As Fosfolipases A2 (PLA2) são enzimas que atuam desconstruindo membranas celulares, resultando em ácidos graxos e lisofosfolipidios, causando inflamação tecidual. Evidências indicam que serpentes possuem uma resistência natural devido a propriedades presentes no sangue, que inibem ações de proteínas presentes no veneno. Portanto, no presente trabalho foi isolado e caracterizado bioquimicamente e biologicamente o primeiro inibidor de PLA2 do tipo gama (γPLI) do soro da serpente B. jararaca, denominado PLI_BJ. O inibidor de PLA2 foi isolado utilizando dois passos cromatográficos. O PLI_BJ mostrou, por SDS-PAGE, uma massa molecular aparente de 25 000 e 20 000 em condições redutoras e não redutoras, respectivamente. A sequência de aminoácidos parcial de PLI_BJ foi determinada por espectrometria de massa e corresponde a 72% e 68% de cobertura da sequência de aminoácidos de duas proteínas já descritas como PLI. O PLI_BJ mostrou também atividade inibitória satisfatória nos três testes realizados sugerindo um papel deste inibidor nos efeitos de envenenamento da serpente. / Phospholipases A2 (PLA2) are enzymes that act on cell membrane phospholipids resulting in fatty acids and lysophospholipids, deconstructing the cell wall causing tissue inflammation. Evidence indicates that snakes have natural resistance due to protective properties of blood that inhibits the action of proteins present in the venom. This study aimed to purify and characterize PLA2 inhibitors (PLI) from serum of the Bothrops jararaca snakes. PLA2 inhibitor was isolated using two chromatographic steps, and was named PLI_BJ. The purity of the PLI_BJ was confirmed by HPLC and SEC. The PLI_BJ showed, by SDS-PAGE, an molecular mass of 25,000 and 20,000 under reducing and non-reducing conditions, respectively. The partial amino acid sequence of PLI_BJ was determined by mass spectrometry and it corresponds to 72% and 68% of coverage of the amino acid sequence of two proteins already described as PLI. The PLI_BJ also showed satisfactory inhibitory activity in the three tests performed suggesting a role of this inhibitor in snake envenomation effects.

Glioblastoma (GBM) é caracterizado por sua agressividade e invasão infiltrativa do tecido cerebral. Mecanismos inflamatórios demonstram associação direta com processos carcinogênicos, especialmente aqueles relacionados à produção de eicosanoides através da ativação da fosfolipase A2 (PLA2). Compostos metálicos como o rutênio associado a drogas anti-inflamatórias não esteroides (AINEs) surgem como tratamentos antitumorais promissores. O objetivo foi avaliar in vitro a ação desses complexos de rutênio em linhagens celulares de GBM. Pudemos observar que todos os complexos de Rutênio utilizados apresentaram diminuição na contagem celular, aumento de apoptose e diminuição da mitose, destaque para a linhagem U87MG para o tratamento RuIBpOTf com diminuição de 65,4% e na linhagem A172 para aumento de apoptose em todos os tratamentos, especialmente RuIBpCl com 106,8% . Em ambas as linhagens celulares verificamos que houve a captação dos complexos, inclusive em suas frações celulares como o núcleo. Alterações nas enzimas PLA2 e COX 1 e 2 também foram detectadas nos ensaios realizados ELISA e RT-PCR. Através destes resultados, concluímos que os complexos de rutênio foram eficazes na diminuição do número de células de GBM em concentrações e tempos pré-determinados, aumento da apoptose e diminuição das mitoses, características que são fortemente recomendadas para novos fármacos. / Glioblastoma (GBM) is characterized by its aggressiveness and infiltrative invasion of brain tissue. Inflammatory mechanisms demonstrate direct association with carcinogenic processes, especially those related to the production of eicosanoids through the activation of phospholipase A2 (PLA2). Metal compounds such as ruthenium associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) appear as promising antitumor treatments. The objective was to evaluate in vitro the action of these ruthenium complexes in GBM cell lines. It was observed that all the Ruthenium complexes showed decrease in the cell count, increase of apoptosis and decrease of mitosis, highlight to the U87MG cell line for the treatment RuIBpOTf with reduction of 65.4% and in cell line A172 to increase apoptosis in all the treatments, especially RuIBpCl with 106.8%. In both cell lines we verified that there was the uptake of the complexes, including in their cellular fractions as the nucleus. Changes in PLA2 and COX 1 and 2 enzymes were also detected in ELISA and RT-PCR assays. Through these results, we conclude that ruthenium complexes were effective in decreasing the number of GBM cells at predetermined concentrations and times, increased apoptosis and decreased mitoses, characteristics that are strongly recommended for new drugs.

