Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-24T02:14:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 252589.pdf: 2798460 bytes, checksum: 501e918e31f92d430b708d8a9d588dda (MD5) / O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da microinjeção de antagonista dos receptores AMPA (a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolproprionato) no Núcleo Accumbens (NAcc) sobre a emocionalidade e ingestão de alimento em ratos Wistar fêmeas. Investigou-se, no experimento 1, se a microinjeção de DNQX (6,7-Dinitroquinoxalina-2,3-diona), na concha e no centro do NAcc, poderia alterar o nível de ansiedade e a aprendizagem emocional dos animais no Labirinto em Cruz Elevado(LCE), um modelo animal de ansiedade (AP entre +1,08 e +2,16mm anterior ao bregma). Os resultados do Experimento 1 mostraram que a administração bilateral de DNQX (330 e 660ng) na concha do NAcc induziu um efeito do tipo ansiolítico, uma vez que houve um aumento na exploração dos braços abertos do LCE quando comparado às fêmeas que receberam a microinjeção de veículo. A microinjeção de 660ng de DNQX na concha também foi capaz de aumentar a exploração dos braços abertos em relação aos animais que receberam a mesma microinjeção no centro, indicando que o bloqueio dos receptores AMPA é ansiolítico apenas na concha do NAcc. A microinjeção de DNQX, tanto na concha quanto no centro, não prejudicou a aprendizagem emocional, pois os animais apresentaram um aumento na esquiva dos braços abertos na 2ª exposição em relação à primeira exposição ao LCE. Além disso, não houve alteração no número de entradas nos braços fechados, em qualquer uma das exposições no LCE, sugerindo que a microinjeção da droga não prejudicou atividade locomotora do animal. Já o experimento 2 teve como objetivo avaliar se a microinjeção de CNQX (6-Ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona; 2,5 e 5,0 nmol/lado), em ambos os sitios do NAcc, poderia induzir efeito ansiolítico e hiperfagia em fêmeas submetidas a um teste de ingestão de alimento. Os resultados do experimento 2 mostraram que a microinjeção de CNQX (5,0 nmol/lado) na concha, mas não no centro do NAcc (AP, +1.08 to +2.04), induziu efeito do tipo ansiolítico em relação aos ratos que receberam amicroinjeção de veículo, uma vez que os animais exibiram baixo nível de avaliação de risco na caixa de ingestão. O efeito ansiolítico, induzido pela dose de 5,0nmol de CNQX, na concha, não deve ser atribuído a alterações na atividade motora dos animais já que a frequência da locomoção e dos comportamentos de exploração vertical e de auto-limpeza não foram modificados após a microinjeção da droga. Entretanto, CNQX, em qualquer um dos sítios, não foi capaz de alterar a ingestão de alimento ao longo de 1h ou 24h depois da administração da droga. Os dados sugerem que o bloqueio dos receptores AMPA na concha do NAcc deve alterar, de forma diferenciada, os comportamentos defensivos e de ingestão de alimento.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T05:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 251125.pdf: 818028 bytes, checksum: da250f7004be5c38103ebbfd5873e03a (MD5) / O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos psiquiátricos mais comuns em crianças e adolescentes, afetando cerca de 2 a 12% das crianças em idade escolar. A linhagem de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) tem sido utilizada como principal modelo animal para o estudo deste transtorno, já que estes animais apresentam características comportamentais (hiperatividade, impulsividade e prejuízo atencional) e neuroquímicas semelhantes às observadas neste transtorno em humanos. Trabalhos recentes demonstraram que a administração de cafeína, um antagonista adenosinérgico não seletivo, reverteu os prejuízos apresentados pelos ratos SHR nas tarefas de aprendizado espacial e de memória social. Sendo assim o objetivo do presente estudo foi caracterizar o prejuízo apresentado por ratos SHR machos e fêmeas na tarefa de reconhecimento de objetos quando comparados aos ratos Wistar (WIS). Investigamos ainda o efeito agudo do metilfenidato, cafeína e de antagonistas seletivos de receptores adenosinérgicos na idade adulta e também o efeito da administração repetida de metilfenidato e cafeína na idade adulta ou durante a adolescência. Os resultados demonstraram que os ratos WIS discriminam todos os objetos apresentados, enquanto que os ratos SHR discriminam apenas os objetos com grandes diferenças estruturais. Foi também observado que o tratamento intraperitoneal com metilfenidato (2 mg/kg), cafeína (1-10 mg/kg), antagonistas adenosinérgicos seletivos para receptores A1 - DPCPX (5 mg/kg), antagonistas adenosinérgicos seletivos para receptores A2A - ZM241385 (1 mg/kg) e também a associação de doses não efetivas de DPCPX (3 mg/kg) + ZM241385 (0,5 mg/kg) na idade adulta reverteram o prejuízo apresentado pelos ratos SHR na tarefa de reconhecimentos de objetos, sem alterar a atividade locomotora ou a hipertensão apresentada por esses animais. Além disso, o tratamento repetido de metilfenidato (2 mg/kg) ou cafeína (3 mg/kg) durante a idade adulta ou durante a adolescência reverteram de forma persistente o prejuízo apresentado nesta tarefa pelos ratos SHR, no entanto a administração de ambas as drogas durante a adolescência causou prejuízo na capacidade discriminatória dos ratos WIS quando testados na idade adulta. Surpreendentemente não ocorreram diferenças entre as linhagens, na expressão de receptores adenosinérgicos do subtipo A1 e A2A avaliada através da técnica de imuno-histoquímica. Estes resultados sugerem que o desempenho dos ratos SHR na tarefa de reconhecimento de objetos parece estar relacionado com prejuízos no aprendizado discriminatório, aos déficits atencionais e não com a capacidade de armazenar informações. O presente estudo demonstra também que os antagonistas seletivos e não seletivos de receptores adenosinérgicos revertem o prejuízo apresentado pelos ratos SHR, sendo que os efeitos da administração repetida destas drogas podem persistir mesmo após o termino do tratamento, sugerindo assim o potencial destas drogas para o tratamento dos prejuízos cognitivos associados ao TDAH. Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most common childhood psychiatric disorders, affecting between 2 and 12% of primary-school children. The spontaneously hypertensive rat (SHR) is considered a genetic model for the study of this disorder since it displays behavioral and neurochemical characteristics of ADHD. Recent studies demonstrated that administration of the non selective adenosine receptor antagonist caffeine improved memory impairments in SHR rats. Therefore the objective of this study was to investigate whether adult male and female SHR exhibit altered short-term object recognition abilities compared to Wistar rats (WIS). The acute effects of methylphenidate, caffeine, or selective adenosine receptor antagonists in the performance of adults WIS and SHR rats in the object recognition task and the effects of repeated administration of methylphenidate and caffeine in adult age and adolescence were also evaluated. The results show that WIS rats displayed discrimination ability for all the objects employed while, SHR only discriminated #distinct# pairs of objects, they were not able to discriminate pairs of objects with subtle structural differences. In addition, the acute intraperitoneal (i.p.) injection of methylphenidate (2 mg/kg), caffeine (1#10 mg/kg), the selective adenosine A1 receptor antagonist DPCPX (5 mg/kg), the selective adenosine A2A receptor antagonist ZM241385 (1.0 mg/kg) or association with low doses with DPCPX (3 m/kg) and ZM242385 (0,5 mg/kg), reversed the impairment of object recognition in SHR, without altering the locomotion or hypertensive state. The repeated treatment with methylphenidate (2 mg/kg) and caffeine (3 mg/kg) in the adult age or in adolescence improved the object recognition deficits in the SHR rats. However, in WIS rats these treatments during adolescence impaired the recognition task. Interestingly, no major differences in the immunoreactivity of adenosine A1 and A2A receptors were observed in brain areas of WIS and SHR rats. These findings suggest that the previously described inability of SHR in cognitive paradigm may not be associated with their capacity to store information for short-term periods but rather may reflect discriminative learning impairments associated with attentional deficits. The present work also shows that selective and non selective adenosine receptors antagonists improved the cognitive impairment in SHR rats. Moreover, the effects of repeated administration of these drugs were persistent after the end of treatment, suggesting the potential of adenosinergic drugs for the treatment of cognitive impairment associated to ADHD.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2013-04-03T17:21:22Z No. of bitstreams: 1 Claudia_Valeria_de_Araujo.pdf: 3901306 bytes, checksum: 6449c70c8037ebc0049d5989078927c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-03T17:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claudia_Valeria_de_Araujo.pdf: 3901306 bytes, checksum: 6449c70c8037ebc0049d5989078927c0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A regulação deficiente da resposta inflamatória do indivíduo aos produtos microbianos é crucial para a mortalidade de paciente com SIRS (síndrome da resposta inflamatória sistêmica) e sepse. Vários mediadores inflamatórios são liberados e a regulação da expressão destes mediadores é crítica para a defesa do hospedeiro, mas também pode resultar em dano tecidual, disfunção orgânica múltipla e morte. Estratégias anti-inflamatórias são investigadas no tratamento da sepse. Estudos têm focado em fatores transcricionais que possuem um interesse terapêutico, como receptor nuclear PPAR (receptor ativado por proliferador de peroxissomo do tipo gama). Nosso objetivo principal foi caracterizar o papel do PPARγ na sepse experimental. Foram feitas análises de sobrevida e parâmetros inflamatórios, como eliminação bacteriana, produção de mediadores inflamatórios e migração celular, além da avaliação da microcirculação cerebral 24 horas após a ligadura e punção cecal (CLP) em animais tratados com agonista de PPARγ (Rosiglitazona) 15 min após a indução de sepse. Observamos um aumento da sobrevida de camundongos submetidos à CLP e tratados com Rosiglitazona. Em animais submetidos à sepse grave, a Rosiglitazona foi igualmente eficaz em aumentar a sobrevida dos animais e induzir uma melhora no quadro clínico. Nos animais tratados com Rosiglitazona houve um aumento nos níveis plsmáticos de mediadores anti-inflamatórios como a IL-10 e CCL2 e decréscimo de mediadores pró-inflamatórios como TNF-α, IL-6 e de corpúsculos lipídicos, sem alteração da glicemia. Houve uma diminuição plasmática da quimiocina CXCL1 nos animais tratados com Rosiglitazona quando comparados ao grupo controle. Além disso, observamos um aumento na migração de neutrófilos peritoneaisl de animais submetidos à CLP e o pós-tratamento com Rosiglitazona foi capaz de reverter este efeito. Observamos que a Rosiglitazona diminuiu o número de unidades formadoras de colônias (UFC) do lavado peritoneal, que se correlacionou com o aumento no metabolismo oxidativo de células fagocíticas com a diminuição da taxa de mortalidade. Em um estudo in vitro com E.coli incubadas com ligantes de PPARγ observamos que não houve alteração do crescimento bacteriano, mostrando que a Rosiglitazona não parece ter um efeito direto sobre o patógeno. Em outro experimento in vitro com neutrófilos humanos incubados com LPS ou E. coli,a Rosiglitazona aumentou a eliminação bacteriana por estas células e levou a um aumento na formação de redes extracelulares de neutrófilos (NETs) por estas células. O antagonista do PPARγ, o GW9662 foi capaz de reverter este efeito. A Rosiglitazona também foi capaz de aumentar a liberação da proteína histona em polimorfonucleares (PMNs), um importante marcador na formação de NETs e o GW9662 reverteu este efeito. Nos experimentos de microcirculação cerebral, a Rosiglitazona diminuiu o rolamento, a aderência dos leucócitos no endotélio vascular, assim como a rarefação capilar, aumentando a perfusão tecidual cerebral. Estes efeitos foram independentes de alterações na pressão arterial média e frequência cardíaca. Nossos estudos indicam que a Rosiglitazona atuou em diversos parâmetros da fisiopatologia da sepse, modulando a resposta inflamatória, aumentando a eliminação bacteriana, melhorando o quadro clínico e diminuindo a mortalidade em camundongos sépticos. É de extrema importância o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na sepse, para que possa servir de potencial manobra ou intervenção terapêutica no futuro. / The defective regulation of the inflammatory response to microbial products is crucial in mortality rate of patients with SIRS (systemic inflammatory response syndrome) and sepsis. Several inflammatory mediators are released and the regulation in expression of these mediators is critical for host defense, but can also result in tissue damage, multiple organ failure, and death. Antiinflammatory strategies are investigated for sepsis treatment. Studies have been focusing on transcription factors with a therapeutic interest, such as the nuclear receptor PPAR γ (Peroxisome proliferator-activated receptors γ). Our main objective was to characterize the role of PPAR γ in experimental sepsis. Survival analyzes were performed, as well as the inflammatory parameters, such as bacterial clearance, inflammatory mediators productions and cellular migration. We assessed the brain microcirculation 24 hours after CLP in