L’évaluation de l’effet cytotoxique de différents jus de fruits naturellement riches en polyphénols vis-à-vis de quatre lignées de cancer colorectal a montré que le jus de la canneberge est particulièrement actif. En effet, les polyphénols de la canneberge induisent l’apoptose associée à une surexpression des deux facteurs de transcription pro-apoptotiques p73 et FOXO3a. Cette mort programmée est aussi associée à une diminution de l’expression de SIRT1 le déacétylateur de protéines non histone telles que p73, KU70, ou FOXO. D’autres événements précoces comme la production de ROS et les dommages à l’ADN connus pour réguler l’expression de SIRT1 ont été confirmés. Une deuxième étude avait pour objectif de valider le potentiel anticancéreux in vivo chez la souris Balb/C injectée de cellules d’adénocarcinome colique murin. Pour cela nous avons choisi le jus d’aronie noire qui a montré in vitro un profil de cytotoxicité intéressant. L’analyse des tumeurs a montré que l’administration de jus d’aronie entraine une réduction de la prolifération des cellules tumorales. Enfin, l’augmentation significative de la mobilité de LC3 suggère l’activation d’une mort cellulaire autophagique. Afin d’évaluer l’utilisation clinique des polyphénols, nous avons évalué les effets cytotoxiques des polyphénols de myrtille sur des lymphocytes, de patients atteints de LLC. Nos résultats montrent que l’extrait polyphénolique induit une apoptose dépendante du stress oxydant et impliquant aussi des protéines pro-apoptotiques dans des cellules de patients atteints de LLC mais pas dans les cellules de sujets sains. / The evaluation of the cytotoxic effect of different fruit juices, naturally rich in polyphenols, on four different colorectal cancer cell lines proved that cranberry juice was the most active. Indeed, cranberry polyphenols induce apoptosis associated with the overexpression of two important proapoptotic transcription factors, p73 and FOXO3a on one hand. Furthermore, it has been also correlated with a decrease in the expression of SIRT1, the deacetylase of several non-histone proteins such as p73, KU70 and FOXO. Other early events such as ROS production and DNA damage, which are known to regulate the expression of SIRT1 were confirmed. The second study aims at validating the potential anticancer effects in an in vivo model of colorectal cancer in BALB/c mice injected subcutaneously of murine colon adenocarcinoma cells. Accordingly, we chose the black chokeberry juice, which showed an interesting cytotoxic profile in vitro. The analysis of tumors demonstrated that the administration of chokeberry juice leads to a reduction in tumor cell proliferation. Finally, the significant increase in the mobility of LC3 suggests the activation of autophagic cell death. To validate the clinical use of polyphenols, we evaluated the cytotoxic effects of blueberry polyphenols on lymphocytes of CLL patients. Our results show that the polyphenolic extract induces an oxidative stress-dependent apoptosis that involve various pro-apoptotic proteins in cells of patients with CLL but not in healthy subjects.

Face aux problèmes de résistance aux médicaments actuels sur le marché, issus pour la grande part du milieu terrestre, les molécules isolées du milieu marin ont suscité un grand intérêt ces dernières années. Pour notre part, nous nous sommes intéressés au R1864-03, un macrocycle a 16 chaînons qui a été extrait d¿une éponge marine présente en Nouvelle Calédonie et qui possède des propriétés anticancéreuses. La synthèse de ce produit naturel a été envisagée à partir de deux fragments principaux, qui ont été rassemblés grâce à un couplage chimiosélectif de Suzuki. Dans un premier temps, une réaction intramoléculaire de Diels-Alder a été envisagée pour construire le motif cis- décaline du R1864-03 avant de réaliser le couplage des deux fragments. Suite à la mauvaise stéréosélectivité inverse observée pour la réaction de Diels-Alder intramoléculaire, une réaction de Diels-Alder transannulaire sur le macrocycle à 24 chaînons du R1864-03 a été envisagée. Nous avons pu accéder au précurseur de macrocyclisation, ayant le squelette carboné complet du R1864-03, en 16 étapes avec un rendement global de 4.2%. La macrocyclisation sur ce dernier, suivie de la Diels-Alder transannulaire semble avoir conduit au R1864-03 protégé ou à un diastéréoisomère. Ces étapes restent à optimiser et a réaliser sur plus grosse échelle pour pourvoir réaliser la détermination structurale complète du produit de Diels-Alder transannulaire et de compléter la synthèse totale du R1864-03. / Due to resistance problems faced by existent drugs on the market, originated most from terrestrial sources, a great attention has recently been devoted to marine natural products. In this context, we have been interested in the total synthesis of R1864-03, a new 16-membered macrolide isolated from a Caledonian marine sponge and with important anticancer properties. The synthesis of this natural product was designed around the chimiosélective Suzuki-Miyaura coupling of two main fragments. A key intramolecular Diels-Alder reaction was first planed to install the cis-decalin motif of R1864-03 to generate one of these fragments. Due to an inverse stereoselectivity of the intramolecular Diels-Alder reaction, a transannular Diels-Alder reaction on the 24-membered macrocycle of R1864-03 was considered. We have been able to obtain the macrocyclisation precursor with the complete carbon skeleton of R1864-03 in place in 16 steps (4.2% overall). Macrocyclisation of the latter, followed by the transannular Diels-Alder reaction, seems to have provided the protected R1864-03 or a diastereoisomer. These last steps have to be optimized and carried out on larger scale in order to achieve complete structural determination of the transannular Diels-Alder product and to complete the total synthesis of R1864-03.

