Nous avons mis en place au cours de ce travail de thèse différentes stratégies permettant d'améliorer l'efficacité thérapeutique des adénovirus (Ad) oncolytiques contre différents types de tumeurs. Une première stratégie a été de combiner un inhibiteur d'histone-désacétylase, l'acide valproique (VPA) avec un Ad oncolytique à capside sauvage E1Δ24 (CRAd) dans le traitement de carcinomes côliques. Nous avons dans un premier temps démontré que la combinaison du CRAd et du VPA permettait une diminution plus importante de la survie des cellules cancéreuses côliques comparé au simple traitement basé sur le CRAd ou le VPA in vitro mais aussi in vivo.De plus, nous avons observé que cet effet n'était pas lié à une meilleure réplication du CRAd par le VPA. En effet, le VPA provoquait un ralentissement de la réplication virale à des temps précoces mais ne modifiait pas la production virale. Nous avons également découvert que le co-traitement CRAd+VPA conduisait à une forte inhibition de la croissance cellulaire mais aussi à une mort cellulaire non apoptotique. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que les cellules co-traitées par le CRAd et le VPA affichaient une forte polyploïdie accompagnée d'une augmentation de la phosphorylation de l'histone H2AX, un marqueur de dommages à l'ADN. Une deuxième stratégie a été de fournir aux Ad oncolytiques de nouvelles voies d'entrée afin d'infecter et de détruire plus efficacement des cellules de carcinomes rénaux réfractaires à l'infection adénovirale. Nous avons démontré que les CRAd à hexon modifié porteurs d'un ligand CKS-17 (Ad-HCKS-17-E1Δ24) ou à fibre modifiée de sérotype 3 (AdF3-E1Δ24) étaient capables d'infecter et de tuer plus efficacement ces cellules qu'un CRAd à capside sauvage in vitro. Malheureusement in vivo, les modifications de capside n'ont permis ni d'améliorer l'entrée des CRAd dans les tumeurs rénales, ni d'améliorer leur efficacité anti-tumorale. Cependant, nous avons observé qu'après administration intra-tumorale, les Ad à capside modifiée présentaient un plus faible tropisme hépatique comparé à un Ad à capside sauvage.

La fièvre aphteuse (FMD pour Foot-and-mouth disease en anglais) est une maladie très contagieuse touchant les animaux biongulés. Elle provoque des dégâts économiques considérables sur toute la surface du globe. La fièvre aphteuse est provoquée par un virus, le FMDV. Il s'agit d'un virus à ARN simple brin, de polarité positive appartenant au genre Aphtovirus dans la famille Picornaviridae. Ce virus se réplique et se propage dans l'hôte très rapidement. Dans les zones infectées, les deux principales stratégies de contrôle utilisées sont l'abattage systématique des animaux infectés et la vaccination. A l'inverse, les vaccins ne sont pas utilisés dans les zones sans FMDV, mais l'apparition d'une épidémie nécessite des stratégies pour arrêter ou au moins limiter la diffusion du virus. Actuellement, les vaccins inactivés sont les vaccins les plus utilisés pour prévenir la maladie. Cependant, ils requièrent une production à grande échelle du virus, et malgré les mesures mises en place (laboratoire sécurisé, etc), des épidémies ont été provoquées par le passé du fait de la fuite de virus FMDV. De plus, il est difficile de distinguer les animaux infectés des vaccinés (DIVA). Il est donc nécessaire de développer de nouveaux vaccins. Au cours de l'infection, la polyprotéine du virus est clivée par des protéases virales en précurseurs structural (P1) et non structuraux (P2 et P3). La protéase 3C est responsable de la majorité des clivages ; ainsi, le précurseur P1 est clivé par la 3C en trois protéines structurales, VP1, VP3 et VP0, formant le protomère de FMDV, l'unité de base de la capside virale. La protéine VP1 joue des rôles importants dans l'attachement, la protection et le sérotypage. Du fait de la présence d'un site antigénique linéaire suffisant à la protection par production d'anticorps neutralisants, VP1 est considérée comme la protéine la plus immunogénique du virus. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau vaccin contre la FMD, basé sur l'adénovirus canin de type 2 (Cav2). L'évaluation du transfert de gène médié par Cav2 chez le porc et le bétail in vitro montre des résultats prometteurs pour le développement de vaccins pour ces espèces, notamment l'expression des antigènes de FMDV par les candidats vaccins Cav2-FMDV. L'immunogénicité de ces candidats vaccins a été montrée chez les modèles murins et cobayes. De plus, des résultats encourageants ont été observés chez le cobaye, suggérant que la réponse immunitaire élicitée par les vecteurs recombinants pouvait conduire à une protection partielle des animaux après épreuve. Cependant, une optimisation de l'immunisation doit être faite dans le but de confirmer ces résultats. Ce type de vaccin peut de plus être utilisé comme vaccin marqueur, car il ne contient aucune protéine non structurale. / Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious and economically devastating disease affecting cloven-hoofed livestock worldwide. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is the causative agent of FMD and one of the most infectious known animal viruses. FMDV is a positive-sense, single-stranded RNA virus belonging to the Aphthovirus genus in the Picornaviridae family. FMDV replicates and spreads in the host extremely rapidly. Slaughter and vaccination are the two major strategies used to control FMD in infected countries. In FMDV-free countries, vaccines are not used, and once the disease breaks out in these areas, strategies are required to stop or at least slow the spread of the virus. Currently, inactivated vaccines are by far the most commonly used vaccines to prevent FMD. Such vaccines, however, require large-scale production of virus, and despite the use of bio-safety facilities, vaccine production has led to inadvertent virus release and FMDV outbreak. Another limitation of inactivated vaccines is the difficulty in distinguishing between infected and vaccinated animals (DIVA). Therefore, improved vaccines need to be developed.During infection, the FMDV polyprotein is cleaved into structural (P1) and non-structural (P2 and P3) precursors by a viral protease. The non-structural 3C protein is the protease that is responsible for most of the maturation events. The P1 precursor is processed by 3C protease into three structural proteins, VP1, VP3 and VP0, forming the FMDV protomer. The VP1 protein plays important roles in attachment, protective immunity and serotype specificity. VP1 is considered to be the major immunogenic protein, as it contains a linear antigenic site that is able to induce neutralizing antibodies that suffice to protect animals against the disease.In this project, we developed a novel vaccine against FMD, based on canine adenovirus type 2 (Cav2). In vitro evaluation of Cav2 mediated gene transfer in pigs and cattle showed that the Cav2 vector holds promise for the development of vaccines for pigs and cattle. Study of these recombinant viruses indicated that Cav2-FMDV supported expression of FMDV capsid proteins in vitro. The immunogenicity of these recombinant viruses was evidenced in mouse and guinea pig models, and encouraging results in guinea pigs suggested that the immune response elicited against FMD by recombinant virus could afford partial protection against FMDV challenge. In the future, immunization with Cav2-derived vector should be optimized to confirm these preliminary results. This type of vaccine, when designed to express capsid but not non-structural proteins of FMDV, can serve as a marker vaccine against FMD.

Certains adénovirus humains (HAdV) comme le sérotype 3 (appartenant au sous-groupe B) sont capables de former des particules pseudo-virales composées des deux protéines impliquées dans l’entrée virale : la base du penton et la fibre (= penton). En effet, 12 pentons sont capables de s’auto-assembler de manière symétrique pour former des particules appelées dodécaèdres (Dd). Dans le présent travail, nous avons modifié et caractérisé les dodécaèdres bases (c’est à dire des Dds sans fibres) de l’HAdV3 afin d’en faire une plateforme vectorielle multi-épitopique versatile appelée ADDomer (ADenovirus Dodecamer). Pour cela, nous avons identifié des régions de la base du penton permettant l’insertion de peptides d’intérêt et créé une plateforme génétique générique permettant l’insertion facile de ceux-ci par biologie synthétique. L’insertion de séquences codant un peptide d’intérêt directement dans le gène de l’ADDomer, résulte dans son exposition de manière multivalente à la surface de la VLP du fait de la pentamérisation puis de la dodécamérisation de la base. L’ADDomer a été produit et caractérisé afin d’évaluer sa capacité à vectoriser des épitopes linéaires ou structuralement complexes. Nous avons ensuite conçu une deuxième stratégie de vectorisation, toujours basée sur l’ADDomer mais cette fois-ci en utilisant l’interaction base/fibre. Un peptide mimant la partie de la fibre de l’HAdV3 (les 20 résidus N-terminaux) interagissant avec la base du penton a été élaboré pour servir d’adaptateur formant des liaisons covalentes avec l’ADDomer.Le comportement de l’ADDomer in vivo a été étudié dans un contexte vaccinal. Pour cela, nous avons injecté l’ADDomer chez la souris afin de valider son transport vers le système lymphatique. Nous avons également démontré que l’ADDomer était capable de s’internaliser dans les monocytes et dans des cellules dendritiques dérivées de monocytes et d’induire les caractères spécifiques de maturation de ces dernières. Fort de ces résultats, nous avons généré un ADDomer vectorisant un épitope du virus Chikungunya décrit pour être la cible d’anticorps neutralisants de patients infectés par ce virus. Pour finir cette étude in vivo, nous avons évalué la capacité de l’ADDomer-TevChik à induire