAmPEG σωματιδίων για εφαρμογές ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων. Πάντως η χρησιμότητα των PLGAmPEG νανοσωματιδίων σε ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκων φαίνεται να περιορίζεται στις περιπτώσεις των φαρμάκων με μικρή σχετικά υδατοδιαλυτότητα. / The rapid removal of conventional polymeric nanoparticles from the bloodstream limits their potentional in controlled drug delivery and targeting. Surface engineering, however, may lead to nanoparticles capable of evading their uptake from the mononuclear phagocyte system (MPS), which exhibit prolonged residence in blood. Thus, coating the nanoparticle surface with a hydrophilic polymer such as poly(ethylene glycol) (PEG) has been shown to confer long circulation properties to PLGA (poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles. Although the basic physicochemical and biological properties of these nanoparticles have been studied, there is currently a luck of studies dealing in a systematic way with their drug incorporation and release properties. In this work the effect of three different PLGAmPEG copolymer composition on drug loading and release properties, was studied using the members of the methyl-xanthine class of drugs, i.e. caffeine, theophylline, theobromine, as model drugs. This way, the effect of drug solubility on drug loading and release from the nanoparticles can be evaluated in a more scientifically sound way than applying more common practices, such as the study of a drug and its salt. PLGAmPEG copolymers were synthesized from dl-lactide (LE), glycolide (GE) and mPEG(5000) by a melt polymerization process. The synthesized copolymers were identified by the moral ratio of (LE +GE)/mPEG determined by 1H-NMR. PLGAmPEG nanoparticles loaded with caffeine, theophylline and theobromine were prepared by a double emulsion (w1/o/w2) method, where w1: aqueous solution of drug, o: a dichloromethane (dcm) solution of the polymer and w2: an aqueous solution of sodium cholate (12mM). The size and æ potential of the nanoparticles, were determined by photon correlation spectroscopy and microelectrophoresis respectively. The size of the nanoparticles ranged approximately from 130 to 200nm depending on the type of PLGAmPEG copolymer used and the formulation. All nanoparticle formulations exhibited low negative æ potential in the range -7 to -20. Drug loading was determined using direct method in which the samples were dissolved in NaOH and the drug in the solution was assayed by a High Performance Liquid Chromatography method (HPLC). The release experiments were performed in phosphate buffered saline and in human plasma in vitro. The nanoparticles were enclosed in a dialysis bag and incubated in PBS (pH=7.4, 37oC) and in human plasma under mild agitation. At predetermined time intervals, samples were withdrawn and assayed for the drug by HPLC. The drug loading and encapsulation values increased and decreased respectively when the drug/polymer ratio increased, by increasing drug input (initially present drug) while keeping polymer input constant. Due to the relatively high aqueous solubility of the three methylxanthines low nanoparticle loadings were generally obtained. Caffeine, despite its higher aqueous solubility, exhibited a little higher encapsulation and loading than theophylline and theobromine. This may be attributed to the much higher partition coefficient K (dcm/water) of caffeine compared to theophylline and theobromine, which would decrease to a higher extend in the case of caffeine the tendency of the drug to pass from the dcm droplets, formed during the second emulsification step of nanoparticle preparation, to the surrounding aqueous phase. As a result, higher drug retention in the nanoparticles was observed in the case of caffeine. Drug release from the nanoparticles was sustained and depended on the aqueous solubility of the drugs. For instance, the more water-soluble caffeine was released relatively faster than the less water-soluble theophylline and the even less water-soluble theobromine, from all PLGAmPEG compositions both in PBS and in human plasma. Drug release from the nanoparticles did not appear to depend on the composition of the PLGAmPEG copolymer used to prepare the nanopaparticles. Drug release rate in plasma was lower than that in PBS, probably due to the binding of the drug molecules to plasma proteins. Drug encapsulation of methylxanthines in the PLGAmPEG nanoparticles depended on the solubility properties of the drugs. The organic/aqueous phase partition coefficient of the drug may be crucial with regard to the incorporation efficiency of the drug in these nanoparticles. Drug release from the nanoparticles was sustained in both PBS and human plasma, but only for the relatively hydrophobic theobromine in a satisfactory extent. The rate of drug release was affected by the aqueous solubility of the drug and the release medium. It appears that PLGAmPEG nanoparticles can be applied for controlled drug delivery applications only in the case of relatively water-insoluble drugs.

