Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los agentes antimicrobianos han sido usados en la agricultura desde comienzos de la década de los cincuenta, ya sea para el tratamiento y prevención de enfermedades infecciosas como también para promover el crecimiento y aumentar la eficiencia alimentaria en animales. Al igual que lo ocurrido en medicina humana, el uso y abuso de drogas antimicrobianas han generado una exagerada presión de selección sobre las poblaciones bacterianas, lo que ha tenido como consecuencia la emergencia y diseminación de resistencia bacteriana. El impacto de la resistencia bacteriana ha sido de tal magnitud que organizaciones como la Organización Mundial de la Salud, vienen trabajando desde la década de los ochenta para incentivar la implementación de una serie de medidas que logren de alguna manera, mitigar el explosivo aumento de la resistencia bacteriana a nivel mundial. Entre ellas, una de las más importantes es la implementación de redes de vigilancia de la resistencia bacteriana a nivel nacional que permitan determinar los niveles de resistencia bacteriana y evaluar la efectividad de las medidas implementadas. El objetivo fundamental de este estudio, fue determinar los niveles de resistencia en cepas de Salmonella spp. aisladas desde bovinos provenientes de las regiones V, Metropolitana y X, y de esta manera poder evaluar la situación actual de la resistencia en este importante agente zoonótico en estos animales de producción. De las 29 cepas de Salmonella spp. aisladas desde 2.118 bovinos se hallaron los siguientes serotipos: Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Typhimurium, Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Panama, Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Mbandaka y Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Dublin. El 86,21% de las cepas mostró resistencia a uno o más de los 14 antimicrobianos analizados, existiendo un alto porcentaje de multiresistencia (68%). Las drogas que presentaron mayor número de cepas resistentes fueron: amoxicilina (72%), oxitetraciclina (72%) y estreptomicina (48%); siendo quinolonas el único grupo de antimicrobianos al que las cepas presentaron un 100% de sensibilidad. Se establecieron 12 diferentes perfiles de resistencia para las cepas de Salmonella spp. aisladas. Estos resultados permiten visualizar la necesidad de implementar una serie de medidas en el ámbito de la medicina veterinaria, entre las que se encuentra establecer un programa de vigilancia de la resistencia bacteriana a nivel nacional, de carácter permanente. Este programa de vigilancia debería incluir aislamientos realizados en alimentos y especies de abasto, complementando con esto la información de los programas humanos actualmente vigentes

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las bacterias nosocomiales han tenido gran repercusión en la práctica médica al producir una alta morbilidad y mortalidad en pacientes inmunocomprometidos, debido principalmente a su capacidad fenotípica de multiresistencia a antimicrobianos. La información que permite a una bacteria desarrollar un mecanismo de resistencia se encuentra en su material genético, existiendo la posibilidad de traspasarlo en forma horizontal a otras bacterias. Adicionalmente, causan un gran costo para el paciente y los centros de atención al generar complicaciones y una mayor estancia hospitalaria. Así, es necesario realizar un seguimiento dinámico de las especies nosocomiales, para establecer una retroalimentación constante respecto de su existencia y la de los fenómenos medioambientales involucrados en su presentación, con la finalidad de mejorar los protocolos de control de los patógenos asociados a este tipo de infecciones. Este protocolo debe incluir la búsqueda de los genes responsables de la resistencia a los antimicrobianos en distintas especies y analizar su relación epidemiológica, buscando resguardar la salud pública y animal. El objetivo de este trabajo fue identificar los genes más frecuentemente descritos que otorgan resistencia a los antimicrobianos beta-lactámicos (ampicilina y meticilina), mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en sesenta y siete aislados ambientales obtenidos y caracterizados previamente, entre los años 2007 y 2008- desde unidades clínico Veterinarias de la Universidad de Chile. La implementación de la técnica de PCR permitió la detección de fragmentos de ADN compatibles con los descritos en la detección del gen blaTEM en bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas y en la detección del gen mecA, en bacterias Gram-positivas, encontrando indiscutiblemente un alto porcentaje de bacterias que poseerían estos genes, lo que debe generar una gran preocupación para los encargados de los recintos hospitalarios veterinarios de la Universidad de Chile y como medida preventiva, se deben realizar esfuerzos para controlar esta realidad / Financiamiento: FIV 4602016