A quantificação dos componentes bioquímicos como frutose, ácido cítrico e proteína total existentes no plasma seminal de caprinos e ovinos localizados na região Centro-Oeste do Brasil é uma forma de avaliar a atividade fisiológica e bioquímica espermáticas. Estes dados servem como indicadores de prováveis problemas com os testículos e glândulas acessórias desses animais e de sua respectiva fertilidade. A frutose e o ácido cítrico são importantes para o sêmen como fonte de energia metabólica e como componente de sistema tampão, respectivamente. A frutose é um marcador da função secretora das vesículas seminais, e é um componente importante para a sobrevivência dos espermatozóides em condições anaeróbicas e está estreitamente relacionada com a motilidade inicial das células espermáticas. Sendo assim, os objetivos do presente projeto foram analisar quantitativamente esses componentes do plasma seminal de bodes e carneiros sob latitude 20°31\'S em quatro épocas do ano e purificar, através de técnicas cromatográficas, a enzima fosfolipase A2, importante proteína presente no plasma seminal. As análises bioquímicas foram feitas usando-se um espectrofotômetro UV/Vis para obtenção da curva padrão e para a determinação das concentraçõoes mensais e da concentração anual média dos constituintes analisados. A purificação da PLA2 foi feita por cromatografia líquida preparativa usando-se como fase estacionária a coluna Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) de exclusão por tamanho e membranas semipermeáveis de 10 e 30 kDa. Como resultado das análises bioquímicas, obteve-se a concentração anual média de proteínas totais de 3,27 ± 0,60 g/dL para ovinos e de 5,02 ± 0,43 para caprinos, ácido cítrico de 1015,33 ± 66,50 µg/mL para ovinos e de 1584,35 ± 143,90 µg/mL para caprinos e frutose de 23,40 ± 4,80 mg/dL para ovinos e 72,73 ± 18,50 mg/dL para caprinos. Os resultados mostraram que a PLA2 extraída do plasma seminal de ovinos tem massa molecular próxima de 13,8 kDa e a PLA2 do plasma seminal de caprinos tem massa molecular próxima a 12,8 kDa. / Quantification of biochemical components in seminal plasma including fructose, citric acid and total protein of goat and sheep of the Midwest region of Brazil is one way of evaluating the biochemical and physiological activity of the sperm. These data serve as indicators of potential problems with the testicles and accessory glands of these animals and their relative fertility. The fructose and citric acid are important for the semen as a source of metabolic energy and as a component of a buffer, respectively. Fructose is a marker of secretory function of seminal vesicles, important for the survival of spermatozoa under anaerobic conditions, and is closely related to the initial motility of sperm cells. Therefore, the objectives of this project were to quantitatively analyze these components in the seminal plasma of goats and sheep in latitude 20°31\'S 3 1\'S in four seasons and purify by chromatographic techniques the enzyme phospholipase A2, an important protein in the seminal plasma. Biochemical analysis were done using a spectrophotometer UV / Vis to obtaining the standard curve and to determine the monthly and annual average concentration of the constituents analyzed. The purification of PLA2 was performed by preparative liquid chromatography using the column as stationary phase Superdex 75-16/60 (GE HealthCare) by size exclusion and semipermeable membranes 10 and 30 kDa. As a result of biochemical analysis, we obtained the annual average concentration of total protein of 3,27 ± 0,60 g / dL for sheep and 5,02 ± 0,43 g/dL for goats, citric acid of 1015,33 ± 66, 50 g / mL for sheep and 1584,35 ± 143,90 g / mL for goats and fructose 23,40 ± 4,80 mg / dL for sheep and 72,73 ± 18,50 mg / dL for goats. The results showed that the PLA2 extracted from seminal plasma of sheep has a molecular mass of 13,8 kDa and the next PLA2 from goat seminal plasma has a molecular mass close to 12,8 kDa.