Στη παρούσα εργασία, μελετήθηκαν διάφοροι τύποι αρσονολιποσωμάτων, ως προς την επίδραση της λιπιδικής τους σύστασης στην σταθερότητα τους, την αλληλεπίδραση τους με φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα και την βιοκατανομή τους. Παρασκευάστηκαν sonicated αρσονολιποσώματα με 1,2-rac-διάκυλοοξυπροπυλ-αρσονικό οξύ με παλμιτόυλ- παράπλευρες αλυσίδες (αρσονολιπίδιο, Ars), χοληστερόλη (Chol) και φωσφατιδυλοχολίνη (PC) [PC-based αρσονολιποσώματα] ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη (DSPC) [DSPC-based αρσονολιποσώματα], με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 12:8:10 mol:mol:mol. Επίσης παρασκευάστηκαν παρόμοια αρσονολιποσώματα με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 17:3:10 mol:mol:mol. Παρασκευάστηκαν επίσης αρσονολιποσώματα που, εκτός από αρσονολιπίδιο, χοληστερόλη, φωσφατιδυλοχολίνη ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη περιείχαν στην σύσταση τους και PEG2000-λιπίδιο (πολυαιθυλενογλυκόλη, Μ.Β. 2000, συζευγμένη με 1,2-διστεαρόυλ-φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, DSPE-PEG2000) [PEGylated PC- και DSPC-based αρσονολιποσώματα]. Εκτός από τα παραπάνω αρσονολιποσώματα, παρασκευάστηκαν και sonicated λιποσώματα με χοληστερόλη και PC ή DSPC σε αναλογίες PC:Chol και DSPC:Chol 2:1 mol:mol («συμβατικά» λιποσώματα, χωρίς αρσονολιπίδιο). Μελετήθηκε αρχικά η τοξικότητα όλων των παραπάνω λιποσωμάτων έναντι διάφορων τύπων καρκινικών κυττάρων: ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων (ΝΒ4), κυττάρων από καρκίνο του προστάτη (PC3), ανθρώπινων κυττάρων από καρκίνο του μαστού (MDA-MB-468) και Τ-λεμφοκυττάρων από ασθενείς με λευχαιμία (ΜΤ-4), καθώς και έναντι φυσιολογικών ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβες ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC). Η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων υπολογίσθηκε με μετρήσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από αλληλεπίδραση τους με τα λιποσώματα με την μέθοδο MTT. Από τις καμπύλες βιωσιμότητας υπολογίσθηκαν και οι IC50 τιμές, οι συγκεντρώσεις δηλαδή στις οποίες κάθε λιπόσωμα προκαλεί 50% μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα όλοι οι τύπο αρσονολιποσωμάτων είναι τοξικοί έναντι των καρκινικών κυττάρων (PC3, NB4 και MT-4), με εξαίρεση τα MDA-MB-468 κύτταρα, ενώ αντιθέτως δεν επηρεάζουν την βιωσιμότητα των φυσιολογικών HUVEC κυττάρων. Ωστόσο, για τον ίδιο τύπο κυττάρων, υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών τύπων αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες δεν είναι ανάλογες με τις διαφορές της σταθερότητας των αρσονολιποσωμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακεραιότητα της μεμβράνης των αρσονολιποσωμάτων δεν αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την εμφάνιση τοξικότητας. Είναι φανερό επομένως πως η σύσταση των αρσονολιποσωμάτων πρέπει να προσαρμόζεται κατάλληλα, ανάλογα με την in vivo κινητική τους και την επιθυμητή βιοκατανομή τους. Μελετήθηκε επίσης ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης των λιποσωμάτων με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, καθώς αυτές οι δυο κυτταρικές σειρές ήταν οι σειρές που επέδειξαν την περισσότερη και την λιγότερη ευαισθησία αντίστοιχα έναντι των αρσονολιποσωμάτων στις μελέτες βιωσιμότητας, με χρήση μιας φθορισμομετρικής μεθόδου. Η μέθοδος επιτρέπει την παρακολούθηση της ενδοκυττάρωσης, της δέσμευσης και διαφυγής των λιποσωμάτων από τα κύτταρα. Το HPTS, μια υδατοδιαλυτή, έντονα φθορίζουσα ουσία, της οποίας ο φθορισμός εξαρτάται από το pH, εγκλωβίστηκε στο εσωτερικό των λιποσωμάτων. Η τιμή του φθορισμού του HPTS στα 413 nm εξαρτάται από το pH, ενώ είναι ανεξάρτητη από το pH στα 454 nm, με μήκος κύματος διέγερσης 512 nm. Η ύπαρξη ισοασβεστικού σημείου στα 413 nm επιτρέπει την «μετάφραση» του φθορισμού σε ποσότητα της ουσίας. Τα NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα επωάστηκαν με λιποσώματα που είχαν εγκλωβίσει φθορίζουσα στο εσωτερικό τους (HPTS-λιποσώματα) στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα και υπολογίστηκε ο λόγος των τιμών φθορισμού στα 413 nm και τα 454 nm (Ι454/Ι413), που λειτουργεί ως ένδειξη της ενδοκυττάριας εντόπισης των λιποσωμάτων. Με σκοπό να διευκρινιστεί ο εντοπισμός των λιποσωμάτων στα κύτταρα μετά την επώαση τους, τα κύτταρα επωάστηκαν με NH4Cl, που αλκαλοποιεί το όξινο περιβάλλον των υποκυτταρικών διαμερισμάτων, με αποτέλεσμα αύξηση της τιμής φθορισμού στα 454 nm, εφόσον η φθορίζουσα βρίσκεται στα ενδοσώματα (π.