animals treated with Rosiglitazone. Our results have shown an increase in survival rate with Rosiglitazone treatment. In a model of severe sepsis Rosiglitazone was equally effective in increasing the survival rate accompanied by an improvement in clinical status. The Rosiglitazone treatment increased the inflammatory mediators levels, such as IL-10 and CCL2 with a decrease of pro-inflammatory mediators such as TNF-α, IL-6, as well as a decrease in lipid bodies formation. A reduction in chemokine CXCL1 was also observed in animals treated with Rosiglitazone compared to control groups. An increase of neutrophils migration was seen in the peritoneal cavity 24 hours after CLP and the Rosiglitazone post-treatment was effective into reversing this parameter. A reduced number of colony forming units (CFU) of peritoneal fluid was also observed in rosiglitazone treatment which was directly correlated with an increase in oxidative stress and survival rate. However, in our experiments we did not observed any alteration of animals blood glucose levels. In an in vitro study with E. coli incubated only with PPARγ ligands, no changes on bacterial growth was seen, demonstrating that Rosiglitazone by itself does not have an effect on the pathogen. In another experiment with human neutrophils incubated with LPS or E. coli in the presence of Rosiglitazone, we observed an increase in the extracellular bacterial clearance mediated by netosis. The PPAR γ antagonist, GW9662, was able to reverse this effect. Rosiglitazone also enhanced the release of histone protein in PMNs, an important marker of NETs formation, and this effect was abolished by GW9662. During the assessement of cerebral microcirculation, Rosiglitazone decreased leukocyte rolling and adhesion to the vascular endothelium, as well as the capillary rarefaction, resulting with an improvement of brain perfusion. It was supposed that these effects were independent of haemodynamic changes. Finally, our studies suggested that Rosiglitazone acts on several parameters in the pathophysiology of sepsis by modulating the inflammatory response, increasing the bacterial clearance, improving clinical score, and reducing mortality rate in septic mice. In addition, it is extremely important in the understanding of molecular mechanisms involved in sepsis syndrome, thus it might serve as a potential therapeutic intervention or maneuver in the future.

O antraz é uma doença infecciosa aguda grave, com uma taxa de mortalidade superior a 90% em sua forma respiratória, causada pelo Bacillus anthracis, uma bactéria altamente virulenta, que está desenvolvendo resistência e que tem potencial aplicação como arma biológica e agente de bioterrorismo. Nesse trabalho, a inibição de deidroshikimato desidratase do B. anthracis foi estuda por meio docking, dinâmica molecular e ensemble docking. Essa enzima é responsável por uma etapa chave na biossíntese de petrobactina, molécula através da qual o B. anthracis adquire ferro – micronutriente essencial para seu desenvolvimento e proliferação no hospedeiro. O docking de 25 compostos com ação inibitória conhecida na estrutura cristalográfica da enzima indicou interações importantes com os resíduos His144, His175, Phe211, Tyr217 (ligações de hidrogênio), Arg102 (ponte salina), His144 e Phe255 (interações π-π). Ligantes estruturalmente semelhantes ao cristalográfico (3,4-DHBA) foram docados adequadamente no sítio ativo, enquanto ligantes mais volumosos foram docados na entrada do sítio, resultando em baixa correlação entre as energias livres de ligação experimentais e os escores de docking (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360) e desvios de 23%, em média, frente ao experimental. Simulações de dinâmica molecular mostraram que essa proteína apresenta uma grande rigidez estrutural intrínseca, porém porções do seu sítio ativo, sobretudo da estrutura em forma de laço que o recobre, apresentaram flexibilidade significativa. A presença de ligantes induz a alterações conformacionais que proporcionam o alargamento do sítio e permitem a entrada de ligantes mais volumosos, indicando que o sítio cristalográfico era, de fato, muito restrito. A atividade inibitória aparenta estar relacionada com a formação de uma rede de ligações de hidrogênio entre os ligantes e resíduos do sítio ativo, sendo as principais entre grupos 3-OH do anel aromático dos ligantes e a His175; entre o grupo carboxílico e a Arg102 (ponte salina); entre o grupo 4-OH e a Phe211 e principalmente entre o grupo 5-OH e a His144, um resíduo importante no mecanismo enzimático. O ensemble docking em três estruturas extraídas das simulações de dinâmica molecular permitiu a aprimorar a correlação entre os escores de docking e atividade inibitória experimental, com R² = 0,363 e R-Pearson = 0,602 considerando a totalidade dos ligantes ou com R² = 0,8157 e R-Pearson = 0,903 considerando-se os dez ligantes mais potentes (contra R² = 0,5683 e R-Pearson = 0,754 na estrutura cristalográfica), evidenciando a necessidade de se considerar a flexibilidade do receptor para o docking adequado. Esse modelo linear juntamente com essa compreensão mais profunda dos mecanismos relacionados com a inibição dessa enzima permitirão o desenho e a triagem in silico de novas moléculas com potência e seletividade aprimoradas e com potencial aplicação como uma nova terapia contra o Bacillus anthracis. / Anthrax is a serious acute infectious disease with a mortality rate higher than 90% in its inhalational form. This disease is caused by Bacillus anthracis, a highly virulent bacterium that is developing resistance and which has potential application as a biological weapon and bioterrorism agent. In this work, the inhibition of dehydroshikimate dehydratase from B. anthracis was studied through docking, molecular dynamics and ensemble docking. This enzyme is responsible for a key step in the biosynthetic pathway of petrobactin, a molecule released by B. anthracis to acquire iron, an essential micronutrient for its development and proliferation within the host. Molecular dockings of 25 compounds with known inhibitory activity against dehydroshikimate dehydratase in the crystallographic structure of this enzyme indicated important interactions with the residues His144, His175, Phe211, Tyr217 (hydrogen bonds), Arg102 (salt bridge), His144 and Phe255 (π-π interactions). Ligands structurally similar to the crystallographic (3,4-DHBA) were appropriately docked within the active site, while bulkier ligands were docked at the site's entrance, resulting in a low correlation between the experimental binding free energies and the docking scores (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360), as well as a deviation of 23%, on average, compared to the experimental data. Molecular dynamics simulations showed that this protein has a high structural