O objetivo principal deste trabalho foi a investigação da viabilidade de uma nova rota sintética para a obtenção do fármaco Baclofen em sua forma enantiopura. A etapa principal da rota sintética por nós proposta consiste na síntese de uma aziridina de estereoquímica cis, utilizando uma nova metodologia, desenvolvida em nosso laboratório pelo emprego da catálise de transferência de fase (CTF). Para a obtenção da aziridina apropriada, tornou-se necessário preparar de maneira estereosseletiva, a (2S, 3R)-(4-clorofenil)-serina. Este precursor seria adequado, uma vez que, em estudos preliminares, verificamos que o fechamento do aziridínico ocorre sem racemização dos estereocentros presentes na molécula. Inicialmente, tentamos obter o β-hidróxi-α-aminoácido desejado pela reação de adição aldólica de uma imina do éster terc-butílico da glicina com o 4-clorobenzaldeído, em condições de catálise de transferência de fase assimétrica. Tais reações não apresentaram estereosseletividade. Porém, apesar de gerarem dois produtos diastereoméricos racêmicos, estes são de interesse, uma vez que um deles é uma oxazolidina cis inédita. Para a obtenção da (2S, 3R)-(4-clorofenil)-serina, optamos pelo emprego de uma metodologia alternativa, que consistiu em efetuar a reação aldólica do p-clorobenzaldeído com a glicina, sob a forma de um complexo de quiral de níquel (II). Uma vez obtido o ß-hidróxi-α-aminoácido, efetuamos a reação de aziridinização, seguida da abertura do anel heterocíclico com malonato de dietila, o que resultou na obtenção da (2S,3R) 4-carboetóxi-3-(4-clorofenil)-1-tosil-piroglutamato de metila, que consiste em uma mistura de diastereoisômeros, mas de estereoquímica definida nos carbonos 2 e 3. A hidrólise dos grupos ésteres deste composto, seguida de mono-descarboxilação do diácido resultante, conduziu ao ácido 3-(4-clorofenil)-1-tosil-piroglutâmico opticamente ativo, em 17% a partir da aziridina. As etapas finais de transformação de transformação deste intermediário no fármaco Baclofen não foram efetuadas. No entanto, consistem em reações bem descritas na literatura e freqüentemente utilizadas em outras rotas visando a síntese do mesmo fármaco. / In this work, the feasibility of a new synthetic route to Baclofen was investigated. The starting material, a cis-aziridine, was prepared by ring closure of (2S,3R)-(4-clorophenyl)- serine, under phase transfer conditions (PTC). As for the preparation of the required ß- hydroxy-α-aminoacid, two alternative synthetic strategies were investigated. (i) the PTC aldol addition of 4-chlorobenzaldehyde to the benzophenone imine of the tert-butyl ester of glycine, using chiral catalysts, or (ii) the aldol addition of the same aldehyde to a chiral nickel (II) complex of glycine. The first mentioned reaction failed to yield enantiomerically pure aldol adducts, although a cis oxazolidina, not yet described in the literature, could be isolated and fully characterized. Using a newly prepared nickel complex, bearing (R)-proline as ligand, (2S,3R)-(4-chlorophenyl)-serine could be prepared and subsequentely transformed into the corresponding aziridina. Ring opening of heterocycle, using diethylmalonate as nucleophile, afforded N-tosyl-4-carbethoxy-3-(4-chlorophenyl)-methyl pyroglutamate as a mixture of diastereomers but with defined stereochemistry at C-2 and C-3. Hydrolysis and mono- decarboxalation led to the corresponding N-tosyl-3-(4-chlorophenyl)-pyroglutamic acid, exhibiting optical activity. This valuable intermediate could be prepared in 17% from the starting aziridina and can be further transformed into the γ-aminoacid Baclofen using fully investigated and well described procedures.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aldo Tovo Neto.pdf: 648463 bytes, checksum: b133940cbe853e6bbd59b51fbcfa544e (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of the study was to evaluate ractopamine increasing levels (0, 4, 8, 12 and 16 mg kg-1) as an additive in diet of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) in final growout period (750-920 g), during 38 days of feeding. The fishes (400) were distributed in 20 experimental units in a completely randomized design with five treatments and four replications. Were evaluated: the morphometric relations, growth performance, beef cuts yield and chemical composition of fish flesh and organs. The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) with multiple comparisons of means (Tukey). Ractopamine is a feed additive with potential for use in diets for Nile tilapia, 8 mg kg-1 did not cause any decrease in performance parameters and demonstrated positive effect in reducing fat content of abdominal muscles to growout period (750-920 g). / O objetivo do estudo foi avaliar a inclusão da ractopamina como aditivo na dieta da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), no período final de engorda (750 a 920 g), em níveis crescentes de inclusão (0, 4, 8, 12 e 16 mg kg-1) durante 38 dias de alimentação. Foram distribuídos 400 peixes em 20 unidades experimentais, em um delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos e quatro repetições. Foram avaliados: as relações morfométricas, desempenho zootécnico, rendimento de cortes e composição química da carne e órgãos dos peixes. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) com teste de comparação múltipla de médias (Tukey). A ractopamina é um aditivo com potencial para a utilização em rações para a tilápia do Nilo, e o nível 8 mg kg-1 não causou nenhum decréscimo nos parâmetros de desempenho e demonstrou efeito positivo na redução do teor de gordura da musculatura abdominal no período final de engorda (750 a 920 g).