χ. λυσοσώματα). Το φαινόμενο αυτό μπορεί να αναστραφεί με απομάκρυνση του NH4Cl. Υπολογίσθηκαν οι λόγοι Ι454/Ι413 πριν και μετά την επώαση τους με NH4Cl, καθώς και μετά από την απομάκρυνση του. Προσδιορίστηκε επίσης το % ποσοστό πρόσληψης αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα. Η τιμή του φθορισμού στα 413 nm αποτελεί μέτρο της συγκέντρωσης αρσονολιποσωμάτων στα κύτταρα, ανεξάρτητα από το σημείο εντόπισης τους (ανεξάρτητα από το pH). Με σύγκριση των τιμών φθορισμού με πρότυπες καμπύλες αναφοράς προσδιορίστηκε η συγκέντρωση φθορίζουσας σε NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, μετά από επώαση τους με HPTS-λιποσώματα στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα. Οι ίδιες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και μετά από επώαση NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με τα ίδια HPTS-αρσονολιποσώματα στους 4 oC, με σκοπό να διευκρινιστεί αν ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης τους εξαρτάται από την θερμοκρασία, αν είναι δηλαδή ενεργειακά εξαρτώμενη διαδικασία. Για τις μορφολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν, προστέθηκε στα λιποσώματα επισημασμένο με φθορίζουσα λιπίδιο στην μεμβράνη τους (ροδαμίνη συζευγμένη με φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, Rho-PE) και η κατανομή των λιποσωμάτων παρατηρήθηκε μικροσκοπικά μετά από επώαση τους στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα. Η επίδραση αναστολέων της ενδοκυττάρωσης μελετήθηκε με επώαση των NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με χλωροπρομαζίνη (CPZ, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης) και με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (ΜeβCD, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω caveolae) πριν την επώαση τους με HPTS-λιποσώματα. Προσδιορίστηκαν στην συνέχεια οι λόγοι Ι454/Ι413 και τα % ποσοστά πρόσληψης των αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα, με σκοπό να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της ενδοκυττάρωσης. Όλα τα αρσονολιποσώματα επέδειξαν σχεδόν την ίδια συμπεριφορά σε σχέση με τον τρόπο που αλληλεπιδρούν με τα MDA-MB-468 κύτταρα. Ο κύριος μηχανισμός ενδοκυττάρωσης τους φαίνεται να περιλαμβάνει συμμετοχή υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των μελετών βιωσιμότητας προκύπτει ότι η έλλειψη τοξικότητας αυτών των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση τους στο εσωτερικό των λυσοσωμάτων ως φυσικό επακόλουθο της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης, γεγονός που συμφωνεί και με τον προσδιορισμό αρσενικού που έγινε στα MDA-MB-468 κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης και ανιχνεύτηκαν ποσοστά αρσενικού μόνο στην περίπτωση των πιο σταθερών DSPC-based λιποσωμάτων (PEGylated και μη). Στην περίπτωση των NB4 κυττάρων, προκύπτει πως η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να συνδέεται επίσης με το ποσοστό συμμετοχής υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Λιποσώματα όπως τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα (που είναι τα πιο τοξικά), δεν αλληλεπιδρούν καθόλου με τα NB4 κύτταρα μέσω υποδοχέων, ενώ αντίθετα τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα, που αποδείχθηκαν τα λιγότερο τοξικά έναντι των NB4 κυττάρων, φαίνεται να εισέρχονται στα κύτταρα αποκλειστικά μέσω κλαθρίνης ή/και caveolae. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης, δεν ανιχνεύτηκαν παρ’ όλα αυτά ποσοστά αρσενικού στα κύτταρα, γεγονός που θέτει πολλά ερωτηματικά για την ενδοκυττάρια τύχη των αρσονολιποσωμάτων και συγκεκριμένα των αρσονολιπιδίων, δεδομένου ότι γίνεται ενδοκυττάρωση ολόκληρων των λιποσωμάτων αφού «control» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα δεν αποδείχθηκαν τοξικά για τα κύτταρα. Τέλος, με σκοπό να μελετηθεί η βιοκατανομή των αρσονολιποσωμάτων, πραγματοποιήθηκαν in vivo πειράματα. Σε ένα πρώτο σετ πειραμάτων, ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα 1, 2, 5, 12 και 24 ώρες μετά την χορήγηση μετρήθηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS). Ένα