la réponse anti-épitopique et nous avons ainsi démontré que la façon dont l’épitope est présenté à la surface de l’ADDomer était importante pour obtenir une réponse significative. / Some human adenoviruses (HAdV) such as adenovirus derived from serotype 3 (belonging to subgroup B) are able to form virus-like particles composed of the two proteins involved in viral entry: the penton base and the fiber (= penton). Indeed, 12 pentons are able to self-assemble in a symmetrical manner to form penton dodecahedron (PtDd). In the present work, we modified and characterized the base dodecahedron (BsDd = PtDd without fiber) of HAdV3 in order to create a versatile multi-epitopic platform named ADDomer (ADenovirus Dodecamer). We have created a genetic platform allowing easy insertion of epitope(s) of interest (s) thanks to synthetic biology. The insertion of sequences encoding a peptide of interest in the ADDomer gene enable a multivalent exposure at the surface of the VLP due to the pentamerization then to the dodecamerization of the penton base. ADDomer has been produced and characterized to assess its ability to vectorize linear or structurally complex epitopes. We then designed a second vectorization strategy, still based on the ADDomer, but using the interaction penton base / fibre. A peptide mimicking the part of the Ad3 fiber interacting with the penton base (the 20 N-terminal residues) has been designed to serve as an adaptor forming covalent bonds with the ADDomer.The behavior of the ADDomer in vivo has been studied in a vaccine context. For this, we injected the ADDomer in mice to validate its transport to the lymphatic system. We have also demonstrated that ADDomer is able to internalize monocytes and dendritic cells derived from monocytes (MoDC) and induces the specific characters of MoDC maturation. Based on these results, we generated an ADDomer vectorizing an epitope of the Chikungunya virus (ADDomer TevChik) described to be the target of neutralizing antibodies of patients who have been infected by this virus. To conclude this in vivo study, we assessed the ability of ADDomer TevChik to induce the anti-epitopic response and thus demonstrated that the way the epitope is displayed on the surface of the ADDomer was important to obtain a meaningful response.

L'interférence ARN est un processus biologique permettant la dégradation d'un ARN messager par un ARN double brin de courte taille spécifique de cet ARNm. Elle a un potentiel d'application en thérapie antivirale pour peu que les ARN interférents (ARNi) soient délivrés efficacement in vivo. Dans le genre Morbillivirus, on trouve des pathogènes importants en santé publique et vétérinaire tels que le virus de la rougeole et les virus de la peste des petits ruminants (PPR) et de la peste bovine. Il n'existe aucun traitement contre les infections à morbillivirus. L'objectif de ce travail était d'évaluer la possibilité d'administrer in vivo un ARNi actif contre le virus PPR in vitro. Une formulation basée sur des liposomes complexés avec des ARNi ou un adénovirus non réplicatif exprimant des ARN courts en tête d'épingle (shARN) ont été testés chez des chèvres dans un modèle d'épreuve infectieuse avec une souche virulente de PPR. Les différences observées n'étaient cependant pas significatives au plan statistique. Pour améliorer la délivrance par vecteur viral, nous avons comparé un autre vecteur de type baculovirus qui s'est avéré plus efficace in vitro que l'adénovirus précédent. Par ailleurs, nous avons testés in vitro également deux peptides capables de pénétrer dans les cellules. L'un d'entre eux, le Perfect 6 (PF6) a presque complètement inhibé l'expression du gène de la nucléoprotéine par le virus PPR. En revanche, l'autre (PF14) a été moins efficace mais a relativement mieux résisté à l'inhibition de son activité par la présence de fortes concentrations de sérum dans le milieu. Dans le but d'évaluer in vivo ces nouveaux systèmes de délivrance en s'affranchissant du modèle chèvre lourd et couteux à mettre en œuvre, nous avons initié une stratégie de mise au point d'un modèle non infectieux de suivi dynamique de l'interférence ARN chez la souris par imagerie in vivo. Dans ce travail, nous montrons qu'il est possible de mesurer et de standardiser l'expression d'un gène rapporteur comprenant une séquence du virus PPRV et ensuite de quantifier le niveau de dérégulation de l'expression induit par un ARNi dirigé contre le virus PPR. Après calibration, ce modèle est désormais pour tester différents systèmes de délivrance de siRNA chez la souris / RNA interference (RNAi) is the process of mRNA degradation that is induced by double-stranded RNA in a sequence-specific manner. RNAi has a potential of developing into an effective and specific antiviral therapy if small interfering RNAs (siRNAs) can be efficiently delivered in vivo. Morbillivirus genus includes important pathogens of humans and animals, which