A identidade na segmentação do corpo de diversos organismos, durante o desenvolvimento, é devida, em grande parte, à ação das proteínas homeóticas. Em especial, dois grupos de proteínas, Trithorax (trxG) e Polycomb (PcG) têm um papel fundamental na manutenção, respectivamente, da ativação e da repressão da transcrição gênica, associando-se à cromatina. A importância das PcG nos estimulou a buscar a caracterização das proteínas humanas ortólogas ao \"Enhancer of Polycomb\" (Epc) de Drosophila, até então não descritas no genoma humano. Para tanto, buscamos: - obter a sequência completa e mapear o cDNA do novo gene humano homólogo ao \"Enhancer of Polycomb\" de Drosophila; - analisar sua expressão em tecidos fetais, adultos e tumorais e fazer estudos buscando sua caracterização funcional. Encontramos, mapeamos e obtivemos a seqüência completa de dois genes humanos, ortólogos de Epc1 (10p11-22) e de Epc2 (2q21-23) de camundongo, publicando estes dados em 2001 (Camargo et al., 2001). Ambos os genes são bastante conservados entre várias espécies, sendo que o cDNA de hEPC2 humano, por exemplo, é 94% idêntico ao Epc2 de camundongo e possui 96% de identidade ao nível de proteína, sugerindo que a função do gene deve ter sido mantida durante a evolução. No entanto, as seqüências protéicas de hEPC1 e hEPC2 humanos possuem apenas 68% de identidade entre si. Portanto, é provável que após a duplicação dos parálogos, estes tenham divergido funcionalmente. A expressão de ambos os genes foi avaliada utilizando \"dot-blots\" contendo 76 mRNAs de amostras de tecidos fetais, adultos e tumorais, mostrando-se fraca e ubíqua. Análises in silico sugeriram a existência de 4 isoformas de splicing para hEPC2, as quais foram validadas por RT-PCR ou \"Northern blots\". Uma das isoformas (de 2.7 Kpb) se mostrou mais abundante em todas as linhagens tumorais estudadas através de análises de \"Northern blot\", principalmente nas linhagens de linfoma de Burkitt\'s Raji e na linhagem de leucemia pró-mielocítica HL-60. Esta isoforma é gerada através de um sítio alternativo de poli-adenilação, que reduz sua porção 3\'UTR, retirando 4 dos 5 \"elementos ricos em adenilatos e uridilatos\" (AREs), envolvidos com a degradação de mRNAs lábeis que codificam proteínas regulatórias. Estes resultados se encontram em um manuscrito recentemente submetido à publicação (anexo à tese). Interação entre hEPC2 e SMADs e sua modulação por TGF-β. Durante a montagem da seqüência completa de hEPC2, verificamos que duas ESTs patenteadas mostravam alta identidade com o gene. Estas seqüências foram descritas como sendo parte de uma nova proteína de interação com as proteínas da família SMAD, envolvidas com transdução de sinais desencadeados por TGF-β. Esta citocina por sua vez, regula a proliferação, diferenciação e morte celular. Partimos para a avaliação da possível interação entre hEPC2 e as SMADs, em colaboração com o grupo do Dr. Aristidis Moustakas, do Ludwig Institute for Cancer Research de Uppsala, Suécia. Os resultados de co-imunoprecipitação sugeriram que as SMADs 2, 3, 4, 7 e 8 interagem com hEPC2, sendo que a interação entre as SMAD2, SMAD3, SMAD4 e hEPC2 nas células tratadas com TGF-β1, mostraram uma redução na co-imunoprecipitação. Este resultado sugere que TGF-β1 modula negativamente a interação entre essas proteínas. Da mesma maneira, foi observada uma redução na interação de hEPC2 com SMAD8 após o tratamento com BMP-7. Esse resultado é ainda mais destacado para as SMADs 2 e 3. Estes dados foram observados para ambas as construções de hEPC2, o que sugere fortemente a veracidade da interação entre estas proteínas. A localização celular de hEPC2, e também sua co-localização com SMAD2 foram investigadas através de imunofluorescência indireta e confirmaram a predição do programa PSORTII, de que hEPC2 se localiza no núcleo. No entanto, não foi possível observar a co-localização entre hEPC2 e SMAD2. É possível que hEPC2 não se ligue diretamente ao DNA, necessitando se associar como parceiro de um fator de transcrição. Esta foi uma das hipóteses para a atuação de hEPC2, como um co-fator que se associe com uma das SMADs e se ligue a um elemento específico de ligação a SMAD (SBE). Para investigar essa hipótese um ensaio de gene repórter foi feito utilizando uma construção de um repórter contendo 12 repetições da seqüência CAGA (seqüência específica de ligação das SMADs 2,3 e 4) fusionado com o gene da luciferase. No entanto, este ensaio não demonstrou que a transcrição de SMAD2 é dependente de hEPC2 e o experimento deverá ser repetido. Para confirmar a interação entre hEPC2 e as SMADs, será feito um experimento de \"pull-down\". Para tal o cDNA de hEPC2 foi clonado no vetor pET-32A de expressão indutível em bactérias. A proteína recombinante já foi produzida, tendo sido induzida e posteriormente purificada em condições desnaturantes. Apesar de dezenas de genes PcG terem sido caracterizados em Drosophila, poucos destes genes foram estudados em mamíferos. Portanto, a descrição do gene hEPC2 e seus transcritos alternativos, contribui para o conhecimento de PcG humanos, indicando a associação de maior expressão de uma de suas isoformas em linhagens celulares tumorais. Em relação à interação de hEPC2 com as SMADs, é interessante observar que nenhuma outra proteína foi descrita por possuir a particularidade de interagir com as SMADs de diferentes