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la sociedad moderna, la tenencia de animales de compañía constituye una práctica cada vez más frecuente, extendiéndose a nivel mundial y a través de todas las clases socioeconómicas. Así, dentro de muchas otras áreas, la participación del médico veterinario ha aumentado en el ámbito clínico de mascotas, logrando grandes avances en técnicas diagnósticas, quirúrgicas y terapéuticas. Al igual que los humanos, las mascotas pueden sufrir diversas enfermedades, pudiendo tener algunas un componente infeccioso. Frente a las infecciosas de origen bacteriano, la principal herramienta con que cuentan los profesionales, son los antimicrobianos. Desde su descubrimiento, los antimicrobianos han constituido la primera línea de acción frente a enfermedades bacterianas, ayudando a disminuir su impacto -tanto en las personas como en distintas poblaciones animales- encontrándose disponible una variada gama de sustancias, con diferentes mecanismos de acción e indicaciones terapéuticas. Sin embargo, desde hace ya varios años se ha observado la presencia y aumento de la resistencia bacteriana a diversos antimicrobianos, constituyendo un tema de gran preocupación mundial tanto en medicina humana como veterinaria. Entre los antimicrobianos que han visto reducida su efectividad debido a la resistencia bacteriana se encuentran los betalactámicos, como meticilina y oxacilina, y las tetraciclinas, como doxiciclina y oxitetraciclina. El objetivo de este trabajo fue la detección, mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), del gen mecA involucrado en la resistencia a meticilina y de los genes tet(M) y tet(O), involucrados en la resistencia a tetraciclinas mediante la generación de proteínas de protección ribosomal, en cepas de Staphylococcus coagulasa positivas aisladas desde gatos. La aplicación de esta técnica de biología molecular permitió detectar dos de los tres genes mencionados, en cepas caracterizadas como sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia de acuerdo a antibiogramas por difusión en agar. Los resultados de este trabajo señalan que la detección de genes de resistencia a antimicrobianos complementaría la técnica del antibiograma de la Microbiología clásica en el estudio de la resistencia bacteriana. Finalmente, la secuenciación y posterior determinación del porcentaje de identidad nucleotídica respecto del GenBank® de uno de los genes detectados otorgó al laboratorio de Microbiología del Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, un control positivo para continuar con los estudios moleculares de resistencia bacteriana / Proyecto FIV Nº 12101401.9102.008

A colonização e proliferação de micro-organismos periodontopatogênicos na gengiva marginal aos implantes dentários, assim como ao redor de seus componentes protéticos, pode representar riscos à saúde dos tecidos peri-implantares, à semelhança do que ocorre com os tecidos periodontais. O objetivo deste estudo foi identificar e quantificar 32 espécies microbianas de biofilmes coletados das superfícies de dois sistemas de encaixe para sobredentaduras retidas por implantes: um esférico (Retentive Anchor, Institut Straumann AG, Suíça - RA) e um cilíndrico (Locator, Zest Anchors Inc., CA-USA - Loc), das próteses, implantes e sulcos peri-implantares, ao longo do tempo. Os biofilmes analisados foram coletados em um estudo randomizado envolvendo 24 pacientes portadores de prótese total superior e sobredentadura inferior retida por dois implantes com sistemas de encaixe esférico RA (n= 12) ou cilíndrico Loc (n= 12). Amostras de biofilme foram coletadas de sete sítios para cada implante, nos períodos: após a instalação de novos encaixes (baseline), assim como aos 3 e 12 meses subsequentes. A identificação e quantificação das espécies microbianas foram realizadas por meio da técnica de hibridização DNA-DNA Checkerboard. Os resultados foram submetidos à análise não paramétrica de modelo misto ANOVAF, e matriz de covariância não estruturada para cada tratamento, com nível de significância de 0.05, posteriormente ajustado por Benjamini-Hochberg false discovery rate (FDR). Considerando-se todos os sítios e períodos investigados em conjunto e as 32 espécies bacterianas investigadas, apenas a S. constellatus foi encontrada em maior abundância nos biofilmes associados ao sistema RA. A análise sítio-específica revelou maior prevalência das espécies S. constellatus e P. micra na rosca do componente macho do encaixe esférico RA e da espécie S. sanguinis na superfície externa do componente macho do encaixe cilíndrico Loc. De modo geral, pôde-se concluir que os sistemas de encaixe para retenção de sobredentaduras RA e Loc são colonizados por microbiotas com perfis semelhantes, embora esses sistemas exerçam influência seletiva sobre o padrão de colonização das espécies bacterianas S. constelatus, P. micra e S. sanguinis / The colonization and proliferation of periodontopathogenic microorganisms in the dental implants marginal gingiva, as well as around their prosthetic components, may represent risks to the health of the peri-implant tissues, similar to what occurs with the periodontal tissues. The objective of this study was to identify and quantify 32 microbial species of biofilms collected from the surfaces of two attachment systems for implant retained mandibular overdentures: one spherical (Retentive Anchor, Institut Straumann AG, Switzerland - RA) and one cylindrical (Locator, Zest