Fosfolipases A2 miotóxicas (Lys49, enzimaticamente inativa, e Asp49, com atividade) isoladas do veneno de Bothrops asper, induzem hipernocicepção. Assim, avaliamos os mecanismos estruturais, moleculares e mediadores centrais envolvidos neste efeito. A injeção intraplantar das FLA2s acarretou hiperalgesia, enquanto que apenas a FLA2-Asp49 induziu alodinia. A região C-terminal é a responsável pelo efeito da FLA2-Lys49, enquanto que a atividade catalítica da FLA2-Asp49 parece ser responsável pela indução de hipernocicepção. Canais de Ca2+ e Na+ participam deste efeito. Na medula espinhal, receptores NK1 e para CGRP, receptores ionotrópicos para glutamato, NO, IL-1, prostanóides e adenosina participam da hiperalgesia induzida pelas FLA2s. Adicionalmente, receptores metabotrópicos para glutamato e o TNF?, estão envolvidos na hiperalgesia induzida pela FLA2-Asp49. Receptores NK1 e NK2 e para CGRP, receptores para glutamato, TNF? e prostanóides medeiam a alodinia. A ativação de astrócitos e microglia, na medula espinhal, contribui para a gênese do efeito hipernociceptivo. / Phospholipase A2 (Lys49, catalytically-inactive and Asp49, catalytically active), isolated from Bothrops asper snake venom, induce pain. The present studies examined the molecular, structural and central mechanisms involved in hypernociception induced by both PLA2s. These PLA2s induced mechanical hyperalgesia, whereas only PLA2-Lys49 evoked allodynia. The C-terminal region of the PLA2-Lys49 seems to be responsible for hyperalgesia, whereas the enzymatic activity of PLA2-Asp49 contributes to such an effect. Calcium and sodium channels are involved in PLA2s-induced hyperalgesia. In the spinal cord, NK1 and CGRP receptors, glutamate ionotropic receptors, NO, IL-1, prostanoids and adenosine contribute to hyperalgesia caused by PLA2s. Additionally, metabotropic glutamate receptors and TNF are involved in hyperalgesia induced by PLA2-Asp49. NK1, NK2 and CGRP receptors, glutamate receptors, TNF and prostanoids mediate allodynia. Activation of spinal astrocytes and microglia contribute to the generation of hyperalgesia and allodynia induced by both toxins.

As fosfolipases A2 secretadas (sFLA2) de veneno de serpente apresentam homologia estrutural e funcional com as sFLA2s do GIIA de mamíferos, cujos níveis estão elevados em doenças inflamatórias, como a aterosclerose. Nesta doença, as células de músculo liso vascular (CMLVs) acumulam corpúsculos lipídicos (CLs) e se diferenciam em células espumosas. Porém, o papel das sFLA2s neste fenômeno não é conhecido. Neste estudo foram avaliados os efeitos das FLA2 MT-III, cataliticamente ativa, e da BthTx-II, sem atividade catalítica, em CMLVs, com ênfase na formação de CLs e a participação de fatores da homeostasia lipídica. Os resultados obtidos demonstraram que a MT-III e a BthTx-II induziram a formação de CMLVs espumosas. Para tanto, estas enzimas recrutaram diferentes fatores envolvidos na síntese e acúmulo de lipídios. Nesta condição, os CLs constituem um local de síntese de prostaglandinas. Ainda, a MT-III induziu a diferenciação de CMLVs para fenótipo e função de macrófagos. A atividade catalítica não é relevante para a formação de CLs induzida por FLA2s. / Bothrops snake venom secreted phospholipases A2 (sPLA2s) share structural and functional features with mammalian GIIA sPLA2s, which are highly expressed during inflammatory diseases, such as atherosclerosis. In this disease, vascular smooth muscle cells (VSMCs) are loaded with lipid droplets (LDs) differentiating into foam cells. However, the role of these enzymes in this process is still unknown. In this study the effects of snake venom PLA2s MT-III with catalytic activity and BthTx-II, devoid of catalytic activity in VSMCs, with focus on LDs formation and mechanisms involved were investigated. Results here obtained show that both MT-III and BthTx-II induce formation of foam VSMCs and recruit distinct factors of synthesis and storage of lipids in these cells. In this condition, LDs constitute sites for synthesis of prostaglandins. Moreover, MT-III showed the ability to modulate VSMCs functions, leading them to a phenotipic switch to macrophage-like cells. In addition, the catalytic activity is not relevant to sPLA2-induced LDs formation.

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli. / Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.

