Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000042.pdf: 1706671 bytes, checksum: dc956801bf26bdb2686d937802c8fb3f (MD5) Previous issue date: 2008 / O diagnóstico da tuberculose (TB) se baseia em dados clínicos e epidemiológicos associados aos métodoslaboratoriais (baciloscopia, cultura de materiais biológicos e TTI - Teste Tuberculínico Intradérmico) e radiografia de tórax. Em crianças, por serem paucibacilares e muitas vezes apresentarem reações cruzadas ao TST, devido à vacinação recente com BCG e à exposição à micobactérias ambientais, existem dificuldades maiores para obter esse diagnóstico. Diante disso, métodos imunológicos têm sido propostos. Dentre eles, destacam-se os baseados em antígenos recombinantes específicos do complexo M. tuberculosis: o ESAT-6 (early secretory antigen target 6) e o CFP- 10 (culture filtrate protein 10), que são potentes indutores de IFN- . Baseado nisso, o nosso estudo teve como objetivos: avaliar os níveis de IFN- , produzidos por células sanguíneas induzidos por ESAT-6, CFP-10 e PPD in vitro, através de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), em pacientes pediátricos e determinar a sensibilidade e a especificidade dos ensaios definindo qual o teste mais apropriado para o diagnóstico. Foram selecionadas, no Hospital das Clínicas e no Instituto Professor Fernando Figueira-PE, crianças com idade de 3 a 15 anos, de ambos os sexos, e de acordo com os fatores de inclusão foram distribuídas em grupos de TB doença (n = 21) e TB latente (n = 17). O grupo controle negativo (n=21) foi formado por crianças com ausência de sinais e sintomas de TB e sem história de contato com adulto bacilífero. Os níveis de IFN- contra os antígenos ESAT-6, CFP-10 e PPD in vitro foram quantificados e a curva ROC (receiving operating characteristics) foi utilizada para avaliar a capacidade desses antígenos de diagnosticar TB infantil (latente e/ou doença). O único antígeno que demonstrou essa capacidade foi o ESAT-6 (P 0,05), tanto para TB latente (AAC

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-06-25T20:55:47Z No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-25T20:55:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Garboggini Pinheiro Avaliação da resposta imune em camnundongos....pdf: 3469982 bytes, checksum: 4041d40a1d0e55867e25c7be92f3dd02 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença parasitária causada por Leishmania chagasi. Os cães são considerados como principais reservatórios do parasito. Uma vacina efetiva para o cão pode contribuir para o controle da LV tanto no homem como no cão. Em um estudo prévio, antígenos recombinantes, obtidos a partir de uma biblioteca de cDNA da forma amastigota de Leishmania chagasi, foram selecionados a fim de serem avaliados como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. No presente trabalho, a resposta imune humoral e celular de camundongos foi avaliada após injeção de alguns desses antígenos recombinantes, em cinco diferentes protocolos de imunização. Grupos de camundongos BALB/c foram injetados com as proteínas rLci4A-NH6 ou rLci2B-NH6, isoladamente ou associadas aos adjuvantes saponina, ODN 1826 ou diferentes doses de um plasmídeo codificando IL-12 murina. Além disso, animais foram sensibilizados com plasmídeo codificando Lci2B e receberam reforço com a proteína rLci2B-NH6 associada à saponina. Por último, os animais foram injetados com plasmídeos codificando novos antígenos, Lci2-NT-5R-CT ou Lci2-NT-CT, e recebram reforço com as respectivas proteínas recombinantes rLci2-NT-5R-CT-NH6 ou rLci2-NT-CT-NH6 associadas à saponina. Nesse último protocolo, os plasmídeos utilizados continham o gene para uma proteína transmembrana associada a lisossomos, LAMP, visando à produção in vivo de quimeras de dos antígenos de Leishmania com LAMP, a fim de direcionar a apresentação dos peptídeos para linfócitos T CD4+ via moléculas de MHC-II. Em um dos protocolos, os animais foram desafiados com 1 x 107 Leishmanias para avaliação da carga parasitária no baço após imunização. Os resultados encontrados mostraram que animais que receberam rLci4A-NH6, isoladamente ou com diferentes doses de plasmídeo codificando IL-12, apresentaram níveis signficantes de IgG e IgG1, ao passo que o uso do antígeno com os adjuvantes saponina ou ODN 1826 induziu a produção de IgG, IgG2a e IgG1, além de produção de IL-5 pelo grupo que recebeu saponina. Animais que receberam rLci2B-NH6, isoladamente ou associado aos plasmídeos contendo inserto de IL-12, produziram IgG e IgG1 antígeno específicos e falharam também na produção de citocinas e proliferação celular. A utilização de saponina com esse antígeno induziu produção de IgG, IgG2a e IgG1, assim como de IFN-γ. Já o uso de ODN 1826, induziu a produção de IgG e IgG1, favoreceu a produção de IgG2a, mas falhou na indução de resposta imune celular significante. Por outro lado, animais que receberam plasmídeo codificando Lci2B e reforço com a proteína associada à saponina apresentaram uma resposta imune com predominância de anticorpos IgG2a e produção de IFN-γ por alguns animais, a qual não conferiu proteção contra infecção pelo parasito. Por fim, a utilização de quimeras de LAMP/Lci2-NT-5R-CT ou LAMP/Lci2-5R-CT induziu uma fraca resposta imune humoral, com produção de IgG, IgG1 e IgG2a por alguns animais. No entanto, a utilização da