categorias. Talvez este seja um dado importante, que indique o papel singular de hEPC2 na sinalização de TGF-β1. / The identity of body segmentation in several organisms during development is, to a large extent, due to the action of the homeotic proteins. In particular, two groups of proteins, the Trithorax (trxG) and Polycomb (PcG), have a major role in maintenance of respectively, transcription activation and repression, when associated to the chromatin. The importance of PcGs has motivated us to pursue the isolation and characterization of two new human proteins that are orthologs of the \"Enhancer of Polycomb\" (Epc) of Drosophila. To achieve this goal we undertook the task of the cloning and mapping of complete cDNA sequence of the novel genes hEPC1 and hEPC2, analyzing its expression in fetal, adult and tumoral tissues and functionally characterizing the hEPC2 protein. In 2001, we published the mapping and cloning of the complete cDNA sequences of both genes, as being orthologs of the mouse Epc1 (10p11-22) and Epc2 (2q21-23), together with the strategy used to obtain the full-length cDNAs (Camargo et al., 2001). Both genes are shown to be highly conserved among several species. Thus, the human hEPC2 cDNA is 94% identical to the mouse Epc2 and displays 96% identity at the protein level, suggesting maintenance of its function during the evolution. However, the protein sequences of the human hEPC1 and hEPC2 display only 68% identity. Therefore, it is likely that they have undergone a functional divergence after their duplication. The expression of both genes was evaluated using \"dot-blots\" containing 76 mRNAs samples from fetal, adult and tumoral tissues and is shown to be weak and ubiquitous. \"In silico\" analysis suggested the existence of 4 hEPC2 splicing isoforms that were validated by RT-PCR and/or Northern-blots. One of the isoforms (of 2.7 Kbp) is shown to be more abundant in all of the tumoral cell lines evaluated using Northern-blot analysis, mainly in the Burkit\'s Raji lymphoma and in the promyelocytic leukemia HL-60. This isoform results from the use of an alternative polyadenylation site that reduces the 3\'UTR, abolishing 4 of 5 \"adenylates and urilates rich elements\" (AREs), involved in the degradation of labile mRNAs that codify to regulatory proteins. These results have been recently submitted to publication (manuscript attached to this thesis). Interaction between the hEPC2/SMADs and its modulation by TGF-β. During the assembly of the hEPC2 full-length cDNA sequence, we found two patented ESTs that tagged a portion of the gene. These sequences were described as partial sequences of a \"new SMAD interacting protein\", involved in signal transduction of TGF-β, a cytokine that regulates cell proliferation, differentiation and death. To evaluate this putative interaction between hEPC2 and the SMADs proteins, we begun a collaboration with the TGF-β signalling group of the Dr. Aristidis Moustakas, from the Uppsala Ludwig Institute for Cancer Research, Sweden. The results of co-imunoprecipitation assays suggested that SMADs 2, 3, 4, 7 e 8 interact with hEPC2. Moreover, the interaction among SMAD2, SMAD3, SMAD4 and hEPC2 in cells treated with TGF-β1 showed decreased co-imunoprecipitation. This result suggests that TGF-β1 negatively modulates the interaction of these proteins. Likewise, we observed a reduction in hEPC2 interaction with SMAD8 upon BMP-7 treatment. This effect was even more dramatic for SMADs 2 and 3. These data were observed for both hEPC2 plasmid constructs, which strongly suggest the veracity of these proteins interaction. The cell localization of the hEPC2 protein, as well as its co-localization with the SMAD2, were investigated through indirect immunofluorescence assay, confirming the predicted localization of hEPC2 in the cell nucleus using the PSORTII program. However, we were not able to confirm the co-localization of hEPC2 and SMAD2. It is possible that hEPC2 does not bind directly to the DNA, requiring an association with a partner such as a transcription factor. This raises the hypothesis of hEPC2 having a role as a co-factor associated to one of the SMADs and binding to a \"SMAD binding element\" (SBE). To investigate this hypothesis, gene reporter assays were undertaken using a reporter construct containing 12 CAGA sequence repetitions (specific binding sequence of the SMADs 2, 3 and 4) fused to the luciferase gene. However, this assay could not demonstrate that the transcription of the SMAD is dependent on hEPC2. This experiment must be repeated. To confirm the interaction of hEPC2 and SMADs, a pull-down assay will be performed. To this end, the coding region of hEPC2 was cloned into the pET-32A bacterial inducible expression vector. The recombinant protein was already produced, having been induced and purified under denaturing conditions. Despite the dozens of PcG genes that were described in Drosophila, only a few of these genes have been characterized in mammals. Therefore, the description of the hEPC2 and its alternative transcripts is a contribution to better knowledge of the human PcGs. Regarding the hEPC2 and SMADs interaction, it\'s it is noteworthy that this is the first protein described to interact with SMADs of distinct categories. This may be an important indication of a unique role for hEPC2 in the TGF-β1 signaling pathway.