rigidity, however portions of its active site, especially the loop-like structure that covers it, showed a significant mobility. The presence of ligands induced conformational changes that lead to the widening of the site and allowed bulkier ligands to enter it, what indicates the crystallographic site was, in fact, very restricted. The inhibitory activity appears to be related with the formation of a network of hydrogen bonds between ligands and active site residues, mainly between the 3-OH moiety in the aromatic ring of ligands and His175; between the carboxylic group and Arg102 (salt bridge); between the 4-OH moiety and Phe211 and specially between the 5-OH group and His144, a residue with an important role in the enzymatic mechanism. Ensemble docking with three structures extracted from molecular dynamics simulations allowed to improve the correlation between docking scores and experimental inhibitory activity, with R² = 0,363 and R-Pearson = 0,602, when considering all ligands, and R² = 0,8157 and R-Pearson = 0,903 when considering the ten ligands of higher activity (against the values of R² = 0,5683 and R-Pearson = 0,754 for their docking in the crystallographic structure). This point out the need to account for receptor's flexibility for an appropriate docking. This linear model coupled with this deeper understanding about the mechanisms related with enzymatic inhibition will allow the in silico drug design and screening of new molecules with improved potency and selectivity and with potential application as a new therapy against Bacillus anthracis.

O antraz é uma doença infecciosa aguda grave, com uma taxa de mortalidade superior a 90% em sua forma respiratória, causada pelo Bacillus anthracis, uma bactéria altamente virulenta, que está desenvolvendo resistência e que tem potencial aplicação como arma biológica e agente de bioterrorismo. Nesse trabalho, a inibição de deidroshikimato desidratase do B. anthracis foi estuda por meio docking, dinâmica molecular e ensemble docking. Essa enzima é responsável por uma etapa chave na biossíntese de petrobactina, molécula através da qual o B. anthracis adquire ferro – micronutriente essencial para seu desenvolvimento e proliferação no hospedeiro. O docking de 25 compostos com ação inibitória conhecida na estrutura cristalográfica da enzima indicou interações importantes com os resíduos His144, His175, Phe211, Tyr217 (ligações de hidrogênio), Arg102 (ponte salina), His144 e Phe255 (interações π-π). Ligantes estruturalmente semelhantes ao cristalográfico (3,4-DHBA) foram docados adequadamente no sítio ativo, enquanto ligantes mais volumosos foram docados na entrada do sítio, resultando em baixa correlação entre as energias livres de ligação experimentais e os escores de docking (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360) e desvios de 23%, em média, frente ao experimental. Simulações de dinâmica molecular mostraram que essa proteína apresenta uma grande rigidez estrutural intrínseca, porém porções do seu sítio ativo, sobretudo da estrutura em forma de laço que o recobre, apresentaram flexibilidade significativa. A presença de ligantes induz a alterações conformacionais que proporcionam o alargamento do sítio e permitem a entrada de ligantes mais volumosos, indicando que o sítio cristalográfico era, de fato, muito restrito. A atividade inibitória aparenta estar relacionada com a formação de uma rede de ligações de hidrogênio entre os ligantes e resíduos do sítio ativo, sendo as principais entre grupos 3-OH do anel aromático dos ligantes e a His175; entre o grupo carboxílico e a Arg102 (ponte salina); entre o grupo 4-OH e a Phe211 e principalmente entre o grupo 5-OH e a His144, um resíduo importante no mecanismo enzimático. O ensemble docking em três estruturas extraídas das simulações de dinâmica molecular permitiu a aprimorar a correlação entre os escores de docking e atividade inibitória experimental, com R² = 0,363 e R-Pearson = 0,602 considerando a totalidade dos ligantes ou com R² = 0,8157 e R-Pearson = 0,903 considerando-se os dez ligantes mais potentes (contra R² = 0,5683 e R-Pearson = 0,754 na estrutura cristalográfica), evidenciando a necessidade de se considerar a flexibilidade do receptor para o docking adequado. Esse modelo linear juntamente com essa compreensão mais profunda dos mecanismos relacionados com a inibição dessa enzima permitirão o desenho e a triagem in silico de novas moléculas com potência e seletividade aprimoradas e com potencial aplicação como uma nova terapia contra o Bacillus anthracis. / Anthrax is a serious acute infectious disease with a mortality rate higher than 90% in its inhalational form. This disease is caused by Bacillus anthracis, a highly virulent bacterium that is developing resistance and which has potential application as a biological weapon and bioterrorism agent. In this work, the inhibition of dehydroshikimate dehydratase from B. anthracis was studied through docking, molecular dynamics and ensemble docking. This enzyme is responsible for a key step in the biosynthetic pathway of petrobactin, a molecule released by B. anthracis to acquire iron, an essential micronutrient for its development and proliferation within the host. Molecular dockings of 25 compounds with known inhibitory activity against dehydroshikimate dehydratase in the crystallographic structure of this enzyme indicated important interactions with the residues His144, His175, Phe211, Tyr217 (hydrogen bonds), Arg102 (salt bridge), His144 and Phe255 (π-π interactions). Ligands structurally similar to the crystallographic (3,4-DHBA) were appropriately docked within the active site, while bulkier ligands were docked at the site's entrance, resulting in a low correlation between the experimental binding free energies and the docking scores (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360), as well as a deviation of 23%, on average, compared to the experimental data. Molecular dynamics simulations showed that this protein has a high structural rigidity, however portions of its active site, especially the loop-like structure that covers it, showed a significant mobility. The presence of ligands induced conformational changes that lead to the widening of the site and allowed bulkier ligands to enter it, what indicates the crystallographic site was, in fact, very restricted. The inhibitory activity appears to be related with the formation of a network of hydrogen bonds between ligands and active site residues, mainly between the 3-OH moiety in the aromatic ring of ligands and His175; between the carboxylic group and Arg102 (salt bridge); between the 4-OH moiety and Phe211 and specially between the 5-OH group and His144, a residue with an important role in the enzymatic mechanism. Ensemble docking with three structures extracted from molecular dynamics simulations allowed to improve the correlation between docking scores and experimental inhibitory activity, with R² = 0,363 and R-Pearson = 0,602, when considering all ligands, and R² = 0,8157 and R-Pearson = 0,903 when considering the ten ligands of higher activity (against the values of R² = 0,5683 and R-Pearson = 0,754 for their docking in the crystallographic structure). This point out the need to account for receptor's flexibility for an appropriate docking. This linear model coupled with this deeper understanding about the mechanisms related with enzymatic inhibition will allow the in silico drug design and screening of new molecules with improved potency and selectivity and with potential application as a new therapy against Bacillus anthracis.