La separación y purificación de una proteína desde una fermentación a gran escala es un elemento crítico en los procesos modernos biotecnológicos, puesto que representa el mayor costo industrial. Es por esto que numerosos estudios se enfocan en mejorar y/o disminuir las etapas de purificación, de manera de aumentar la pureza de la proteína de interés, y al mismo tiempo disminuir los costos de producción. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico a una celulasa del tipo endoglucanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para este estudio se seleccionaron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P), de a lo más 6 aminoácidos, para formar la secuencia del extremo que fue adicionado en el extremo carboxilo terminal de la enzima nativa, mediante la técnica Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las endoglucanasas mutadas Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3. Los cultivos productores de las endoglucanasas modificadas con los extremos hidrofóbicos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas; luego las proteínas fueron recuperadas de la fracción extracelular para la posterior medición de actividad enzimática, proteína total y cálculo de la actividad específica. La adición de extremos hidrofóbicos no afectó la distribución de la actividad enzimática en las fracciones subcelulares, puesto que la endoglucanasa nativa y las mutadas presentaron comportamiento similar: más del 90% de actividad en el medio extracelular y en el periplasma un 6% aproximadamente. Los valores de proteína total demostraron que la endoglucanasa nativa y las mutadas tienen una igual distribución de proteínas, aproximadamente de un 87% en el medio extracelular y 8% en la fracción periplasmática. Con esto, fue posible concluir que la actividad y recuperación de la endoglucanasa no se vio afectada por la adición de los extremos hidrofóbicos. Adicionalmente, las endoglucanasas nativa y modificadas se purificaron por HIC, utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa Fast Flow 6FF. De los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retención adimensionales (DRT), de acuerdo a la fracción en la cual eluyó cada una de las endoglucanasas. En todos los cromatogramas se observó una tendencia similar, presentándose dos peaks de actividad tanto para la endoglucanasa nativa como para las modificadas. Esto se atribuye a la presencia de proteasas en el medio que posiblemente fragmentaron a la proteína en un sitio previo al extremo hidrofóbico. Se recomienda para futuros estudios, agregar inhibidores de proteasas para evitar estos sucesos. Por otra parte, se calculó la hidrofobicidad superficial de la endoglucanasa nativa y el aporte de cada extremo polipeptídico, para esto se usó como modelo una endoglucanasa de código pdb 1TVN, que tenía un 88,4 % de identidad a nivel de aminoácidos con la enzima utilizada en este estudio. Las proteínas mutadas presentaron en los valores de DRT un aumento porcentual promedio respecto de la endoglucanasa nativa de 19,7 %, 15,0 %, 14,3 % y 10,9 % para el caso de Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3 respectivamente, los cuales se relacionan con el porcentaje de aumento de la hidrofobicidad superficial total de la proteína (φ), según la recta: DRT = 2,41φ – 19,36 con un R2 = 0,96. Finalmente, se estableció como criterio cualitativo para seleccionar el extremo que reporte mayores mejoras en el proceso de purificación, que no es necesario que el extremo hidrofóbico incluya prolina para que esta proteína extracelular mantenga su actividad. Y como criterios cuantitativos, se estableció que el extremo a adicionar debe tener una hidrofobicidad menor a 500 y que existe una relación lineal entre el aumento de DRT y el aumento de hidrofobicidad.