A banana é considerada um bom modelo para o estudo da transformação amido-sacarose, já que acumula um alto teor de amido durante o desenvolvimento que é rapidamente degradado durante o amadurecimento. Várias enzimas e provavelmente mais de uma via metabólica estão envolvidas neste processo. Com isso, o objetivo deste trabalho foi estudar as características estruturais dos grânulos, bem como, a atuação das enzimas envolvidas em sua degradação. Os grânulos de amidos foram isolados de bananas controle (não tratadas) e submetidas a diferentes tratamentos: etileno, 1-MCP, frutos mantidos a 13°C e frutos tratados com etileno e mantidos a 13°C. Os resultados obtidos mostraram alta atividade de enzimas α e β-amilases ligadas ao grânulo tanto por ensaios in vitro como por géis de eletroforese contendo amilopectina como substrato. Os resultados obtidos para Western blot utilizando anticorpos produzidos contra essas enzimas, indicaram que a α-amilase atua no início da degradação enquanto a β-amilase foi encontrada no momento em que o amido estava em pleno processo. de degradação. Nos estudos de imunolocalização observou-se que as proteínas associadas aos grânulos de amido e em cortes do fruto demonstraram que estas enzimas estão localizadas na superfície do grânulo. As técnicas utilizadas para observação dos grânulos de amido foram a de Microscopia Óptica, Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia de Varredura Confocal a Laser. Os grânulos apresentaram um padrão de degradação diferenciado para cada tratamento realizado nos frutos. O teor de amilose encontrado para os amidos foi ao redor de 15%, não variando durante a degradação. O padrão de difração de Raios-X foi do tipo B em amidos de banana recém-colhidas e tipos A e B foram encontrados em amidos degradados. O grau de cristalinidade aumentou de 15% para 17% nos amidos em degradação. / Banana fruit is considered a good example for studying the starch-sucrose transformation, accumulating high starch content during the development being rapidly degraded during the ripening. Several enzymes and, probably more then one metabolic way are involved in this processo Then, the aim of this work was to study the structural characteristics of starch granules and the action of the enzymes involved in its degradation. Starch granules were isolated from bananas control (fruits without treatment), and exposed to different treatments, such as: ethylene, 1-MCP, stored fruits to 13°C and stored fruits to 13°C + ethylene. Results obtained showed high activities of enzymes α and β-amylases associated to starch granules, measured by in vitro assay and native PAGE containing amylopectin like substrate. Results obtained by Western blot using antibodies against these enzymes, indicated that α-amylase is responsible for the initial attack on the starch, and β-amylase was localized at moment that starch was in degradation processo Results of the immunolocalization of proteins associated on starch granule and proteins on banana tissue confirmed that these enzymes are localized on granule surface. When techniques of microscopy were used to starch, such as Optical Microscopy, Scanning Electron Microscopy and Confocal Laser Scanning Microscopy, was observed that granules showed a different degradation pattern, for each treatment made on fruits. Amylose content obtained for starch was around 15%, not changing during degradation. B-type diffraction pattern was found for green banana starch, and A and. B-type patterns for degraded starch. Degree of crystallinity increased from 15% to 17% for starches during degradation.

O pólen apícola apresenta elevadas porcentagens de nutrientes e pode ser utilizado como suplemento nutricional na alimentação humana. Este trabalho teve por objetivo principal avaliar a estabilidade das vitaminas antioxidantes (vitamina C, E e &#946;-caroteno) em pólen apícola durante um ano de estocagem. Foram adquiridos entre os meses de março e abril 2007 seis lotes de pólen apícola in natura e desidratado, diretamente de entrepostos de comercialização de produtos apícolas. Foram analisadas as concentrações das três vitaminas no tempo zero e em seguida amostras foram armazenadas, em embalagens fornecidas pelo produtor, sob três formas: a temperatura ambiente; a temperatura ambiente, porém protegida da luz; em freezer. Foi utilizado o método títulométrico para análise de vitamina C. Para &#946;-caroteno utilizou-se a cromatografia em coluna aberta no tempo zero e cromatografia líquida de alta eficiência após 6 e 12 meses de estocagem. Esta última foi utilizada para as análises da vitamina E. Foram realizadas ainda análises polínica e de composição centesimal. Foram encontradas as seguintes variações: 14&#177;0,25 a 119&#177;1,961 &#181;g/g para vitamina C, 19,43&#177;1,70 a 45,00&#177;3,61&#181;g/g para vitamina E 3,77&#177;0,10 a 99,27&#177;2,45 &#181;g/g para &#946;-caroteno em amostras frescas. Após processo de desidratação, houve uma alteração de 67,1% para mais na vitamina C (diferença significativa p<0,05), uma perda de 18,7% para vitamina E e de 15,6% para &#946;-caroteno. O valor pró-vitamínico A das amostras desidratadas variou de 0,26 a 6,48 &#181;g/g. A composição centesimal das amostras estudadas está de acordo com as especificações estabelecidas pela legislação brasileira em vigor (Instrução Normativa N° 3, de 19/01/2001). Houve grande variabilidade dos tipos polínicos encontrados nas amostras e alguns deles estiveram fortemente correlacionados