Anchors Inc., CA-USA - Loc), of prostheses, implants and peri-implant sulcus, over time. The biofilms analyzed were collected in a randomized study involving 24 patients with superior complete dentures and inferior overdenture retained by two implants with spherical attachment RA (n = 12) or cylindrical Loc (n = 12) systems. Biofilm samples were collected from seven sites of each implant, at the periods: after new attachments installation (baseline), as well at the next 3 and 12 months. The microbial species identification and quantification were carried out using DNA-DNA Checkerboard hybridization technique. The results were submitted to the mixed model non-parametric analysis \"ANOVAF\" and non-structured covariance matrix for each treatment, with 0.05 significance level, later adjusted by \"Benjamini-Hochberg\" false discovery rate (FDR). Considering all the sites and periods investigated together and the 32 bacterial species investigated, only S. constellatus was found in greater abundance in the biofilms associated to the RA system. The site-specific analysis revealed a higher prevalence of S. constellatus and P. micra species on the male component of the RA spherical attachment and of S. sanguinis species on the outer surface of the male component of the cylindrical Loc attachment. In general, it can be concluded that the overdenture attachment systems RA and Loc are colonized by microbiotas with similar profiles, although these systems exert a selective influence on the colonization pattern of S. constelatus, P. micra and S. sanguinis bacterial species

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Resumo: Escherichia coli é o principal agente de mastite clínica bovina de origem ambiental, caracterizado pela complexidade de fatores de virulência (FV). O patógeno causa sinais clínicos que variam desde alterações exclusivamente no leite (grau 1 ou leve), no quarto afetado (grau 2 ou moderado), até manifestações sistêmicas (grau 3 ou grave). No entanto, até o momento, não está estabelecido o perfil de genes deste patógeno relacionados à virulência em infecções mamárias em vacas, tampouco com a gravidade clínica dos casos. Neste cenário, o presente estudo investigou 18 genes associados com E. coli extraentérica (ExPEC), o perfil “in vitro” de motilidade swimming e swarming, e a sensibilidade/resistência aos antimicrobianos em 114 isolados de E. coli obtidos de vacas com mastite clínica com escores de gravidade 1 (45/114=39,5%), 2 (62/114=54,4%) e 3 (7/114=6,1%). Os principais genes codificadores de FV detectados foram de adesinas (fimH, 114/114=100%; ecpA, 73/114=64,0%; fimA, 36/114=31,6%), resistência ao soro (traT, 93/114=81,6%; ompT, 40/114=35,1%), sideróforos (irp2, 11/114=9,6%) e hemolisina (hlyA, 8/114=7%). Os isolados apresentaram 99,1% (113/114) de resistência in vitro a bacitracina e cloxacilina, 98,2% (112/114) a lincosamina e 54,4% (62/114) a eritromicina. Do total de isolados, 98,2% (n=112/114) foram multirresistentes pelo cálculo do índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (IRMA). Não houve diferença estatística significante entre as medianas para motilidade ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Escherichia coli is the major pathogen involved in the etiology of bovine mastitis from the environment origin. This pathogen is characterized by a complexity of virulence factors (VF). Mammary infections by E. coli has shown a wide range of clinical signs causing changes in milk (score 1 or mild), quarters (score 2 or moderate), and systemic signs (score 3 or severe). Nevertheless, to date, the profile of the genes related to the virulence of this pathogen in mammary infections and the severity scores of the cases are not fully understood. In this scenario, a panel of 18 genes associated with extra-intestinal E. coli (ExPEC) were investigated, in addition to in vitro swimming and swarming motility profile, and antimicrobial susceptibility/resistance pattern among 114 E. coli strains isolated from cows with clinical mastitis showing severity scores 1 (45/114=39.5%), 2 (62/114=54.4%) and 3 (n=7/114=6.1%). The main genes related to VF harbored by isolates were adhesins (fimH, 114/114=100%; ecpA, 73/114=64.0%; fimA, 36/114=31.6%), serum resistance (traT, 93/114=81.6%; ompT, 40/114=35.1%), siderophores (irp2, 11/114=9.6%) and hemolysin (hlyA, 8/114=7%). Among studied isolates, 99.1% (113/114) showed in vitro resistance to bacitracin and cloxacillin, 98.2% (112/114) to lincosamin, and 54.4% (62/114) to erytromycin. Out of the total isolates, 98.2% (112/114) were considered multidrug resistant based on multiple antimicrobial resistance (MAR) index. No statistical difference was obs... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A multirresistência aos antibióticos observada em bacilos gram-negativos é um grave problema de saúde pública devido a alta morbidade e mortalidade apresentada, especialmente em instituições assistenciais de saúde. Como consequência do intenso uso de antibióticos, a multirresistência a esses fármacos é principalmente mediada por enzimas hidrolisantes, onde destaca-se as enzimas ?-lactamases, principal mecanismo de resistência aos ?