En la producción de proteínas una de las etapas más importantes es la de purificación, por lo que muchos estudios se enfocan en modificar esta etapa de manera de mejorar la pureza de la proteína de interés. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico corto (tag) a una xilanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para el estudio se escogieron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P) para formar la secuencia del extremo, y se realizaron mutaciones en la proteína para adicionar esta secuencia en el extremo C terminal de la misma por medio de la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las mutantes Xilanasa-(WP)2, Xilanasa-(YP)2Y, Xilanasa-Y3 y Xilanasa-(YP)3. Las cepas de la proteína modificada con estos extremos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo de la fracción periplasmática de la célula, se midió actividad enzimática y proteína total, y actividad específica. Para la cepa nativa y las mutantes, se observó una baja producción de proteína, como se indica en los resultados de proteína y actividad total. Debido a esto se sugiere hacer un estudio de las condiciones óptimas de crecimiento e inducción tanto para la proteína nativa como para las modificadas. En el caso de la xilanasa mutada con la secuencia (YP)3, se observó que en la fracción periplasmática obtuvo la menor cantidad de proteína total, pero la mayor actividad xilanolítica total, mientras que para el resto de las mutantes, se obtuvo una mayor actividad total en la fracción extracelular. Por esto, se recomienda hacer un estudio para analizar las causas de esta forma de expresión de la xilanasa en estudio. Las fracción periplasmática de la cepa nativa y las 4 cepas mutadas se analizó por HIC utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa y se calculó gráficamente los tiempos de retención adimensional (DRT) de a cuerdo a la fracción en que eluyó la proteína en cada caso. Para la xilanasa nativa y las 4 mutadas se observó una tendencia similar en los cromatogramas, y los DRT presentaron un aumento porcentual promedio respecto de la xilanasa nativa de 46,17 % y 31,82 % para las mutantes Xilanasa-(WP)2 y Xilanasa-(YP)2Y respectivamente, mientras que para la Xilanasa-Y3 se observó una disminución de la hidrofobicidad en un 16,6 %. El aumento de los DRT coincide con la presencia de prolinas en el extremo adicionado, mientras que la disminución del mismo se observa en ausencia de este aminoácido. La Xilanasa-(YP)3 se excluyó del estudio de los DRT, debido a que no presentó actividad en medio sólido en las fracciones de la cromatografía, por lo que no se pudo determinar en qué fracción eluyó dicha proteína. Esto se debe probablemente a la baja cantidad de proteína presente en el periplasma de esta cepa. Se calculó la hidrofobicidad superficial de la xilanasa nativa, y el aporte de cada cola a ella. Sin embargo, para esto se utilizó un modelo de xilanasa cuya secuencia posee aproximadamente un 38% de parecido, por lo que no es confiable, y se recomienda buscar un modelo que tenga un mayo porcentaje de similitud con la proteína de trabajo o modelar la misma. Es posible concluir que el aumento de hidrofobicidad superficial de la proteína xilanasa debida a la adición de una secuencia corta de aminoácidos hidrofóbicos, permite un aumento del DRT de las proteínas para el caso de las extremos que contienen prolina como la (WP)2 e (YP)2Y. En el caso del extremo que no tiene prolina (Y3), se observa una disminución de los tiempos de retención adimensional, por lo que se recomienda continuar el estudio de extremos hidrofóbicas sin prolinas, para confirmar la importancia de la presencia de este aminoácido en la secuencia de estos extremos.

A partir de las nuevas políticas de gestión de residuos de la Planta Santa Fe de Celulosa de la Compañía Manufacturera de Papeles y Cartones (CMPC), ubicada en la Octava región de Chile en la ciudad de Nacimiento, y debido al eventual término de la vida útil del área de desechos controlados (ADC) que esta posee, se realizó un estudio con el objeto de producir compost a partir de tres diferentes desechos sólidos que esta genera. El objetivo principal de este estudio fue utilizar estos residuos para evaluar el potencial uso de estos RISes como compost, según la Norma Chilena (NCh) 2880 del año 2005 “Compost-clasificación y requisitos”, la cual clasifica el compost como tipo A o B dependiendo de su calidad; el compost tipo B presenta algunas restricciones en su uso. Particularmente, se estudió el proceso de compostaje, producido a través de la biodegradación aeróbica, de Lodos de la planta de tratamientos de efluentes primarios y secundarios, Corteza de Eucalipto proveniente de la descortezadora y una mezcla de Dregs/Grits (7:3) ambos proveniente de la planta química recuperadora de licor blanco utilizado en el proceso de digestión de la madera. El trabajo realizado consistió en el montaje de tres experimentos con el fin de comparar las características finales de los residuos compostados. En el primer experimento se evaluó la mezcla de los residuos en distintas proporciones, en pequeños volúmenes. En un segundo experimento, debido a la línea de estudio recomendada por la empresa, se realizó el compostaje de los residuos por separado. Finalmente, en un tercer experimento, se realizó una mezcla Lodos/Corteza 1:1 con el objeto de comparar su caracterización final con los resultados obtenidos en el segundo experimento. De acuerdo a la NCh 2880 (2005) los experimentos se monitorearon periódicamente, determinando variación de la temperatura, pH, humedad, densidad aparente, conductividad eléctrica, materia orgánica, carbono orgánico, nitrógeno total, relación C/N, concentración de metales pesados y número de las bacterias presentes. Los resultados demuestran que en los experimentos realizados no se logró tal como se esperaba, un aumento de la temperatura por sobre los 35°C, lo que habría dado cuenta de la participación de microorganismos termófilos, típicos en estos procesos. Además se observó, con las caracterizaciones finales de los residuos, que ninguno de ellos podrían ser clasificados como compost Tipo A. No obstante, los Lodos y la mezcla Lodos/Corteza con una proporción mayor a 2:1 serían los mejores candidatos para producir compost Tipo B, si se lograra disminuir las concentraciones de Níquel y Zinc.

