Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-28T14:36:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO FINAL PDF DIGITAL.pdf: 1241777 bytes, checksum: 0031dd125d40fe083cb1ec9da8552635 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T14:36:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO FINAL PDF DIGITAL.pdf: 1241777 bytes, checksum: 0031dd125d40fe083cb1ec9da8552635 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CNPq / Pacientes acometidos por neoplasias hematológicas realizam tratamento quimioterápico intenso e têm alto risco de desenvolver infecções invasivas por espécies de Candida spp. devido à baixa resposta imune, neutropenia e outros fatores de risco, contribuindo para uma elevada morbimortalidade. Entretanto, devido a peculiaridades da imunossupressão a que são submetidos, a distinção entre os processos infecciosos ainda não é uma tarefa fácil podendo levar o paciente a óbito. O presente estudo teve como objetivo diagnosticar candidemias e avaliar o perfil epidemiológico e sensibilidade antifúngica em pacientes acometidos por neoplasias hematológicas. O diagnóstico micológico foi realizado através da taxonomia clássica e automatizada e confirmado pela técnica molecular (PCR-Reação em Cadeia da Polimerase) e identificação proteômica (MALDI-TOF MS). O teste de sensibilidade antifúngica seguiu as recomendações M27-A3 do Clinical & Laboratory Standards Institute (2008). A análise estatística descritiva foi realizada no programa GraphPad Prism6 através do teste exato de Fisher e cálculo do Odds ratio (intervalo de confiança de 95% para p < 0,05). Foram analisadas 105 amostras sanguíneas de 62 pacientes internados no serviço de Onco-hematologia do Hospital de Câncer de Pernambuco (HCP) no período de janeiro de 2015 a setembro de 2015. Dentre estas, foram isoladas nove (8,57%) leveduras do gênero Candida, sendo seis (66,66%) C. tropicalis e três (33,34%) C. albicans. O óbito ocorreu em 66,6% dos casos de candidemia demonstrando haver associação estatística significativa (p = 0,03, Odds Ratio = 5,53). O internamento em UTI, como fator de risco, foi associado à candidemia (p = 0,0008 Odds ratio = 24,8) e o choque séptico ao óbito (p= 0,0476 Odds ratio= 25,67). Ao teste de sensibilidade antifúngica, os isolados mostraram sensibilidade aos antimicóticos anfotericina B, caspofungina, micafungina, anidulafungina e fluconazol. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que candidemia é uma infecção invasiva frequente causada por espécies de Candida não-albicans, em pacientes com neoplasias hematológicas, como a espécie C. tropicalis. / Patients affected by neoplasia hematological which require intense chemotherapy treatment have high risk of developing invasive infections by Candida spp species due to low immune response, neutropenia and other risk factors contributing to high morbimortality. However, due to peculiarities of the immunosuppression that are submitted, the distinction between the infectious processes is still not an easy task and may progress rapidly and take the patient to death. The study aimed to identify the candidemia and epidemiological profile in patients with hematologic neoplasia. The mycological diagnosis was performed by classical taxonomy and automated and confirmed to molecular technique (PCR-polymerase chain reaction) and proteomics (MALDI-TOF MS). The antifungal susceptibility testing followed the M27 -A3 & recommendations of the Clinical Laboratory Standards Institute (2008). The descriptive statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 program through the Fisher exact test and calculation of Odds ratio (95% confidence interval for p < 0.05) .Blood samples (105) were analysed of 62 patients admitted in the oncohematology service of the Hospital of Pernambuco (HCP) from January 2015 to September 2015. Among samples studied, nine (8,57%) were found positive for yeasts of the genus Candida in which identified six (66,66%) species C. tropicalis and three (33,34%) C. albicans. The death occurred in 66.6 % of cases of candidemia demonstrated significant statistical association (p = 0,03, Odds ratio = 5,53). The admission to the ICU, as a risk factor was associated with candidemia (p = 0.0008 Odds ratio = 24.8) and septic shock with death (p = 0.0476 Odds ratio = 25.67). The antifungal susceptibility testing, isolates were presented, in its entirety, sensitive to antifungal agents amphotericin B, caspofungin, micafungin, anidulafungin and fluconazole. Among the patients with candidemia 66,6% evolved to death. Based on these results, one can conclude that candidemia is a common invasive infection caused by Candida non-albicans species in patients with hematological malignancies, such as C. tropicalis species.