υψηλό ποσοστό της δόσης που χορηγήθηκε αποβλήθηκε ταχέως, καθώς στην πρώτη ώρα μετά την χορήγηση σχεδόν 30-40% της δόσης ανιχνεύθηκε στις ιστούς των ζώων. Από το χρονικό σημείο αυτό και μετά, η απομάκρυνση του αρσενικού ήταν βραδεία με χρόνους ημιζωής 27.6 h για τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα και 83 h για τα DSPC-based. Και για τους δύο τύπους αρσονολιποσωμάτων, η κατανομή αρσενικού ήταν υψηλότερη στα έντερα, μετά στο ήπαρ και μειωνόταν κατά την ακόλουθη σειρά: δέρμα + τρίχωμα, στομάχι, σπλήνα, νεφρά, πνεύμονες και καρδιά. Από τα αποτελέσματα αυτά, αν συγκριθούν με τα αποτελέσματα από παρόμοιες μελέτες που έχουν γίνει με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα, φαίνεται πως τα DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα χαρακτηρίζονται από καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα. Από το γεγονός αυτό γίνεται φανερό πως η λιπιδική σύσταση (και κατ’ επέκταση η σταθερότητα) των λιποσωμάτων επηρεάζει το φαρμακοκινητικό τους προφίλ και συνεπώς, η σωστή επιλογή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων είναι πολύ σημαντική ανάλογα με την εφαρμογή για την οποία προορίζονται τα λιποσώματα. Παρόμοιες in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν τόσο με DSPC-based και PEGylated DSPC-based, όσο και με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα. Τα λιποσώματα χορηγήθηκαν ενδοφλέβια (i.v.) σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα προσδιορίστηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS) 1, 3 και 24 ώρες μετά την χορήγηση. Στην περίπτωση των DSPC-based, τα επίπεδα αρσενικού στους ιστούς των ζώων ήταν γενικά υψηλότερα συγκριτικά με τα επίπεδα μετά από χορήγηση PC-based αρσονολιποσωμάτων. Η επικάλυψη των λιποσωμάτων με PEG επηρέασε περισσότερο την συμπεριφορά των DSPC-based. Τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα επέδειξαν παρόμοια συμπεριφορά με τα PEGylated «συμβατικά» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα. Μετά από σύγκριση με τα αποτελέσματα των πειραμάτων με i.p. χορήγηση, προκύπτει πως ο ρόλος της οδού χορήγησης είναι σημαντικός στην κινητική των αρσονολιποσωμάτων, όπως και στην περίπτωση των «συμβατικών» λιποσωμάτων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι, μετά από την i.v. χορήγηση, βρέθηκαν ανιχνεύσιμες ποσότητες αρσενικού στον εγκέφαλο, που αποτελεί ένδειξη πως τα αρσονολιποσώματα μπορούν να περάσουν τον αιματεγκεφαλικό φραγμό σε κάποιο ποσοστό, όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα. / In this study we investigated the behavior of arsonolipid containing liposomes, in respect with their lipid composition and its effect on their stability, their interactions with normal and cancer cells and their biodistribution. Sonicated arsonoliposomes were prepared using arsonolipid with palmitic acid acyl chain (Ars), mixed with cholesterol (Chol) and phosphatidylcholine (PC-based arsonoliposomes) or 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC-based arsonoliposomes), with PC/Ars/Chol and DSPC/Ars/Chol 12:8:10 molar ratio. Arsonoliposomes with PC/Ars/Chol and DSPC/Ars/Chol 17:3:10 molar ratio was also studied. PEG2000-lipid (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine conjugated to polyethylenoglycol 2000) containing vesicles (PEGylated arsonoliposomes, PC-based and DSPC-based) were also prepared. Sonicated liposomes were also prepared using phosphatidylcholine or 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, both mixed with cholesterol, PC/Chol and DSPC/Chol 2:1 molar ratio. The cytotoxicity of these arsonoliposomes towards different cancer cells (human promyelocytic leukemia (NB4), prostatic cancer (PC3), human breast adenocarcinoma (MDA-MB-468), human T-lymphocyte (MT-4) and also towards HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) was evaluated by calculating the arsonoliposome-induced growth inhibition of the cells by the MTT assay. IC50 values were interpolated from cell number/arsonolipid concentration curves. The results reveal that all types of arsonoliposomes evaluated significantly inhibit the growth of most of the cancer cells studied (PC3, NB4 and MT-4) with the exception of the MDA-MB-468 breast cancer cells, which were minimally affected by arsonoliposomes in some