-lactâmicos verificado em bacilos gram-negativos. Os esgotos de origem hospitalar e de estações de tratamento de esgoto (ETE) são considerados como reservatórios de bactérias multirresistentes pela presença de antibióticos que as selecionam e por favorecem a transmissão de determinantes de resistência. Nesse sentido, o presente estudo objetivou avaliar a multirresistência a antibióticos e a produção de enzimas ?-lactamases em bacilos gram-negativos isolados de efluente hospitalar e da estação de tratamento de esgoto, na cidade de Ribeirão Preto, SP. No hospital terciário, amostras de esgotos foram coletadas dos ambulatórios, das enfermarias e da junção do esgoto hospitalar. Na ETE, amostras foram coletadas na caixa de entrada do esgoto bruto e após ao tratamento. Dez microlitros foram semeados em ágar MacConkey, SalmonellaShigella, Cetrimide e TCBS e a identificação dos bacilos gram-negativos foi realizada pelo kit Bactray®. O teste de susceptibilidade aos antibióticos foi realizado pelo método de discodifusão em ágar. A detecção fenotípica de bacilos produtores de ESBL foi realizada pelos testes de sinergia de disco-duplo e disco combinado com ácido clavulânico, e para detecção de isolados produtores de carbapenemases foi utilizado os testes de disco combinado com ácido fenilborônico e EDTA e o teste Blue Carba. A PCR foi utilizada para amplificação dos genes codificadores de ESBL e carbapenemases. No total, 45 bacilos gram-negativos foram isolados, sendo as espécies Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa as de maiores prevalências. Ampla resistência foi verificada aos antibióticos ?-lactâmicos, sendo a resistência ao aztreonam, a cefepime e a cefotaxima mais expressiva nos isolados do esgoto hospitalar, com diferenças estatisticamente significante (p<0,05). O fenótipo multidroga resistente foi atribuído a 33,3%, nos isolados exclusivamente do esgoto hospitalar, com diferença estatisticamente significante (p = 0,0025) em relação aos isolados do esgoto da ETE. Genes de ?-lactamases foram encontrados em 35,6% das bactérias, sendo o blaKPC e blaTEM os de maiores ocorrências, ambos em 17,8% dos isolados, e os genes blaSHV e blaCTX-M em 13,3% e 8,9%. Somente em um isolado de Enterobacter cloacae no esgoto tratado da ETE foi identificado o gene blaSHV, os demais isolados portadores dos genes de ?-lactamases foram encontrados no esgoto hospitalar. Os dados obtidos neste estudo são importantes levando em consideração que no Brasil o esgoto hospitalar pode ser lançado in natura na rede coletora municipal, no entanto, acredita-se que tal permissão favorece a disseminação da multirresistência bacteriana, posto que, os resultados demonstram alta frequência de bactérias portadoras de genes de resistência a antibióticos no esgoto hospitalar estudado. Assim, a implementação do tratamento de efluentes hospitalares, especialmente os de hospitais terciários, e adicionalmente ao tratamento da ETE evitaria a propagação dessas bactérias no ambiente e de impactar negativamente os recursos hídricos / Antibiotic multi-resistance observed in Gram-negative bacilli is a serious public health problem due to high morbidity and mortality, especially in health care institutions. As a consequence of the intense use of antibiotics, multi-resistance to these drugs is mainly mediated by hydrolyzing enzymes, in which ?-lactamases, the main ?-lactam resistance mechanism observed in Gramnegative bacilli, are prominent. Hospital sewage and wastewater treatment plants (WWTP) are considered reservoirs of multiresistant bacteria by the presence of antibiotics that select these bacteria and favor the transmission of resistance determinants. In this sense, the present study aimed to evaluate the antibiotics multi-resistance and the production of ?-lactamase enzymes in Gram-negative bacilli isolated from hospital effluent and the wastewater treatment plants in Ribeirão Preto city, SP. In the tertiary hospital, sewage samples from the outpatient clinics, rooms patients and the hospital sewage junction were collected. In the WWTP, raw and treated sewage were collected. Ten microliters were seeded on MacConkey, Salmonella-Shigella, Cetrimide and TCBS agar and the identification of Gram-negative bacilli was performed by the Bactray® kit. Antibiotic susceptibility test was performed by agar-diffusion method. Phenotypic detection of ESBL-producing bacilli was performed by double-disc and discsynergy tests combined with clavulanic acid, and for the detection of carbapenemase-producing isolates the combined disk tests with phenylboronic acid and EDTA and Blue Carba test were used. PCR amplification of ESBL and carbapenemases-encoding genes was used. In total, 45 Gram-negative bacilli were isolated, and Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa being the most prevalent. Extensive resistance was verified to ?-lactam antibiotics and resistance to aztreonam, cefepime and cefotaxime was more pronounced in hospital sewage isolates, with statistically significant differences (p<0.05). Multidrug-resistant phenotype was attributed to 33.3% in isolates exclusively from hospital sewage, with a statistically significant difference (p = 0.0025) in relation to the sewage isolates from the WWTP. ?