Les cibles épigénétiques telles que les histones désacétylases (HDAC) sont étudiées comme nouveaux traitements anticancéreux, leur fonctionnement anormal étant associée aux processus cancéreux. De nombreux inhibiteurs de ces enzymes sont apparus tel que le SAHA ou le CI-994. Notre laboratoire a développé un nouvel analogue de la trichostatine A appelé NODH. Malgré leur activité anticancéreuse in vitro prometteuse, ces inhibiteurs souffrent de leur manque de solubilité, d'effets toxiques et de leur rapide métabolisation par l'organisme. Afin de pallier ces limitations, ces iHDAC peuvent être conjugués à des vecteurs capables de les transporter dans l'organisme et de les libérer une fois la cible tumorale atteinte. Ce travail de thèse a consisté dans un premier temps à développer des prodrogues acido-sensibles capable de libérer la substance active après endocytose par les cellules. Ces systèmes ont été appliqués aux trois iHDAC SAHA, CI-994 et NODH. Les prodrogues développées ont ensuite été accrochées sur des nanoparticules polymériques connues pour leur biocompatibilité et leur accumulation dans les tumeurs grâce à l'effet EPR. L'activité anticancéreuse de certaines nanoparticules a été validée par des tests in vitro et in vivo. Un deuxième travail a été entrepris concernant la préparation de prodrogues fluorescentes pH labiles capables de libérer la substance active et de moduler la fluorescence par la variation du pH. La dernière partie de ce travail a été consacrée à la mise au point d'une nouvelle méthode de synthèse par voie superacide potentiellement stéréosélective de benzofuranones nécessaires à la préparation d'analogues de NODH. / Epigenetic targets like histone deacetylases (HDAC) are studied as new anticancer treatments, their dysfunctioning being associated to cancer mechanisms. Several epigenetic target inhibitors have been developed like SAHA or CI-994. Our group has developed a new trichostatin A analogue called NODH. Despite their promising in vitro anticancer effect, these inhibitors suffer from lack of solubility, toxic effects and rapid clearance. These constrains make the HDACi good candidates for ligation to vectors able to carry them in the body and to release them when the tumor is reached. The first part of this thesis work has focused on the development of acid sensitive prodrugs able to release an active substance after cellular internalization by endocytosis. These systems were applied to three HDACi SAHA, CI-994 and NODH. These prodrugs were then conjugated to polymeric nanoparticles known for their biocompatibility and their accumulation in tumors exploiting the EPR effect. The anticancer activity of some nanoparticles has been validated by in vitro and in vivo tests. The second part of this work was carried out in order to prepare pH sensitive fluorescent prodrugs able to release the active molecule and to modulate the fluorescent effect by pH changes. The last part of this work was dedicated for the development of a new synthesis in suparacid potentially stereoselective of several benzofuranones required for the preparation of NODH analogs.