A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista, causada por leveduras do gênero Candida, de ocorrência comum na cavidade bucal. O aumento da incidência está relacionado, em grande parte, ao surgimento das terapias e patologias imunossupressoras, embora ela possa ocorrer em indivíduos considerados saudáveis. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota leveduriforme de pacientes com lesão bucal suspeita de candidíase e compará-la com a de indivíduos saudáveis através da quantificação, produção de enzimas fosfolipase, proteinase e determinação da CIM dos antifúngicos: anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo método de microdiluição em caldo. As leveduras foram isoladas a partir de amostras de saliva não estimulada no meio CHROMagar® Candida, que permitiu a observação de colonização mista e uma identificação presuntiva. Posteriormente os isolados foram identificados pela metodologia clássica, através das provas: formação de tubo germinativo em soro humano, estudo da micromorfologia, crescimento a 37°C e 42°C, provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Das 100 amostras de saliva dos pacientes com lesão, 70 apresentaram crescimento de leveduras e foram identificadas 63 C. albicans e 16 C. tropicalis. Entre as 50 amostras de salivas do grupo controle, 16 apresentaram crescimento e foram identificadas 14 C. albicans e 3 C. tropicalis. Quanto à capacidade de síntese das exoenzimas observou-se que 100% das C. albicans de ambos os grupos avaliados produziram as enzimas fosfolipase e proteinase em diferentes níveis de atividade. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produção da fosfolipase, com relação à proteinase 43,8% dos isolados de pacientes com lesão bucal foram positivos. Em relação aos testes de sensibilidade, a faixa da CIM para anfotericina B foi de 0,125 ? 4µg/mL para os isolados de C. albicans e de 2 ? 4 µg/mL para os de C. tropicalis, com o itraconazol o intervalo da CIM foi de 0,03 ? 16µg/mL para as duas espécies e para o fluconazol a faixa da CIM foi de 0,125 - ?64µg/mL para os isolados de C. albicans e de 0,25 - ?64µg/mL para os de C. tropicalis. Com base nos resultados obtidos conclui-se que: a análise de saliva é sensível para detecção de leveduras tanto em pacientes com sinais clínicos de candidíase quanto em indivíduos saudáveis portadores da levedura; C. albicans foi à espécie mais isolada em ambos os grupos; todas os isolados de C. albicans foram produtores das enzimas fosfolipase e proteinase; nenhum isolado de C. tropicalis apresentou atividade da enzima fosfolipase. A maioria dos isolados de C. albicans e C. tropicalis foram sensíveis in vitro aos antifúngicos testados / Candidiasis is the most frequent oportunistic fungal infection. It is caused by Candida yeasts, commonly seen in the oral cavity. Newer therapies and immunosupressive pathologies are related to the increase of oral candidiasis incidence, although it may occur in healthy subjects. Therefore, the aim of this work was to evaluate yeasts frequency in the oral cavity from patients with clinical signs of oral candidiasis and compare it with frequency observed in healthy subjects through quantification, phospholipase and proteinase activity tests and antifungal susceptibility (amphotericin B, itraconazole, fluconazole) by broth microdilution test. The yeasts were isolated from unstimulated whole saliva samples in CHROMagar® Candida medium, which allowed association between two or more species observation and presumptive identification. Latter, strains identification were confirmed by classical methodology. Of 100 candidiasis patients samples, yeast growth was observed in 70 samples and 63 C. albicans and 16 C. tropicalis strains were identified. Of 50 healthy subjects samples, yeast growth was observed in 16 samples and 14 C. albicans e 3 C. tropicalis strains were identified. Differential activity of phospholipase and proteinase enzymes was detected in 100% C. albicans strains in both groups. Phospholipase activity was not detected in C. tropicalis strains, and proteinase activity was detected in 43,8% strains from oral candidiasis group. Susceptibility tests showed amphotericin B MIC range from 0,125 ? 4 µg/mL for C. albicans strains and 2 ? 4 µg/mL for C. tropicalis strains; itraconazole MIC range from 0,03 ? 16 µg/mL for both species; fluconazole MIC range from 0,125 - ? 64 µg/mL for C. albicans strains and 0,25 - ? 64 µg/mL for C. tropicalis strains. In conclusion, our study demonstrates that saliva analysis is sensitive to detect yeasts from patients with clinical signs of oral candidiasis and from yeasts carriers; C. albicans was prevalent in both groups; all C. albicans strains showed phospholipase and proteinase activity; None C. tropicalis strains showed phospholipase activity. The majority of C. albicans and C. tropicalis strains were inhibited in vitro by antifungals evaluated