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:21:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monete_gomes_ioc_dout_2014.pdf: 17494099 bytes, checksum: f62cd38280e24c9b275f4d31899e443a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Protozoários são organismos unicelulares que causam várias doenças que atingem tanto humanos como animais. Essas doenças causam ônus econômicos principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Atualmente, não existem vacinas comercialmente disponíveis e não há tratamento eficaz para tais doenças. Isso se deve ao fato dos fármacos disponíveis apresentarem muitos efeitos colaterais e estarem propensos ao desenvolvimento de resistência. A maioria desses fármacos foi descoberta através da seleção de um grande número de compostos contra parasitas íntegros. Porém, nos últimos anos, uma nova abordagem vem ganhando espaço sob o termo de \201Cdesenho racional de fármacos\201D. Este termo representa a busca por compostos contra alvos moleculares específicos, visando diferença bioquímicas e fisiológicas entre o parasita e o hospedeiro. A era pós-genômica gerou uma grande quantidade de informações que vem permitindo a identificação de novos alvos. Neste contexto, a partir de dados dos proteomas de 23 protozoários dos gêneros Entamoeba, Giardia, Trichomonas, Trypanosoma, Leishmania, Cryptosporidium, Plasmodium, Toxoplasma, Babesia e Theileria, realizamos buscas para a identificação de enzimas isofuncionais não-homólogas (NISE) que possam ser futuramente priorizadas como alvos terapêuticos. Em nossa metodologia utilizamos a ferramenta AnEnPi localmente para buscar nas sequencias proteicas por enzimas funcionalmente análogas. Utilizando os dados provindos do KEGG, primeiro houve uma etapa de clusterização das estruturas primárias de todas as enzimas anotadas com o mesmo EC (Enzyme comission). Para isso utilizou-se uma pontuação (score) de similaridade no BLASTP de 120, como parâmetros de corte Encontramos 812 Ecs com mais de um cluster e 1778 com um único cluster. Após isso, foi realizado um passo de inferência funcional na qual um novo BLASTP foi feito e assumido como ponto de corte o e-value de 10-20. Nesse BLASTP foram comparadas todas as proteínas preditas nos protozoários contra todos os clusters. Desses dados identificamos, inicialmente, 54 potenciais NISEs, e a partir destes fizemos as validações no SUPERFAMILY manualmente. Confirmamos 24 ECs com casos de NISE como potenciais alvos para estudos futuros de validação deste e proposição de fármacos. Além disso, buscamos em 3 bancos de dados principais de alvos terapêuticos, TDTARGETS, TTD e PDTD pelos ECs identificados como possíveis alvos, e encontramos a ocorrência de algumas dessas enzimas já sendo estudadas como alvos. Além disso, selecionamos alguns casos de NISE de acordo com critérios estabelecidos por nós para modelagem comparativa através da ferramenta MODELLER, para a visualização da diferença em suas estruturas 3D. A maioria dos modelos obtidos, de acordo com os resultados dos programas de validação PROCHECK e ERRAT, precisaram ser refinados. Utilizamos a minimização de energia para tal tarefa através do portal KoBaMIN. Todas as enzimas modeladas tiveram diferenças ou na topologia geral, ou nos cofatores e coenzimas utilizados para sua atividade catalítica / Protozoa are unicellular organisms that cause several diseases affecting both humans and animals. These diseases cause economic burden mainly in subtropical and tropical regions. Currently there are no commercially available vaccines and there is no effective treatment for such diseases. This is because the available drugs present many side effects and are prone to development of resistance. Most of these drugs were discovered through the selection of a large number of compounds against entire parasites. However, in recent years, a new approach has been gaining ground within the term "rational drug design". This term represents the search for compounds against specific molecular targets, aiming biochemical and physiological differences between the parasite and the host. The post-genomic era has generated a large amount of information which has been enabling identification of new targets. In this context, from the proteomes data of 23 protozoa from genera Entamoeba, Giardia, Trichomonas, Trypanosoma, Leishmania, Crytptosporidium, Plasmodium, Toxoplasma, Babesia and Theileria, we perform searches to identify non-homologous isofunctional enzymes (NISE) that may be in future prioritized as therapeutical targets. In our methodology we use the tool AnEnPi locally to search in protein sequences for functionally analogous enzymes. Using the data from the KEGG, there was a first clustering step of all the enzymes primary structures annotated with the same EC (Enzyme Comission). For this we used a score similarity in BLASTP of 120 as cut-off. We found 812 EC with more than one cluster and 1778 with a single cluster. After this, we performed a functional inference step in which a new BLASTP was done and assumed as a cutoff the e-value of 10-20. On this BLASTP all protozoa predicted proteins were compared against all clusters. From these data we identify, initially, 54 potential NISEs, and from these we did the validation on SUPERFAMILY database manually. We confirmed 24 ECs with NISE cases as potential targets for future validation studies and proposition of drugs. In addition, we searched in 3 major databases of therapeutical targets, TDRTARGETS, TTD and PDTD for the ECs identified as possible targets, and we found the occurrence of some of these enzymes already have been studied as targets. Also we selected some cases of NISEs according to criteria settled by us to comparative modeling by MODELLER tool, for visualization of the difference in their 3D structures. Most models obtained, in accordance with the validation results from softwares PROCHECK and ERRAT, needed to be refined. We use minimizing energy for such task through the KoBaMIN portal. All enzymes modeled had differences or in the overall topology, or in the cofactors and the coenzymes used.