quimera LAMP/Lci2-NT-CT induziu proliferação celular e tendência a produção de IFN-γ. Em conclusão, nenhum dos cinco protocolos utilizados foi capaz de induzir uma resposta imune específica predominantemente celular do tipo Th1 ou capaz de conferir proteção contra infecção dos animais. / Visceral leishmaniasis is a disease caused by Leishmania chagasi. Dogs are the main reservoir of the parasite. A canine vaccine may contribute to the desease control in humans and dogs. In a previous study, recombinant antigens were selected from a cDNA library of Leishmania chagasi amastigotes in order to be evaluated as components of a vaccine against canine visceral leishmaniasis. In this study, five immunization protocols were assessed in mice with some of these antigens. BALB/c mice were injected with either rLci4A-NH6 or rLci2B-NH6 proteins, associated or not with the adjuvants saponin, ODN 1826 and different doses of a plasmid encoding murine IL-12 (pIL-12). Moreover, animals were primed with a plasmid encoding Lci2B (pLci2B) and boosted with rLci2B combined with saponin. Finally, all mice were primed with new antigens, Lci2-NT-5R-CT or Lci2-NT-CT, and they were boosted with the following recombinant proteins rLci2-NT-5R-CT-NH6 or rLci2-NT-CTNH6 associated with saponin. In this late experiment, the used plasmids had an insert of a lisossome associated membrane protein, LAMP, to produce in vivo chimeras composed of LAMP with the antigens and to direct the presentation of the peptides to CD4+ T cell through MHC-II molecules. The humoral immune response was assessed by antibodies production (IgG, IgG1 and IgG2a) in animal serum samples and the cellular immune response by cellular proliferation and cytokine production (IFN-γ and IL-5). The results showed that animals that were injected with rLci4A-NH6 alone or combined with pIL-12 generated IgG and IgG1 specific antibodies, while others that received saponin and ODN 1826 as adjuvants produced IgG, IgG2a and IgG1. Furthermore, IL-5 was detected in rLci4A-NH6/saponin group, but only in one of two experiments. Animals that were injected with rLci2B-NH6, alone or associated with pIL-12, presented IgG and IgG1 antibodies but no cellular immune response. The saponin used as adjuvant induced IgG, IgG2a and IgG1 antibodies, as well as IFN-γ. The use of ODN 1826 induced IgG and IgG1, and favored IgG2a production, but failed in inducing IFN-γ. On the other hand, animals that were primed with pLci2B and boosted with the protein associated with saponin produced IgG IgG1 and more intensively IgG2a, and only some animals produced IFN-γ. Nevertheless, such immune response did not protect the animals against the parasite infection. At last, LAMP/Lci2-NT-5R-CT or LAMP/Lci2-5R-CT chimeras induced a weak humoral immune response, in which IgG, IgG1 and IgG2a antibodies were detected in only a few animals. However, mice that were injected with LAMP/Lci2-NT-CT presented cellular proliferation and some animals produced IFN-γ. In conclusion, in spite of the fact that the antigens are immunogenic in a murine model, none of the used protocols elicited an intense Th1 cellular immune response or a protective one.

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jessica_silva_ioc_mest_2015.pdf: 2328113 bytes, checksum: b930ef473cd389fd3c0702a994f45595 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus dengue é caracterizado por quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1 a 4), apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, em que o risco de desenvolvimento das formas graves está parcialmente relacionado com a resposta imune de reatividade cruzada a sorotipos heterólogos. Os alelos do antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I e classe II têm sido correlacionados com a susceptibilidade à dengue grave em diferentes populações. Neste estudo, nosso objetivo foi associar a frequência dos alelos do HLA de classe I e II de pacientes com dengue, caracterizados pela infecção por diferentes sorotipos e apresentando diferentes manifestações clínicas, com as frequências de células T produtoras de IL-2, IFN-g e Granzima B, e também com o perfil de ativação destas células em resposta ao antígeno total de DENV-2 (DENV-2 Ag). Utilizamos uma coorte de 60 pacientes naturalmente infectados de diferentes epidemias com prevalência de DENV-1, 2 e 4. Entre os pacientes, 36 deles foram classificados como dengue (FD) e 24 deles como FD com sinais de alerta mais graves (FDSA/Graves) de acordo com a OMS, 2009. A tipagem de alelos de HLA de classe I e II foi realizada utilizando Luminex de múltiplas análises (One Lambda, CA). As células de pacientes foram cultivadas com DENV-2 Ag (isolado de um paciente brasileiro) para a realização dos ensaios de FluoroSpot de IFN-\03B3/IL-2/Granzima B. Em seguida, recuperamos gentilmente as células após a estimulação e realizamos a marcação extracelular com marcadores de ativação (CD45RO, CCR7 e CD62L) por citometria de fluxo. Para as análises estatísticas os testes T pareado, não paramétrico Mann Whitney U, Wilcoxon e as análises com o RATE foram utilizadas Desta forma, a frequência gênica dos HLA classe I mais frequentes em nossa coorte de pacientes DENV+ (>5%) inclui 6 alelos HLA-A (A*02, A*30, A*24, A*03, A*23 e A*01), 7 alelos HLA-B (B*51, B*35, B*44, B*15, B*07, B*58 e B*40), e 7 alelos HLA-C (C*07, C*04, C*03, C*06, C*15, C*08 e C*05). Para o HLA de classe II, 4 alelos HLA-DQA1 (*01, *05, *03 e *02), 5 alelos HLA-DQB1 (*03, *02, *06, *05 e *04) and 8 alelos HLA-DRB1 (*13, *04, *03, *07, *11, *01, *15 e *16). Destes, 2 alelos foram associados com aumento da susceptibilidade (alelo HLA-A*03, p=0.024) ou resistência (alelo HLA-B*15, p=0.034) ao desenvolvimento de FDSA/Grave. Além disso, 6 alelos foram associados com contagem de plaquetas abaixo de 150 mil/mm3 (alelo HLA-B*35, p=0.02, HLA-C*04, p=0.04 e supertipo A03, p=0.003) ou acima de 150 mil/mm3 (HLA-DQA1*02, p=0.033, HLA-DRB1*07, p=0.022 e supertipo A24, p=0.03). Nós demonstramos um aumento de células T produtoras de IFN-\03B3 específicas ao DENV-2 Ag em pacientes FD, mas não em pacientes FDSA/Grave, em comparação com a condição de estímulo basal. No entanto, nenhuma reposta restrita a alelos de HLA foi associada com células produtoras de IFN-\03B3, mas o alelo HLA-C*03 foi associado com células T produtoras de Granzima B após estimulação com DENV-2 Ag. Por fim, também avaliamos a frequencia de subpopulações de linfócitos T A maior parte da resposta de linfócitos T CD4+ após estímulo com DENV-2 Ag foi da subpopulação de linfócitos T CD4 CD45ROposCCR7negCD62Lneg, caracterizado por linfócitos T de memória efetora/efetor. A ausência desta resposta foi associada ao alelo HLA-B*58. Portanto, corroborando estudos anteriores, a expressão de certas moléculas de HLA contribuem com a susceptibilidade ou proteção ao desenvolvimento de formas graves da doença. Além disso, dois dos alelos mais frequentes em nossa coorte de pacientes parecem estar relacionados com uma resposta imune de alta magnitude, e, portanto, uma possível resposta imunoprotetora / The dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV-1 to 4), characterized by a broad spectrum of clinical manifestations, in which the risk of developing the severe forms is partially related to the cross-reactive immune responses with heterologous serotypes. Human leukocyte antigen (HLA) class I and class II alleles have been correlated with susceptibility to severe dengue in different populations. In this study, our goal is to associate the HLA class I and II allele frequency from dengue patients, characterized by different serotypes infection and clinical outcomes, with the frequencies of the IL-2, IFN-g and Granzyme B-producing T-cells and also with the profile of activation of these cells in response to DENV-2 antigen. We proceeded in a cohort of 60 naturally infected patients from different epidemics with prevalence of DENV-1, 2 and 4. Among patients, 36 of them classified as dengue fever (DF) and 24 of them as DF with warning signs plus severe (DFWS/S) according to WHO 2009. The profile of HLA class I and II alleles were typed using a Luminex Multi-analyte profiling system (One Lambda, CA). Cells from patients were cultured with DENV-2 Antigen (DENV-2 Ag isolated from a Brazilian patient) for realizing IFN-\03B3/IL-2/Granzyme-B FluoroSpot assays. Then, we gently recovered these cells after stimulation and submitted them to the activation markers (CD45RO, CCR7 and CD62L) extracellular staining by flow cytometry assay The paired t test, nonparametric t test Mann Witney U, Wilcoxon and RATE analysis were used. Briefly, the genotypic frequency of the highly prevalent HLA class I found in our DENV-patients (>5%) included six HLA-A alleles (A*02, A*30, A*24, A*03, A*23 and A*01), seven HLA-B alleles (B*51, B*35, B*44, B*15, B*07, B*58 and B*40), and seven HLA-C alleles (C*07, C*04, C*03, C*06, C*15, C*08 and C*05). For HLA class II, four HLA-DQA1 alleles (*01, *05, *03 and *02), five HLA-DQB1 alleles (*03, *02, *06, *05 and *04) and eight HLA-DRB1 alleles (*13, *04, *03, *07, *11, *01, *15 and *16). These two alleles were associated with increased susceptibility (HLA-A*03 allele, p=0.024) or resistance (HLA-B*15 allele, p=0.034) to DFWS/Severe DENV clinical outcomes. Besides, six alleles were associated with platelets count bellow 150 mil/mm3 (HLA-B*35 allele, p=0.02, HLA-C*04, p=0.04 and supertype A03, p=0.003) or up 150 mil/mm3 (HLA-DQA1*02, p=0.033, HLA-DRB1*07, p=0.022 and supertype A24, p=0.03). We demonstrated an increased DENV Ag-specific IFN-\03B3-producing T cells in DF patients, but not in DFWS/Severe patients, in relation to unstimulated conditions. However, no HLA allele restricted responses were associated with the IFN-g-producing T cells, but HLA-C*03 allele was associated with the granzyme B-producing T cells following DENV-2 Ag stimulation. In the same series of experiment, we also tested the frequency T cells subsets The majority of the CD4+ T-cell responses after DENV-2 Ag stimulation were CD45ROposCCR7negCD62Lneg CD4 T-cells subsets, characterized by effector/effector memory T-cells. This response was mostly associated with HLA-B*58 allele. Therefore, confirming previous studies the expression of certain HLA molecules contribute with susceptibility to or protection from severe clinical outcome. Moreover, two of the most frequent alleles seen in our patients appear to be involved in a higher magnitude of immune response and therefore a more immunoprotective response