-lactamase genes were found in 35.6% of the bacteria, with blaKPC and blaTEM having the highest occurrences, both in 17.8% of the isolates, and the blaSHV and blaCTX-M genes in 13.3% and 8, 9%. Only in an isolate of Enterobacter cloacae in the treated sewage from WWTP was the blaSHV gene identified, the other isolates carrying the ?-lactamases genes were found in hospital sewage. The data obtained in this study are important considering that in Brazil the hospital sewage can be released in nature in municipal collection network, however, it is believed that such permission favors the dissemination of bacterial multi-resistance, since, the results show high frequency of bacteria carrying antibiotic resistance genes in the hospital sewer studied. Thus, the implementation of treatment of hospital effluents, especially those in tertiary hospitals, and in addition to the treatment of WWTP would prevent the spread of these bacteria in the environment and negatively impact water resources

Orientador: Adriano Sakai Okamoto / Resumo: Uma das principias doenças transmitida por alimento é a salmonelose, causada pela bactéria Salmonella spp., ela está presente em vários aviários, e com o aumento da produção avícola, se disseminou nos aviários, tornando-se um problema pertinente e de grande importância na saúde pública e animal. Com isso medidas de controle foram instituídas, entre elas o uso de antimicrobiano, causando diversas discussões, principalmente em relação a resistência bacteriana á antimicrobianos utilizados na medicina humana, onde medidas alternativas estão sendo desenvolvidas para evitar o uso dos antimicrobianos. Dessa forma o objetivo do projeto foi avaliar a capacidade dos Lactobacillus spp., isolados na inibição da Salmonella Heidelberg (SH), pelo mecanismo de quorum sensing in vitro e in vivo. Foram colhidos de suabes cloacal de frangos de corte que passaram por provas fenotípica e molecular. Esses isolados foram submetidos ao teste de inibição em placa para avaliar a capacidade de inibição da SH. Em seguida foram produzidos os filtrados, a partir dos Lactobacillus sp. (ATCC), separadamente, com contato com a SH. Esses isolados foram cultivados com os filtrados, separadamente e em seguida submetidos novamente ao teste de inibição em placa. Dessa maneira, foi possível medir e comparar os halos de inibição, para a verificação da ocorrência da comunicação bacteriana entre os Lactobacillus sp. (ATCC) e os isolados. Foi realizada a análise estatística selecionando um Lactobacillus spp. isolado d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: One of the main food-borne diseases is salmonellosis, caused by the bacterium Salmonella spp., It is present in several aviaries, and with the increase of poultry production, it has spread in aviaries, becoming a relevant problem and of great importance in health public and animal. With this, control measures were instituted, including the use of antimicrobial, causing several discussions, mainly regarding bacterial resistance to antimicrobials used in human medicine, where alternative measures are being developed to avoid the use of antimicrobials. Thus, the objective of the project was to evaluate the ability of Lactobacillus spp., isolated in the inhibition of Salmonella Heidelberg (SH), by in vitro and in vivo quorum sensing mechanism. They were harvested from cloacal swabs of chickens that underwent phenotypic and molecular tests. These isolates were subjected to plaque inhibition test to assess the inhibitory capacity of SH. Filtrates were then produced from Lactobacillus sp. (ATCC), separately, with SH. These isolates were cultured with the filtrates separately and then replate inhibited. In this way, it was possible to measure and compare inhibition halos to verify the occurrence of bacterial communication between Lactobacillus sp. (ATCC) and the isolates. Statistical analysis was performed by selecting a Lactobacillus spp. isolated from chickens and a filtrate which obtained better results in the in vitro test. The in vivo test was divided into four treatments, Lacto... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Doctorado en Ciencias mención Microbiología. / Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria que obtiene energía metabólica y poder reductor a partir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre. En estado natural, esta bacteria se encuentra junto con otros microorganismos participantes del consorcio de biolixiviación de sulfuros metálicos formando estructuras multicelulares llamadas biopelículas sobre la superficie de sulfuros minerales. Las células están embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) las cuales se componen principalmente de exopolisacáridos, proteínas y lípidos. Se ha descrito que la solubilización de los minerales sulfurados metálicos está mediada por estos EPS. Sin embargo, la composición de los EPS y su rol exacto en la solubilización de sulfuros metálicos ha sido caracterizado solamente en la bacteria oxidadora de hierro y azufre Acidithiobacillus ferrooxidans, aunque las demás especies de Acidithiobacillus que son capaces de oxidar solamente compuestos reducidos del azufre son fundamentales en estos