15N-based nuclear magnetic resonance techniques are considered very powerful to study the molecular properties of platinum-containing anticancer agents, these properties being responsible for the efficacy of the compounds, but also for the understanding of resistance mechanisms and toxicity. Therefore, the first part of the present work aimed to develop a new method for synthesizing 15N-labeled, chiral platinum compounds. A theoretical discussion on the nucleophilic ring-opening of aziridines has also been envisaged, rationalizing an interesting regiochemistry question. Indeed, a surprising inversion of regiochemistry arose during the development of the above-mentioned synthetic pathway, and density functional theory calculation brought a rational framework to the experimental findings.<p><p>Infrared spectroscopy probes the global chemical composition of a sample and has been used to produce a snapshot of cancer cells contents after treatment with platinum coordinates. Indeed, in vitro studies focused here on the use of modern spectroscopic methods to fingerprint the cellular impact of platinum complexes. These drug signatures help to classify and select promising compounds. It makes no doubt that such systemic approaches for compound discovery are helpful technologies. Also, we made the use of the COMPARE algorithm from the NCI, which analyzes similarity between any active compounds previously tested by the NCI large scale in vitro screening program of anticancer agents. <p><p>The last chapter aimed to study the interactions between a series of platinum coordinates and DNA. Binding mode to telomeric-like sequences and binding kinetics to genomic-like sequences were assessed to investigate any differences between the compounds and to gain insight into structure-activity relationships. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La chimiothérapie conventionnelle est principalement constituée d’agents pro-apoptotiques. Or, de nombreux cancers sont intrinsèquement résistants à l’apoptose et cela explique en grande partie les mauvais pronostics associés à certains cancers, dont les cancers métastatiques, en raison de leur résistance aux chimiothérapies pro-apoptotiques. La thématique de ce travail s’inscrit dans la recherche de molécules présentant des modes d’actions différents afin de vaincre les mécanismes de résistance des cellules cancéreuses. <p><p>Une nouvelle série de composés di- et trivanilliques a ainsi été déclinée. La structure de ces composés est inspirée de molécules naturelles divanilliques étudiées pour leurs propriétés anti-falciformation dans la drépanocytose. Notre stratégie a été de transposer l’activité présumée de ces composés sur le cytosquelette des érythrocytes falciformes au niveau de la prolifération et de la migration des cellules cancéreuses. A cette fin, des méthodes pour analyser l’activité antitumorale de cette série de nouveaux composés ont été mises en place.<p><p>In vitro, les composés que nous qualifions d’actifs inhibent la croissance d’une dizaine de populations cellulaires cancéreuses distinctes à des valeurs inhibitrices de croissance à 50 % (indice IC50) de l’ordre de 30 µM. Les dérivés trivanilliques se classent parmi les composés les plus actifs de la série, en particulier le composé trivanillique chloré 13c qui exerce un effet cytostatique sur les lignées cellulaires cancéreuses analysées tout en présentant un certain taux de biosélectivité vis-à-vis des cellules normales. Nous avons ainsi consacré une partie de ce travail à approfondir la compréhension du mécanisme d’action du composé 13c et à le comparer à ses analogues de synthèse pour tenter d’établir une relation de type structure-activité.<p><p>Le dérivé 13c est cytostatique car il interfère avec le processus mitotique et il inhibe à plus de 75 % l’activité de 26 kinases à la concentration de 2 µM qui est donc plus de dix fois inférieure à la concentration inhibitrice IC50 moyenne de 30 µM rapportée ci-avant. Huit de ces 26 kinases sont directement impliquées dans l’organisation du cytosquelette d’actine et notamment dans les processus de cytokinèse. Parmi les kinases dont l’activité est la plus fortement modifiée par le composé 13c figurent les Aurora kinases qui sont de puissants contrôleurs de la cytokinèse. Nos résultats montrent également que l’activité cytostatique du composé 13c entraînant une désorganisation du cytosquelette d’actine pourrait être induite non seulement par l’inhibition de l’activité de certaines kinases mais aussi par des modifications induites par ce produit au niveau de l’homéostasie du calcium intracellulaire.