O antraz é uma doença infecciosa aguda grave, com uma taxa de mortalidade superior a 90% em sua forma respiratória, causada pelo Bacillus anthracis, uma bactéria altamente virulenta, que está desenvolvendo resistência e que tem potencial aplicação como arma biológica e agente de bioterrorismo. Nesse trabalho, a inibição de deidroshikimato desidratase do B. anthracis foi estuda por meio docking, dinâmica molecular e ensemble docking. Essa enzima é responsável por uma etapa chave na biossíntese de petrobactina, molécula através da qual o B. anthracis adquire ferro – micronutriente essencial para seu desenvolvimento e proliferação no hospedeiro. O docking de 25 compostos com ação inibitória conhecida na estrutura cristalográfica da enzima indicou interações importantes com os resíduos His144, His175, Phe211, Tyr217 (ligações de hidrogênio), Arg102 (ponte salina), His144 e Phe255 (interações π-π). Ligantes estruturalmente semelhantes ao cristalográfico (3,4-DHBA) foram docados adequadamente no sítio ativo, enquanto ligantes mais volumosos foram docados na entrada do sítio, resultando em baixa correlação entre as energias livres de ligação experimentais e os escores de docking (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360) e desvios de 23%, em média, frente ao experimental. Simulações de dinâmica molecular mostraram que essa proteína apresenta uma grande rigidez estrutural intrínseca, porém porções do seu sítio ativo, sobretudo da estrutura em forma de laço que o recobre, apresentaram flexibilidade significativa. A presença de ligantes induz a alterações conformacionais que proporcionam o alargamento do sítio e permitem a entrada de ligantes mais volumosos, indicando que o sítio cristalográfico era, de fato, muito restrito. A atividade inibitória aparenta estar relacionada com a formação de uma rede de ligações de hidrogênio entre os ligantes e resíduos do sítio ativo, sendo as principais entre grupos 3-OH do anel aromático dos ligantes e a His175; entre o grupo carboxílico e a Arg102 (ponte salina); entre o grupo 4-OH e a Phe211 e principalmente entre o grupo 5-OH e a His144, um resíduo importante no mecanismo enzimático. O ensemble docking em três estruturas extraídas das simulações de dinâmica molecular permitiu a aprimorar a correlação entre os escores de docking e atividade inibitória experimental, com R² = 0,363 e R-Pearson = 0,602 considerando a totalidade dos ligantes ou com R² = 0,8157 e R-Pearson = 0,903 considerando-se os dez ligantes mais potentes (contra R² = 0,5683 e R-Pearson = 0,754 na estrutura cristalográfica), evidenciando a necessidade de se considerar a flexibilidade do receptor para o docking adequado. Esse modelo linear juntamente com essa compreensão mais profunda dos mecanismos relacionados com a inibição dessa enzima permitirão o desenho e a triagem in silico de novas moléculas com potência e seletividade aprimoradas e com potencial aplicação como uma nova terapia contra o Bacillus anthracis. / Anthrax is a serious acute infectious disease with a mortality rate higher than 90% in its inhalational form. This disease is caused by Bacillus anthracis, a highly virulent bacterium that is developing resistance and which has potential application as a biological weapon and bioterrorism agent. In this work, the inhibition of dehydroshikimate dehydratase from B. anthracis was studied through docking, molecular dynamics and ensemble docking. This enzyme is responsible for a key step in the biosynthetic pathway of petrobactin, a molecule released by B. anthracis to acquire iron, an essential micronutrient for its development and proliferation within the host. Molecular dockings of 25 compounds with known inhibitory activity against dehydroshikimate dehydratase in the crystallographic structure of this enzyme indicated important interactions with the residues His144, His175, Phe211, Tyr217 (hydrogen bonds), Arg102 (salt bridge), His144 and Phe255 (π-π interactions). Ligands structurally similar to the crystallographic (3,4-DHBA) were appropriately docked within the active site, while bulkier ligands were docked at the site's entrance, resulting in a low correlation between the experimental binding free energies and the docking scores (R² = 0,1295; R-Pearson = 0,360), as well as a deviation of 23%, on average, compared to the experimental data. Molecular dynamics simulations showed that this protein has a high structural rigidity, however portions of its active site, especially the loop-like structure that covers it, showed a significant mobility. The presence of ligands induced conformational changes that lead to the widening of the site and allowed bulkier ligands to enter it, what indicates the crystallographic site was, in fact, very restricted. The inhibitory activity appears to be related with the formation of a network of hydrogen bonds between ligands and active site residues, mainly between the 3-OH moiety in the aromatic ring of ligands and His175; between the carboxylic group and Arg102 (salt bridge); between the 4-OH moiety and Phe211 and specially between the 5-OH group and His144, a residue with an important role in the enzymatic mechanism. Ensemble docking with three structures extracted from molecular dynamics simulations allowed to improve the correlation between docking scores and experimental inhibitory activity, with R² = 0,363 and R-Pearson = 0,602, when considering all ligands, and R² = 0,8157 and R-Pearson = 0,903 when considering the ten ligands of higher activity (against the values of R² = 0,5683 and R-Pearson = 0,754 for their docking in the crystallographic structure). This point out the need to account for receptor's flexibility for an appropriate docking. This linear model coupled with this deeper understanding about the mechanisms related with enzymatic inhibition will allow the in silico drug design and screening of new molecules with improved potency and selectivity and with potential application as a new therapy against Bacillus anthracis.