com os teores de vitamina C (Myrtaceae), de &#946;-caroteno (Arecaceae, Cecropia e Fabaceae) e de lipídeos (Arecaceae e Fabaceae). Outros estiveram correlacionados de forma negativa, como é o caso dos Mimosa caesalpineafolia e Poacease com os níveis de &#946;-caroteno, do tipo Arecaceae com as proteínas e do tipo Mimosa caesalpineafolia com os lipídeos. A estocagem em freezer foi a condição mais eficiente na conservação das três vitaminas e a perda na estocagem a temperatura ambiente exposto a luz e protegido da luz foram semelhantes. Considerando-se as três condições estudadas, a vitamina E parece ser mais preservada durante estocagem quando comparada à vitamina C e ao &#946;-caroteno. Entretanto, conforme teste estatístico realizado, houve perdas significativas (p<0,05) apenas para vitamina C em todas as condições estudadas quando comparadas a sua concentração inicial (tempo 0). / Bee pollen contains high percentages of nutrients and it can be used as a nutritional supplement for human feeding. The aim of this work was to evaluate the stability the antioxidant vitamins (vitamin C, E and &#946;-carotene) in bee pollen during one year of storage. Six batches of fresh and dried bee pollen pellets were acquired in 2007 March and April from bee products warehouses. The three vitamins were quantified and then stored under three forms in packages supplied by the producer: in room temperature, in room temperature protected from light and frozen. Vitamin C was quantified by potentiometric titration. The open column chromatography was used for &#946;-carotene analyses in the zero time and the high performance liquid chromatography after 6 and 12 months storage. This last one was used for the vitamin E analyses. The centesimal composition and botanical characterization of the bee pollen were obtained. Vitamin content in fresh samples varied between 14&#177;0.25 and 119&#177;1.96&#181;g/g for vitamin C; 19.43&#177;1.70 and 45.00&#177;3.61&#181;g/g for vitamin E and 3.77&#177;0.10 and 99.27&#177;2.45&#181;g/g for &#946;-carotene. After the drying process a significant alteration 67.1 % for more in the vitamin C (p<0.05), a losses of 18.7% for vitamin E and 15.6% for &#946;-carotene were observed. The provitamin A value was between 0.26 and 6.48&#181;g/g. The proximal composition of the samples studied presented results which were ali accordance to the specifications established for the Brazilian regulation (Normative Instruction N° 3, 19/01/2001). A great variability of the pollen types was found in the samples and some of them were strongly correlated with the vitamin C (Myrtaceae), &#946;-carotene (Arecaceae, Cecropia and Fabaceae) and lipids (Arecaceae and Fabaceae). Other ones were negatively correlated, such as Mimosa caesalpineafolia and Poaceae types with &#946;-carotene, Arecaceae type with proteins and Mimosa caesalpineafolia type with lipids. Storage in freezer was more efficient to keep the vitamins and the losses at room temperature storage when exposed to light and in the dark were similar. Vitamin E was more preserved during the storage when compared to vitamin C and &#946;-carotene. However, only vitamin C presented significant statistical losses (p<0.05) in ali of the studied conditions when compared to its initial content.

Ferro é o metal de transição mais abundante da Terra. Quando se encontra na presença de substratos biológicos como o peróxido, Fe(II) o reduz ao radical hidroxila através da reação de Fenton. Os riscos associados a desordens neurodegenerativas aumentam devido à presença das espécies reativas de oxigênio, em alguns casos geradas por intermédio de reações com ferro. Uma das desordens mais graves entre estas é a Doença de Alzheimer (DA). Diferentes fármacos foram desenvolvidas ao longo dos anos para tratamento da DA. O tratamento da sobrecarga de Fe é baseado na terapia de quelação. Um dos quelantes amplamente empregados é a desferrioxamina (DFO). Nos últimos anos, um novo paradigma tem surgido na química medicinal, a estratégia MTDL (Multiple- target- directed ligand; ligante direcionado a múltiplos alvos). Propomos neste trabalho a conjugação de diferentes aminas aromáticas inspiradas em moléculas anti-Alzheimer com DFO, a fim de melhorar as propriedades farmacológicas deste quelante. Os novos quelantes, conjugados de DFO com anilina (DFOANI), benzosulfanilamida (DFOBAN), 2-aminonaftaleno(DFONAF) e 6-aminoquinolina (DFOQUN) foram obtidos. DFOQUN apresenta atividade quelante comparável à da DFO, enquanto os demais conjugados parecem menos eficientes. Ensaio antioxidante com dihidrorodamina (DHR) mostra que os conjugados (exceto DFONAF) apresentam comportamento similar ao da DFO, o que era esperado em função do ambiente de coordenação envolvido. DFOQUN promoveu significativo aumento de inibição de agregação de beta amilóide (&#946;A) quando comparado com DFO, devido ao anel quinolínico em sua estrutura. Estudos com a enzima acetilcolinesterase (AChE) realizados in vitro e in vivo (Caenorhabditis elegans) mostraram que a atividade de AChE decaiu na presença de DFOQUN. Estudos comportamentais demonstraram aumento no número de curvaturas dos vermes tratado com Fe na presença de DFO e DFOQUN. Além disso, verificou-se aumento de permeabilidade celular de DFOQUN e DFOANI comparado com DFO, sem decaimento da viabilidade dos conjugados na presença de Fe. Concluímos que DFOQUN demonstra características importantes como novo candidato a fármaco anti-DA. / Iron is the most abundant transition