<i>Staphylococcus aureus</i> is a ubiquitous organism causing world-wide morbidity and mortality. This species readily develops resistance to antimicrobial agents. Current dosing strategies are based, in part, on minimum inhibitory concentrations (MICs). This susceptibility test fails to detect the presence of first-step resistant mutants often present in large heterogeneous populations of infecting bacteria. Dosing strategies based on MIC results may, in fact, allow for the selective proliferation of resistant subpopulations. The mutant-prevention concentration (MPC) is the drug concentration at which all first-step resistant mutants will be eradicated along with the susceptible cells. Determination of the mutant-selection window (MSW) is possible using MIC and MPC data. When considered together with achievable drug concentrations in human bodily sites, the MSW helps determine which antimicrobials are likely to select for resistance. MIC and MPC testing on clinical isolates of methicillin-susceptible (MSSA) and -resistant (MRSA) S. aureus was performed. Characterization via the polymerase chain reaction, sequencing, and electron microscopy (EM) was done on selected organisms recovered from MPC studies (MPC-recovered). MIC and MPC testing was performed on organisms isolated sequentially from patients with recurring S. aureus infections. Pulsed field gel electrophoresis was performed on these sequential isolates. Based on the MIC and the MPC values, the most potent agents for systemic MSSA and MRSA infections are gemifloxacin and vancomycin, respectively. Re-testing MPC-recovered populations by the MIC showed increased MIC results compared to the parent populations. Macrolide-resistance genes were discovered in S. aureus MPC-recovered populations; in contrast, parental isolates lacked these resistance determinants. EM revealed an increase in cell wall thickness of a vancomycin MPC-recovered population compared to its parental population. Moxifloxacin and vancomycin had the lowest and narrowest MSWs for systemic MSSA and MRSA infections, respectively, compared to the other agents tested. Sequential isolates showed no change in MIC and MPC values. The data presented provides evidence for the application of the MPC test to S. aureus organisms. The MPC data is significant when determining appropriate dosing strategies aimed at preventing resistance.

<i>Staphylococcus aureus</i> is a ubiquitous organism causing world-wide morbidity and mortality. This species readily develops resistance to antimicrobial agents. Current dosing strategies are based, in part, on minimum inhibitory concentrations (MICs). This susceptibility test fails to detect the presence of first-step resistant mutants often present in large heterogeneous populations of infecting bacteria. Dosing strategies based on MIC results may, in fact, allow for the selective proliferation of resistant subpopulations. The mutant-prevention concentration (MPC) is the drug concentration at which all first-step resistant mutants will be eradicated along with the susceptible cells. Determination of the mutant-selection window (MSW) is possible using MIC and MPC data. When considered together with achievable drug concentrations in human bodily sites, the MSW helps determine which antimicrobials are likely to select for resistance. MIC and MPC testing on clinical isolates of methicillin-susceptible (MSSA) and -resistant (MRSA) S. aureus was performed. Characterization via the polymerase chain reaction, sequencing, and electron microscopy (EM) was done on selected organisms recovered from MPC studies (MPC-recovered). MIC and MPC testing was performed on organisms isolated sequentially from patients with recurring S. aureus infections. Pulsed field gel electrophoresis was performed on these sequential isolates. Based on the MIC and the MPC values, the most potent agents for systemic MSSA and MRSA infections are gemifloxacin and vancomycin, respectively. Re-testing MPC-recovered populations by the MIC showed increased MIC results compared to the parent populations. Macrolide-resistance genes were discovered in S. aureus MPC-recovered populations; in contrast, parental isolates lacked these resistance determinants. EM revealed an increase in cell wall thickness of a vancomycin MPC-recovered population compared to its parental population. Moxifloxacin and vancomycin had the lowest and narrowest MSWs for systemic MSSA and MRSA infections, respectively, compared to the other agents tested. Sequential isolates showed no change in MIC and MPC values. The data presented provides evidence for the application of the MPC test to S. aureus organisms. The MPC data is significant when determining appropriate dosing strategies aimed at preventing resistance.