A cristalografia de raios-X e um método de singular importância para a determinação da estrutura de macromoléculas. A importância em resolver estruturas de proteínas continua a crescer em campos variando desde a bioquímica e biofísica básicas ate o desenvolvimento farmacêutico e biotecnologia. o presente trabalho esta relacionado com os estudos cristalográficos de três diferentes moléculas biológicas. Calgranulina C de granulócitos porcinos, uma proteína que liga cálcio, supostamente envolvida em processos celulares regulados, foi cristalizada com parâmetros de rede a=b=54.35 e c=141.32&#197, grupo espacial P3121 ou seu enantiomorfo P3221. Várias tentativas foram feitas no sentido de se determinar a estrutura por substituição molecular, mas a alta flexibilidade entre os motivos \"EF-hands\" quando da ligação ao íon cálcio podem ser responsáveis pelo insucesso dos resultados. Tripanotiona redutase de T. cruzi e um excelente alvo para modelagem de inibidores e potenciais drogas contra a doença de Chagas. O complexo mutante TR + GSPD foi cristalizado com parâmetros de rede a=b=92.7 e c=156.2&#197, grupo espacial P43. Um conjunto preliminar de fases foi obtido por refinamento de corpo rígido contra as coordenadas da TR nativa. O modelo foi refinado a 2.4&#197 de resolução, Rfactor=19.8%. Fosfolipase A2 extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni foi cristalizada com parâmetros de rede a=63.1, b=90.5 e c=40.2&#197 e &#946=125.1&#176, grupo espacial C2. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o dímero da fosfolipase A2 de Crotalus atrox como modelo. A analise de sua seqüência de aminoácidos e necessária para posteriores ciclos de refinamento. / X-ray crystallography is a essential method for determination of the structure of macromolecules. The importance of solving protein structures continues to grow in fields ranging from basic biochemistry and biophysics to pharmaceutical development and biotechnology. The current work is concerned to the crystallographic studies of three different biological molecules. Calgranulin C from pig granulocytes, a calcium binding protein though to be involved in regulation of cell process, was crystallized with cell parameters a=b=54.35 and c=141.32&#197, space group P3121 or its enantiomorph P3221. Several attempts were made in order to solve the structure, but the high flexibility between its EF-hands motives while binding the ion calcium may be responsible for the lack of success in the results. Trypanothione reductase (TR) from T. cruzi is a target enzyme for modeling an inhibitor for Chagas´ disease. The C58S TR + GSPD mutant complex was crystallized with a=b=92.7 and c=156.2&#197, space group P43. A preliminary set of phases was obtained by rigid body refinement against the coordinates for the native TR. The model was refined to 2.4&#197 resolution, Rfactor=19.8%. Phospholipase A2 extracted from the venon of the snake Bothrops moojen; was crystallized with cell parameters a=63.1, b=90.5, c=40.2&#197 and &#946=125.1&#176, space group C2. The structure was solved by molecular replacement techniques using the dimer of phospholipase A2 from Crotalus atrox as a model. The aminoacid sequence analysis is needed for further refinement cycles.

Une nouvelle lignée homozygote de souris « humanisé » HLA transgéniques : HLA-A2.1+/+HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-β2m-/- (HLA-A2/DP4), a été obtenue en croisant entre les souris HLA transgéniques HLA-A2.1+/+β2m-/-(A2) et les souris HLA transgéniques HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-(DP4). Chez les souris HLA-A2/DP4, les réponses cellulaire T HLA-A2 restreint ou HLA-DP4 restreint contre l’antigène HBs du virus de l’Hépatite B suite à une immunisation avec le vaccin anti-AgHBs sont similaires à ceux observés chez les souris A2, chez les souris DP4, chez les humains infectés par le virus ou immunisés avec le même vaccin. Ces résultats montrent que les réponses cellulaires induites les souris HLA-A2/DP4 miment fidèlement les réponses homologues humaines. Ainsi, ces souris représentent un excellent modèle d’expérimentations précliniques animal pour évaluer ou comparer l’efficacité des réponses « humain » induites in vivo par des candidates vaccins. Le modèle facilitera également l'identification de nouvelles épitopes HLA-A2 et HLA-DP4 restreints, qui constituera de futurs réactives de suivi clinique des réponses contre l'infection chez les humains.En exploitant ces souris HLA-A2/DP4, nous avons identifié quatre nouveaux HLA-DP4-restricted épitopes issus de l'AgHBs et deux nouveaux HLA-A2 restreint épitopes dérivés de protéines M1. / A new homozygous humanized HLA transgenic mouse