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_cuero_ioc_mest_2016.pdf: 2091495 bytes, checksum: 520eacc5a4964c1f22509ada51d4d97a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:44Z (GMT). No. of bitstreams: 3 monica_cuero_ioc_mest_2016.pdf.txt: 128716 bytes, checksum: 4fd30b67febb8c98bc54a69c0cccdcfd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monica_cuero_ioc_mest_2016.pdf: 2091495 bytes, checksum: 520eacc5a4964c1f22509ada51d4d97a (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A complexa diversidade genética do Plasmodium falciparum é em parte responsável pela evasão da resposta imune do hospedeiro, pelo surgimento da resistência aos fármacos e pela dificuldade no desenvolvimento de uma vacina anti-malárica eficaz. Estudos sobre a biologia deste parasito se concentram fundamentalmente em áreas holo e hiperendêmicas de malária na África subsaariana. Trabalhos realizados na região Amazônica, ainda são escassos no que se refere à diversidade genética de populações naturais de P. falciparum. Este estudo analisou a diversidade genética de P. falciparum isolados de indivíduos provenientes da região do médio rio Negro, Amazonas utilizando como alvo o gene que codifica para a proteína de superfície do merozoíta 2. METODOLOGIA: O estudo foi realizado em Barcelos, um município de alto risco epidemiológico para malária com uma média anual de 5.000 casos nos últimos cinco anos (IPA médio=156,4/1000). Foram avaliadas 79 amostras isoladas de indivíduos que apresentaram malária clínica ou infecção assintomática. Os DNAs genômicos extraídos foram submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR) para a confirmação do diagnóstico de infecção pelo P. falciparume em seguida foi feita uma PCR-nested, para amplificação da região do bloco 3 do gene msp2 para diferenciação das famílias alélicas (3D7 e FC27) e a diversidade intra-família foi observada após digestão com a enzima HinfI RESULTADOS: Só foi encontrada a familia 3D7 nas amostras estudadas. Dois diferentes genótipos foram encontrados circulando na área, caracterizados pela combinação dos fragmentos 16 pb, 108 pb, 349 (genotipo 1) e 16 pb, 108 pb, 400pb (genotipo 2). Foi observado que só dois indivíduos com malária clinica portavam os dois genótipos simultaneamente. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas ao comparar a presença de genótipos com sexo, grupos de idade, área rural ou urbana, antecedentes de malária previa e o desfecho clinico dos indivíduos (p>0,05). CONCLUSÕES: O estudo do polimorfismo do gene msp2 tem se mostrado como uma ferramenta útil para o estudo da diversidade genética do P. falciparum. No município de Barcelos a diversidade genética desde parasito foi limitada mostrando só a presença de dois genótipos circulantes e em poucos casos uma multiplicidade da Infecção de dois parasitas simultáneamente / The complex genetic diversity of Plasmodium falciparum is partly responsible for the evasion of the host immune response, the emergence of drug resistance and the difficulty in developing an effective anti-malarial vaccine. Studies on the biology of this parasite are mainly concentrated in holo and hyperendemic malaria areas in sub-Saharan Africa. Research in the Amazon region, is scarce in relation to the genetic diversity of natural populations of P. falciparum. This study analyzed the genetic diversity of P. falciparum isolates from individuals of the Middle Rio Negro, Amazon in Brazil, using the gene coding for the merozoite surface protein 2 (MSP2). METHODOLOGY: The study was conducted in Barcelos, a malaria high epidemiological risk municipality, with an annual average of 5,000 cases in the last five years (mean IPA = 156.4 / 1000). We evaluated 79 samples isolated from subjects presenting clinical malaria or asymptomatic infection. The extracted genomic DNA was subjected to polymerase chain reaction (PCR) to confirm the diagnosis of infection with P. falciparum. A PCR-nested was made for amplification of the gene msp2 block 3 region for differentiation of allelic families (3D7 and FC27); intrafamily diversity was observed after digestion with the enzyme HinfI RESULTS: Only family 3D7 was observed in the samples. Two different genotypes were found circulating in the area, characterized by the combination of fragments 16 bp, 108 bp, 349 (genotype 1) and 16 bp, 108 bp, 400bp (genotype 2). It was observed that only two individuals with clinical malaria carried two genotypes simultaneously. No statistically significant differences were found when comparing the presence of genotypes with sex, age groups (p>0,05). Only two individuals carried out two different genotypes simultaneously (MOI). CONCLUSIONS: The study of polymorphism of the msp2 gene has been shown to be a useful tool for the study of genetic diversity of P. falciparum. The genetic diversity and MOI is very limited in this area with the presence of only two circulating genotypes