INTRODUÇÃO: A importância do parênquima pulmonar na piora funcional da asma tem sido recentemente investigada. Embora a ativação da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) amplifique a responsividade e o remodelamento das vias aéreas induzidos pela inflamação crônica, seu efeito no parênquima pulmonar não foi previamente estudado. OBJETIVO: Avaliar a influência do óxido nítrico derivado da iNOS na mecânica pulmonar, na inflamação e no processo de remodelamento no tecido pulmonar periférico de cobaias com inflamação pulmonar alérgica. MÉTODOS: Os animais foram submetidos a sete inalações com doses crescentes de ovalbumina (1~5 mg/mL) ou soro fisiológico por 4 semanas. As cobaias receberam 1400-W (inibidor específico de iNOS, intraperitoneal) ou veículo por 4 dias, iniciando 30 minutos antes da sétima inalação. Após 72h da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados e fatias de tecido pulmonar periférico foram retiradas e suspensas em banho orgânico de Krebs, e a resistência e elastância tecidual foram avaliadas em condição basal e após desafio com ovalbumina. Após, as fatias de tecido pulmonar periférico foram submetidas à avaliação histopatológica. RESULTADOS: Os animais expostos às inalações com ovalbumina apresentaram valores maiores de porcentagem de aumento da resistência e da elastância tecidual em relação ao basal após desafio com ovoalbumina no banho (p<0.05). Houve aumento no número de eosinófilos (p<0.001), nas células iNOS positivas (p<0.001), na deposição de fibras elásticas e colágenas (p<0.05), na densidade de actina (p<0.05) e na expressão de 8-epi-PGF2a (p<0.001) no septo alveolar. A administração de 1400-W reduziu todos estes parâmetros funcionais e morfológicos (p<0.05). CONCLUSÕES: Neste modelo experimental, o bloqueio específico da iNOS atenuou a constrição, a inflamação e o remodelamento no parênquima pulmonar. Estas alterações podem estar relacionadas aos efeitos do óxido nítrico na modulação da via do estresse oxidativo. O presente estudo sugere que a inibição específica da iNOS pode amplificar as estratégias terapêuticas utilizadas na abordagem de doenças inflamatórias crônicas pulmonares. / INTRODUCTION: The importance of lung parenchyma in functional asthma impairment has been recently addressed. Although the inducible nitric oxide synthase (iNOS) activation amplifies chronic inflammation-induced airway responsiveness and remodeling, its effect on lung parenchyma has not been previously investigated. OBJECTIVE: To evaluate the influence of iNOSderived NO in the pulmonary mechanics, inflammation, and remodeling processes in peripheral lung tissue of guinea pigs with pulmonary allergic inflammation. METHODS: Animals were submitted to seven ovalbumin exposures with increasing doses (1~5 mg/mL) or saline for 4 weeks. The guinea pigs received 1400-W (iNOS-specific inhibitor, intraperitoneal) or vehicle for 4 days, beginning 30 minutes before the 7th inhalation. At 72h after the 7th inhalation, animals were anesthetized, exsanguinated and peripheral lung tissue strips were retreat and suspended in a Krebs organ bath, and the tissue resistance and elastance were evaluated at baseline condition and after ovalbumin challenge. After that, strips were submitted to histopathological evaluation. RESULTS: The ovalbumin-exposed animals presented greater values of percentage of increase of tissue resistance and elastance related to baseline after ovalbumin challenge in the bath (p<0.05). There were increase in the number of eosinophils (p<0.001) and iNOSpositive cells (p<0.001), in collagen and elastic fiber deposition (p<0.05), in actin density (p<0.05) and in 8-epi-PGF2a expression (p<0.001) in the alveolar septa. The 1400-W administration reduced all these functional and morphological parameters (p<0.05). CONCLUSIONS: In this experimental model, the iNOS-specific blockage attenuated constriction, inflammation, and remodeling in the lung parenchyma. These alterations may be related to NO effects in the modulation of the oxidative stress pathway. The present study suggests that specific iNOS inhibition can amplify the therapeutics strategies used in the management in chronic inflammatory lung diseases.