procesos de lixiviación. En base a estos antecedentes, nos propusimos caracterizar alguno de los EPS y los mecanismos moleculares involucrados en la formación de biopelículas en la especie modelo At. thiooxidans. En un trabajo previo, se identificó un gen putativo que codifica para una proteína de unión a c-di-GMP PelD, la cual está caracterizada en Pseudomonas aeruginosa formando parte de un complejo multiproteico de membrana involucrado en vii la biosíntesis del exopolisacárido Pel. Al analizar el contexto genético del gen pelD, se identificó un putativo operón con una estructura similar al operón canónico identificado en P. aeruginosa. El análisis comparativo entre los genomas disponibles de las bacterias acidófilas que están presentes en los entornos minerales ácidos reveló que este operón sólo está presente en los genomas de At. thiooxidans y At. caldus. Ante este resultado, este trabajo se enfocó en comprender cuál sería la importancia de este exopolisacárido en la formación de biopelículas de At. thiooxidans sobre la superficie de azufre elemental. La medición de los niveles de transcrito mediante qPCR mostró que los genes pelA, pelD y wcaG del putativo operón presentan un mayor de expresión en células adheridas que en células planctónicas. El análisis de azúcares de superficie mediante el uso de lectinas identificó la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetil-glucosamina. Tratando de dilucidar algunas de las señales que regulan la producción de Pel, se descubrió que la adición exógena de la molécula de Quorum Sensing (QS) 3-oxo-C8 AHL incrementa la transcripción de los genes pelA y pelD. Finalmente, se procedió a obtener una cepa mutante nula en el gen pelD mediante recombinación homóloga. Luego de analizar el DNA de esta cepa, se realizaron análisis de adherencia y formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental mediante microscopía electrónica y de epifluorescencia. La mutación ΔpelD afectó la estructura de la biopelícula al reducir la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetilglucosamina en la superficie, pero adicionalmente provocó un incremento en la viii producción de estructuras filamentosas que rodean a las células. Para resolver la incógnita sobre la naturaleza de estas fibras, se realizaron análisis comparativos preliminares de la expresión de proteínas extracelulares. El análisis del sobrenadante de los cultivos y de las proteínas del EPS reveló un cambio en producción de proteínas secretadas al medio. En base a estos resultados es posible concluir que el exopolisacárido Pel producido por la bacteria biominera At. thiooxidans juega un rol estructural en la formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental y que la regulación de su síntesis involucra a las vías del QS y del c-di-GMP. / Acidithiobacillus thiooxidans is a bacterium that obtains metabolic energy and reducing power from the oxidation of reduced sulfur compounds. In the natural state, this bacterium is found along with other microorganisms that are members of the metal sulfides bioleaching consortium forming multicellular structures called biofilms on the surface of mineral sulfides. The cells are embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) which are composed mainly of exopolysaccharides, proteins and lipids. It has been described that the solubilization of the metal sulfide minerals is mediated by these EPS. However, the composition of the EPS and their exact role in the solubilization of metal sulfides has been characterized only in the iron and sulfur oxidizer bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans, although the other Acidithiobacillus species that are only capable of oxidizing reduced sulfur compounds are important in these leaching processes. Based on this background, we set out to characterize some of the EPS and the molecular mechanisms involved in biofilm formation in the model species At. thiooxidans. In a previous work it was identified a putative gene encoding a c-di-GMP binding PelD protein, which is characterized as part of a multiprotein membrane complex involved in Pel exopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. x When we were analyzing the genetic context of the pelD gene, a putative operon with a structure similar to the canonical operon identified in P. aeruginosa was identified. Comparative analysis between available genomes of acidophilic bacteria that are present in acidic mineral environments revealed that this operon is only present in the genomes of At. thiooxidans and At. caldus. Given this result, this work focused on understanding the importance of this exopolisaccharide in biofilm formation of At. thiooxidans on the surface of elemental sulfur. Measurement of transcript levels by qPCR showed that pelA, pelD and wcaG genes of the putative operon exhibit a greater expression in attached cells than in planktonic cells. The analysis of surface sugars by the use of lectins identified the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl-glucosamine. Trying to elucidate some of the signals that regulates the production of Pel, it was discovered that the exogenous addition of Quorum Sensing (QS) molecule of 3-oxo-C8 AHL