<p><p>L’efficacité des agents chimiothérapeutiques est souvent altérée par une résistance tumorale intrinsèque appelée résistance multidrogue (le phénotype MDR). In vitro, le composé 13c s’est montré tout aussi efficace sur des lignées cancéreuses possédant cette résistance multidrogue que sur des cellules cancéreuses sensibles aux agents chimiothérapeutiques. De même, diverses lignées cellulaires résistantes aux stimuli pro-apoptotiques sont également sensibles à l’activité inhibitrice de croissance in vitro du trivanillate 13c. <p><p>Enfin, l’activité du composé 13c a été testée in vivo sur un modèle de pseudométastases pulmonaires issues du mélanome B16F10 murin. Les tumeurs pulmonaires présentent une cible intéressante pour le composé 13c au vu de son activité anti-tyrosine kinase comprenant la kinase EGFR et ses formes mutées EGFR-L858R et EGFR-T790M fréquemment retrouvées au sein des cancers du poumon non-à-petites-cellules (NSCLC). Le principe actif a été administré dans les poumons par inhalation via un dispositif endotrachéal. La voie inhalée est avantageuse par rapport à la voie systémique pour l’administration du produit 13c car cette molécule possède des liaisons esters qui sont hydrolysables par les estérases plus présentes au niveau des voies systémiques que dans les tissus pulmonaires. L’inhalation permet aussi de cibler mieux le site tumoral afin de réduire les dommages collatéraux. <p><p>Ce travail offre des perspectives au niveau de l’élaboration de formulations permettant d’augmenter la biodisponibilité de la molécule 13c. Une association d’un traitement au composé 13c et d’une chimiothérapie conventionnelle est envisagée car elle pourrait potentialiser les effets de ces deux traitements. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le glioblastome est la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs cérébrales primaires.<p>Malgré un traitement standard pluridisciplinaire (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie),<p>la médiane de survie des patients atteints de ce type de tumeur est de 15 mois et aucun patient<p>n’a pu être guéri à ce jour. Ce pronostic très sombre est directement lié à la capacité<p>d’invasion diffuse du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales, ce qui rend<p>impossible une résection chirurgicale totale. De plus, ces cellules sont particulièrement<p>résistantes aux traitements chimiothérapeutiques de type pro-apoptotique, entrainant une<p>récidive quasi inévitable de la tumeur. De nombreuses stratégies thérapeutiques telles que<p>l’immunothérapie ou les thérapies ciblées sont actuellement explorées pour tenter de<p>combattre ces tumeurs. Cependant, leur efficacité au niveau clinique s’est avérée décevante. Il<p>devient donc indispensable d’identifier de nouveaux agents thérapeutiques afin d’améliorer la<p>survie des patients atteints de glioblastome.<p>Dans ce travail, nous avons caractérisé les propriétés anticancéreuses in vitro et in vivo de<p>deux terpénoïdes extraits de champignons, la fusicoccine A et l’ophioboline A, puis nous<p>avons caractérisé en partie leur mécanisme d’action anti-tumoral dans des cellules de<p>glioblastome.<p>Tout d’abord, nous avons montré que l’activité inhibitrice de croissance in vitro de la<p>fusicoccine A et de l’ophioboline A n’était pas dépendante du degré de sensibilité ou de<p>résistance à l’apoptose des cellules gliales tumorales. Nous avons ensuite mis en évidence que<p>la fusicoccine A était capable de diminuer l’invasion des cellules de glioblastome in vitro en<p>ciblant la kinase focale d’adhérence (FAK). Dans le même temps, nous avons démontré que<p>l’ophioboline A était capable d’induire la mort de ces cellules par paraptose en inhibant<p>l’activité du canal ionique BKCa. Ces deux cibles sont intéressantes car en plus d’être<p>surexprimées dans les glioblastomes, elles interviennent dans de nombreux processus<p>cellulaires tels que la prolifération, la migration et la survie cellulaire.<p>Pour finir, nous avons analysé le pouvoir anti-tumoral in vivo de ces deux terpénoïdes en<p>utilisant un modèle murin de mélanome métastatique, couramment utilisé dans notre<p>laboratoire. Seule l’ophioboline A, injectée en intrapéritonéal à 10 mg/kg, augmentait de<p>manière significative la survie des souris traitées avec cette molécule par rapport aux souris<p>contrôles. Dans ce premier modèle, nous n’avions pas déterminé les conditions optimales<p>9<p>pour l’évaluation in vivo de la fusicoccine A et de l’ophioboline A. Lorsque celles-ci seront<p>définies, des modèles de xénogreffes orthotopiques de glioblastomes humains implantées dans<p>le cerveau de souris immunodéficientes seront utilisés.<p>En conclusion, l’ophioboline A, pouvant être produite en quantités industrielles par culture<p>du champignon qui la synthétise, possédant un mécanisme d’action original et montrant déjà<p>un début d’activité in vivo, pourrait représenter une molécule méritant des études plus<p>approfondies en termes d’agent thérapeutique susceptible de combattre les glioblastomes. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