include measles virus, peste des petits ruminants virus (PPRV) and rinderpest virus. No treatment exists for morbillivirus diseases. The aim of this work was the in vivo delivery of siRNA against PPRV infection. The delivery of siRNA by a liposome and short hairpin RNA (shRNA) by means of a replication deficient adenovirus was tested in goats which were later challenged with PPRV. However, significant therapeutic effects were not obtained. To find more efficient vectors, the PPRV inhibition efficiency of recombinant replication deficient adenovirus and a baculovirus expressing shRNA against nucleoprotein of PPRV were compared in vitro. The baculoviral vector was found to be more efficient. Similarly, two cell penetrating peptides (CPPs) were also compared and PepFect6 (PF6) could deliver siRNA NPPRV1 effectively in vitro resulting in an almost complete inhibition of N gene expression by PPRV. Another CPP, the PF14 though with lower transfection efficiency in vitro, was found to be relatively serum resistant compared to PF6. A small animal model for PPRV infection does not exist. Due to economic, ethical, and biosecurity issues involved with use of small ruminants, a strategy based on the use of a non-infectious mouse model and a dynamic follow up of siRNA treatment by live imaging was developed. We show in this work that it is possible to measure and standardize the expression of a bioluminescent reporter gene containing a PPRV sequence and thus, to quantify a down-regulation of such gene by siRNA against PPRV. After some calibration, siRNA delivery can now be tested in this mouse model for comparing various delivery vectors in vivo.

La pollution de l'air est l'un des principaux problèmes de santé publique de notre siècle et surtout de l'air intérieur alors que nous passons environ 90% de notre temps dans des environnements fermés. Parmi les polluants les bioaérosols ont été peu étudiés. Cependant des études épidémiologiques ont déjà montré une relation entre les bioaérosols et la santé. Le but de cette thèse est d’étudier les virus respiratoires dans les milieux clos via les systèmes de ventilation. A l’issue d’un état de l’art des polluants de l’air, il est important de définir ceux nécessitant d’être traités, les systèmes de ventilation, les procédés de filtration par médias fibreux et les procédés de traitement pouvant être mis en oeuvre. Les effets des bioaérosols viraux dans les environnements intérieurs sur la santé publique ont été discutés dans une revue bibliographique. Une méthodologie a été mise en oeuvre pour étudier le comportement des virus dans une centrale de traitement de l’air (CTA). Les virus respiratoires, mengovirus (virus nu à ARN de la même famille que les rhinovirus responsables du rhume) et adénovirus (virus respiratoire nu à ADN), ont été choisis et étudiés dans un système expérimental miniature représentatif des systèmes de traitement d’air. La performance de filtration d’un filtre de CTA vis-à-vis des aérosols viraux a été évaluée avec une validation du système expérimental utilisé. Cette étude a montré la capacité des virus de passer à travers le filtre tout en restant infectieux. Peu de littérature existant sur le sujet, ce projet a permis d’ajouter de nouvelles données pertinentes quant à la persistance des virus respiratoires dans l’air intérieur et plus précisément au niveau des filtres dans les centrales de traitement d’air. / Air pollution is one of the major public health problems of our century and especially of indoor air as we spend about 90% of our time in closed environments. Among pollutants bioaerosols have been poorly studied. However, epidemiological studies have already shown a relationship between bioaerosols and human health. The aim of this PhD work is to learn about respiratory viruses in closed environments via ventilation systems in order to study indoor air quality. At the end of state of the art of air pollutants, it is important to define those present in the air that need to be treated, ventilation systems, filtration processes by fibrous media and the processing methods being able to be implemented. The effects of viral bioaerosols on public health in indoor environments were discussed and drafted in a bibliographic review. The methodology of the study was to assess the fate of respiratory viruses, mengoviruses and adenoviruses, in a miniature experimental system similar to air treatment systems used in closed environments. The experimental system used was validated and the filter performance against viral aerosols was investigated. This study presented originality for the characterization and the fate of two non-enveloped respiratory viruses, mengovirus (RNA) and adenovirus (DNA), in indoor environments and their fate on fiber glass filter. This study showed the ability of viruses to pass through the filter and to remain infectious upstream and downstream the filter. There is scarce literature on this subject, and this project allowed us to add new relevant data on the persistence of respiratory viruses in indoor air and more precisely at the level of filters in air handling units.