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-05Bitstream added on 2014-06-13T20:35:49Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_pa_me_jabo.pdf: 283666 bytes, checksum: 9d4635249701354d18b4a667c65f5861 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de cepas de Escherichia coli produtoras de Shiga toxina (STEC) em queijos mussarela produzidos artesanalmente. Foram analisadas 59 amostras de queijo, produzidas no Vale do Jequitinhonha (Nordeste de Minas Gerais, Brasil). Isolando-se 147 cepas de E. coli e através da técnica de PCR, foram investigadas a presença dos genes da Shiga toxina (stx 1 e stx 2) e da intimina (eae). Dezesseis cepas bacterianas (10,8%) apresentaram o gene stx ( todas portavam o gene stx 1) e 13 delas também se mostraram eae positivas. Os isolados de E. coli foram também examinados para a detecção dos genes codificadores de adesinas (pap, sfa e afa). Não foram identificados nenhum desses genes.Todas as cepas STEC isoladas foram pesquisadas para resistência a 12 agentes antimicrobianos. As resistências predominantes detectadas foram de 37,5% para estreptomicina, 37,5% para a tetraciclina, 31,2% para a ampicilina e 31,2% para a amicacina. A resistência a múltiplas drogas foi encontrada em 5 cepas (31,2%). A presença dos genes codificadores dos fatores de virulência indica que o queijo mussarela produzido artesanalmente pode representar um risco à saúde dos consumidores. / The aim of the present study was to investigate the occurrence of Escherichia coli strains presenting the Shiga toxin gene (probably STEC strains) in mussarela cheese produced by artesanal method in the Jequitinhonha Valey (Northeast of Minas Gerais State, Brazil). Fifty-nine cheese samples were analyzed and a hundred forty seven strains of E. coli were isolated. Using the PCR method the strains were screened for the Shiga toxin (stx 1 and stx 2) and the intimin (eae) genes. Sixteen isolates (10,8%) carried the stx gene (all of them showed the stx 1 gene ) and thirteen also presented the eae gene. Using the same method the strains were screened for the presence of pap, afa, and sfa genes, adhesin genes caracteristics of the E. coli extraintestinal pathogenic strains (ExPEC). None of them showed these adhesin genes and could not be classified as an ExPEC strains. The susceptibility of the probably STEC strains to twelve antimicrobial drugs were evaluated. The most important resistance was detected to the streptomycin (37,5%), tetracycline (37,5%), ampicillin (31,2%) and amikacin (31,2%). The multidrug resistance was detected in 5 isolates (31,2%). The presence of coding genes for virulence factors in the E. coli isolates recovered from mussarela cheese produced by artesanal method could represent a risk for the human health.

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-03-03T10:48:26Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-03-03T10:48:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

The objective of this study was to evaluate the antimicrobial and anti-caries effects of two plant extracts. The first chapter dealt with a review of the literature whose objective was to discuss the antimicrobial potential of Brazilian natural agents on the biofilm related to dental caries and gingivitis/periodontal disease. The research of the articles was carried out using PubMed. We found a total of 23 papers. Most of the studies were performed using planktonic microorganisms or under clinical trials. Nineteen articles were focused on cariogenic bacteria. From these nineteen articles, eleven were also about periodontopathogenic bacteria. Four studies addressed only periodontopathogenic bacteria. The most tested Brazilian natural agents were green propolis, essential oils of Lippia sidoides and Copaifera sp. Most of the tested agents showed similar results when compared to positive control (essential oils and extracts) or better effect than negative control (green propolis). More studies involving protocols closer to the clinical condition and the use of response variables that allows understanding the mechanism of action of natural agents are necessary before the incorporation of these natural agents into dental products. The second chapter aimed to test the effect of the hydroalcoholic extracts of Myracrodruon urundeuva All. and Qualea grandiflora Mart. leaves on the viability of the microcosm biofilm and on the prevention of enamel demineralization. The microcosm biofilm was produced on bovine enamel, using human saliva pool mixed with McBain saliva (0.2% sucrose) for 14 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva at 100, 10 and 0.1 g/ml and Q. grandiflora at 100 and 0.1 g/ml reduced cell viability similarly to the positive control and significantly more than negative control. M. urundeuva at 1000, 100 and 0.1 g/ml were able to reduce the counting formation unit-CFU counting of lactobacilli sp. and Streptococcus mutans, while Q. grandiflora at 1000 and 1.0 g/ml significantly reduced the S. mutans CFU counting. On the other hand, the