There is an urgent need to develop reliable and cost-saving methods to select pre-clinically new drug candidates with original mechanism for cancer therapy. Previous results have shown that IR spectra of cancer cells exposed to various drugs provided a global signature of all the metabolic changes induced by the treatments. In this thesis, we attempted to develop a selection criterion – based on FTIR spectroscopy – for potential antitumor compounds according to their mechanism of action. <p>In chapter III, it was demonstrated that spectral variations in IR spectra of cancer cells induced by a treatment can be correlated to the mechanism of the drug. Human prostate cancer PC-3 cells were exposed to 7 well-described anticancer drugs belonging to 3 distinct classes. Each class is characterized by a unique mode of action. Drugs known to induce similar types of metabolic disturbances appear to cluster when spectrum shapes are analyzed. Chapter IV generalized the results obtained on PC-3 cells with six other cell lines. We showed that the spectral signatures of drug effects are mainly independent of the cell line. Chapter V indicated that, while the cell cycle phase influence IR spectra of cells, the drug spectral signature was dominated by global metabolic modifications and not much by the cell cycle perturbations due to this drug. <p>Chapter VI and VII focused on lipids. While the precise identification of particular molecules is particularly complex with IR spectroscopy, we attempted to extract more precise information and to assign spectral variations to specific changes in lipids. IR spectra of lipids contain very interesting details on their nature and structure. We achieved to build a tool which quantifies five major lipid classes in complex mixtures such as total lipid cell extracts. However, based on this tool, the treatments used do not induce any variation in the lipid cell composition (for five classes).<p>Finally, in chapter VIII, we applied the method developed previously on a new potential class of anticancer molecules: the polyphenols. A global method was particularly interesting as the development of therapy using these compounds is hampered by the complexity of the multiple anticarcinogenic mechanisms of these molecules. We have noticed the similarities and discrepancies among 3 very close synthetic molecules and the observations were coherent with previous biological data. We also compared them with 3 natural molecules already in clinical phase for treatment of various cancers.<p>In conclusion, we developed an objective classifier for potential anticancer drugs based on their global effects on cancer cells. Applied to a larger scale, this method could constitute a first step in the screening method to select drugs with original mode of action.<p>There is an urgent need to develop reliable and cost-saving methods to select pre-clinically new drug candidates with original mechanism for cancer therapy. Previous results have shown that IR spectra of cancer cells exposed to various drugs provided a global signature of all the metabolic changes induced by the treatments. In this thesis, we attempted to develop a selection criterion – based on FTIR spectroscopy – for potential antitumor compounds according to their mechanism of action. <p>In chapter III, it was demonstrated that spectral variations in IR spectra of cancer cells induced by a treatment can be correlated to the mechanism of the drug. Human prostate cancer PC-3 cells were exposed to 7 well-described anticancer drugs belonging to 3 distinct classes. Each class is characterized by a unique mode of action. Drugs known to induce similar types of metabolic disturbances appear to cluster when spectrum shapes are analyzed. Chapter IV generalized the results obtained on PC-3 cells with six other cell lines. We showed that the spectral signatures of drug effects are mainly independent of the cell line. Chapter V indicated that, while the cell cycle phase influence IR spectra of cells, the drug spectral signature was dominated by global metabolic modifications and not much by the cell cycle perturbations due to this drug. <p>Chapter VI and VII focused on lipids. While the precise identification of particular molecules is particularly complex with IR spectroscopy, we attempted to extract more precise information and to assign spectral variations to specific changes in lipids. IR spectra of lipids contain very interesting details on their nature and structure. We achieved to build a tool which quantifies five major lipid classes in complex mixtures such as total lipid cell extracts. However, based on this tool, the treatments used do not induce any variation in the lipid cell composition (for five classes).