FEITOSA, Neli Patricia Pereira. Imunoexpressão de marcadores de células -tronco, CD44 e CD133, no câncer gástrico primário e metástases linfonodais. 2015. 68 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-29T13:47:51Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_nppfeitosa.pdf: 1566891 bytes, checksum: c867b84a46d19b6c755515c32880e5be (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-29T13:50:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_nppfeitosa.pdf: 1566891 bytes, checksum: c867b84a46d19b6c755515c32880e5be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T13:50:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_nppfeitosa.pdf: 1566891 bytes, checksum: c867b84a46d19b6c755515c32880e5be (MD5) Previous issue date: 2015 / Gastric cancer is the fourth most common cancer worldwide, accounting for the second leading cause of cancer mortality. Despite treatment with surgery and chemotherapy, the overall five-year survival of patients with gastric cancer remains low. One possible explanation for the ineffectiveness of therapy is the presence of cancer stem cells, a subpopulation of tumor cells that have stem cell characteristics. It has been reported that these, as well as embryonic stem cells, are immortal, can self-renew and to differentiate to be transformed in any cell type in the body. Several markers, including CD44 and CD133, have been reported as stem cell markers in both normal and cancerous cells and have been used to isolate cancer cells from solid tumors. The aim of this study was to evaluate the expression of CD44 and CD133 in primary gastric cancer and lymph node metastases by immunohistochemical and to relate it to clinicopathologic variables as histological type, gender, age, anatomical site, tumor size, angiolymphatic invasion, infiltration perineural, TNM classification (TN) and lymph node involvement. This study was developed from a set of 72 cases of gastric adenocarcinoma, from the Archives of Pathology and Forensic Medicine of the Federal University of Ceará Service (DPML-UFC). Tissue microarray and immunohistochemistry were utilized, with anti-CD44 monoclonal antibody and polyclonal anti-CD133. The cases with one or more cells with cytoplasmic and / or membrane immunostaining were considered positives. It was observed that 30% of the samples were positive for CD44. No statistically significant differences were found between the clinical and pathological variables studied and the immunoreactivity of CD44. Regarding the immunoreactivity of CD133, the present study showed that 24% of samples were positive. The degree of tumor invasion presented data showing a statistically significant trend (p = 0.0505), in reverse. The other variables, we found no statistically significant difference. The immunoreactivity of CD133 in histologically normal mucosa was higher than in the primary tumor and intestinal metaplasia, with statistically significant difference (p = 0.0159 and p = 0.0058, respectively). The CD133 immunostaining in intestinal type gastric carcinoma was significantly higher than in the histologically normal mucosal metaplasia (p = 0.0260). The frequency of expression of these markers is highly variable, and even in the samples considered positive, the stained cells percentage is also variable, and very low overall. / O câncer gástrico é a quarta neoplasia mais comum em todo o mundo, representando a segunda causa de mortalidade por câncer. Apesar do tratamento com cirurgia e quimioterapia, a sobrevida global em cinco anos de pacientes com câncer gástrico permanece baixa. Uma possível explicação para ineficácia da terapia é a presença de células-tronco cancerosas, uma subpopulação de células tumorais que apresentam características de células-tronco. Estas células, assim como as células tronco embrionárias, são consideradas imortais, podem se auto-renovar e se transformar em qualquer célula do corpo. Vários marcadores, incluindo CD44 e CD133, têm sido relatados como marcadores de células-tronco, normais e cancerosas, e utilizados para isolar células cancerosas de tumores sólidos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de CD44 e de CD133, no câncer gástrico primário e metástases linfonodais, através de imunohistoquímica, e relacioná-la com as variáveis clínico-patológicas de tipo histológico, sexo, idade, localização anatômica, dimensão do tumor, invasão angiolinfática, infiltração perineural, classificação TNM (TN) e acometimento linfonodal. Este estudo foi desenvolvido a partir de um conjunto de 72 casos de adenocarcinoma gástrico, dos Arquivos do Serviço de Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará (DPML-UFC). Utilizou-se a técnica de tissue microarray asociada à imunohistoquímica com anticorpo monoclonal anti-CD44 e policlonal anti-CD133. Foram considerados positivos os casos que apresentaram uma ou mais células com imunomarcação citoplasmática e/ou membranar. Foi observado que 30% das amostras foram positivas para o CD44. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre as variáveis clínico-patológicas estudadas e a imunoexpressão de CD44. A imunoexpressão do CD133 foi positiva em 24% das amostras. O grau de invasão do tumor apresentou dados com tendência estatisticamente significante (p=0,0505), de forma inversa. Nas demais variáveis, não foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significante. A imunoexpressão de CD133 na mucosa histologicamente normal foi maior do que no tumor primário e na metaplasia intestinal, com diferença estatística significante (p=0,0159 e p=0,0058, respectivamente). A imunoexpressão de CD133 no adenocarcinoma gástrico tipo intestinal foi significativamente maior na mucosa histologicamente normal do que na metaplasia (p=0,0260). A frequência da expressão desses marcadores é muito variável, e mesmo nas amostras consideradas positivas, o percentual de células coradas também é variável, e em geral muito baixo.