natural extracts did not reduce the production of extracellular polyssacharides, lactic acid and the development of enamel caries lesions. The third chapter aimed to evaluate the effect of hydroalcoholic extracts of M. urundeuva and Q. grandiflora (alone or combined) on the viability of S. mutans biofilm and the prevention of enamel demineralization. S. mutans strain (ATCC 21175) was reactivated in BHI broth. Minimum inhibitory concentration, minimum bactericidal concentration, minimum biofilm inhibitory concentration and minimum biofilm eradication concentration were determined to choose the concentrations to be tested under the biofilm model. S. mutans biofilm (5x105 CFU/ml) was produced on bovine enamel using McBain saliva with 0.2% sucrose for 3 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva (isolated or combined) at concentrations equal or higher than 0.625 mg/ml was able to reduce the bacteria viability, whereas Q. grandiflora extract alone showed antimicrobial effect at 5 mg/ml only (p<0.05). On the other hand, none of the extracts was able to reduce the development of enamel caries lesions. Despite the tested natural extracts have antimicrobial effect; they are unable to prevent caries in enamel. / O objetivo foi avaliar os efeitos antimicrobiano e anti-cárie de dois extratos de plantas. O primeiro capítulo se referiu a uma revisão da literatura cujo objetivo foi discutir o potencial antimicrobiano dos agentes naturais brasileiros sobre o biofilme relacionado à cárie dentária e à gengivite/doença periodontal. A pesquisa dos artigos foi realizada usando o PubMed. Foram encontrados 23 trabalhos. A maioria dos estudos foi realizada utilizando microorganismos na fase planctônica ou ensaios clínicos. Dezenove artigos foram focados em bactérias cariogênicas. Dos dezenove artigos, onze também eram sobre bactérias periodontopatogênicas. Quatro estudos abordaram apenas bactérias periodontopatogênicas. Os agentes naturais brasileiros mais testados foram própolis verde, óleos essenciais de Lippia sidoides e Copaifera sp. Os agentes testados apresentaram resultados similares quando comparados ao controle positivo (óleos essenciais e extratos) ou melhor efeito que o controle negativo (própolis verde). Mais estudos próximos da condição clínica e o uso de variáveis de resposta que permitam entender o mecanismo de ação são necessários, para permitir a incorporação desses agentes naturais em produtos odontológicos. O segundo capítulo teve como objetivo testar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de Myracrodruon urundeuva All. e Qualea grandiflora Mart. sobre a viabilidade do biofilme microcosmo e na prevenção da desmineralização do esmalte. O biofilme microcosmo foi produzido em esmalte bovino, utilizando pool de saliva humana misturada à saliva de McBain (0,2% de sacarose) durante 14 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva a 100, 10 e 0,1 g/ml e Q. grandiflora a 100 e 0,1 g/ml reduziram a viabilidade dos microrganismos de forma semelhante ao controle positivo e significativamente maior do que o controle negativo. M. urundeuva a 1000, 100 e 0,1 g/ml foi capaz de reduzir a contagem de Unidade formadora de colônia-UFC para Lactobacilos totais e Streptococcus mutans, enquanto a Q. grandiflora a 1000 e 1,0 g/ml reduziu significativamente a contagem de UFC para S. mutans. Os extratos naturais não conseguiram reduzir a produção de polissacarídeos extracelulares-PEC, ácido lático e o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte. O terceiro capítulo teve como objetivo avaliar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de M. urundeuva. e Q. grandiflora (sozinhos ou combinados) sobre a viabilidade do biofilme de S. mutans e na prevenção da desmineralização do esmalte. Cepa de S. mutans (ATCC 21175) foi reativada em caldo BHI. Concentração inibitória mínima, concentração bactericida mínima, concentração inibitória mínima de biofilme e concentração de erradicação mínima de biofilme foram determinadas para escolher as concentrações a serem testadas sob o modelo de biofilme. O biofilme de S. mutans (5x105 CFU/ml) foi produzido em esmalte bovino, utilizando saliva de McBain com 0,2% de sacarose durante 3 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva (isolada ou combinada) nas concentrações iguais ou superiores a 0,625 mg/ml foi capaz de reduzir a viabilidade das bactérias, enquanto que o extrato da Q. grandflora apresentou efeito antimicrobiano somente a 5 mg/ml (p<0,05). Nenhum dos extratos reduziu o desenvolvimento da lesão da cárie. Apesar dos extratos naturais terem efeito antimicrobiano, são incapazes de prevenir o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The edible coatings are defined as a thin layer of edible material usually applied in liquid form on the product by immersing the same. Several studies have shown that the addition of bioactive substances such