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-06T15:21:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-06T15:21:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-04-06T15:21:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-06T15:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Vivian do N. Pereira.pdf: 2756512 bytes, checksum: 9892b08404437328cce673864effe453 (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Candidemia is an infection recognized as public health problem related to health assistance. Filling the knowledge gaps through epidemiological studies and diagnostic tools to respond emerging threats that may be involved in the disease process is among the actions to eliminate these infections. The objective of this research was to study the Candida yeasts isolated from blood cultures of patients admitted in 11 hospitals of Manaus in 2013, as well to study the clinical epidemiological aspects of candidemia, the antifungal profile of susceptibility and virulence factors. The detection of yeasts in the collected samples was performed by conventional methodology. The antifungal susceptibility was determined using E-Test® strips. The studied virulence factors were proteinase, phospholipase, hemolysin and biofilm formation. During the study period, there were 85 cases of infection in the blood of 81 patients with Candida spp. In relation to gender, 67.9% were male, the median age of adult patients was 53 years and between pediatric patients was 60 days. The main risk conditions were: previous use of antibiotics (98.6%), presence of central venous catheter (95.9%), ICU (84.9%), use of protectors of gastric mucosa (84.4 %) and one-third of patients are from natal care and 72.8% of patients had up to 1 year old. According to the clinical course of patients, 40.7% died. C. albicans was the most frequently isolated species (34.57%), followed by C. tropicalis (32.1%) and Candida parapsilosis (17.28%). A susceptibility test was performed against Caspofungin, Micafungin, and Voriconazole, where the resistance 12.1%, 4.3% and 4.3% was respectively found. The virulence factors related to production of enzymes was: Proteinase with 56.4% of the isolates being producers, Phospholipase 36.2% and 78.7% hemolysin with this capability being more expressive in the species C. albicans. The biofilm formation was present in 34% of the isolates whose C. tropicalis was the most significant in this factor. The importance of epidemiology studies and local phenotypic studies may contribute to improve decision-making process and propose more effective measures for control and prevention of these infections. / As Candidemias são Infecções Relacionadas à Assistência a Saúde que são reconhecidamente um problema de saúde pública, e dentre as várias ações como medidas de eliminação destas infecções, estão o preenchimento das lacunas de conhecimento para responder as ameaças emergentes, isto se dá por estudos epidemiológicos, de diagnóstico e dos fatores que podem estar envolvidos no processo de adoecimento. O objetivo deste trabalho foi estudar as leveduras do gênero Candida isoladas a partir de hemoculturas de pacientes internados em 11 Hospitais de Manaus no ano de 2013, bem como estudar os aspectos clínicos epidemiológicos das candidemias, o perfil de susceptibilidade antifúngica e fatores de virulência. A detecção das leveduras presentes nas amostras coletadas foi realizada por meio de metodologia convencional. A susceptibilidade antifúngica foi determinada utilizando fitas de Etest® seguindo as recomendações do fabricante. Os fatores de virulência estudados foram: proteinase, fosfolipase, hemolisinas e formação de biofilme. No período de estudo, foram registrados 85 casos de infecção na corrente sanguínea de 81 pacientes por Candida spp. Em relação ao gênero 67,9% eram do sexo masculino, a mediana das idades entre os pacientes adultos foi de 53 anos e entre os pediátricos de 60 dias. As principais condições de risco foram: o uso prévio de antibióticos (98,6%), presença de cateter venoso central (95,9%), internação em UTI/CTI (84,9%), uso de gastroprotetores (84,4%) e um terço dos pacientes são procedentes de maternidades, e 72,8% dos pacientes tinham até 1 ano de idade. Segundo a evolução clínica dos pacientes, 40,7% foram a óbito. C. albicans foi a espécie isolada com mais frequência (34,57%), seguido de C. tropicalis (32,1%), C. parapsilosis (17,28%). Foi realizado teste de susceptibilidade frente a Caspofungina, Micafungina e Voriconazol, onde a resistência encontrada foi de 12,1%, 4,3% e 4,3% respectivamente. Os fatores de virulência relacionados à produção de enzimas foram: Proteinase com 56,4% dos isolados sendo produtores, Fosfolipase 36,2% e Hemolisina 78,7 com esta capacidade; sendo mais expressiva nas espécies de C. albicans. A formação de biofilme estava presente em 34% dos isolados, sendo a C. tropicalis a mais expressiva neste fator. A importância de estudos de epidemiologia e estudos fenotípicos locais podem contribuir para a melhoria da tomada de decisão e propor medidas mais efetivas de controle e prevenção destas infecções.

Several yeast species had previously been isolated from water systems in the North West Province, South Africa. Some of the identified species had, in other studies, been associated with superficial mucosal infections to life threatening diseases. Antifungal drugs are used to treat such yeast infections. However, due to prophylactic usage and continuous exposure some yeast species have developed resistance to some antifungal agents. The aim of this study was to determine the diversity and antifungal susceptibility of yeasts in selected rivers, Mooi River and Harts River in the North West Province, South Africa. Waters samples were collected from the rivers in summer and winter seasons. Physico-chemical parameters such as pH, temperature, total dissolved solids, chemical oxygen demand, nitrates and phosphates were measured to determine the water quality. Yeast colonies were enumerated at room temperature and 37°C using yeast-malt-extract agar (containing 100 ppm chloramphenicol). Pure isolates from 37°C were identified by biochemical tests and 26S rRNA gene sequencing. Yeast sequences of isolated yeasts were sent to Genbank. Phylogenetic tree was conducted to determine phylogenetic relationship between the yeast isolates. Disk diffusion antifungal susceptibility tests were conducted on the yeast species. Physico-chemical parameters of the water were within target water quality range for livestock farming but in most