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement efficace des Hémopathies malignes. Cependant, les complications des allogreffes parmi lesquelles les infections virales sont associées parfois à une morbidité et une mortalité importantes. Ces infections surviennent en l’absence de reconstitution immunitaire. Un monitoring régulier de la charge virale des principaux agents infectieux impliqués est réalisé mais amène parfois à la mise en oeuvre abusive de traitements anti-viraux qui ne sont pas dénués de toxicité.Dans ce travail, nous proposons d’associer à ce monitoring un suivi régulier de la reconstitution immunitaire spécifique afin de cibler parmi les patients présentant une réactivation ceux qui nécessitent un traitement curatif de ceux qui pourront maîtriser l’infection par leur système immunitaire. Nous illustrons ce propos avec le virus d’Epstein Barr (EBV) et avons en cours une étude sur l’Adénovirus (ADV).Dans certains cas parfaitement ciblés, les traitements anti-viraux s’avèrent inefficaces. C’est pourquoi dans ce travail, nous présentons la mise au point d’une technique de grade clinique de production de lymphocytes T cytotoxiques anti-ADV (CTL anti-ADV) en condition GMP (Good Manufacturing Practice), grâce au système CliniMACS et au Cytokine Capture System de Miltenyi, afin de proposer une immunothérapie adoptive.Nous décrivons par la suite trois expériences cliniques de traitement compassionnel d’une infection ADV post-allogreffe de CSH. Enfin, nous présentons les résultats préliminaires de la production de CTL bispécifique anti-ADV et CMV / Hematopoietic stem cells Transplantation (HSCT) is a well recognized strategy for treatment of haematological malignancies. However, HSCT complications among which the viral infections a reassociated with high morbidity and mortality. These infections arise in the absence of immune reconstitution. Monitoring of viral reactivations after allogeneic HSCT is necessary, to identify patients at risk of viral infections, but not sufficient, as patients may be abusively treated. In this work we propose to combine viral DNA load assessment with specific immune monitoring to target patients who need to be treated. We report a retrospective study investigating EBV infection and EBV-specific immune recovery using the functional IFN Elispot assay in 40 allogeneic HSCT patients. We initiated a similar study with ADV which is pending. However, although patients are correctly targeted, anti-viral treatment is sometimes not effective. We present a study on the development of a complete clinical grade generation of Human anti-Adenovirus cytotoxic T cells in GMP (Good Manufacturing Practice) conditions, thanks to the system CliniMACS and the Cytokine Capture System, to propose an adoptive immunotherapy to the recipient.We describe afterwards three clinical experiments of treatment of an ADV infection after HSCT.Finally, we present the preliminary results of the anti-ADV and -CMV bi-specific CTL production.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La myopathie myotubulaire (XLMTM, OMIM 310400) est causée par des mutations dans le gêne MTM1 situé sur le chromosome X et apparaît à une fréquence de 1/50 000 naissances mâles. Les patients présentent une hypotonie et une faiblesse musculaire généralisées et de graves problèmes respiratoires à la naissance. En absence de traitement, les patients sont nombreux à décéder durant la première année de vie. Mon travail de thèse consiste à développer un traitement de thérapie génique pour la myopathie myotubulaire. L'injection intraveineuse du vecteur thérapeutique rAAV9-DES-Mtm1 chez le modèle murin de la myopathie myotubulaire permet d'obtenir de la protéine transgénique dans l'ensemble des muscles squelettiques de l'organisme. Un an après le traitement, les muscles malades retrouvent une morphologie normale et les souris sont en vie. La seconde partie porte sur l'évaluation des effets de la protéine MTMR2, un homologue de la myotubularine (MTM1), sur le muscle déficient en myotubularine, comme alternative à la thérapie génique avec MTM1. L'administration d'un vecteur AAV comportant le transgène MTMR2 dans le muscle malade améliore, partiellement, le phénotype musculaire. Ces résultats suggèrent que l'augmentation du niveau d'expression de MTMR2 dans le muscle malade pourrait être un traitement efficace. Enfin j'ai étudié le rôle de l'activité phosphatase de la myotubularine dans son action thérapeutique. J'ai comparé l'effet d'une forme inactive de myotubularine (MTMIC375S) à celui du transgène thérapeutique sur le muscle atteint de myopathie myotubulaire. Les résultats montrent que l'activité phosphatase de la myotubularine est nécessaire pour son activité thérapeutique.