cases even less than HUVEC. Nevertheless, for the same cell type the differences between the different types of arsonoliposomes were significant but never proportional to their stability, indicating that high rigidity of the arsonoliposome membrane is not a problem for their anticancer activity. Thereby it is concluded that arsonoliposome composition should be adjusted accordingly depending on their in vivo kinetics and the desired biodistribution. The interaction of liposomes with NB4 and MDA-MB-468 cells (cells with minimum and maximum viability after interaction with the arsonoliposomes accordingly) was monitored by a fluorescence method, which allows for the simultaneous monitoring of endocytosis, binding and leakage. Pyranine (1-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonic acid, HPTS), a highly fluorescent, water-soluble, pH sensitive dye, was encapsulated at high concentration into the lumen of liposomes. HPTS exhibits two major fluorescence excitation maxima (403 and 450 nm), which have a complementary pH dependence. The intensity of fluorescence of HPTS at 413 nm (the isosbestic point of HPTS) is pH-independent, while the intensity of fluorescence at 454 nm is pH-dependent. NB4 and MDA-MB-468 cells were incubated at 37 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods and the intracellular fate of liposomes was monitored by measuring the fluorescence, at excitation wavelengths of 413 nm and 454 nm and an emission wavelength of 512 nm. The ratio of the fluorescence intensities (Ι454/Ι413) was calculated and evaluated, since it serves as an indicator of liposomes intracellular fate. In order to gain quantitative proof concerning the localization of cell-associated liposomal fluorescence in endosomes or lysosomes of NB4 and MDA-MB-468 cells, after incubation with HPTS-encapsulating liposomes, the cells were incubated with NH4Cl. This results in an increase of pH in the acidic cellular compartments, which would induce an increase in HPTS fluorescence at 454 nm, if the dye is localized in cell endosomes (i.e. lysosomes). This effect can be reversed by removal of NH4Cl. The ratio Ι454/Ι413 was calculated, before and after NH4Cl incubation, as well as after its removal. The % uptake of liposomal contents by cells and their subsequent exposure to acidified endosomes or secondary lysosomes was also monitored. The intensity at 413 nm serves as a measure of total number of liposomes associated with cells, regardless of their location along the endocytotic pathway. The concentration of dye associated with cells was determined by measuring fluorescence at 413 nm (pH independent point) and comparing the results to a standard curve, after incubation of NB4 and MDA-MB-468 cells at 37 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods. Fluorescence microscopy studies were performed to visualize the uptake of HPTS-encapsulating arsonoliposomes in NB4 and MDA-MB-468 cells. The intra- and extracellular distribution of Rho-PE-arsonoliposomes (arsonoliposomes with 0,2% rhodamine conjugated with phosphatidyl-ethanolamine in their lipid composition), was observed after incubation with cells at 37 oC for different time periods, by fluorescence microscopy, using appropriate excitation and barrier filters. Furthermore, in another set of experiments, pretreatment of cells with endocytosis inhibitors was performed. Chloropromazine (clathrin mediated endocytosis inhibitor, CPZ) and methyl-β-cyclodextrin (caveolae mediated endocytosis inhibitor, ΜeβCD) were preincubated with cells, HPTS- encapsulating liposomes were added and the Ι454/Ι413 ratio and the % uptake of liposomal contents by cells were measured for different time periods., in order to clarify in which cases the endocytosis is clathrin- or caveolae-dependent. The interaction of liposomes with cells was monitored at 4 oC as well, in order to study the time-course of the binding of liposomes to cells and clarify whether the mechanism of the association of liposomes with cells is energy dependent. NB4 and MDA-MB-468 cells were incubated at 4 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods in two different concentrations and the estimation of the intracellular fate and amount of bound liposomes on the cells was once again