metal on Earth. In the presence of biological substrates such as peroxide, Fe(II) generates hydroxyl radical through the Fenton reaction. The risks associated with neurodegenerative disorders increase due to the presence of reactive oxygen species, in some cases catalyzed by iron. One of the most serious disorders among these is Alzheimer\'s Disease (AD). Different drugs have been developed over the years for the treatment of AD. The treatment of iron overload is based on chelation therapy. One of the widely used chelators is desferrioxamine (DFO). In recent years, a new paradigm has emerged in medicinal chemistry, the MTDL (Multiple Target-directed ligand) strategy. We propose in this work the conjugation of different aromatic amines inspired in anti-Alzheimer molecules with DFO to improve the pharmacological properties of this chelator.The novel chelators, DFO conjugate with aniline (DFOANI), benzosulfanilamide (DFOBAN), 2-naphtylamine (DFONAF) and 6-quinolinamine (DFOQUN) were obtained. DFOQUN has comparable chelating activity to that of DFO, while the other conjugates appear to be less efficient. Antioxidant tests with dihydrorhodamine (DHR) showed that, except for DFONAF, the conjugates exhibit similar behavior as DFO, due to the coordination environment involved. DFOQUN promoted a significant increase in inhibition of beta amyloid (A&#946;) aggregation when compared to DFO, because of the quinoline ring in its structure. Studies with the enzyme acetylcholinesterase (AChE) performed in vitro and in vivo (Caenorhabditis elegans) showed that AChE activity declined in the presence of DFOQUN. Behavioral studies showed an increase in the number of bends of the worms treated with Fe in the presence of DFO and DFOQUN. In addition, increased cell permeability of DFOQUN and DFOANI compared to DFO was observed, without decreased cell viability caused by the conjugates in the presence of Fe. We conclude that DFOQUN showed important characteristics for a new anti-AD drug candidate.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em estudo anterior, as espécies de enterobactérias apresentando perfis variados de resistência aos antimicrobianos foram detectadas em 20% dos sítios com lesões periodontais de pacientes sadios do ponto de vista sistêmico. Tais cepas microbianas foram submetidas a investigações com o intuito de determinar à expressão de enzimas hidrolíticas para substratos diversos, a multirresistência aos agentes antimicrobianos e os mecanismos de resistência aos antimicrobianos da classe dos &#946; lactâmicos. A maioria das amostras expressou atividade de gelatinase (65%), caseinase (30%) e elastase (10%). Lipase, lecitinase e DNase foram observadas apenas para Serratia marcescens. A multirresistência (considerado como a resistência a pelo menos dois agentes antimicrobianos de famílias diferentes) foi observada em 56% das amostras isoladas. A maioria das cepas foi resistentes à ampicilina (93,75%) e amoxicilina/ácido clavulânico (81,25%). Investigações sobre a resistência aos antibióticos &#946;-lactâmicos mostraram que três amostras resistentes à cefalosporinas de 2 geração, apresentaram perfis plasmidiais de diferentes pesos moleculares. A expressão fenotípica de &#946;-lacatamases, foi detectada nas cepas de Enterobacter cloacae (PcOM46 e PcOM5) e S. marcescens (PcOM63). No entanto, na análise molecular, não foi possível confirmar a expressão fenotípica de diferentes &#946;-lactamases, com exceção do E. cloacae PcOM46, que apresentou amplificação para AmpC e blaTEM. Embora sensível à maioria dos antibióticos &#946;-lactâmicos (exceção feita à ampicilina e amoxicilina / ácido clavulânico), amostra de S. marcescens PcOM68 apresentou amplificação para o gene blaSHV. Os experimentos de conjugação não detectaram a transferência de plasmídios para uma cepa de Escherichia coli K12 sensívei aos &#946;-lactâmicos, o mesmo ocorreu nos procedimentos de transformação por eletroporação e por CaCl2, sugerindo uma resistência dependente de genes cromossomiais. A expressão de diferentes atividades enzimáticas, juntamente com a resistência aos antimicrobianos, aponta estes grupos de bactérias como agentes patogênicos potenciais capazes de contribuir para a patogênese e resposta à quimioterapia antimicrobiana nas doenças periodontais, além da disseminação sistêmica para outros locais do corpo, especialmente em indivíduos imunocomprometidos. A colonização prévia de lesões periodontais por espécies resistentes aos &#946;-lactâmicos, pode contribuir para a disseminação destes genes relacionados à resistência aos antimicrobianos em ambientes hospitalares. / In a previous study, the enterobacterial species were detected in 20% of systemically healthy patients presenting periodontal lesions, with different profiles of antimicrobial resistance. These microbial strains were investigated in view to determine the expression of hydrolytic enzymes for diverse substrates, multiresistance to antimicrobial agents, and the mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics. The enzymes related to bacterial virulence were detected phenotypically in 90% isolates. The proteolytic activity displayed by the isolates against gelatin, casein and elastin was detected in 65%, 30% and 10%, respectively. Lipase, lecithinase, and DNase were observed only for Serratia marcescens strains. Multi-resistant phenotypes (considered as the resistance to at least two antimicrobial agents from different families) were observed for 