O ergosterol é um componente responsável por manter a integridade e a fluidez das membranas de Leishmania spp. A partir de uma metodologia que consiste em seleção por superexpressão gênica, foram isolados nove diferentes loci de L. (L.) major relacionados com a resistência a dois inibidores da via de biossíntese do ergosterol: Terbinafina (TBF) e Itraconazol (ITZ). Análises funcionais individuais desses nove loci na presença de TBF e ITZ (ou do análogo Cetoconazol - CTZ) apresentaram níveis significantes de resistência após transfecção em células selvagens de L. (L.) major. Nesse trabalho apresentamos a metodologia de isolamento de um desses loci (cItz2), bem como a análise in silico das regiões cromossômicas correspondentes aos insertos dos nove cosmídios no genoma de L. (L.) major / Ergosterol is an important compound responsible to maintain integrity and fluidity of Leishmania spp. membranes. Starting from an overexpression/selection method, our group has isolated nine different loci of L. (L.) major related to resistance against two inhibitors of the ergosterol biosynthesis pathway, Terbinafine (TBF) and Itraconazole (ITZ). Individual functional analysis of these nine loci in the presence of TBF and/or ITZ (or the ITZ analog Ketoconazole, CTZ), have showed significant levels of resistance after transfection into L. (L.) major wild-type cells, followed by over expression induction. In this work, we show the insert mapping and chromosomal identification of one of these loci (cItz2), as well as discuss the in silico chromosomal analysis of the nine correspondent inserts in the L. (L.) major genome

O Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-alfa) possui um importante papel na imunopatogênese da psoríase e agentes biológicos, como os inibidores de TNF-alfa, têm apresentado bons resultados no tratamento desta. No entanto, estes agentes foram associados ao aumento de casos de reativação de tuberculose entre os pacientes que os utilizaram. Este estudo foi realizado com o intuito de avaliar a resposta imune de pacientes com psoríase grave, ativa, sem tratamento, frente a antígenos de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), e o efeito dos inibidores de TNF-alfa nesta resposta. Estudamos 24 pacientes com psoríase grave divididos em 2 grupos: não reatores (n = 14) e reatores (n = 10) ao teste intradérmico com PPD. Como controle, utilizamos um total de 26 indivíduos sadios, também separados em 2 grupos segundo a reatividade ao PPD (PPD-, n = 13; PPD+, n = 13). Em uma segunda etapa estudamos 11 pacientes com psoríase leve a moderada, também sem tratamento, PPD (-) para avaliarmos a importância da gravidade da psoríase na resposta aos antígenos micobacterianos. Avaliamos a resposta imunológica in vitro através da linfoproliferação, quantificação da produção de IFN-gama (ELISA) e quantificação de células produtoras de IFN-gama (ELISPOT), na presença e ausência dos inibidores de TNF-alfa (infliximab e etanercepte), utilizando os antígenos purificados ESAT-6, Ag85B e o antígeno bruto sonicado da cepa H37Rv (AgSMtb), e o mitógeno fitohemaglutinina (PHA). Os pacientes com psoríase grave PPD (-) apresentaram reposta linfoproliferativa e níveis de IFN-gama menores que nos controles PPD (-). Os pacientes com psoríase leve a moderada apresentaram resposta imune intermediária entre controles e pacientes graves. Em relação aos inibidores de TNF- alfa, verificou-se que infliximab e etanercepte apresentaram diferença em suas capacidades de inibição, sendo que somente o infliximab ocasionou a inibição total de TNF-alfa. Em contrapartida o etanercept manteve a produção de TNF-alfa, e em alguns casos elevou sua produção. Estes diminuíram apenas parcialmente a reatividade in vitro dos pacientes com psoríase, uma vez que a secreção de IFN-gama e o número de células produtoras de IFN-gama não foram alterados na presença dos inibidores. A secreção de IL-10 foi diminuída tanto na presença do infliximab, quanto na presença do etanercepte. Os dados obtidos permitem concluir que (a) os pacientes com psoríase grave PPD (-) apresentam uma baixa reatividade in vitro, principalmente das respostas que avaliam linfócitos T de memória central, aos antígenos de Mtb, sendo que essa baixa reatividade não está totalmente relacionada com a gravidade da doença, uma vez que os pacientes com psoríase leve a moderada apresentaram resposta intermediária a dos controles e pacientes com psoríase grave; (b) e que apesar dos inibidores de TNF- alfa promoverem uma inibição parcial da resposta imune, a reativação da tuberculose estaria mais relacionada à própria ausência de TNF-alfa, não compensada pela atuação isolada, e provavelmente insuficiente, de IFN-gama na manutenção do granuloma, do que a outras substanciais modificações na resposta imunológica frente aos antígenos micobacterianos. / Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) has a pivotal role in psoriasis pathogenesis and biologic agents, such as TNF-alpha inhibitors, have provided good results in its treatment. However, the use of these agents has been associated with an increase in the number of cases of tuberculosis reactivation. This study aimed to evaluate the immune response of severe psoriasis patients, with active, untreated disease to relevant Mycobcterium tuberculosis antigens, and the effect of the TNF-alpha inhibitors (infliximab and etanercept) in this response. Twenty four severe psoriasis patients were enrolled and divided in two groups according to their reactivity to the tuberculin skin test: TST (n= 14) and TST + (n=10). As controls, we studied 26 healthy donors, also divided in two groups to the TST reactivity (TST -, n=13; TST+, n=13). Eleven mild to moderate psoriasis patients, untreated, TST (-) were studied to evaluated the role of psoriasis severity in the immune response to the mycobacterial antigens. Immune responses were evaluated in vitro by the lymphocyte proliferative response (LPR) assay, ELISA for IFN-? secretion by peripheral blood mononuclear cells and enumeration of IFN-? secreted cells (ELISPOT) induced in response to the purified antigens ESAT-6, Ag85B and a crude sonicated antigen preparation from H37Rv Mtb strain (AgSMtb), as well as to the mitogen phytohemagglutinin (PHA), in the presence or absenceinflimab/etanercept. The LPR and IFN-g secretion to Mtb antigens were lower in TST- severe psoriasis patients than TST- controls. Mild to moderate psoriasis patients had intermediate responses, between controls and severe psoriasis patients. The TNF-a inhibitors infliximab and etanercept showed differences in their inhibitiory activity, since only infliximab was capable to neutralize all TNF-a. On the other hand, etanercept kept TNF-alpha production, and in some cases even increased its production. The TNF-alpha inhibitors diminished partially the in vitro patients immune responses, since the IFN-? secretion and enumeration of IFN-? secreted cells were not affected. IL-10 secretion was diminished with both TNF-a inhibitors. In conclusion: (a) TST(-) severe psoriasis patients have decreased in vitro reactivity, mainly in those responses that evaluate central memory T-cell responses, to Mtb antigens, and this decrease could not be fully explained by disease severity, since mild psotiasis patients had intermediate responses; (b) and despite the fact that TNF-alpha inhibitors promote a partial immune response inhibition, tuberculosis reactivation could be related more with the lack of TNF-alpha, which was probably not compensated by the IFN-g activity alone, probably insufficient, to the support granuloma formation, than other defects of the immune response to Mtb antigens.