as essential oils have increased antimicrobial packaging potential of these, contributing to the increased food shelf life. Thus, this study aimed to develop and evaluate in vitro and in situ microbiological efficiency of edible coatings to chitosan base incorporated with essential oils of Myrcia ovata Cambess (MYRO). The antimicrobial potential of 9 essential oils (EOs) was evaluated in vitro by diffusion technique in discs against foodborne bacteria (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus faecalis and Salmonella enteritidis). Due to greater availability of MYRO-174 and MYRO-175 oils and being gram-positive bacteria very sensitive to extremely sensitive to them, these were selected for incorporation into edible eatable coatings of chitosan base.The edible coatings formulations were prepared ranging cassava starch, chitosan and essential oil concentrations according the central composite rotational design (23 + 6 axial points and 3 central points). The bacteria were sensitive to edible coatings with diameters of inhibition zone between 9.0 -12.5 mm. The edible coatings formulations containing MYRO-175 oil were optimized for the B. Cereus and B. subtilis inhibition using the response surface methodology, a predictive mathematical model for the inhibition of them was obtained. The essential oil concentration was the more significant parameter to antimicrobial activity of coatings. The edible coatings incorporated with MYRO-174 oil or MYRO-175 (1.00% cassava starch, 1.00% chitosan and 1.25% essential oil) were applied in mangabas and the antimicrobial potential against natural microflora and Bacillus cereus artificially contaminated in the fruits was studied. The coated mangabas showed total mesophilic aerobic bacteria counts the order of 102 CFU/g, molds and yeasts <10 CFU/g (estimated value) and inhibition of growth of B. cereus for 12 days of storage at 10°C. On the other hand, uncoated mangabas (control) rotted from the 8th day of refrigerated storage. The edible coatings based in chitosan incorporated with M. ovata Cambess. EOs demonstrated potential to be used as an alternative in vitro microbiological control of foodborne bacteria and in situ on mangaba preservation. / As coberturas comestíveis são definidas como uma camada fina de material comestível, geralmente aplicada na forma líquida sobre o produto, por imersão do mesmo. Várias pesquisas têm demonstrado que a adição de substâncias bioativas como os óleos essenciais têm aumentado o potencial antimicrobiano destas embalagens contribuindo para o aumento da vida de prateleira de alimentos. Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo desenvolver e avaliar in vitro e in situ a eficiência microbiológica de coberturas comestíveis à base de quitosana incorporadas com óleos essenciais de Myrcia ovata Cambessedes (MYRO). O potencial antimicrobiano de 9 óleos essenciais foi avaliado in vitro através da técnica de difusão em discos frente à bactérias patogênicas de alimentos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Salmonella enteritidis). Devido a maior disponibilidade dos óleos MYRO-174 e MYRO-175 e sendo as bactérias Gram-positivas de muito sensíveis a extremamente sensíveis aos mesmos, estes foram selecionados para a incorporação nas coberturas comestíveis a base de quitosana. As formulações de coberturas comestíveis foram elaboradas variando-se as concentrações de fécula de mandioca, quitosana e óleo essencial conforme o delineamento composto central rotacional (23 + 6 pontos axiais e 3 pontos centrais). As bactérias foram sensíveis às coberturas com halos de inbição entre 9,0 –12,5 mm. As formulações contendo o óleo MYRO-175 foram otimizadas para a inibição de B. cereus e B. subtilis utilizando a metodologia de superfície de resposta, sendo possível obter um modelo matemático preditivo para a inibição das mesmas. A concentração de óleo essencial foi o parâmetro significativo para a atividade antimicrobiana das coberturas. As coberturas comestíveis incorporadas com o óleo MYRO 174 ou MYRO-175 (1,0% de fécula de mandioca, 1,0% de quitosana e 1,25% de óleo essencial) foram aplicadas em mangabas e o potencial antimicrobiano foi avaliado frente a microbiota e ao Bacillus cereus artificialmente contaminado nos frutos. As mangabas revestidas com cobertura comestível apresentaram contagens de bactérias aeróbias mesófilas totais da ordem de 102 UFC/g, bolores e leveduras < 10 UFC/g (valor estimado) e inibição do crescimento de B. cereus por 12 dias de armazenamento a 10ºC. Já as mangabas sem revestimento (controle) apodreceram a partir do 8º dia de estocagem refrigerada. As coberturas comestíveis à base de quitosana incorporadas com óleos essenciais de M. ovata Cambessedes demonstraram potencial para serem utilizadas como alternativa no controle microbiológico in vitro de bactérias patogênicas de alimentos e in situ na conservação de mangabas.