56% enterobacterial isolates. Most of the strains were resistant to ampicillin (93.75%) and amoxicillin/clavulanic acid (81.25%). Investigations concerned to the resistance to beta-lactam antibiotics demonstrated that three bacterial strains resistant to penicilins and 2nd generation cephalosporins, had detectable plasmids. The extended resistance to &#946;-lactams was detected phenotypically for E. cloacae PcOM46 and PcOM5) and S. marcescens (PcOM63) strains. However, the molecular detection of extended spectrum beta-lactamase failed to confirm the phenotypic expression of different &#946;-lactamases, with exception to the E. cloacae PcOM46 isolate, which presented amplification for both ampC and blaTEM. Although sensitive to most of the &#946;-lactam antibiotics (exception made to ampicilin and ampicilin/clavulanate), the strain S. marcescens PcOM68 was shown to amplify the blaSHV gene. Plasmid transference by both conjugation and transformation procedures failed to detect the resistance by a &#946;-lactam-sensitive strain (E. coli K12), suggesting a chromosomal dependent resistance. The expression of varied enzymatic activities along with the resistance to antimicrobial agents point these group of bacteria as potential pathogens that may contribute to both pathogenesis and antimicrobial management of periodontal diseases, and systemic dissemination to other body sites, specially in immunocompromised host. The previous colonization of periodontal lesions by &#946;-lactam resistant species may represent a threat for dissemination of genes related to antimicrobial resistance inside hospital environments.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A imobilizaÃÃo de &#946;-galactosidase para hidrÃlise de lactose à uma proposta para agregar valor ao soro de leite com conseqÃente produÃÃo de galactose e glicose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver biocatalisadores a partir de diferentes suportes orgÃnicos e protocolos de ativaÃÃo visando à hidrÃlise de lactose proveniente do soro de leite. Inicialmente, prepararam-se os suportes a serem aplicados no estudo como quitosana 2,5% (m/v) (sem e com prÃ-tratamento com dimetilformamida) e 2,0% (m/v), quitosana-alginato-epoxilado (QAE), bagaÃo de caju (BC) e fibra de casca de coco verde (CV), os quais foram ativados de diferentes formas, com glutaraldeÃdo, epicloridrina ou glicidol. Na primeira etapa, determinaram-se o rendimento de imobilizaÃÃo, atividade recuperada e atividade aparente dos diferentes derivados obtidos para assim determinar os seis melhores â quitosana 2,5% (m/v) ativada com glutaraldeÃdo (QUITGLU1), quitosana 2,0% (m/v) coagulada com KOH a 50ÂC ativada com glutaraldeÃdo (QUITGLU2) ou epicloridrina (QUITEPI) ou glicidol (QUITGLI), quitosana 2,5% (m/v) tratada com dimetilformamida ativada com epicloridrina (QUIT-DMFEPI) ou glicidol (QUIT-DMFGLI). Para segunda fase, os catalisadores (QUITGLU1, QUITGLU2, QUITEPI, QUITGLI) foram estudados quanto à estabilidade operacional com o uso de reator contÃnuo, assim como ensaios de carga mÃxima e efetividade. Baseado nestes ensaios determinou-se QUITGLU2 como melhor biocatalisador e realizaram-se os seguintes estudos: variaÃÃo do tempo de imobilizaÃÃo, determinaÃÃo da melhor temperatura e pH para atividade enzimÃtica, determinaÃÃo de parÃmetros cinÃticos, estocagem sob 10ÂC e estabilidade operacional com o uso de alta carga enzimÃtica usando soro de leite como substrato. Suportes como CV e BC nÃo apresentaram boa adequaÃÃo para imobilizaÃÃo de &#946;-galactosidase de Kluyveromyces lactis, assim como o suporte QAE. Suportes com tratamento com dimetilformamida apresentaram baixos rendimentos de imobilizaÃÃo. Os resultados para o derivado QUITGLU2 apresentaram carga mÃxima de 75 mgProteÃna.g-1 de suporte e efetividade superiores aos demais. A estabilidade operacional para este derivado apresentou-se estÃvel, visto sua produÃÃo de glicose constante por 10 h de reaÃÃo. O tempo 3 h mostrou-se suficiente para imobilizaÃÃo. Os valores de Km e VmÃx tanto para enzima solÃvel (46,79 mM e 7.142,86 &#956;mol.(mL.min)-1) quanto para o derivado (69,56 mM e 113,25 &#956;mol.(g.min)-1). Durante os 120 dias de armazenamento sob 10ÂC, nÃo houve decrÃscimo da atividade hidrolÃtica do derivado, demonstrando Ãtima estabilidade à estocagem. Por fim, o biocatalisador mostrou bons resultados de estabilidade operacional quando utilizado em alta carga oferecida (255,9 mgProteÃna.g-1 de quitosana de carga teoricamente imobilizada) para hidrÃlise de soro de leite / &#946;-galactosidase immobilization was studied seeking to add value to cheese whey trough lactose hydrolyze producing galactose and glucose. This work aimed to develop biocatalysts using different organic supports and activation protocols. Firstly, some supports were prepared as chitosan 2.5% (w/v) (with and without pretreatment with dimethylformamide) and 2.0% (w/v), chitosan-alginate-epoxide (QAE), cashew bagasse (BC) and coconut shell fiber (CV), which were activated in different ways with glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol. Initially, it was determined the immobilization yield, couple yield and apparent activity from obtained catalysts, being chosen six derivatives according to better results parameters: 2.5% chitosan (w/v) glutaraldehyde activated (QUITGLU1), 2.0% chitosan (w/v) KOH coagulated at 50ÂC glutaraldehyde activated (QUITGLU2) and epichlorohydrin (QUITEPI) or glycidol (QUITGLI), chitosan 2.5% (w/v) dimethylformamide