<p>Finally, in chapter VIII, we applied the method developed previously on a new potential class of anticancer molecules: the polyphenols. A global method was particularly interesting as the development of therapy using these compounds is hampered by the complexity of the multiple anticarcinogenic mechanisms of these molecules. We have noticed the similarities and discrepancies among 3 very close synthetic molecules and the observations were coherent with previous biological data. We also compared them with 3 natural molecules already in clinical phase for treatment of various cancers.<p>In conclusion, we developed an objective classifier for potential anticancer drugs based on their global effects on cancer cells. Applied to a larger scale, this method could constitute a first step in the screening method to select drugs with original mode of action.<p><p>Afin d’améliorer les thérapies contre le cancer, il devient actuellement cruciale de développer une méthode pour améliorer la sélection préclinique de nouvelles molécules, potentiellement anticancéreuses. Des publications précédentes ont mis en évidence que les spectres infrarouges de cellules cancéreuses exposées à différents agents thérapeutiques fournissent une empreinte globale de l’ensemble des changements métaboliques induit par ce médicament. Dans cette thèse, nous proposons d’utiliser la spectroscopie infrarouge pour mettre au point un critère de sélection basé sur le mode d’action des agents anticancéreux. Plusieurs aspects de la technique ont été investigués. Nous avons d’abord démontré la possibilité d’utiliser les spectres infrarouges de cellules cancéreuses de prostate PC-3 traitées avec 7 drogues pour classer ces molécules selon leur mode d’action. Nous avons ensuite reproduit les résultats obtenus sur PC-3 avec 6 autres lignées cellulaires et montré que la signature spectrale obtenue était largement indépendante de la lignée. Par la suite, nous avons étudié si l’effet sur le cycle cellulaire induit par de nombreuses molécules anticancéreuses, pouvait expliquer certains changements spectraux observés suite au traitement. Nous avons pu montrer que la majorité des variations spectrales n’étaient pas liées à une perturbation du cycle cellulaire. Nous nous sommes ensuite concentrés sur une classe de molécules en particulier: les lipides. Après avoir mis en évidence l’ensemble des informations contenues dans un spectre infrarouge de lipides, nous avons mis au point un modèle permettant de quantifier 5 classes de lipides dans des mélanges complexes tels que des extraits lipidiques provenant de cellules. Néanmoins, aucune variation du contenu en ces 5 classes de lipides n’a été observée pour les traitements utilisés dans cette étude. Enfin, nous avons appliqué la méthode mise au point dans cette thèse à une classe de molécules prometteuses :les polyphénols. Une approche globale s’avère particulièrement intéressante pour ces composés étant donné qu’ils présentent des mécanismes anticancéreux multiples et complexes. Nous avons comparé 3 molécules naturelles en phase clinique pour le traitement de certains cancers et 3 molécules synthétiques présentant une structure très proche. Par notre méthode, nous avons mis en évidence certaines similarités et différences de ces 6 molécules en termes d’effets globaux sur les cellules. En conclusions, nous avons développé un outil objectif de classification pour les molécules anticancéreuses potentielles, basée sur le mécanisme global des composés. Appliquée à plus large échelle, cette méthode pourrait constituer une première étape permettant de sélectionner les molécules avec un mode d’action original. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Malgré la découverte des antigènes tumoraux depuis quelques décennies dans les mélanomes humains, l’immunothérapie anticancéreuse reste encore relativement inefficace. En outre, les traitements anti-tumoraux classiques tels que la chimiothérapie et la radiothérapie ont longtemps été considérés comme des traitements affectant principalement les cellules tumorales en division. Actuellement, des études de plus en plus nombreuses suggèrent que le succès de la chimiothérapie dépendrait, en partie, du système immunitaire. En effet, d’une part, les agents chimio-thérapeutiques pourraient induire une mort immunogène des cellules tumorales et donc potentialiser les réponses immunitaires. D’autre part, certains rapports montrent que la présence préalable de cellules immunes dans l’environnement tumoral améliore le pronostic clinique observé après chimiothérapie notamment.