Resumo não disponível

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017. / Submitted by Raiane Silva (raianesilva@bce.unb.br) on 2017-07-20T17:50:06Z No. of bitstreams: 1 2017_ElanePriscillaMaciel​.pdf: 1934684 bytes, checksum: 86424beedbeaa3ca6047a04bf26106ab (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-09-06T23:00:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ElanePriscillaMaciel​.pdf: 1934684 bytes, checksum: 86424beedbeaa3ca6047a04bf26106ab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T23:00:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ElanePriscillaMaciel​.pdf: 1934684 bytes, checksum: 86424beedbeaa3ca6047a04bf26106ab (MD5) Previous issue date: 2017-09-06 / As infecções do trato urinário são uma das principais causas de busca por atendimento médico, se definem como a invasão microbiana de qualquer órgão do trato urinário, que tem natureza estéril, desde a uretra até os rins. Escherichia coli, uma bactéria gram-negativa, comensal aos humanos, é o agente mais comum isolado em torno de 75 a 95% das infecções urinárias agudas de origem bacteriana. As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), essenciais nos eventos iniciais da infecção por atuarem como sentinelas e servirem de ponte entre a resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro. Assim, realizamos experimentos para entender a interação de DCs e UPECs. Para tal, DCs foram obtidas de monócitos do sangue periférico de doadores saudáveis, cultivadas na presença de IL-4 e GM-CSF e infectadas com as cepas V27 e J96 de UPECs por 24 horas. Observamos a capacidade das UPECs em infectar as DCs. Então as células foram analisadas por citometria de fluxo para avaliação da expressão de moléculas de superfície CD11c, CD1a, CD83, CD62L, CCR7, CD209, HLA-DR, CD86, CD80, CD40 e CD274. Após a interação DCs-UPECs observou-se diminuição de CD11c, diminuição de CD209 (DC-SIGN), tendência à diminuição da porcentagem e MFI da expressão de HLA-DR, aumento de CD80 e diminuição da média de espressão de CD86. A avaliação de morte celular demonstra que aparentemente a cepa V27 induz a morte por apoptose ou um processo de apoptose mais tardio nas DCs. Já a cepa J96 parece estimular uma tendência à morte por necrose ou apoptose tardia. Em conclusão, as UPECs regulam negativamente a expressão de DC-SIGN, moléculas co-estimulatórias como o CD86, além de regularem de forma diferente, a sobrevivência dessas células. / Urinary tract infections are one of the main causes of seeking medical attention, defined as the microbial invasion of any organ of the urinary tract, which has a sterile nature, from the urethra to the kidneys. Escherichia coli, a gram-negative bacterium commensal to humans, is the most common agent isolated in 75-95% of acute urinary tract infections of bacterial origin. Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs), essential in the early events of the infection by acting as sentinels and bridging the innate and adaptive immune response of the host. Thus, we perform experiments to understand the interaction of DCs and UPECs. To that end, DCs were obtained from peripheral blood monocytes from healthy donors cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF and infected with the VEC and J96 strains of UPECs for 24 hours. We observed the ability of UPECs to infect DCs. Cells were then analyzed by flow cytometry to evaluate the expression of surface molecules CD11c, CD1a, CD83, CD62L, CCR7, CD209, HLA-DR, CD86, CD80, CD40 and CD274. After the DCs-UPECs interaction, CD11c decreased, CD209 (DC-SIGN) decreased, tendency to decrease in percentage and MFI of HLA-DR expression, increase of CD80 and decrease in mean CD86 expression. Evaluation of cell death demonstrates that apparently the V27 strain induces death by apoptosis or a later apoptosis process in DCs. On the other hand, strain J96 seems to stimulate a tendency towards death by necrosis or late apoptosis. In conclusion, UPECs negatively regulate the expression of DC-SIGN, costimulatory molecules such as CD86, in addition to regulating the survival of these cells differently.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Anexos. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-26T16:10:44Z No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-08T19:10:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T19:10:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LorenaCarvalhodeSouzaChaves_Parcial.pdf: 2413443 bytes, checksum: c9dc564135b9d2985ba35dcfc919d239 (MD5) / Os baculovírus são vírus de insetos amplamente utilizados no controle biológico de pragas agrícolas e também como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas. Os baixos custos, a segurança na manipulação e as diferentes formas de expressão de proteínas tornam os baculovírus e células de inseto uma escolha eficaz para a correta expressão de antígenos vacinais e produção de VLPs (“Virus like particles”). No capítulo 1 deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo o EDIII (Domínio III da proteína de envelope do vírus da Febre amarela – FA) fusionado à proteína GP64 dos baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV); e também de uma massa protéica gerada pela fusão de EDIII com a proteína poliedrina de AcMNPV. O EDIII interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão das proteínas recombinantes (GP64 + EDIII e Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e confocal. No caso do EDIII fusionado à GP64 de AcMNPV e AgMNPV, as partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. O teste de proliferação de linfócitos indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparado com o controle LPS. Testes complementares serão feitos, para avaliar o perfil da resposta imunológica e confirmar a obtenção de um antígeno vacinal contra FA. No capítulo 2, o sistema baculovírus de expressão foi utilizado para expressar o precursor da proteína GAG (Pr55) de HIV-1. A expressão de Pr55 HIV-1 é suficiente para a montagem de VLPs na membrana plasmática da célula do hospedeiro. Porém, a proteína GP64 de baculovírus é altamente imunogênica e também é expressa na superfície de células