treated with epichlorohydrin (QUIT-DMFEPI) or glycidol (QUIT-DMFGLI). Thus, catalysts (QUITGLU1, QUITGLU2, QUITEPI, QUITGLI) were studied as operational stability by using a continuous reactor, as well as, maximum enzyme loading and effectiveness assays. Then, it was determined QUITGLU2 as the best biocatalyst and following studies were carried out: immobilization time, enzyme optimum temperature and pH, kinetic parameters using lactose as substrate at 37ÂC, storage at 10ÂC and operational stability using high load enzyme and cheese whey as substrate. CV and BC supports did not present good results for &#946;-Kluyveromyces lactis galactosidase immobilization, as well as, QAE support. Supports treated with dimethylformamide presented low immobilization yields. The results for QUITGLU2 derivative presented maximum loading of 75 mgProtein.g-1support and higher effectiveness than others. The operational stability for this derivative remained stable, with constant glucose production for 10 h of reaction. Immobilization time of 3h proved enough for the process. The Km and VmÃx values were respectively: free enzyme (46.79 mM and 7,142.86 &#956;mol.(mL.min)-1) and catalyst (69.56 mM and 113.25 &#956;mol.(g.min)-1). During 120 days of storage at 10ÂC, no decrease derivative hydrolitic activity was noted, demonstrating satisfactory storage stability. Finally, the biocatalyst showed good results as operational stability when used high offered enzyme load (theoretically immobilized load 255.9 mgProtein.g-1chitosan) for cheese whey hydrolysis

In this study, the effects of bioprocess design parameters on &amp / #946 / -lactamase production were systematically investigated using wild type Bacillus species. For this purpose, the research programme was carried out in mainly four parts. Initially, potential &amp / #946 / -lactamase producers were screened and Bacillus licheniformis ATCC 25972, a constitutive &amp / #946 / -lactamase producer, was selected. Next, the effects of bioprocess medium components, i.e., carbon sources (glucose, fructose, sucrose, citric acid and glycerol), inorganic nitrogen sources ((NH4)2HPO4 and NH4Cl) and organic nitrogen sources (yeast extract, peptone and casamino acids), were investigated in agitation and heating rate controlled laboratory scale bioreactors. Thereafter, by using the designed medium, the effects of bioprocess operation parameters, i.e., pH and temperature, on &amp / #946 / - lactamase activity were investigated in order to achieve a higher &amp / #946 / -lactamase production. Among the investigated bioprocess conditions, the highest &amp / #946 / - lactamase activity was obtained as 275 U cm-3, in the medium with 10.0 kg m-3 glucose, 1.2 kg m-3 (NH4)2HPO4, 8.0 kg m-3 yeast extract and the salt solution, at pH0=6.0, T=32&deg / C, N=200 min-1, which was 7.9 fold higher than the activity obtained in the reference medium. Finally, using the optimum bioprocess parameters obtained in laboratory scale experiments, the fermentation and oxygen transfer characteristics of the bioprocess were investigated in 3.0 dm3 pilot scale bioreactor, having temperature, pH, foam and stirring rate controls, at Q0/V=0.5 vvm and N=500 min-1 oxygen transfer conditions. The variations in &amp / #946 / - lactamase activity, cell, glucose, amino acid and organic acid concentrations with the cultivation time / the oxygen uptake rate and the liquid phase mass transfer coefficient values were determined. Throughout the bioprocess, overall oxygen transfer coefficient (KLa) varied between 0.008-0.016 s-1 / oxygen uptake rate varied between 0.001-0.003 mol m-3 s-1. Furthermore, rate limiting step analysis was performed / the yield and maintenance coefficients for the bioprocess as well as the kinetic parameters for &amp / #946 / -lactamase were determined.

Some yeasts secrete polypeptide toxins, which are lethal to other sensitive yeast cells, gram-positive pathogenic bacteria and pathogenic fungi. Therefore these are designated as killer toxins. Killer toxins are suggested as potent antimicrobial agents especially for the protection of fermentation process against contaminating yeasts, biological control of undesirable yeasts in the preservation of foods. Moreover they are promising antimicrobial agents in the medical field / due to immune system suppressing diseases like AIDS, there is an increase in the incidence of fungal diseases and current antimycotics have low selectivity and severe side effects. In this study our aim was to explain the cytocidal effect and enzymatic properties of K5 type yeast killer protein, which is secreted by Pichia anomala NCYC 434 cells, and known to have a broad range of killing spectrum. Competitive inhibition of the toxin with cell wall polysaccharides showed that primary binding site of toxin is &amp / #946 / -1,3-glucans of sensitive cells. Toxin showed exo-&amp / #946 / -1,3-glucanase activity which causes loss of cell wall rigidity leading cell death. Km and Vmax were found to be 0,3 mg/ml and 372,3 &micro / mol/min/mg for laminarin hydrolysis. The toxin exerted its cytocidal effect after 2 h contact with the target cells. Toxin production was found to be dependent on &amp / #946 / -1,3-glucan content of the media. Toxin activity was completely inhibited by Hg+2 ,while several metal ions and DTT increased the activity to different extends. Our findings revealed the characteristics of K5 type killer toxin which will help for its possible uses in near future.