increases the transcription of pelA and pelD genes. Finally, a pelD gene null mutant strain was obtained by homologous recombination. After analyzing the DNA of this strain, adherence and biofilm formation analysis were performed on the elemental sulfur surface by electronic and epifluorescence microscopy. The ΔpelD mutation affected the structure of the biofilm by reducing the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl glucosamine on the surface, but additionally caused an increase in the production of fibrillar structures xi surrounding the cells. To solve the unknown about the nature of these fibers, preliminary comparative analysis of extracelluar protein expression were performed. Analysis of the culture supernatant and proteins from EPS revealed a change in production of secreted proteins to the medium. Based on these results it is possible to conclude that the Pel exopolisaccharide produced by the biomining bacterium At. thiooxidans plays a structural role at biofilm formation on the surface of elemental sulfur and that the regulation of its synthesis involves QS and c-di-GMP pathways. / Proyectos regulares Fondecyt 1120295 y 1160702 y beca Conicyt 21120064 por aportar el financiamiento durante el desarrollo de la tesis.

A prata metálica é um conhecido agente antimicrobiano, e a sua aplicação na forma de nanopartículas de prata vem sendo apontada como uma alternativa para aplicação em dispositivos médico hospitalares. Vários métodos foram sugeridos para a prevenção da infecção relacionada ao acesso vascular, entre eles, os cateteres revestidos com nanopartículas de prata têm recebido atenção mais recentemente, por oferecerem desempenho superior em aspectos onde outros métodos falharam. Este trabalho propôs avaliar a ação de nanopartículas de prata (AgNPs) em linhagens hospitalares e sua aplicabilidade em cateteres intraluminais. Na primeira fase, 12 linhagens (3 linhagens de referência e 8 linhagens hospitalares) foram testadas frente a diferentes concentrações de nanopartículas de prata de 10 nm; e na segunda fase, duas linhagens de referência foram escolhidas para os testes com os cateteres impregnados com uma solução polimérica contendo nanopartículas de prata. Os resultados obtidos atestam que as nanopartículas de prata funcionam como uma opção para controle bactericida. / In recent years, there has been increased concern regarding the use of antimicrobials (antibiotics) in general practices and in hospital-medicine devices, a factor that may contribute for the development and selection of antibiotic-resistant strains. The metallic silver is a known antimicrobial agent. Currently, its application in the form of nanoparticles (nanosilver) has been suggested as an alternative for use in hospital medical devices. Central venous catheters (CVCs) are commonly used in critically ill patients to administer fluids, blood products and parenteral nutrition. The contamination of catheters introduced into the bloodstream and subsequent infection, severe sepsis and septic shock are associated with high morbidity and mortality. This is one of the greater challenges of treating critically ill patients. Various methods have been suggested for prevention of infection related to the vascular access, including, catheters coated with silver nanoparticles which have received attention more recently, since they offer higher performance in aspects in that other methods have failed. This alternative consists in associating nanoparticles of metallic silver to a polymeric material that coats the catheter inner and externally. The main characteristics of the coating that can potentially be ajusted are the intensity and spectrum of bactericidal activity, the rate of bactericidal releasing and resistance to biofilm formation. This work proposes to evaluate the effects of silver nanoparticles (AgNPs) in hospital strains and their applicability in intraluminal catheter. In the first stage, 12 strains (3 reference strains and 9 hospital strains) were tested against different concentrations of silver nanoparticles of 10 nm (SIGMA-Aldrich); and in the second phase, two reference strain (a Gram-positive and Gram-negative) were selected for the tests with catheters impregnated with a polymer solution containing silver nanoparticles of 10 nm (SIGMA-Aldrich). The results obtained in the first stage showed a high efficiency of nanoparticles on three reference strains - S. aureus IPT 246, P. aeruginosa IPT 322 and K. pneumoniae IPT 412-, and moderate efficiency on hospital strains - S. aureus S.a. 1 and S.a. 2; P. aeruginosa P.a. 1 and P.a.2 ; and A. baumannii Acb. 2, Acb. 4 and Acb. 8, indicating that silver nanoparticles work as an option for bacterial control. A preliminary search of silver resistance genes in the strains indicates the possibility that 5 of these strains have genes related to silver resistance similar to those described in the literature. The results obtained in the second phase show that the process of impregnation of the intraluminal catheter has reached the desired goal in both the coating device, and in reducing bioburden according the tests carried with the reference strains S. aureus 246 IPT and P. aeruginosa IPT 322.