infectadas e normalmente está presente na superfície da VLP. Neste trabalho, mostramos que não é possível separar BVs e VLPs produzidos em um mesmo ciclo de infecção por baculovírus mesmo usando diferentes metodologias de separação. Então, utilizando um sistema que consegue produzir baculovírus recombinantes livres de GP64, foi construído o vírus recombinante vGAGHIV-1 GP64 null e utilizado na infecção de células Sf9. Por Western blot foi observado a perda do sinal da proteína GP64 de baculovírus no extrato de células infectadas com esse vírus recombinante. Essas mesmas células foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando que mesmo quando GP64 não está presente (o que resulta na ausência de produção de BVs), o brotamento de VLPs continua a acontecer. Essa técnica mostrou-se eficiente para a produção de VLPs livres de partículas ou proteínas baculovirais. Este trabalho confirma a eficiência do uso do sistema de expressão baseado em baculovírus para a expressão de proteínas e VLPs de interesse famacológico. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are insect viruses widely used in the biological control of agricultural pests and as a tool for heterologous protein expression. Their low production costs, security in manipulation and the many ways of protein expression, make baculoviruses and insect cells an effective choice for the efficient expression of vaccine antigens and VLPs (Virus like particles) production. In chapter 1 of this work, it was evaluated the immunogenic potential of recombinant BVs (Budded virus) containing EDIII (Yellow fever virus -YF- envelope protein domain III) fused to the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) GP64 protein; and also of a protein mass generated by the fusion of the EDIII and AcMNPV polyhedrin protein. The EDIII interacts with cell receptors and contains epitopes recognized by neutralizing antibodies, being the target for the production of a subunit vaccine. We showed in this work the confirmation of the correct recombinant protein expression (GP64 + EDIII and Polyhedrin + EDIII) by Western blot, optical and confocal microscopy. In the case of the EDIII fused with AcMNPV and AgMNPV GP64, the recombinant viral particles were purified and inoculated in mice. The lymphocyte proliferation assay showed a higher proliferation in mice immunized with recombinant virus containing the EDIII fused with the GP64 from the AgMNPV baculovirus comparing to the LPS control. Complementary assays will be carried out in order to evaluate the immunological response pattern and to confirm the production of a vaccine antigen against YF. In chapter 2, the baculovirus expression system was used to express the GAG protein precursor (Pr55) of HIV-1. The Pr55 expression is sufficient to VLP assembly on the cell host plasma membrane. However, the GP64 baculovirus protein is highly immunogenic and is also expressed on the surface of infected cells and is also present on the surface of the VLP. In this work, we showed that is not possible to separate BVs and VLPs produced in the same baculovirus infection cycle using different separation methodologies. Then, using a system able to produce GP64 free recombinant baculovirus, the recombinant virus vGAGHIV-1 GP64 null was produced and used to infect Sf9 cells. By Western blot analyses, it was shown that the baculovirus protein GP64 signal was missing in the recombinant virus infected cell extract. These same cells were observed by transmission electron microscopy (MET), showing that even when the GP64 is absent (which results in the absence of BVs production), VLPs budding continues to happen. This technique was shown to be efficient for VLPs production, free of baculvirus particles or proteins. This work confirms the efficiency of the baculovirus expression system for protein expression and VLPs of pharmacological interest.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-07T15:37:54Z No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-27T14:15:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T14:15:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LeonardoAssisdaSilva.pdf: 45220811 bytes, checksum: 82b91a980d6f3f5f5fc0367dde4e22b2 (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA de dupla fita circular que infectam insetos, inicialmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado. Hoje, os baculovírus têm sido utilizados amplamente para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo utilizados como potenciais vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero. Entretanto, são capazes de penetrar nessas células, além de apresentarem propriedades imunoestimulatórias. Deste modo, inúmeras proteínas de importância médica e econômica foram expressas em níveis elevados aplicando desse sistema. Atualmente, não existem indústrias ou empresas nacionais disponíveis para a produção escalonável do antígeno de superfície HBsAg. Perante disso, os insumos são importados tanto para fins vacinais como para o diagnóstico. A vacina anti-rábica altualmente é constituída por suspensões de vírus purificados e inativados com β- propiolactona, representando um risco de manipulação. Portanto, a produção de proteínas virais recombinantes permitiu o desenvolvimento e métodos de diagnóstico e vacinas mais seguras. Neste trabalho foram construídos baculovírus recombinantes contendo os genes do antígeno HBsAg de HBV e de um peptídeo imunogênico derivado da glicoproteína do vírus da Raiva (Pept/G), fusionados à proteína poliederina (POLH) do baculovírus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). As proteínas recombinantes foram expressas em inseto e culturas de células na forma de agregrados protéicos cristalinos. A proteína recombinante contendo o antígeno HBSAg foi reconhecida por anticorpos anti-HBsAg em testes de imunoensaio (EIA) comerciais. A protéina recombinante contendo o Pept/G foi capaz de estimular o sistema immune de camundongos com sucesso, verificado por meio da proliferação celular in vitro. Desta forma, é possível concluir que proteínas recombinantes derivadas de vírus humanos fusionadas à protéina POLH de baculovírus são