sampling sites out of range for irrigation use. pH, Nitrates, phosphates and chemical oxygen demand levels ranged from 7.40 to 8.64, 0 to 5.4 mg/L, 0 to 7.14 mg/L and 31 to 43 mg/L, respectively. Elevated levels of total dissolved solids were measured in all the sampling sites. Total yeast counts ranged between 320-4200 cfu/L and 27-2573 cfu/L for room temperature and 37˚C. All the yeast colonies isolated were non-pigmented. Diazonium Blue B tests determined the yeasts isolates as ascomycetes. Haemolysin and extracellular enzyme production tests were negative on all the isolates. Yeasts isolates were identified and belonged to the genera Arxiozyma, Candida, Clavispora, Cyberlindnera, Lecythophora, Pichia, Saccharomyces, and Wickerhamomyces. Saccharomyces cerevisiae and Candida glabrata were mostly isolated species. Furthermore, the results indicated that levels of yeast could be correlated to physico-chemical quality of water. A large number of isolates were resistant to azoles, especially fluconazole as well as other antifungal classes. Most of the Candida species were resistant to almost all the antifungals. Several of the isolated yeast species are opportunistic pathogens. They could cause infections in sensitive individuals during occasional direct contact especially immune compromised people. Resistance of these yeast species to antifungal agents is a major health concern. / MSc (Environmental Sciences), North-West University, Potchefstroom Campus, 2015

Several yeast species had previously been isolated from water systems in the North West Province, South Africa. Some of the identified species had, in other studies, been associated with superficial mucosal infections to life threatening diseases. Antifungal drugs are used to treat such yeast infections. However, due to prophylactic usage and continuous exposure some yeast species have developed resistance to some antifungal agents. The aim of this study was to determine the diversity and antifungal susceptibility of yeasts in selected rivers, Mooi River and Harts River in the North West Province, South Africa. Waters samples were collected from the rivers in summer and winter seasons. Physico-chemical parameters such as pH, temperature, total dissolved solids, chemical oxygen demand, nitrates and phosphates were measured to determine the water quality. Yeast colonies were enumerated at room temperature and 37°C using yeast-malt-extract agar (containing 100 ppm chloramphenicol). Pure isolates from 37°C were identified by biochemical tests and 26S rRNA gene sequencing. Yeast sequences of isolated yeasts were sent to Genbank. Phylogenetic tree was conducted to determine phylogenetic relationship between the yeast isolates. Disk diffusion antifungal susceptibility tests were conducted on the yeast species. Physico-chemical parameters of the water were within target water quality range for livestock farming but in most sampling sites out of range for irrigation use. pH, Nitrates, phosphates and chemical oxygen demand levels ranged from 7.40 to 8.64, 0 to 5.4 mg/L, 0 to 7.14 mg/L and 31 to 43 mg/L, respectively. Elevated levels of total dissolved solids were measured in all the sampling sites. Total yeast counts ranged between 320-4200 cfu/L and 27-2573 cfu/L for room temperature and 37˚C. All the yeast colonies isolated were non-pigmented. Diazonium Blue B tests determined the yeasts isolates as ascomycetes. Haemolysin and extracellular enzyme production tests were negative on all the isolates. Yeasts isolates were identified and belonged to the genera Arxiozyma, Candida, Clavispora, Cyberlindnera, Lecythophora, Pichia, Saccharomyces, and Wickerhamomyces. Saccharomyces cerevisiae and Candida glabrata were mostly isolated species. Furthermore, the results indicated that levels of yeast could be correlated to physico-chemical quality of water. A large number of isolates were resistant to azoles, especially fluconazole as well as other antifungal classes. Most of the Candida species were resistant to almost all the antifungals. Several of the isolated yeast species are opportunistic pathogens. They could cause infections in sensitive individuals during occasional direct contact especially immune compromised people. Resistance of these yeast species to antifungal agents is a major health concern. / MSc (Environmental Sciences), North-West University, Potchefstroom Campus, 2015

As leveduras do gênero Candida são responsáveis por 80% das infecções fúngicas sistêmicas. Nas Unidades de Terapia Intensiva, essas leveduras estão envolvidas em aproximadamente 17% das infecções. Essas doenças aumentam o tempo de hospitalização, resultando em aumento de gastos; além disso, as infecções sistêmicas causadas por Candida spp. apresentam elevada taxa de mortalidade. A candidemia representa grande parte das candidíases invasivas e sua epidemiologia pode variar de acordo com o local de estudo, práticas hospitalares e país estudado. Assim, o objetivo do presente estudo foi caracterizar 79 isolados de candidemia de pacientes internados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto de junho de 2014 a novembro de 2015. Para isso, os isolados foram submetidos a testes de microdiluição em caldo para a determinação da Concentração Inibitória Mínima dos antifúngicos anfotericina B, caspofungina, fluconazol e voriconazol; testes para avaliar a produção de fatores de virulência: hemolisina, fosfolipase e proteinase; e genotipagem por Pulsed-field Gel Electrophoresis, Microsatellite Length Polymorphism e Multilocus Sequence Typing. Como esperado, C. albicans foi a espécie predominante (44%), seguida por C. glabrata (19%), C. tropicalis (19%), C. parapsilosis (14%) e C. orthopsilosis (4%). Os isolados, em geral, não