Introdução: Staphylococcus aureus são microrganismos causadores de diversos tipos de doenças. Existem dois grandes agravantes a sua presença: a produção de toxinas e a resistência a antimicrobianos. S. aureus produzem enterotoxinas termolábeis que, quando presentes nos alimentos, podem levar a uma toxinfecção a quem o consumir. Esta espécie também é conhecida por facilmente responder adaptativamente ao uso de drogas tornandose cada vez mais difícil controlá-la. Um dos maiores responsáveis por esta preocupação são os MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus), resistentes a beta-lactâmicos através da produção de uma proteína diferenciada de parede codificada pelo gene mecA. A presença deste patógeno resistente fora do ambiente hospitalar é registrada há alguns anos e pouco a pouco vem se descobrindo que a via alimentar pode ser um meio deste gene se disseminar. Objetivos: procurar pelo gene mecA e o codificador da enterotoxina em Staphylococcus aureus de amostras alimentares para discutir a presença do gene de resistência em uma nova via de transmissão e a validade de apenas se fiscalizar a presença apenas de Staphylococcus coagulase positivo em produtos alimentares como forma de manter o alimento seguro contra toxinfecções. Métodos: Cinquenta e sete amostras de S. aureus provenientes de amostras de quatro tipos de fontes alimentares foram testadas por PCR com primer específico para o gene mecA e para o gene codificador da enterotoxina. Resultados: Destas, cinco (8,8 por cento do total) amostras apresentaram o gene de resistência e onze (19,2 por cento do total) continham o gene codificador da enterotoxina termolábil. Conclusão: A presença do gene de enterotoxina em produtos prontos para consumo e peixe cru de feira é uma realidade, assim como o debate sobre qual a melhor forma de se legislar sobre o assunto que deve ser mantido e melhor avaliado. Já no caso do gene de resistência, evidenciou-se que a via alimentar é sim local de circulação do gene de resistência. Também é a primeira vez que se notifica o gene mecA em alimentos prontos para consumo no Brasil e América Latina / Introduction: Staphylococcus aureus are a bacterium that causes various types of diseases. There are two major aggravating to its presence: the toxins production and antimicrobial resistance. S. aureus produce heat-labile enterotoxina that, when present in food, can lead to poisoning of those who consume. This specie is also known to easily respond adaptively to drug use becoming increasingly difficult to control it. One of the main reasons for this concern are MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus) which are resistant to betalactams drugs through a differentiated wall protein production encoded by the mecA gene. The presence of this resistant pathogen outside hospitals has been recorded a few years ago and gradually comes to discover that the food chain can be a way for the gene spread. Objectives: Search for the mecA gene and the enterotoxins encoded gene in Staphylococcus aureus from food samples to discuss the presence of the resistance gene in a new transmission route and the validity of only review the presence of Staphylococcus coagulase positive in food product as a way to keep insurance against food poisoning. Methods: Fifty-seven samples of S. aureus from five different sources of food samples were tested by PCR with specific primer for the mecA gene and the enterotoxins gene. Results: Of these, five (8,8 per cent of total) samples showed the resistance gene and eleven (19,2 per cent of total) contained the gene encoding the heat-labile enterotoxin. Conclusion: The presence of enterotoxin encoded gene in food products ready for consumption and raw fish is a fact and a debate about how best to legislate should be maintained and better evaluated. In the case of the resistance gene, the food chain is really a way where this gene can spread. It is also the first time the mecA gene from food ready for consumption is reported in Brazil and Latin America