<p><p>Au cours de ce travail, nous avons étudié l’effet du cyclophosphamide (CTX, un agent alkylant) sur le système immunitaire et la résistance anti-tumorale dans des souris porteuses du mastocytome P815. Nous avons remarqué qu’une seule injection de CTX dans des souris inoculées 10-20 jours plus tôt avec une dose létale de cellules tumorales induit la survie dans 100% des souris traitées. En outre, le rejet tumoral induit par le CTX est strictement dépendant des lymphocytes T CD4+ et CD8+, et permet une résistance tumorale à long terme spécifique du mastocytome P815. Le but de cette étude était d’appréhender les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans cette mémoire spécifique de la tumeur. <p><p>Nous avons premièrement montré que le CTX augmente les réponses de type Th1 et Th17 dans des souris immunisées. L’activation de ces réponses requiert l’IL-12p40 et corrèle avec une augmentation du nombre de cellules CD11b+/F4/80+/Ly6C+, suggérant que ces DCs inflammatoires présumées pourraient être une source potentielle d’IL-12 et/ou d’IL-23. Des résultats similaires ont été observés dans des souris porteuses de la tumeur P815 et traitées au CTX. Nous avons également caractérisé les cellules T anti-tumorales effectrices qui infiltrent la tumeur et en particulier, nous avons étudié le rôle des cellules T auxiliaires CD4+ dans la migration des lymphocytes T CD8+ spécifiques de la tumeur. Nous avons observé que la déplétion des cellules T CD4+ semble induire un blocage des lymphocytes T CD8+ dans les ganglions drainant la tumeur qui ne migrent alors plus vers le foyer tumoral. Nous avons donc évalué le rôle de chimiokines/récepteurs aux chimiokines qui pourraient être impliqués dans ce processus tels que les couples CXCR3/CXCL9-10-11. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le système immunitaire est capable de rejeter une tumeur, même si l'interaction entre système immun et tumeurs est et reste complexe. Contrôler à long terme la croissance de la tumeur est un challenge, probablement suite à divers mécanismes de tolérance centrale et périphérique. Différentes approches d'immunothérapie du cancer ont été et sont toujours développées. Nous avons, au laboratoire, investigué et démontré, dans le cadre de deux différents modèles tumoraux murins, les capacités thérapeutiques d’une nouvelle stratégie de vaccinations combinées associant des injections de cellules dendritiques (DC) et de cellules tumorales sécrétrices de GM-CSF.<p><p>Notre travail de thèse a consisté à poursuivre l'étude de cette stratégie de vaccins combinés en étudiant plus particulièrement le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg) dans l'efficacité thérapeutique des vaccinations. <p>Les Treg regroupent différentes populations cellulaires immunosuppressives dérivées du thymus qui jouent un rôle clé dans le maintien de la tolérance périphérique. Les Treg naturels dont le mécanisme de suppression principal nécessite un contact cellule-cellule, expriment de façon constitutive les molécules de surface CD4, CD25 et CTLA-4 mais le marqueur le plus spécifique est le facteur de transcription Foxp3 qui est indispensable à leur développement et à leur fonction suppressive. Dans un premier temps, nous avons donc caractérisé les Treg de rat pour l'expression de Foxp3 et la nature et spécificité antigénique de leur fonction suppressive. Nos résultats démontrent d’une part, une expression de Foxp3 restreinte aux LT CD25+ natifs et liée à une fonction suppressive s'exerçant par contact cellule-cellule et d’autre part, une spécificité antigénique non-restreinte de ces Treg. <p><p>Ensuite, nous avons utilisé ce modèle de vaccination associant des injections de DC et de cellules tumorales sécrétrices de GM-CSF pour analyser comparativement les réponses immunes induites chez les rats vaccinés guéris ou non-guéris et les rats contrôles non vaccinés et identifier les paramètres cruciaux conduisant à l'éradication de la tumeur. Nos résultats ont montré que la principale différence entre rats vaccinés guéris et non guéris ne réside pas dans l'induction de réponses cytotoxiques systémiques spécifiques de la tumeur. Par contre, la guérison est associée à la persistance d'une réponse systémique LT CD4+ TH1 ainsi qu'au recrutement important en intratumoral de LT CD8+ cytotoxiques lié à une faible proportion relative de Treg. <p><p>Comme dans la majorité des études publiées chez l'animal, les DC utilisées dans ces vaccins combinés ont été générées à partir de rats naïfs, par différenciation de précurseurs de la moëlle osseuse en présence de GM-CSF seul. Par analogie avec les vaccins DC administrés aux patients cancéreux, nous avons aussi dérivé des DC à partir de la moëlle osseuse de rats porteurs d’une tumeur (TUM+) et nous avons constaté que ces mêmes vaccins combinés montraient in vivo une efficacité thérapeutique nettement moins bonne que leurs équivalents naïfs. Nous avons établi que cette différence d’efficacité était liée à la présence de Treg fonctionnels dans les vaccins DC dérivés de rats TUM+. Puis, nous avons établi le lien entre la présence de Treg dans les vaccins DC TUM+ et leur moins bonne efficacité thérapeutique en montrant qu'un traitement in vivo des rats TUM+ au témozolomide (TMZ) avant de générer les vaccins DC résultait in vitro, en une moindre expression de Foxp3 et une fonction suppressive diminuée et in vivo, en une bien meilleure survie des rats vaccinés.