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-03-03T10:48:26Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-03-03T10:48:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O desenvolvimento de novos procedimentos e tecnologias tem proporcionado um grande avanço no tratamento de feridas e queimaduras, melhorando a qualidade de vida das vítimas e reduzindo as taxas de mortalidade de pessoas com queimaduras graves. Entretanto as complicações infecciosas continuam sendo um desafio e uma das principais causas de óbito de queimados. Por outro lado, em todo o mundo tem-se observado um crescente interesse no uso de hidrogéis para aplicação como curativos para queimaduras, ferimentos e úlceras de pele, tendo em vista que são capazes de absorver exsudatos, ajudam na cicatrização e proporcionam conforto ao paciente, uma vez que favorecem o alívio da dor. Além disso, os hidrogéis também podem ser aplicados como matrizes para sistemas de liberação controlada de princípios ativos e agentes antimicrobianos. O objetivo deste trabalho foi estudar as propriedades mecânicas e físico-químicas de hidrogéis compostos por blendas formadas por Poli(N-vinil-2-pirrolidona)/ Polietilenoglicol/ ágar (PVP/PEG/ágar), Poli(N-vinil-2-pirrolidona)/ glicerol/ ágar (PVP/glicerol/ágar); Poli(álcool vinílico)/ kappa-carragena/ ágar (PVA/KC/ágar), reticuladas por radiação ionizante. Para a preparação das blendas, utilizou-se planejamento de misturas como ferramenta, oferecendo assim subsídios a futuros desenvolvimentos de novos hidrogéis, que possam ser usados como curativos e como matrizes poliméricas para liberação de ativos hidrofílicos e lipofílicos. Foram otimizadas três formulações e sintetizadas seis, três das quais hidrogéis nanocompósitos de prata. As nanopartículas de prata (NPAg) foram sintetizadas, in situ, por radiação gama, sem uso de catalisadores ou outro reagente para obtenção de curativo mais puro e com ação antimicrobiana. A caracterização físico-química dos hidrogéis foi obtida por análises de fração gel, intumescimento, ensaios de tração e perfuração, microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia na região do ultravioleta-visível (UV-vis). Também foi avaliada a atividade antimicrobiana dos hidrogéis e realizado estudo de citotoxicidade in vitro. O planejamento de misturas apresentou modelos confiáveis para os resultados de fração gel e intumescimento, porém, para as propriedades mecânicas, os resultados devem ser vistos com cautela. O uso da radiação se mostrou eficaz para a síntese de NPAg in situ nas blendas estudadas. Os resultados sugerem que os hidrogéis sintetizados não liberaram NPAg, porém os hidrogéis de PVP apresentaram atividade bactericida para S. aureus e P. Aeruginosa, enquanto que o hidrogel de PVA apresentou atividade bactericida para P. aeruginosa e atividade bacteriostática para S. aureus, sendo essa atividade pelo contato direto. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2016-11-11T17:21:57Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2016-11-11T17:21:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O carcinoma mucoepidermóide de pulmão, um tipo histológico que deriva das glândulas mucosas traqueobrônquicas, manifesta-se com sintomas obstrutivos e tende a comprometer a traqueia. Com finalidade curativa ou paliativa da doença, atualmente há uma forte tendência na oncologia em desenvolver estratégias terapêuticas que visam à administração de compostos com elevado potencial de otimizar o efeito do tratamento com a radiação ionizante, de modo a aumentar a morte de células tumorais e preservar íntegras as células dos tecidos sadios adjacentes. A intensa busca por tais estratégias evidenciou resultados promissores apresentados pelo composto denominado Resveratrol (3,4,5-trihidroxiestilbeno), tornando-o amplamente divulgado e alvo de intensas pesquisas. O principal objetivo do presente estudo foi determinar o efeito do resveratrol em cultura celular de carcinoma mucoepidermóide de pulmão exposta a diferentes