strain, HLA-A2.1+/+HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-β2m-/- (HLA-A2/DP4), was obtained by crossing the HLA transgenic HLA-A2.1+/+β2m-/-(A2) mice and HLA transgenic HLA-DP4+/+hCD4+/+mCD4-/-IAβ-/-(DP4) mice. In HLA-A2/DP4 mice, HLA-A2 restricted or HLA-DP4 restricted T cell responses against HBs antigen of hepatitis B virus after immunization with the HBsAg vaccine are similar to those induced in A2 mice, in DP4 mice, in HBV-infected or HBsAg-vaccinated humans. These results show that cellular responses induced in HLA-A2/DP4 mice faithfully mimic human responses counterparts. Thus, these mice represent an excellent animal model for preclinical experimentations to evaluate or compare the effectiveness of responses "human" induced in vivo by candidate vaccines. The model will also facilitate the identification of new epitopes HLA-A2 and HLA-DP4 restricted, which will be of future reactive for clinical monitoring response against infection in humans. By exploiting these HLA-A2/DP4 mice, we identified four new HLA-DP4-restricted epitopes from HBsAg and two new HLA-A2 restricted epitopes derived from protein M1.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

A proteína Tau é um importante componente do citoesqueleto neuronal, encontrada fundamentalmente nos axônios e sendo responsável pela estabilização dos microtúbulos. Agregados de proteína Tau em estado hiperfosforilado dão origem aos filamentos helicoidais pareados, que por sua vez integram os emaranhados neurofibrilares. Estes, ao lado das placas senis, representam os achados patológicos característicos da doença de Alzheimer (DA). A superfamília das fosfolipases A2 (PLA2) compreende diversas enzimas que participam de processos fisiológicos importantes, tais como a digestão de fosfolipídios, a remodelação da membrana celular e a geração de mensageiros para a sinalização intracelular. Existem evidências indiretas de que o estado de fosforilação da Tau é modificado pelos produtos metabólicos da PLA2, em processos de neuritogênese e plasticidade sináptica. O presente trabalho tem como objetivo investigar, em culturas primárias de neurônios, os efeitos da inibição da PLA2 sobre o estado de fosforilação da proteína Tau. Foram utilizados inibidores de diferentes subtipos de PLA2 para o tratamento das culturas, sendo os efeitos determinados pelo método de Western Blot, utilizando-se painel de anticorpos direcionados contra a proteína Tau sensíveis ao estado de fosforilação de seus diferentes fosfoepitopos. Nossos achados mostram que a inibição da PLA2 leva a um aumento dose-dependente e específico da fosforilação da Tau no resíduo de Serina 214. Isso sugere que a PLA2 participa da regulação do estado de fosforilação da Tau em neurônios hipocampais por uma via independente da ação da enzima glicogênio sintase quinase (GSK), que é a principal quinase da proteína Tau em neurônios. Essas evidências reforçam o papel da PLA2 na fisiopatologia da DA, na qual a redução da atividade enzimática correlaciona-se com parâmetros clínicos e neuropatológicos da demência. / Tau protein is an important cytoskeleton component, responsible for microtubules stabilization, found basically in axons of neurons. The abnormal aggregation of Tau protein in a hyperphosphorylated state could lead to paired helical filaments, which in turn integrate the neurofibrillary tangles present in many illnesses, such Alzheimer Disease (AD). Together with senile plaques, neurofibrillary tangles represent the histopathological findings of AD. Indirect evidences show that metabolic products of an important family of enzymes, phospholipase A2 (PLA2) are responsible for modifications in neuritogenesis processes, synaptic plasticity and in Tau phosphorylation state. The superfamily of PLA2 comprehends many enzymes important in physiological processes, such as phospholipids digestion, cellular membrane remodeling and messengers of intracellular signaling. This way, the objective of this research is to investigate, in primary neurons cultures, the effect of PLA2 inhibition on Tau phosphorylation state. Cultures were treated with PLA2 inhibitors and the effects were analyzed by western-blot method using specifics antibodies for some Tau phosphorylated residues. Our findings show that the PLA2 inhibition increases Tau phosphorylation in Serine 214 residue in dose-dependent and specific manner. These findings suggest that PLA2 participate in hippocampal neurons Tau phosphorylation regulation, in a glycogen sintase quinase (GSK) independent manner. These evidences strengthen the possible role of PLA2 in the physiopathology of AD and that the reduction of its enzymatic activity is correlated with clinical and neuropathology parameters of dementia.