No description available.

No description available.

No description available.

Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.

No description available.

No description available.

La celulosa es un polisacárido que se encuentra presente en la naturaleza, el cual es de importancia mundial, debido a sus propiedades únicas que lo hacen fundamental en aplicaciones industriales tan diversas, como lo son en la producción del papel, en la industria biomédica, en el vestuario, cosméticos, entre otros. No sólo los organismos vegetales son capaces de producir celulosa, sino que también microorganismos como las bacterias Acetobacter, entre ellas la bacteria Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus), la cual es el organismo más estudiado por el rendimiento de biopelícula producida, como también por la fuente de celulosa limpia obtenida sin necesidad de purificación. Sin embargo, este rendimiento varía según las condiciones en las que crece la bacteria, como lo son la fuente de glucosa utilizada y la oxigenación que necesita al ser un microorganismo aeróbico estricto. Se ha utilizado esta bacteria a nivel industrial de producción, no obstante, el alto costo de mantenimiento por las necesidades antes mencionadas, no ha logrado concretar el potencial que esta fuente entrega. Es por esto, que en el presente estudio se buscó una fuente natural de oxigenación, como lo es la microalga Chlorella vulgaris (C.vulgaris), la cual es de fácil manejo y económicamente rentable de mantener en laboratorio por sus amplios usos, como también su capacidad de producir oxigeno bajo luminosidad constante como fotoperiodo. Así es como en este trabajo de investigación se caracterizó el crecimiento de G. xylinus y C. vulgaris. Luego, se realizaron co-cultivos (CC) y cultivos separados (CS) entre ambos microorganismos. El objetivo de esta investigación fue estudiar la capacidad de optimizar la producción de celulosa bacteriana, entregando oxigenación controlada xv desde las microalgas fotosintéticamente activas (bajo fotoperiodo y luz constante) hacia el cultivo bacteriano. Nuestros resultados indican que, mediante la metodología de CS y bajo luminosidad constante al sexto día de cultivo estático, se produjo un rendimiento de celulosa bacteriana, dos veces mayor al producido por los controles, siendo el oxígeno producido por las microalgas esencial para esta producción. Estos resultados sugieren que sería más eficiente producir CS por sólo seis días que dejar cultivos por doce días estáticos, siendo factible producir más de dos cultivos para producir un mayor rendimiento que uno por más días. / Cellulose is a polysaccharide that is present in nature, which is of global importance, due to its unique properties that make it essential in industrial applications as diverse as in paper production in the biomedical industry, clothes, cosmetics, among others. Not only are plants capable of producing cellulose, but also microorganisms such as the bacteria Acetobacter, including the bacteria Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus), which is the organism most studied for the biofilm yield produced, as well as by the source of clean cellulose obtained without purification. However, this yield varies depending on the conditions in which the bacteria grow, such as the source of glucose used and the oxygenation it needs as a strict aerobic microorganism. This bacteria has been used at the industrial production level, however, the high cost of maintenance because of the aforementioned needs, has failed to realize the potential that this source delivers.For this reason, in the present study, a natural source of oxygenation was sought, as is the microalga Chlorella vulgaris (C.vulgaris), which is easy to use and economically profitable to maintain in the laboratory for its wide uses, as well as its ability to produce oxygen under constant light as photoperiod. Therefore,the growth of G. xylinus and C. vulgaris was characterized in this research work, by performing co-cultures (CC) and separate cultures (CS) between both microorganisms. The objective of this research was to study the ability to optimize the production of bacterial cellulose, by delivering controlled oxygenation from photosynthetically active microalgae (under photoperiod and constant light) to the bacterial culture. xvii Our results indicate that, through the CS methodology and under constant luminosity at the sixth day of static cultivation, a yield of bacterial cellulose, was produced twice as high as that produced by the controls, the oxygen produced by the microalgae being essential for this production. These results suggest that it would be more efficient to produce CS for only six days than to leave cultures for twelve static days, being feasible to produce more than two cultures to produce a higher yield than one for more days. / Programa de Estímulo a la Excelencia Institucional (PEEI) de la Universidad de Chile