apresentaram resistência aos antifúngicos testados. Entretanto, todos os isolados de C. glabrata e um isolado de C. parapsilosis apresentaram-se suscetíveis dose-dependentes ao fluconazol, três isolados de C. glabrata foram suscetíveis dose-dependentes à caspofungina, um isolado de C. albicans foi suscetível dose-dependente ao voriconazol e um isolado de C. albicans apresentou-se resistente ao fluconazol e voriconazol. Os isolados da espécie C. albicans foram os principais produtores de fatores de virulência. Os resultados dos testes de genotipagem indicaram a espécie C. glabrata apresentou menor variabilidade genética. A incidência de candidemia no período estudado foi de 1,52/1000 admissões e a taxa de mortalidade foi de 52%. O principal fator de risco foi antibioticoterapia (86%), seguido de sonda vesical (68%), acesso venoso central (60%), cirurgias (54%), nutrição parenteral (42%) e neutropenia (14%). Das doenças de base, o câncer sólido estava presente em 28% dos pacientes, seguido por diabetes (23%), doenças gastrointestinais (20%) e doenças hepáticas (15%). Finalmente, os resultados obtidos são úteis para o melhor entendimento do perfil da candidemia no hospital estudado e podem auxiliar na escolha da terapia empírica para essa doença / Candida spp. are responsible for 80% of all systemic fungal infections. In the Intensive Care Units, these yeasts are present in 17% of all infections. These diseases result in extended hospitalization, leading to increased hospital costs; besides, the systemic infections caused by Candida spp. are related to high mortality rates. Candidemia is the main invasive candidiasis and its epidemiology may vary among study location, local healthcare practices and studied countries. Therefore, the aim of this study was to characterize 79 bloodstream isolates from patients of the Hospital das Clínicas of Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, from June 2014 to November 2015. The Minimal Inhibitory Concentration of amphotericin B, caspofungin, fluconazole and voriconazole was determined using broth microdilution; virulence factor production was analyzed; and the strains were typed by Pulsed-field Gel Electrophoresis, Microsatellite Length Polymorphism and Multilocus Sequence Typing. As expected, C. albicans was the most predominant species (44%), followed by C. glabrata (19%), C. tropicalis (19%), C. parapsilosis (14%) and C. orthopsilosis (4%). In general, the strains did not show resistance to the tested antifungals. However, all C. glabrata and one C. parapsilosis isolates exhibited dose-dependent susceptibility to fluconazole, three C. glabrata isolates exhibited dose-dependent susceptibility to caspofungin, one C. albicans isolate was susceptible dose-dependent to voriconazole and one C. albicans isolate was resistant to fluconazole and voriconazole. Candida albicans strains were the main virulence attributes producer. C. glabrata isolates showed less genetic variability than the others studied species. The candidemia incidence was 1.52 per 1,000 admissions, and the mortality rate was 52%. The main risk factors were antibiotic therapy (86%), followed by urinary catheterization (68%), central venous access (60%), surgical procedures (54%), parenteral nutrition (42%) and neutropenia (14%). The most common underlying diseases were solid cancer (28%), diabetes (23%), gastrointestinal disease (20%) and liver disease (15%). Finally, the results are useful to bring a better comprehension of candidemia in the studied hospital and can help in the identification of efficient empirical treatment strategies

Os objetivos deste estudo foram: re-identificar 70 isolados de Candida em micoteca por método tradicional e API 20C; identificar a presença de C. dubliniensis; determinar e comparar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) das amostras, frente a sete antifúngicos (E-test); caracterizar molecularmente as amostras seqüenciais de Candida pela técnica de PFGE; estudar e comparar o perfil genotípico de isolados de C. albicans e C. parapsilosis, através da análise de marcadores microsatélites e cariotipagem. O nível de concordância entre o método tradicional e o API 20C foi de 93%. Nenhum isolado de C. dubliniensis foi identificado no estudo. Em relação à sensibilidade antifúngica, a maioria das amostras apresentou alta porcentagem de sensibilidade às sete drogas testadas. A análise molecular pela técnica de PFGE, mostrou seis perfis de cariótipos diferentes em 24 amostras seqüenciais. Em relação à comparação das técnicas de PFGE e microssatélites, observamos que a última mostrou maior poder discriminatório para as amostras de estudadas. / This study was aimed to: identify the 70 isolates of Candida in a culture collection by the traditional method and by API 20C; identify the presence of C. dubliniensis; determine and compare the minimum inhibitory concentrations (MICs) of these samples in regard to the seven drugs (E-test); molecularly characterize sequential samples from the same patient by the PFGE technique; study the genotypic profile of all the isolates of C. albicans and C. parapsilosis by means of the microsatellite technique and compare the results with those obtained by the PFGE technique. The level of agreement between the traditional method and the API 20C was 93%. No isolate of C. dubliniensis was identified in the study. In relation to antifungal susceptibility, most of the samples presented a high percentage of susceptibility to the seven drugs tested. The molecular analysis by the PFGE technique revealed six different karyotype profiles among 24 sequential samples. In the comparison between the PFGE and microsatellite, the latter showed a greater discriminatory power for samples.