uma alternativa para a produção destes antígenos. / Baculovirus are circular double-stranded DNA viruses that infect insects and initially used only as biological control agents for being able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 1970s and 1980s, its potential as a tool for the expression of heterologous proteins began to be explored. Today, baculoviruses have been used extensively to express antigens for vaccine production, diagnostics and even as potential vectors for gene therapy and DNA vaccines. Their biosafety isguaranteed by the fact that baculoviruses are not able to replicate in mammalian cells. However, they can enter these cells and present immunostimulatory abilities. In this way, numerous proteins of medical and economic importance have been expressed at high levels applying this system. Currently, there are no Brazilian-based companies available to produce HBsAg surface antigen in a large scale, and the supplies to produce both vaccines and diagnostic kits are imported from other countries. The rabies vaccine currently consists of purified and inactivated virus suspensions with β-propiolactone, representing a health risk from its manipulation. Therefore, the use of recombinant proteins from viruses allowed the development of safer diagnostic methods and vaccines. In addition, this strategy may reduce the cost of vaccine manufacturing and eventually, contribute towards disease control. In this work, we constructed two recombinant baculoviruses; one containing of sHBsAg antigen gene of HBV and second recombinant containing an immunogenic peptide derived from the rabies virus glycoprotein (Pept/G). Both were fused to the polyhedrin protein (POLH) of the baculovirus Autrographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Recombinant proteins were expressed in insect cells and in insects in the form of crystalline protein aggregates. The recombinant protein containing the HBSAg antigen was used in commercial immunoassay (EIA) tests and was recognized by the anti-HBsAg antibodies. A recombinant protein containing Pept/G could successfully stimulate the immune system of mice which was verified by cell proliferation in vitro. Thus, it is possible to conclude that recombinant proteins derived from human viruses fused to the baculovírus POLH protein are an alternative to produce diagnostic tests and possible subunit vaccines.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-09T18:12:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JanaínadoNascimentoLimaMatiasdePaula.pdf: 7173674 bytes, checksum: 7c990900f97d3592a318d5a455f033bc (MD5) / A estratégia de humanização de anticorpos tem sido eficiente para melhorar o uso clínico desses biofármacos. Porém, a manipulação da cadeia polipeptídica, eventualmente, leva a uma perda de afinidade, reduzindo sua eficácia. Este estudo é uma continuação dos testes necessários para a melhoria da afinidade de ligação, de um anticorpo humanizado pelo Grupo de Imunologia Molecular da UnB. Em trabalhos anteriores descritos pelo grupo, um anticorpo anti-CD3 humanizado para fins clínicos, foi comparado com o anticorpo original murino quanto a sua capacidade de ligação ao antígeno humano CD3. Os resultados sugeriram que parte da afinidade foi perdida durante o processo de humanização. Então, este estudo visa compreender a interação química e estrutural entre o anti-CD3 humanizado e seu antígeno. Para isto, foram realizadas mutagêneses sítio-dirigidas por PCR overlap, no anticorpo humanizado, com base na estrutura cristalina do complexo OKT3-CD3, que identificou a participação de ligação dos resíduos de aminoácidos chave envolvidos na ligação. Os anti-CD3 com as mutações de interesse foram produzidos em células de ovário de hamster chinês (CHO) na forma de fragmento de anticorpo FvFc (scFv ligado diretamente aos domínios CH2-CH3 de IgG 1 humana). Purificamos estas proteínas e, em paralelo, produzimos um CD3 de cadeia única recombinante usando um sistema de expressão de antigenos solúveis em bactéria. Os anticorpos mutados e o antígeno, serão usados em testes de afinidade, competição, bloqueio e proliferação usando as técnicas de ELISA e FACS. O mapeamento detalhado dos resíduos chave envolvidos intimamente com a ligação ao antígeno, permitirá o desenvolvimento mais eficaz de anticorpos anti-CD3 para uso clínico no futuro. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The strategy of antibody humanization has been effective in improving the clinical use of biopharmaceuticals. Thus, the manipulation of the polypeptide chain, eventually leads to an affinity loss, reducing its effectiveness. This study is a continuation of the tests needed to improve the binding affinity of an antibody humanized by the Group of Molecular Immunology, UnB. In previous work described by the group, a humanized anti-CD3 antibody for clinical purposes, was compared with the original murine antibody and its ability to bind to the human CD3 antigen. The results suggested that part of the affinity was lost during the process of humanization. So, this study aims to understand the chemical and structural interaction between the anti-CD3 humanized antibody and its antigen. With this pourpose, we performed site-directed mutagenesis in the humanized antibody, based on the crystal structure of the complex CD3-OKT3 (a murine monoclonal antibody), which identified the participation of key binding residues involved in binding. Some amino acids residues of the humanized anti-CD3, were selected and modified by PCR overlap. Mutants were produced Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in the form of antibody fragment FvFc (a scFv linked to human IgG1 CH2-CH3 domains). We purified this protein and in parallel, produced a scFv CD3  recombinant expression system that permits the purification of soluble bacterial antigens. The recombinant molecules will be used in assays for affinity, competition, blocking and proliferation using the ELISA and FACS. The detailed mapping of key residues intimately involved with binding to the antigen, will allow the development of more effective anti-CD3 antibody for clinical use in the future.