doses de radiação ionizante. Para tal, os estudos de citotoxicidade utilizando o método de incorporação do vermelho neutro, e da determinação da dose letal 50 % (DL50) da radiação ionizante, foram realizados em cultura de células da linhagem NCI-H292 [H292] (ATCC® CRL-1848TM), CCIAL069. Com base nos resultados do IC50% (401,5 &mu;M) e da DL50 (693 Gy) foram realizados o teste in vitro do micronúcleo e os ensaios para avaliar o efeito do resveratrol no ciclo celular, reparo da lesão no DNA e processo de lesão radioinduzida, necrose e apoptose celular. Os resultados evidenciaram que o resveratrol na concentração de 30 &mu;M apresenta uma importante capacidade em promover danos às células NCI-H292 após 24 h da irradiação. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-21T19:09:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Francielle Campos Lima - 2016.pdf: 2372165 bytes, checksum: 338af5a42ce51711564e513a92bae046 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-26T11:33:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Francielle Campos Lima - 2016.pdf: 2372165 bytes, checksum: 338af5a42ce51711564e513a92bae046 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T11:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Francielle Campos Lima - 2016.pdf: 2372165 bytes, checksum: 338af5a42ce51711564e513a92bae046 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Schiff bases are imine compounds with wide applications in several are as of knowledge, highlighting mainly in the biology fields, especially for antimicrobials applications. The synthesis of six new Schiff bases (SB) are displayed. They were obtained from the direct condensation methanolic solutions of drugs already actives (4- and 5-ASA) with different aldehydes. The synthesized compounds were characterized as to their fusion point, solubility, CHN elementary analysis, infrared absorption spectroscopy, ultraviolet visible spectroscopy and nuclear magnetic resonance of hydrogen. The synthesized products were evaluated in bioassays on E. coli, S. aureus and P. aeruginosa strains. The nature of the characterized compounds class confirms the acquired products as objectified. Two biological results were obtained, as the analyzed variable, the composition of the prepared stock solution. With DMF, the results were biased, from which nothing can be stated because of the possibility of influencing as a false positive result. The other results using DMSO stock solution exhibited a positive prospect regarding the MIC values, with special attention to the BS6 and BS9 ligands wich showed better activity. / Bases de Schiff são compostos iminicos com amplas aplicações nas mais diversas áreas do conhecimento, destacando-se principalmente na área da biologia, com destaque para aplicações como antimicrobianos. A síntese de seis novas bases de Schiff (BS), obtidas a partir da condensação direta de soluções metanólicas de fármacos já ativos (4- e 5-ASA) com diferentes aldeídos, é apresentada. Os compostos sintetizados foram caracterizados quanto ao seu ponto de fusão, solubilidade, analise elementar CHN, espectroscopia de absorção na região do infravermelho, espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta visível e espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Os produtos sintetizados foram avaliados em ensaios biológicos frente a estirpes de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. A natureza da classe de compostos caracterizada confirma a obtenção dos produtos conforme objetivado. Dois resultados dos ensaios biológicos foram obtidos, sendo a variável analisada, a composição da solução estoque preparada. Com DMF os resultados se apresentaram tendenciosos, a partir dos quais nada pode ser afirmado devido a possibilidade de influenciar em um resultado falso positivo. Já os demais resultados utilizando-se solução estoque com DMSO, exibiram um panorama positivo em relação aos valores de CMI, com atenção especial para os ligantes BS6 e BS9 que mostraram melhor atividade.