based on of Ι454/Ι413 ratio and uptake measurements. The mechanism of the association of the liposomes seems to be similar for all arsonoliposomes in the case of MDA-MB-468 cells. The results reveal that arsonoliposomes are uptaken by a receptor-mediated mechanism, probably clathrin- or/and caveolae-mediated. In comparison with the results of the viability studies, the fact that arsonoliposome did not induce growth inhibition of the MDA-MB-468 cells may correlate to their lysosomal degradation resulting from the clathrin-mediated endocytosis. Moreover, the fact that no arsenic was detected by Graphite Furnace Atomic Absorbance Spectrometry in the cells after incubation under the same conditions, except for the more rigid DSPC arsonoliposomes (PEGylated or not), comes in agreement with this previous hypothesis. In the case of NB4 cells, the mechanism of the association and the extent of receptor-mediated endocytosis role may affect the induced growth inhibition. More cytotoxic PEGylated PC-based arsonoliposomes are not endocytosed through receptors at all, while PEGylated DSPC-based seem to be endocytosed through clathrin- or/and caveolae-mediated mechanism. The fact though that no arsenic was detected, after both cancer cell lines were incubated with all arsonoliposomes studied under identical conditions, needs further investigation, given that whole liposomes internalization is taking place and that control liposomes (with no arsenic in their lipid composition) have been found not to be toxic against cancer cells. In order to study the biodistribution of arsonoliposomes, DSPC-based and PEGylated DSPC-based arsonoliposomes, were administered by intraperitoneal (i.p.) injection in balb-c mice and the distribution of arsenic in the organs after 1, 2, 5, 12 and 24h post-injection was measured by atomic absorption spectroscopy. Results demonstrate that a high portion of the dose administered is rapidly excreted, since 1h post-injection only about 30–40% of the dose was detected cumulatively in animal tissues. After this, the whole body elimination of arsenic was a slow process with a half-life of 27.6 h for PEGylated DSPC-based arsonoliposomes, and 83 h for the DSPC-based ones. For both arsonoliposomes, arsenic distribution was greater in intestines, followed by liver, carcass + skin stomach, spleen, kidney, lung and heart. Different arsenic kinetics in blood between the two liposome types was observed. Compared to the results obtained previously with PC-based arsonoliposomes, both the DSPC-based and PEGylated-arsonoliposomes have better bioavailability. This proves that arsonoliposome lipid composition (and consequently their integrity) influences their pharmacokinetic profile. Thus, the proper arsonoliposome composition should be used according to the intended application. The same set of in vivo studies were also performed with DSPC-based and PC-based arsonoliposomes intravenous (i.v.) injection. In all cases PEG-lipid (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine conjugated to polyethylenoglycol 2000) was also added in the lipid membrane of the arsonoliposomes (PEGylated-arsonoliposomes) at 8 mol %. The liposomes were injected intravenously in balb-c mice. For all arsonoliposome types, the biodistribution of arsenic in mice organs was measured by atomic absorption spectroscopy, at 1, 3 and 24 h post-injection. DSPC-based arsonoliposomes give higher arsenic levels in most tissues (compared to PC-based ones) and are also affected to a higher extent by surface PEGylation. PEGylated DSPC arsonoliposomes behave similarly to PEGylated conventional liposomes that bear anionic charge. By comparison with the previous biodistribution values obtained after intraperitoneal administration of most of the vesicle types studied herein, it is concluded that the administration route has a significant effect on arsonoliposome kinetics, in some ways similar to that observed for conventional liposomes. Interestingly, after i.v. injection of all the arsonoliposome types tested, arsenic was found in detectable amounts in the animal brains, indicating that perhaps arsonoliposomes (intact or not) can pass the brain barrier to a certain extent, when high vesicle concentrations are present in the bloodstream.