Candida species have emerged as the second most common cause of vulvovaginitis in the world, producing infections that can cause unwanted symptoms such as itching, discharge, dyspareunia and burning. The objective of this study was to evaluate the genetic variability and the antifungal susceptibility profile of Candida yeasts isolated from vaginal secretions of patients Maceió - Alagoas. The yeasts were collected weekly in the sector of five clinical microbiology laboratories located in the city of Maceió between March and December 2010. For each isolate was performed through a purification of seeding a suspension of yeast in YPD solid medium. DNA extraction was performed by phenol / chloroform and identification by PCR with primers species specific for C.albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei and C. parapsilosis. The patients with vaginal candidiasis were evaluated for the presence of symptoms and risk factors for acquiring the disease. The patterns of sensitivity to ketoconazole, fluconazole, itraconazole and amphotericin B were evaluated according to CLSI standards (M27-A2).Molecular typing was used in the microsatellite (GTG) 5 and the fragments separated on 1.5% agarose gel at 75 volts / cm for 120 minutes, stained with ethidium bromide and viewed on photodocumentation system. Banding patterns were analyzed by BioNumerics 6.5 soltware to obtain electropherogram using the similarity coefficient Jacard. We obtained 296 isolates of Candida yeasts, and C. albicans (82.45%) the most frequent species, followed by C. glabrata with 7.75%, C. parapsilosis with 4.05%, C. tropicalis witn 3.75% and C. krusei 2%. These isolates exhibited resistance profile of 66,7% for amphotericin B, fluconazole for 52,6%, 89,7% for itraconazole and to ketoconazole 21,3%. Among the risk factors for acquiring the disease stands out pregnancy with 24.66% and history of VVC in 15.52%. The main clinical sign was presented discharge in 77,13% of cases. The species analyzed showed a high diversity for the genetic marker (GTG)5, with values ranging from 0.7470 to 0.9963, which allowed the formation of genetic patterns 172 for C. albicans, 10 for C. tropicalis, 11 for C. parapsilosis, 8 for C. glabrata and 4 for C. krusei. The incidence of Candida species with a profile of resistance to itracozaol, amphotericin B, fluconazole and ketoconazole, provides epidemiological data for the study area and reinforces the importance of identifying yeasts to the species level and testing of in vitro antifungal susceptibility. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As espécies de Candida têm emergido como a segunda causa mais comum de vulvovaginites no mundo, produzindo infecções, que podem causar sintomas indesejáveis como, prurido, corrimento, dispareunia e ardor. O objetivo desse estudo foi avaliar a variabilidade genética e o perfil de susceptibilidade aos antifúngicos em leveduras do gênero Candida isoladas de secreção vaginal de pacientes de Maceió Alagoas. As amostras foram coletadas no setor de microbiologia clínica de cinco laboratórios localizados na cidade de Maceió, entre Março e Dezembro de 2010. Para cada isolado foi realizada uma purificação por meio de semeio de uma suspensão da levedura em meio YPD sólido. A extração do DNA foi realizada pelo método do fenol/clorofórmio e a identificação por PCR com iniciadores espécie-específicos para C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei e C. parapsilosis. As pacientes com candidíase vulvovaginal foram avaliadas quanto à presença de sintomas e fatores de risco para aquisição da doença. Os padrões de sensibilidade ao cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B foram avaliados de acordo com as normas do CLSI (M27-A2). Na tipagem molecular foi utilizado o microssatélite (GTG)5 e os fragmentos separados em gel de agarose 1,5 % a 75 volts/cm por 120 minutos, corados com brometo de etideo e visualizados em sistema fotodocumentação. Os padrões de bandas obtidos foram analisados pelo soltware BioNumerics 6.5 para obtenção de eletroferograma utilizando o coeficiente de similaridade Jacard. Foram obtidos 296 isolados de leveduras do gênero Candida, sendo C. albicans (82,45%) a espécie mais frequente, seguida de C. glabrata com 7,75%, C. parapsilosis com 4,05%, C. tropicalis com 3,75% e C. krusei com 2%. Esses isolados exibiram perfil de resistência de 66,7% para anfotericina B, 52,6% para fluconazol, 89,7% para itraconazol e 21,3% para cetoconazol. Entre os fatores de risco para aquisição da doença destaca-se gravidez com 24,66% e histórico prévio de CVV em 15,54%. O principal sinal clínico apresentado foi corrimento em 77,13% dos casos. As espécies analisadas apresentaram elevada diversidade para o marcador genético (GTG)5, com valores que variaram de 0,7470 a 0,9963, o que possibilitou a formação de 172 padrões genéticos para C. albicans, 10 para C. tropicalis, 11 para C. parapsilosis, 8 para C. glabrata e 4 para C. krusei. O aparecimento de espécies de Candida com perfil de resistência ao itraconazol, anfotericina B, fluconazol e cetoconazol, fornece dados epidemiológicos para região estudada e reforça a importância da identificação das leveduras em nível de espécie e da realização de testes de sensibilidade antifúngica in vitro.

Nos últimos anos, várias espécies de fungos, até então conhecidos como saprófitas do ambiente, têm emergido como importantes patógenos na prática clínica, associados muitas vezes com a resistência aos antimicrobianos disponíveis comercialmente. Dessa forma, o conhecimento de aspectos relacionados à patogenicidade desses micro-organismos, como a formação de biofilme, assim como o perfil de susceptibilidade aos antifúngicos e a novas alternativas terapêuticas faz-se necessário. Uma importante tecnologia neste contexto é a utilização de sistemas nanoestruturados a partir de polímeros biodegradáveis para a veiculação de fármacos. Este trabalho visa verificar em isolados fúngicos emergentes a expressão fenotípica de biofilme através do teste em microplaca de poliestireno e o perfil de susceptibilidade frente a antifúngicos na forma livre e incorporados em sistemas nanoestruturados, através da técnica de microdiluição em caldo. Foram selecionados para o estudo 82 isolados fúngicos potencialmente patogênicos, sendo 26 oriundos do ambiente e 56 procedentes de espécimes clínicos. Quanto à capacidade de formação de biofilme verificou-se que 68 (82,9%) isolados produziram biofilme pelo teste da microplaca, sendo 38 classificados como fortes, 17 como moderados e 13 como fracos produtores. Além disso, observou-se que os isolados clínicos apresentaram maior capacidade de formação de biofilme do que os isolados ambientais. Não houve correlação entre a produção de biofilme e a susceptibilidade aos antifúngicos testados nas células planctônicas. De um modo geral, os fungos foram sensíveis à maioria dos antifúngicos testados neste trabalho. Entretanto, o fluconazol apresentou baixa atividade (CIM≥64μg/mL) para 45% dos isolados avaliados. Com o intuito de investigar o efeito de cetoconazol e de fluconazol associados a nanoestruturas sobre os diferentes fungos apresentados no estudo, também foram desenvolvidas nanocápsulas de poli-ɛ-caprolactona contendo estes fármacos. Análises físico-químicas das nanoestruturas revelaram tamanho médio de partícula variando de 206 nm para as nanocápsulas de cetoconazol (CN) e de 211 nm para as nanocápsulas de fluconazol (FN). Ambas as formulações apresentaram características homogêneas e demonstraram estruturas monodispersas. A eficiência de encapsulação do cetoconazol e do fluconazol nas formulações foi de 86,35 e de 80,5%, respectivamente. Os diversos gêneros investigados parecem se comportar de maneira diferente quando expostos às nanoestruturas dos dois fármacos em estudo, sugerindo que as espécies de Candida poderiam apresentar uma maior susceptibilidade in vitro frente a estas nanoestruturas quando comparadas à forma livre dos antifúngicos em questão. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destas formulações para a veiculação de cetoconazol e fluconazol. Como perspectivas, sugere-se a realização de estudos adicionais para evidenciar o efeito in vitro das nanopartículas sobre os diferentes fungos de importância clínica e ambiental. / In recent years, several fungal species known as environmental saprophytes have emerged as important pathogens in clinical practice, often associated with antimicrobial resistance commercially available. Thus, the knowledge of aspects related to these pathogenic micro-organisms, such as biofilm formation, as well as the profile of susceptibility to antifungal agents and new therapeutic options is necessary. An important technology in this context is the use of nanostructured materials from biodegradable polymers for the placement of drugs. This work aims to examine the emerging fungal isolates in the phenotypic expression of biofilm through the test on polystyrene microplate and the susceptibility profile to antifungals front in the free trade and in the nanostructured systems by the broth microdilution method. In this study, 82 potentially pathogenic fungal isolates were selected, being the 26 from environment originating and the 56 from the clinical specimens. Regarding the ability of biofilm formation was found that 68 (82,9%) isolates produced biofilm by the microplate assay. The isolates were classified as 38 strong, 17 moderate and 13 weak biofilm producers. Moreover, it was noted that clinical isolates showed greater capability for the biofilm formation than the environmental isolates. There was no correlation between the biofilm production and the susceptibility to antifungal agents tested in planktonic cells. In general, the fungi were susceptible of the majority of the antifungal agents tested in this study. However, the fluconazole showed low activity (MIC≥64μg/mL) for 45% of the isolates. In order to investigate the effect of the ketoconazole and the fluconazole associated with nanostructures against different fungi contained in the study, polymeric nanocapsules have also been developed containing these drugs. Physicochemical analyzes showed an average size of nanostructures ranging from 206 nm for the nanocapsules of ketoconazole (CN), and 211 nm for the fluconazole (FN). The formulations showed homogeneous characteristics and demonstrated monodisperse structures. The encapsulation efficiency of ketoconazole and fluconazole in the formulations was 86,35 and 80,5%, respectively. The diverse genera investigated appear to behave differently when exposed to the nanostructures of the two drugs have being studied, suggesting that Candida species could exhibit a greater sensitivity to these nanostructures compared to the free form of antifungal concerned. The results demonstrate the potential of the formulations for the delivery of fluconazole and ketoconazole. As perspectives, we suggest further studies to demonstrate the in vitro effect of the nanoparticles against different fungi from the clinical and the environmental importance.

Nos últimos anos, várias espécies de fungos, até então conhecidos como saprófitas do ambiente, têm emergido como importantes patógenos na prática clínica, associados muitas vezes com a resistência aos antimicrobianos disponíveis comercialmente. Dessa forma, o conhecimento de aspectos relacionados à patogenicidade desses micro-organismos, como a formação de biofilme, assim como o perfil de susceptibilidade aos antifúngicos e a novas alternativas terapêuticas faz-se necessário. Uma importante tecnologia neste contexto é a utilização de sistemas nanoestruturados a partir de polímeros biodegradáveis para a veiculação de fármacos. Este trabalho visa verificar em isolados fúngicos emergentes a expressão fenotípica de biofilme através do teste em microplaca de poliestireno e o perfil de susceptibilidade frente a antifúngicos na forma livre e incorporados em sistemas nanoestruturados, através da técnica de microdiluição em caldo. Foram selecionados para o estudo 82 isolados fúngicos potencialmente patogênicos, sendo 26 oriundos do ambiente e 56 procedentes de espécimes clínicos. Quanto à capacidade de formação de biofilme verificou-se que 68 (82,9%) isolados produziram biofilme pelo teste da microplaca, sendo 38 classificados como fortes, 17 como moderados e 13 como fracos produtores. Além disso, observou-se que os isolados clínicos apresentaram maior capacidade de formação de biofilme do que os isolados ambientais. Não houve correlação entre a produção de biofilme e a susceptibilidade aos antifúngicos testados nas células planctônicas. De um modo geral, os fungos foram sensíveis à maioria dos antifúngicos testados neste trabalho. Entretanto, o fluconazol apresentou baixa atividade (CIM≥64μg/mL) para 45% dos isolados avaliados. Com o intuito de investigar o efeito de cetoconazol e de fluconazol associados a nanoestruturas sobre os diferentes fungos apresentados no estudo, também foram desenvolvidas nanocápsulas de poli-ɛ-caprolactona contendo estes fármacos. Análises físico-químicas das nanoestruturas revelaram tamanho médio de partícula variando de 206 nm para as nanocápsulas de cetoconazol (CN) e de 211 nm para as nanocápsulas de fluconazol (FN). Ambas as formulações apresentaram características homogêneas e demonstraram estruturas monodispersas. A eficiência de encapsulação do cetoconazol e do fluconazol nas formulações foi de 86,35 e de 80,5%, respectivamente. Os diversos gêneros investigados parecem se comportar de maneira diferente quando expostos às nanoestruturas dos dois fármacos em estudo, sugerindo que as espécies de Candida poderiam apresentar uma maior susceptibilidade in vitro frente a estas nanoestruturas quando comparadas à forma livre dos antifúngicos em questão. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destas formulações para a veiculação de cetoconazol e fluconazol. Como perspectivas, sugere-se a realização de estudos adicionais para evidenciar o efeito in vitro das nanopartículas sobre os diferentes fungos de importância clínica e ambiental. / In recent years, several fungal species known as environmental saprophytes have emerged as important pathogens in clinical practice, often associated with antimicrobial resistance commercially available. Thus, the knowledge of aspects related to these pathogenic micro-organisms, such as biofilm formation, as well as the profile of susceptibility to antifungal agents and new therapeutic options is necessary. An important technology in this context is the use of nanostructured materials from biodegradable polymers for the placement of drugs. This work aims to examine the emerging fungal isolates in the phenotypic expression of biofilm through the test on polystyrene microplate and the susceptibility profile to antifungals front in the free trade and in the nanostructured systems by the broth microdilution method. In this study, 82 potentially pathogenic fungal isolates were selected, being the 26 from environment originating and the 56 from the clinical specimens. Regarding the ability of biofilm formation was found that 68 (82,9%) isolates produced biofilm by the microplate assay. The isolates were classified as 38 strong, 17 moderate and 13 weak biofilm producers. Moreover, it was noted that clinical isolates showed greater capability for the biofilm formation than the environmental isolates. There was no correlation between the biofilm production and the susceptibility to antifungal agents tested in planktonic cells. In general, the fungi were susceptible of the majority of the antifungal agents tested in this study. However, the fluconazole showed low activity (MIC≥64μg/mL) for 45% of the isolates. In order to investigate the effect of the ketoconazole and the fluconazole associated with nanostructures against different fungi contained in the study, polymeric nanocapsules have also been developed containing these drugs. Physicochemical analyzes showed an average size of nanostructures ranging from 206 nm for the nanocapsules of ketoconazole (CN), and 211 nm for the fluconazole (FN). The formulations showed homogeneous characteristics and demonstrated monodisperse structures. The encapsulation efficiency of ketoconazole and fluconazole in the formulations was 86,35 and 80,5%, respectively. The diverse genera investigated appear to behave differently when exposed to the nanostructures of the two drugs have being studied, suggesting that Candida species could exhibit a greater sensitivity to these nanostructures compared to the free form of antifungal concerned. The results demonstrate the potential of the formulations for the delivery of fluconazole and ketoconazole. As perspectives, we suggest further studies to demonstrate the in vitro effect of the nanoparticles against different fungi from the clinical and the environmental importance.