O estudo de fungos endofíticos tem sido intensificado nos últimos anos e abrange principalmente a descrição de novas espécies, o potencial de utilização no controle biológico de fitopatógenos e a produção de metabólitos secundários com atividades biológicas diversas. No entanto, a interação e a possível função destes organismos em plantas de clima tropical são pobremente estudadas e pouco compreendidas. A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido à produção de etanol para uso como biocombustível. Um grande avanço no conhecimento das comunidades microbianas endofíticas desta planta tem sido alcançado, abrindo a possibilidade de estudo sobre as funções destes organismos na interação endofítica, bem como de seu potencial biotecnológico. Uma espécie que coloniza consistentemente os tecidos de cana-de-açúcar é o fungo Epicoccum nigrum. Este fungo é conhecido por sua atividade de biocontrole de fitopatógenos e por apresentar metabolismo secundário altamente desenvolvido e diverso. Nesse contexto, este trabalho teve por objetivos: 1) estudar a diversidade genética de isolados endofíticos de Epicoccum de cana-de-açúcar e de outros hospedeiros; 2) desenvolver um sistema de transferência de genes repórteres, visando à análise da interação in vitro e in vivo com cana-deaçúcar; 3) avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de isolados endofíticos de Epicoccum contra diferentes fitopatógenos e patógenos humanos; 4) obter mutantes insercionais com atividade antimicrobiana ausente, visando à identificação de genes envolvidos no metabolismo secundário. O trabalho foi iniciado com o isolamento de Epicoccum de cana-de-açúcar. A análise por meio de abordagem polifásica resultou na separação dos isolados em dois taxa distintos (Grupo 1, E. nigrum; Grupo 2, Epicoccum sp.), demonstrando que a classificação de E. nigrum como uma única espécie variável deve ser reavaliada. A seguir, transformantes resistentes a higromicina B e expressando GFP foram obtidos por meio de transferência gênica mediada por A. tumefaciens. Ensaios de colonização de cana-de-açúcar in vitro e in vivo com a linhagem selvagem e transformada demonstraram a natureza não patogênica das linhagens e que E. nigrum é capaz de colonizar endofiticamente e persistir nas folhas desta planta. A análise da atividade antimicrobiana revelou extensa variação fisiológica, a qual foi correlacionada com a variabilidade genética dos isolados. Uma biblioteca de agrotransformantes de E. nigrum e Epicoccum sp. foi caracterizada quanto à perda da atividade antimicrobiana. A análise das seqüências flanqueadoras do T-DNA obtidas por TAIL-PCR a partir dos mutantes revelou que a inserção ocorreu em diferentes locais do genoma, muitos com elevada similaridade com proteínas hipotéticas de fungos, algumas sem função conhecida, e outras contendo domínios conservados envolvidos em diferentes funções celulares, como regulação da expressão gênica, transporte, obtenção de energia e outras funções enzimáticas. A análise do extrato orgânico por meio de bioautografia revelou a perda da atividade antimicrobiana de alguns mutantes insercionais, em comparação ao extrato da linhagem selvagem. O grande número de mutantes obtidos e caracterizados constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário deste fungo endofítico, auxiliando o entendimento da biossíntese de diversos compostos com estruturas complexas produzidos por esta espécie. / The study of endophytic fungi has increased in last few years and includes mainly the description of new species, biological control and production of compounds with biological activity. However, due the fact that few studies have been done, the role of these microorganisms inside the host plant from tropical areas is poorly understood. Sugarcane is one of the most important crop in Brazil, mainly due the biofuel production. Therefore, studies have been done to better understanding the role of endophytic microbial diversity inside the sugarcane plants, allowing the possibility to use this interaction in sugarcane production and also find endophytic isolates with biotechnological potential. Previous studies have shown that an important sugarcane endophytic fungus is Epicoccum nigrum, which species has been associated to biological control of many phytopathogens and also production of different secondary metabolites. In this way, the aims of the present study were to 1) study the genetic diversity of sugarcane endophytic Epicoccum; 2) develop a genetic transformation system for Epicoccum spp., allowing the in vitro and in vivo study of the interaction with sugarcane; 3) evaluate the in vitro antimicrobial activity of Epicoccum; 4) obtain mutants defective to antimicrobial activity and identification of genes associated to this activity. The polyphasic approach indicated that the evaluated Epicoccum population present two different genotypes (Group 1: E. nigrum and Group 2: Epicoccum sp.), suggesting that the classification of E. nigrum in only one species should be revised. Mutants resistant to hygromicin B and expressing GFP gene were obtained by transformation with Agrobacterium tumefaciens. In vitro and in vivo sugarcane colonization showed that the Epicoccum isolates and mutants were able to settling endophytically inside sugarcane without induce disease symptoms, and live up to leaves. The results shown that the antimicrobial activity was related to genetic variability, and this activity was better characterized by analysis of a obtained mutant library of E. nigrum and Epicoccum sp. The TAIL-PCR analysis revealed that the T-DNA introduced into the mutants was inserted in different regions of the fungi genome, truncating different genes those coding fungi hypothetical proteins, conserved domain associated to cellular function, such as genetic regulation, energy obtaining and others enzymatic activity. The analysis by bioautography indicated that some mutants lose the antimicrobial activity, allowing the correlation between the truncated genes and antimicrobial compound production. The evaluation of this mutant library showed that different genes are associated to antimicrobial compound production and may be an important tools to study the secondary metabolism in this endophytic fungus, allowing the understanding of biochemical pathway associated to biosynthesis of complex molecules produced by this fungus.