La tri-thérapie utilisée pour le traitement du VIH-1 est efficace mais limitée par l'apparition de résistances. Par conséquent, des cibles virales alternatives sont nécessaires. Une des cibles les plus prometteuses est la protéine nucléocapside (NC), qui est hautement conservée et qui joue un rôle essentiel dans le cycle viral. Dans ce contexte, le projet européen THINPAD a eu pour but de développer des inhibiteurs de la NC en combinant plusieurs approches : criblage virtuel, criblage secondaire in vitro, tests antiviraux et de toxicité. Pour le criblage in vitro, nous avons utilisé le test de déstabilisation de cTAR, hautement spécifique de l’activité chaperonne de NC. Cinq séries de molécules ont été sélectionnées par les premiers criblages et tests antiviraux. Après des études de relation structure-activité, une seule des cinq séries a été poursuivie jusqu’aux tests d'efficacité chez les souris. Les composés de cette série présentent une activité antivirale à des concentrations nanomolaires, mais ne sont pas actifs dans le modèle murin. Les études de mécanisme d'action ont révélés que leur activité antivirale était bien consécutive au ciblage de la NC. / Highly Active Anti-Retroviral Therapy (HAART) is successfully used for HIV-1 treatment, but is hampered by the appearance of drug resistance. Thereby, alternative drug targets are required. One of the most promising target is the nucleocapsid protein (NC), which is highly conserved and plays essential role in HIV life cycle. In this context, the European project THINPAD was organized with the aim to develop NC inhibitors. To fulfil this objective, several approaches were used, including virtual screening, in vitro secondary screening, in cellulo antivirals tests, and toxicity evaluation. For in vitro screening, the specific NC-promoted cTAR destabilization assay was used. Five series of molecules were selected by the first screenings and antiviral tests. After structure-activity relationship studies, only one series was continued until efficacy testing in mice. The compounds of this series exhibit antiviral activity at nanomolar concentrations but are not active in the murine model. The mechanisms of action studies revealed that their antiviral activity was indeed consecutive to the targeting of the NC.

La curcumine est un polyphénol de couleur jaune extrait du rhizome de la plante (Curcuma longa). Identifié comme un principe actif du curcuma, cette épice est largement consommée compte tenu de ses propriétés antioxydantes, antimicrobiennes et antitumorales. Cependant, sa solubilité et sa biodisponibilité restent limitées en raison de son hydrophobicité et diminuent de ce fait les applications potentielles dans les domaines nutraceutique et pharmaceutique. L’objectif de ce travail s’est focalisé sur l’étude des propriétés physico-chimiques de cette molécule vectorisée sous forme liposomale. Différentes formulations de nanovecteurs préparées à partir de lipides polaires plus ou moins riches en acides gras polyinsaturés à longue chaîne variables, issus de source marine ou végétale, ont été utilisées pour modifier la fluidité membranaire des vecteurs. Ces travaux ont permis d’optimiser le pourcentage d’encapsulation de cette biomolécule et d’étudier les effets de cytotoxicité et de sa biodisponibilité sur différentes lignées cellulaires (MCF7, cellules embryonnaires de neurones corticaux). Les résultats montrent des effets significatifs lors de l’utilisation de nanoliposomes formulés avec de la lécithine marine, protégés par un enrobage de polymère de chitosane. Les analyses physicochimiques de taille par diffraction de la lumière (zetasizer, nanosight), de stabilité (mesure de la taille et la mobilité électrophorétique), de structure par microscopie électronique en transmission et la libération de la molécule vectorisée, ont permis de mieux comprendre les effets des interactions polymère-phospholipides et le relargage de la curcumine encapsulée dans les conditions environnementales drastiques de digestion gastrique et intestinale. Une caractérisation multi-échelle est proposée afin d’améliorer la compréhension des différentes propriétés du nanovecteur et du principe actif qu’il vectorise, ainsi que les interactions possibles entre eux. Les techniques utilisées sont la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR), les rayons X, ainsi que la microscopie électronique en transmission / Curcumin, a yellow lipid-soluble natural pigment, a hydrophobic polyphenol derived from the rhizome of Curcuma longa, has been identified as the active principle of turmeric. Curcumin has already become a research focus due to its numerous biological and pharmacological benefits such as antioxidant, antitumor, anti-inflammatory, antimicrobial properties and other desirable medical benefits. However, due to its low absorption, the poor bioavailability of curcumin limits its clinical use. The objective of this work has focused on the study of the physicochemical properties of this molecule encapsulated in form of liposome. Different formulations of nanocarriers prepared from polar lipids more or less rich in polyunsaturated fatty acids with variable long chain, derived from vegetable or marine source, have been used to modify liposomes membrane fluidity. These works have allowed to optimize the encapsulation efficiency of the curcumin and to study its bioavailability and cytotoxicity effects on different cell lines (MCF7, embryonic cortical neurons). The results show significant effects when using nanoliposomes formulated with marine lecithin, protected by chitosan as the coating polymer. The physico-chemical analyses of the size by light scattering (Zetasizer, NanoSight), the stability (measurement of the size and the electrophoretic mobility), the structure by transmission electron microscopy and the release of the encapsulated molecule, allowed to better understand the effects of polymer-phospholipid interactions and the release of encapsulated curcumin in drastic environmental conditions of gastric and intestinal digestion. A multiscale characterization is proposed in order to improve the understanding of the various properties of the active agent (curcumin) and the nanovector, as well as the possible interactions occuring between them. The techniques used are Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-rays, Rheometer and Transmission Electron Microscopy

Le cancer colorectal est la deuxième cause de mortalité due au cancer en Europe et aux États-Unis. Etant donné l’efficacité limitée et la toxicité élevée des agents de chimiothérapie, de nouvelles approches sont nécessaires. Le flavanolignane silybine représente le principal constituant actif du chardon-marie (Silybum marianum). Les mécanismes moléculaires des propriétés anticancéreuses de la silybine ont été étudiés dans un modèle cellulaire de progression du cancer colorectal humain : les cellules SW480 issues d’un adénocarcinome, et leurs dérivées métastatiques les cellules SW620. Les effets chimiopréventifs de la silybine ont été étudiés dans un modèle de cancérogenèse colique induite par l’azoxyméthane chez le rat. La silybine induit une mort apoptotique avec activation de la caspase-3 dans les deux lignées. L’expression des récepteurs de mort TRAIL est augmentée, et la caspase-8 activée. Le potentiel mitochondrial est perturbé provoquant une libération du cytochrome c et une activation de la caspase-9. En plus de l’activation des voies apoptotiques extrinsèque et intrinsèque la silybine induit une réponse autophagique. La combinaison de la silybine et de TRAIL, un agent anti-cancéreux prometteur, provoque une mort cellulaire synergique dans les deux lignées. Un effet synergique est aussi observé avec la combinaison de la silybine et des inhibiteurs des histones déacétylases (HDAC) : TSA et SAHA. Dans le modèle chez le rat, la silybine réduit de 50% le nombre des lésions prénéoplasiques. En conclusion, la silybine est un agent naturel intéressant pour la prévention du cancer colorectal et dans le cadre d’une combinaison avec TRAIL/des inhibiteurs d’HDACs. / Colorectal cancer (CRC) is the second most common cause for cancer-related deaths in Europe and in the USA. Because of the limited efficacy and considerable toxicity of chemotherapeutic agents, new approaches are needed. The hepatoprotective flavonolignan silibinin is the major biologically active compound of the milk thistle (Silybum marianum).The molecular mechanisms of the anticancer properties of silibinin in CRC were studied in an in vitro model of cancer progression consisting of the adenocarcinoma cell line SW480 and its derived metastatic cell line SW620. Its chemopreventive effects were assessed in an in vivo model of azoxymethane-induced colon carcinogenesis in the rat. Silibinin induced apoptotic cell death with activation of caspase-3 in both cell lines. The expression of death receptors was upregulated, and caspase-8 was activated. The potential of the mitochondrial membrane was perturbed permitting the release of cytochrome c and the activation of caspase-9. Besides the activation of the extrinsic and the intrinsic apoptotic pathway, silibinin induced an autophagic response. Combination of silibinin and TRAIL, a promising anticancer agent selectively inducing apoptosis in cancer cells, induced synergistic cell death in both cell lines. Synergy in cell death induction was also observed by the combination of silibinin and the histone deacetylase (HDAC) inhibitors TSA and SAHA. In the preclinical model in the rat, silibinin administration was able to reduce by half the number of preneoplastic lesions present in the colon. In conclusion, silibinin is a promising natural agent for colon cancer chemoprevention and for combination therapy with TRAIL/HDAC inhibitors.