<p><p>Enfin, dans le but d’une utilisation future en clinique, nous avons développé une approche simplifiée ‘tout in vivo’ de notre modèle de vaccinations combinées, en utilisant la tumeur localement irradiée in vivo comme source d’antigène pour des DC autologues injectées en péri-tumoral et un apport exogène de GM-CSF. Nous avons utilisé des adénovirus associés recombinants porteurs du gène du GM-CSF (AAV1-GM-CSF) pour transduire la tumeur in vivo. Ces injections intratumorales d’AAV1-GM-CSF ont montré de bons résultats en vaccinations combinées puisque 60% des rats ont pu être guéris d’une tumeur 9L pré-implantée. Nous avons ensuite expérimenté l’enrobage des AAV1-GM-CSF dans un polymère biocompatible et thermosensible, le poloxamère, avant de les injecter en intratumoral, sans observer de meilleur effet thérapeutique. Cependant, nous avons constaté que l'utilisation du poloxamère pour enrober du GM-CSF recombinant permettait d'améliorer nettement la survie des rats vaccinés par comparaison à l'utilisation de GM-CSF recombinant seul.<p><p>La stratégie de vaccinations combinées que nous avons largement explorée et validée chez le rat serait une alternative intéressante à développer en clinique, particulièrement en combinaison avec un traitement permettant d'éliminer les Treg à la fois dans les vaccins et chez les patients vaccinés.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Actuellement le criblage en vue de la recherche de nouveaux agents antitumoraux se base principalement sur la qualité cytotoxique d’une molécule. Le principal défaut de cette approche est qu’aucune sélection n’est faite sur le mode d’action du médicament. L’objectif de ce travail est la mise au point d’une méthode permettant un classement rapide et objectif du mode d’action de molécules à visée thérapeutique par spectroscopie infrarouge.<p>La spectroscopie infrarouge est une technique d’absorption de la lumière fournit la signature chimique d’un échantillon. L’excellente qualité du signal rend possible son utilisation comme outil discriminant. En outre, cette technique d’analyse se démarque des autres par son caractère non destructif et la rapidité d’acquisition des données. Elle se révèlerait donc une méthode de choix pour effectuer du criblage de molécules en vue de la recherche de nouveaux agents thérapeutiques.<p><p>Dans un premier temps nous avons voulu évaluer la possibilité d’utiliser la spectroscopie infrarouge pour isoler la signature spectrale du mode d’action induit par des concentrations sub-létales de ouabaïne, un composé de la famille des cardénolides, sur une lignée tumorale de prostate. Nous avons montré que cette signature évolue au cours du temps et peut-être corrélée aux données biologiques décrites dans la littérature. Nous avons également mis en évidence pour la première fois une modification de la composition lipidique de la cellule. Cette altération a été caractérisée au cours du temps par spectrométrie de masse.<p>Nous avons ensuite voulu définir les limites de la méthode. La littérature souligne la diversité des modes d’action que peut induire un agent thérapeutique selon sa concentration. Nous avons montré que cette diversité se reflète sur le spectre infrarouge de cellules tumorales traitées à la ouabaïne en distinguant au moins deux modes d’action distincts, dépendant de la concentration en ouabaïne. Par ailleurs, nous avons montré que la confluence pouvait modifier significativement le spectre infrarouge d’une cellule. Neanmoins cette signature est unique et orthogonale à celle induite par la ouabaïne.<p>Finalement, nous avons évalué le potentiel de la spectroscopie infrarouge à distinguer des modes d’action induits par des molécules à la structure chimique proche. Nous avons montré qu’il était possible de caractériser spécifiquement chacun des modes d’action. D’autre part nous avons mis en évidence que les modes d’action de molécules issues d’une même classe d’agent thérapeutique conduisaient à des signatures spectrales similaires. Cette partie du travail souligne la possibilité d’utilisation de la spectroscopie infrarouge pour un classement objectif, uniquement basé sur leur mode d’action d’agents thérapeutiques potentiels.<p> / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished