Les maladies neurodégénératives regroupent un ensemble de neuropathologies qui se caractérisent par le dysfonctionnement progressif des neurones et leur perte irréversible au niveau du système nerveux central. Parmi ces maladies figure la maladie d’Alzheimer (MA) qui est une des conditions neurodégénératives la plus fréquente. Bien qu’aucune étiologie n’ait encore été identifiée, le vieillissement est par conséquent le principal facteur de risque de la MA. Grâce aux recherches réalisées sur le vieillissement, des caractéristiques de changements cellulaires et biochimiques, comme la sénescence cellulaire et l’inflammaging, ont été associées à ce phénomène. La sénescence cellulaire qui se définit par un état d’arrêt du cycle cellulaire pourrait aggraver une maladie neurodégénérative, entre autres par le biais de phénotypes sécrétoires associés à la sénescence. L’implication du proto-oncogène BMI1 dans la régulation du cycle cellulaire et la sénescence a été démontrée à travers son inhibition du locus INK4/ARF. De plus, une déficience en BMI1 a été rapportée dans des neurones de certains patients avec la MA, et elle est également associée à une neurodégénérescence précoce. Le complexe NF-κB participe à l’expression d’un large éventail de gènes de cytokines pro-inflammatoires impliquées dans les processus de l’inflammaging et de la sénescence cellulaire. Cependant, l’implication conjointe de BMI1 et de NF-κB dans les processus de neurodégénérescence demeure peu connue. Compte tenu de ce contexte, dans le cadre de ce projet de maitrise, nous avons voulu explorer l’implication conjointe des molécules BMI1 et de la voie canonique du facteur NF-κB dans la production de cytokines pro-inflammatoires en utilisant des modèles in vivo et in vitro reproduisant un phénotype de neurodégénérescence similaire à la maladie d’Alzheimer. Nos résultats indiquent qu’une déficience en BMI1 est corrélée à une inactivation du facteur NF-κB aussi bien dans des neurones in vitro qu’in vivo ainsi qu’a une baisse de l’expression des cytokines IL6 et IL8. Bien que nous présentions des résultats générés à partir d’expériences non dupliquées, ils convergent tout de même vers des conclusions similaires à celles obtenues au niveau de pathologies cancéreuses. Ainsi notre projet apporte une information additionnelle qui pourrait servir à la compréhension des mécanismes sous-jacents au phénomène de l’inflammaging dans la neurodégénérescence. / Neurodegenerative diseases are a group of neuropathologies characterized by the progressive dysfunction of neurons and their death in the central nervous system. Among these diseases, Alzheimer's disease (AD) is the most common one. Although no aetiology has yet been identified, aging is therefore the main risk factor for AD. Thanks to several research work on aging, cellular characteristics and biochemical changes, such as senescence and inflammaging, have been associated with this phenomenon. Senescence, which is defined as a state of cell cycle arrest, could worsen neurodegenerative diseases throughout senescence associated secretory phenotypes. The involvement of the proto-oncogene BMI1 in cell cycle regulation and senescence has been demonstrated through its inhibition of the INK4/ARF locus. Additionally, BMI1 deficiency has been reported in neurons of AD patients, and it is also associated with early neurodegeneration. The NF-κB complex participates in the expression of a wide range of pro-inflammatory cytokine involved in the processes of inflammaging and cellular senescence. However, little is known about the joint involvement of BMI1 and NF-κB molecules in neurodegeneration processes. Given this context, within the framework of this master's project, we wanted to explore the combined implication of BMI1 and the canonical pathway of the NF-κB factor in the production of pro-inflammatory cytokines using in vivo and in vitro models reproducing a neurodegenerative phenotype similar to Alzheimer's disease. Our results indicate that a deficiency in BMI1 is correlated to an inactivation of the NF-κB expression both in vitro and in vivo neurones, as well as with a decrease in the expression of cytokines IL6 and IL8. Although we present results generated from unduplicated experiments, they nonetheless converge towards similar conclusions obtained in studies carried out on cancerous pathologies. Thus, our project provides additional information that could help to understand the mechanisms underlying the inflammaging phenomena in neurodegeneration.

Les acides ribonucléiques (ARN) subissent plusieurs modifications posttranscriptionnelles avant de remplir leur rôle dans la cellule. Un des acteurs responsables de ces modifications sont les ligases à ARN. Il existe deux grandes familles de ligases à ARN soit les « ATP-grasp » et les « RtcB-like ». Malgré le fait que ces enzymes ont des rôles biologiques similaires dans la cellule, leurs mécanismes moléculaires sont très différents. Notre équipe a découvert chez un eucaryote marin la présence de trois gènes codant pour des homologues de ligases à ARN de type RtcB. Ceci est pour le moins inhabituel considérant que la plupart des espèces eucaryotes n’ont qu’un seul gène codant pour des ligases de ce type. Diplonema papillatum, l’organisme en question, est un eucaryote dont l’étude a gagné en popularité au courant des dernières années dû au mode d’expression particulier de son matériel génétique mitochondrial. Celui-ci est fragmenté en plusieurs morceaux appelés modules qui, durant le processus de maturation de l’ARN, sont joints ensemble via épissage en trans. Nous supposons que l’une des ligases de type RtcB présente chez D. papillatum, plus spécifiquement DpRTCB1, est un des acteurs principaux de ce phénomène d’épissage en trans. Nous pensons aussi que les deux autres RtcB présentes chez cet organisme, soit DpRTCB2 et DpRTCB3, ont chacune leur propre rôle dans la cellule. Nous avons donc modélisé la structure tertaire de ces protéines in silico donnant ainsi des indices quant à ce qui pourraient être requis comme cofacteurs par ces trois enzymes. Nous proposons aussi un système de classification des ligases de type RtcB en fonction de leurs rôles biologiques et de leurs variations au niveau des résidus composant le site actif de l’enzyme. Nous avons tenté de purifier des protéines de fusion DpRTCB pour de futurs essais enzymatiques afin de déterminer les rôles biologiques potentiels de ces enzymes. Toutefois, ces protéines formaient des corps d’inclusion rendant leur purification difficile. Ce faisant, nous démontrons les différentes techniques qui existent actuellement pour purifier des protéines à partir d’agrégats insolubles. Ce mémoire prédit les potentiels cofacteurs et substrats nécessaires pour de futurs essais biochimiques des ligases DpRTCB. Nous établissons aussi une base robuste pour un système de classification des ligases de type RtcB. Ce document prodigue entre autres des solutions de base aux chercheurs désireux de purifier des protéines qui forment des corps d’inclusion avant de considérer passer à des méthodes de purification plus laborieuses et coûteuses. / Ribonucleic acids (RNA) undergo several post-transcriptional modifications before fulfilling their role in the cell. One of the actors responsible for these modifications are RNA ligases. There are two main families of RNA ligases, namely “ATP-grasp” and “RtcB-like”. Despite the fact that these enzymes have similar biological roles in the cell, their molecular mechanisms are very different. Our team has discovered in a marine eukaryote the presence of three genes encoding RtcB RNA ligase homologs. This is unusual considering that eukaryotes generally have only one gene encoding for an homolog of this ligase. Diplonema papillatum, the organism in question, is a eukaryote that has grown in popularity in recent years due to the particular mode of expression of its mitochondrial genetic material. Its genome is fragmented into several pieces called modules which, during the RNA maturation process, these modules undergo ligation via trans-splicing. We posit that one of the RtcB-type ligases present in D. papillatum, more specifically DpRTCB1, is a major player in this trans-splicing phenomenon. We also believe that the other two RtcB ligases present in this organism, DpRTCB2 and DpRTCB3, each have its own role in the cell. We therefore established in silico models for these proteins which could hint at the cofactors required by these three enzymes. We also propose a classification system for RtcB-type ligases according to their biological roles and variations in known active site residues. We attempted to purify DpRTCB fusion proteins for future enzymatic assays in order to get a better understanding in the biological role of these enzymes. These proteins, however, formed inclusion bodies making their purification difficult. Thus, we demonstrate various techniques that currently exist to attempt to purify proteins from insoluble aggregates. This Master’s thesis attempts to predict the potential cofactors and substrates necessary for future biochemical assays of DpRTCB enzymes. We also establish a robust foundation for a classification system of RtcB-type ligases. Among other things, this document provides basic solutions to researchers wishing to purify proteins that form inclusion bodies before considering switching to more laborious and expensive purification methods.

Le matériel génétique (l’ADN) d’un organisme contient l’information nécessaire à sa survie, sa croissance et sa reproduction. La perte de cette information affecte grandement la santé de l’organisme et cette altération est l’un des facteurs les plus courants dans le vieillissement ou le cancer. Quasiment toutes les cellules d’un organisme contiennent une copie de ce matériel génétique, communément appelé le génome, et font usage de plusieurs mécanismes pour en réparer les sections endommagées ainsi que pour le copier avec précision lors de la division cellulaire. Nous avons cherché à étudier les processus cellulaires qui maintiennent la stabilité génomique en inactivant systématiquement chacun des gènes avec la technique de criblage par CRISPR afin d’en étudier les rôles. Nous avons effectué ces criblages à l’échelle du génome dans des lignées cellulaires humaines en combinaison avec des perturbations chimiques dans le but d’identifier l’effet du traitement chimique ou le rôle de gènes qui exacerbent ou atténuent la perturbation. Nous nous sommes d’abord concentrés sur le resvératrol, une molécule initialement extraite de plantes qui a démontré des propriétés antivieillissement dans certains organismes modèles ainsi que la capacité d’inhiber la prolifération cellulaire. Notre criblage génétique a révélé que le resvératrol inhibait la réplication de l’ADN. En comparant les effets cellulaires du resvératrol à l’hydroxyurée, un agent connu pour causer du stress réplicatif, nous avons montré que ces deux traitements menaient à une diminution similaire de la progression de la fourche de réplication ainsi qu’à une activation de la signalisation en réponse au stress réplicatif. Nous avons également démontré que l’inhibition de la réplication de l’ADN dans les cellules humaines par le resvératrol est l’un des effets principaux de la molécule sur la prolifération cellulaire et ne requiert pas la présence de la déacétylase d’histone Sirtuin-1, protéine qui a été suggérée comme étant la cible principale du resvératrol pour son effet antivieillissement. Nous avons également étudié la perturbation d’un second processus cellulaire, soit le maintien des télomères. Ces séquences spéciales aux extrémités des chromosomes sont indispensables à la protection du génome et leur érosion graduelle est contrebalancée par l’activité enzymatique de la télomérase. Nous avons effectué un crible génétique par CRISPR à l’échelle du génome dans une lignée cellulaire dont nous avons inhibé la télomérase en utilisant BIBR1532, un inhibiteur spécifique de la télomérase. Nous avons découvert une forte interaction génétique entre la télomérase et C16orf72, un gène non-annoté que nous avons nommé TAPR1. Nous avons montré que les cellules déficientes en TAPR1 possèdent des niveaux élevés de la protéine p53, un facteur de transcription central à la réponse cellulaire aux dommages télomériques et aux dommages à l’ADN. Nous suggérons que TAPR1 agit comme un inhibiteur de la stabilité protéique de p53. En somme, ces travaux mettent en évidence la capacité des cribles génétiques CRISPR à approfondir nos connaissances sur le fonctionnement des processus de maintien de la stabilité génomique chez l’humain. / The genetic material (DNA) of an organism contains the necessary information for survival, growth and reproduction. Loss of this information strongly impacts the health of the organism and is the leading factor in aging and cancer. Almost all cells in an organism contain a copy of said genetic material (genome) and employ several mechanisms to repair any damaged section of the genome and to accurately copy it during cell division. We sought to understand the cellular processes by which cells maintain genome stability by systematically inactivating individual genes to uncover their role using pooled CRISPR-Cas9 screening. We employed genome-wide CRISPR screening in human cell lines in combination with specific chemical perturbations to identify gene deletions that enhance or suppress the phenotype of the chemical treatment, thereby shedding light on the effect of the treatment or the role of said enhancer/suppressor genes. We first focused on resveratrol; a small molecule first discovered in plants that has been suggested to extend lifespan in model organisms while also inhibiting cell proliferation ex vivo. Chemical-genetic screening pinpointed a role of resveratrol in inhibition of DNA replication. When we compared the cellular effects of resveratrol to hydroxyurea, a known inducer of replicative stress, we found that both treatments led to slower replication fork progression and activation of signaling in response to replicative stress. Importantly, we showed that the inhibition of DNA replication by resveratrol in human cells is a primary effect on cell proliferation and independent of the histone deacetylase Sirtuin-1, which has been implicated as the primary target in lifespan extension by resveratrol. We then studied the perturbation of a second cellular process, namely telomere maintenance. These specialized sequences at the termini of chromosomes are critical for the protection of chromosome ends and their erosion is counteracted by the enzymatic activity of telomerase. We performed a genome-wide CRISPR screen in cells that were concomitantly treated with a specific telomerase inhibitor, BIBR1532. We uncovered a strong genetic interaction between telomerase and a previously unannotated gene, C16orf72, which we named TAPR1. We found that TAPR1-depleted cells led to elevated p53 levels, a transcription factor central for the cellular response to telomeric and global DNA damage. We propose that TAPR1 is a negative regulator of p53 protein levels by promoting its turnover. Altogether, these studies highlight the power of CRISPR-Cas9 in genetic screening to uncover novel insight into the human genome stability maintenance network.

Les protéines Binder of Sperm (BSP) appartiennent à une superfamille de protéines exprimées dans le système reproducteur masculin, plus particulièrement dans les vésicules séminales chez les ongulés, et dans l’épididyme chez l’humain et la souris. Jusqu'à présent, des rôles variés chez différentes espèces ont été démontrés pour les protéines BSP, tels que dans la motilité et la capacitation chez le bovin. Cependant, leur rôle demeure élusif chez d’autres mammifères comme la souris et l’humain. Des études in vivo récentes ont démontré que la délétion des gènes Bsph1 et Bsph2 chez la souris n’a aucune conséquence sur la fertilité, et n’induit aucune anomalie au niveau de l'appareil reproducteur masculin. Afin d'élucider le rôle spécifique de la protéine BSP chez l'humain (BSPH1), nous avons d’abord développé une méthode de purification efficace permettant d’obtenir la protéine BSPH1 fonctionnelle car ces protéines ne sont présentes qu'en quantité infime dans l’épididyme humain. Suite, a la purification de BSPH1, j’ai réalisé des expériences in vitro et cherché à identifier son réseau d'interaction protéique. Il a été démontré que les protéines BSP interagissent avec des groupes pseudo-choline tels que le diéthylaminométhyle par affinité plutôt que par des interactions ioniques. Le diéthylaminoéthyle est chargé positivement et par conséquence, est un échangeur d'anions faible, mais les BSP interagissent avec affinité à la résine. Cette étude présente également une nouvelle méthode de purification rapide et peu coûteuse, qui fournit des protéines BSP recombinantes de grande pureté qui peuvent être utilisées pour étudier leurs rôles dans la fécondation chez les mammifères. Nous avons montré que la pré-incubation des ovocytes avec la protéine BSPH1 recombinante peut diminuer le taux de fécondation de manière dose-dépendante. Les spermatozoïdes ont également été pré-incubés avec un anticorps anti-BSPH1 et ont montré une diminution du taux de fécondation. Pour identifier le réseau d’interaction protéique de BSPH1, j'ai utilisé la méthode « Proximity-dependent biotin identification » (BioID) couplée à la spectrométrie de masse. Les résultats de la spectrométrie de masse ont démontré une interaction entre BSPH1 et toutes les sous-unités du complexe CCT / TRIC (Chaperonin containing tailless complex polypeptide 1 (CCT) ou tailless complex polypeptide 1 ring complex (TRiC)). Ce complexe interagit avec un autre complexe appelé BBSome (Bardet–Bied syndrome complex), qui joue un rôle important dans le transport de protéines à travers les cils primaires. BSPH1 a également interagi avec un grand nombre de protéines de la famille CEP (centrosome-associated proteins), importantes dans la formation des cils primaires par les microtubules et de la maturation du centrosome, qui soutiennent le rôle de BSPH1 dans les cils primaires. Dans l’ensemble, cette étude démontre que BSPH1 pourrait avoir un nouveau rôle en tant que chaperonne, à travers les cils primaires dans les cellules qui l’expriment dans l’appareil reproducteur masculin. / Binder of SPerm (BSP) proteins belong to a superfamily of proteins expressed in the male reproductive tract, particularly in seminal vesicles of ungulates (e.g., bovine, ram) and in the epididymis of humans and mice. So far, BSP proteins have been shown to play different roles in different species such as in motility and capacitation in bovine; however, their role remains unclear in other mammals. For instance, depletion of Bsph1/Bsph2 in mice had no effect on fertility. In order to elucidate the specific role of BSP protein in humans (BSPH1), I sought to investigate a purification method to produce functional human BSP protein, as these proteins are only present in minute amounts in the human epididymis. Following purification of BSPH1, I carried out in vitro experiments and sought to identify its protein interaction network. BSP proteins have been shown to interact with pseudo-choline groups such as diethylaminomethyl through affinity rather than ionic interactions. Diethylaminoethyl is positively charged and therefore is a weak anion exchanger, but BSPs interact through affinity to this resin. This study presents a new, rapid and cost-effective purification method that provides recombinant BSP proteins of a high purity level, which can be used to study their roles in mammalian fertilization. We showed that pre-incubation of oocytes with recombinant BSPH1 can decrease fertilization rate in a dose-dependant manner. Sperm were also preincubated with anti-BSPH1 antibody and showed a decrease in fertilization rate. Secondly, I used BioID (proximity-dependent biotin identification), coupled with mass spectrometry to identify the protein-protein interaction network of BSPH1 by proximity labeling. Mass spectrometry results showed an interaction between BSPH1 and all subunits of the CCT/TRIC complex (Chaperonin containing tailless complex polypeptide 1 (CCT) or tailless complex polypeptide 1 ring complex (TRiC). This complex interacts with another complex called BBSome (Bardet–Biedl syndrome complex), which plays a role in protein trafficking through primary cilium. I also identified BBS proteins, as well as other proteins, that interact with the BBSome complex and regulate protein trafficking in the cilia. BSPH1 also interacted with a large number of CEP (centrosome-associated proteins) family proteins, important in the formation of primary cilium through microtubules and centrosome maturation, which further support the potential implication of BSPH1 with the primary cilia. Overall, this study demonstrates that BSPH1 may have a new role as a chaperone involved in protein trafficking through the primary cilia in cells that express it in the male reproductive system

La reproduction est un événement crucial pour la vie des plantes. Ce processus nécessite la formation du pollen et des ovules. Les cellules germinales vont subir la méiose puis une succession de mitoses, deux pour le pollen et trois pour l’ovule, ce qui va leur permettre d’acquérir leurs structures finales. Une fois formés, ces deux gamètes doivent se rencontrer. Pour cela, le grain de pollen va germer sur le stigmate puis former le tube pollinique. Le tube pollinique en croissance va traverser les différents tissus femelles et ainsi tracter les deux cellules spermatiques jusqu’à l’ovule, permettant la reproduction. Un important réseau de signalisation cellulaire est nécessaire pour permettre ces événements. Les cascades des Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont l’un des réseaux de signalisation les plus étudiés chez les plantes. Ces kinases sont impliquées dans de très nombreux processus développementaux tels que la formation de l’embryon ou des stomates. Pour autant, leurs rôles restent encore peu caractérisés pendant de la fécondation. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre le rôle que jouent les MAPK lors de la formation des gamètes mâles et femelles ainsi que lors de la croissance des tubes polliniques. Plusieurs membres de la superfamille des MAPKs ont été caractérisés pour leurs rôles dans la reproduction sexuée des végétaux. De précédents travaux dans le laboratoire de Daniel P. Matton, ont démontré l’implication de deux MAPK Kinases Kinases (MAP3K), la Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) et ScFRK2. Ces deux kinases sont nécessaires pour le développement de l’ovule et du pollen chez S. chacoense, une espèce de pomme de terre sauvage diploïde. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction d’une nouvelle ScFRK, la ScFRK3. Ce troisième membre de la classe des FRKs chez S. chacoense, est, elle aussi, impliquée dans le développement des gamétophytes mâles et femelles. Du patron d’expression jusqu’à l’établissement d’une voie de signalisation potentielle, en passant par la caractérisation phénotypique des mutants, plusieurs expériences ont été réalisées dans le but de comprendre le rôle de ScFRK3 lors de la formation des gamètes chez Solanum chacoense. Nous montrons que la ScFRK3 est impliquée dans la formation du pollen ainsi que celui des ovules. Nous avons ensuite poursuivi nos recherches en affinant le phénotypage du mutant de surexpression ScFRK2. En effet, les précédentes études ont permis de montré que la surexpression de ScFRK2 conduit le primordium ovulaire à la formation de structures carpéloïdes. Pour autant, les ensembles des primordius ovulaires ne sont pas devenu des strutures capéloïde. Nous montrons ici que seulement 10 % des ovules dans l'ovaire sont devenu 4 des carpéloïde. Notre étude montre qu’en plus des structures carpéloïdes, un grand nombre d'ovule n'ont pas de sac embryonnaire à l'anthèse ce qui explique le faible nombre de graines par fruit. L’analyse du développement des sacs embryonnaires monte que la surexpression de ScFRK2 entraine l’arrêt au stade mégaspore fonctionnelle. Ce phénotype est similaire à ce qui a pu être observé dans les lignées ARN interférant pour la ScFRK1 et la ScFRK3. De précédentes études faites chez Arabidopsis thaliana semblent montrer que les membres de la superfamille des MAPK ne sont pas essentiels pour la croissance du tube pollinique. Pour comprendre le rôle que jouent les MAPK dans l’élongation du tube pollinique, nous avons utilisé un inhibiteur des MAP Kinase Kinase (MKK), appelé U0126. La présence de cette drogue dans le milieu de croissance des grains de pollen provoque une diminution de la germination et de l’élongation du tube pollinique. L’utilisation de la méthode semi-in vivo montre une perte de la polarisation de la croissance des tubes polliniques causée par l’inhibition des MKK. La présence de l’inhibiteur conduit à la diminution de la quantité de filaments d’actine ainsi qu’à leur désorganisation à l’apex du tube. L’exocytose est aussi affectée par l’inhibition des MKK. Les cascades MAPK sont nécessaires à la croissance polarisée du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana. Pour finir, nous avons voulu identifier certains membres de la superfamille des MAPK impliqués dans la croissance du tube pollinique. Nous nous sommes intéressés en premier lieu aux orthologues de la famille ScFRK chez Arabidopsis thaliana. Les AtMAP3K19-20-21 sont les orthologues les plus proches de ScFRK3. Ces AtMAP3K sont exprimées lors du développement des grains de pollen et lors de l’élongation de tube pollinique. L’analyse du pollen des différentes lignées mutantes montre qu’en leur absence, le pollen ne présente aucun problème de développement contrairement à ScFRK3. Par contre, les doubles mutants et le triple mutant pour les AtMAP3K19-20-21 montrent une diminution de la capacité de germination. L’élongation du tube pollinique est affectée lors de la mutation d’au moins une des AtMAP3K. Ces deux études démontrent que les MAPK sont essentielles dans la formation et l’élongation du tube pollinique. / Reproduction is a crucial event for plant life. This process requires the formation of pollen and ovules. The germ cells will undergo meiosis and then a succession of mitosis, two for the pollen and three for the ovule, which will allow them to acquire their final structures. Once formed, these two gametes must meet each other. For this, the pollen grain will germinate on the stigmas to form the pollen tube. The growth of the pollen tube will pass through the different female tissues and thus pull the two sperm cells to the ovum for reproduction. An important cellular signaling network is necessary to allow these events to occur. The Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPKs) cascades are one of the most studied signaling networks in plants. These kinases are involved in a wide range of developmental processes such as embryo formation and stomata. However, their roles remain poorly characterized during fertilization. The aim of this project is to better understand the role played by MAPKs during the formation of male and female gametes as well as during the growth of pollen tubes. Several members of the MAPK superfamily have been characterized for their role in the sexual reproduction of plants. Previous work in Daniel P. Matton's laboratory has demonstrated the involvement of two MAPK Kinases (MAP3K), Solanum chacoense Fertilization-Related Kinase 1 (ScFRK1) and ScFRK2. These two kinases are necessary for egg and pollen development in S. chacoense, a diploid wild potato species. In a first step, we studied the functionality of a new ScFRK, ScFRK3. This third member of the class of FRKs in S. chacoense, is also involved in the development of male and female gametophytes. From the expression pattern to the establishment of a potential signaling pathway, through the phenotypic characterization of mutants, several experiments have been performed in order to understand the role of ScFRK3 in the formation of gametes in S. chacoense. We show that ScFRK3 is involved in the formation of pollen as well as that of the embryonic sac. We then continued our research by refining the phenotyping of the overexpression mutant ScFRK2. Indeed, previous studies have shown that ScFRK2 overexpression leads the ovular primordium to the formation of carpeloid structures. However, the sets of ovular primordia have not become capeloid structures. We show here that only 10% of the eggs in the ovary have become carpeloid. Our study shows that in addition to the carpeloid structures, a large number of ova do not have an embryonic sac in the anthesis, which explains the low number of seeds per fruit. The analysis of the development of the embryonic sacs shows that 7 overexpression of ScFRK2 leads to the cessation of the functional megaspore stage. This phenotype is similar to what has been observed in interfering RNA lines reducing expression of ScFRK1 and ScFRK3. Previous studies in Arabidopsis thaliana suggest that members of the MAPK superfamily are not essential for pollen tube growth. To understand the role that MAPKs play in pollen tube elongation, we used a MAP Kinase Kinase (MKK) inhibitor called U0126. The presence of this drug in the growth medium of pollen grains causes a decrease in germination and elongation of the pollen tube. The use of the semi in vivo method shows a loss of polarization of the pollen tube growth caused by the inhibition of MKK. The presence of the inhibitor leads to a decrease in the number of actin filaments and their disorganization at the apex of the tube. Exocytosis is also affected by MKK inhibition. We show in this chapter that MAPK cascades are necessary for polarized pollen tube growth in Arabidopsis thaliana. Finally, we wanted to identify some members of the MAPK superfamily involved in pollen tube growth. We were first interested in the ScFRK family orthologs in Arabidopsis thaliana. AtMAP3K19-20-21 are the closest orthologs to ScFRK3. These AtMAP3K are expressed during the development of pollen grains and during the elongation of the pollen tube. Pollen analysis of the different mutant lines shows that in their absence the pollen does not present any development problems unlike ScFRK3. On the other hand, double mutants and triple mutant for AtMAP3K19-20-21 show a decrease in germination capacity. Pollen tube elongation is affected when at least one of the AtMAP3Ks is mutated. These two studies demonstrate that MAPKs are essential for the formation and elongation of the pollen tube and that AtMAP3K19-20-21 participate in these biological processes.

Les systèmes sexuels et les mécanismes responsables de la détermination du sexe chez les animaux sont issus de stratégies diverses. Cette incroyable diversité se reflète notamment chez les bivalves, où autant les facteurs génétiques qu’environnementaux y jouent un rôle, avec des espèces utilisant divers modes de reproduction, tels que le gonochorisme ou l’hermaphroditisme simultané ou séquentiel. La découverte la plus notable est celle d’un système de déterminisme sexuel unique qui impliquerait les mitochondries. Spécifiquement, un système de transmission sexe-spécifique de l’ADN mitochondrial, connu sous le nom de DUI (« Double Uniparental Inheritance » ou double transmission uniparentale), serait lié au maintien du gonochorisme chez certaines espèces de bivalves. La DUI implique un ADN mitochondrial qui est transmis de façon maternelle (ADNmt F) aux femelles et aux mâles, et l’autre transmis de façon paternelle (ADNmt M) aux mâles seulement. Les ADNmt F et M chez les espèces à DUI sont caractérisés par des traits uniques, comme une modification du gène cox2, ou encore la présence de nouveaux gènes associés à chacun des génomes mitochondriaux (des gènes sexe-spécifiques) qui ont une fonction autre que la production d’énergie contrairement aux autres gènes mitochondriaux typiques. Le lien entre la DUI et la détermination du sexe étant encore flou, trois approches ont été proposées pour aider à le démystifier, chacune des approches constituant un chapitre de cette thèse. Les deux premiers chapitres se sont concentrés sur des espèces de moules d’eau douce de l’ordre des Unionida, où une corrélation entre gonochorisme et DUI et hermaphroditisme et SMI (« Strictly Maternally Inheritance » ou transmission strictement maternelle) a été décrite. La première approche consistait à produire une analyse transcriptomique comparative entre les gonades mâles et femelles de deux espèces à DUI gonochoriques, Venustaconcha ellipsiformis et Utterbackia peninsularis (famille Unionidae), pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la détermination du sexe et à la DUI chez ces bivalves. Cette étude a révélé 12 000 gènes orthologues, avec 2 583 gènes différentiellement exprimés chez les deux espèces, dont les gènes Sry, Dmrt1 et Foxl2 connus pour être des éléments clés dans la détermination du sexe chez les vertébrés et d’autres bivalves. Nos résultats ont aussi été comparés avec d’autres espèces à DUI, notamment avec la palourde marine Ruditapes philippinarum, pour identifier des éléments partagés entre des espèces éloignées qui pourraient être responsables de la régulation de la DUI. Globalement, ces résultats corroborent l'hypothèse selon laquelle un mécanisme d'ubiquitination modifié pourrait être responsable de la rétention de l'ADNmt paternel chez les bivalves mâles. Les analyses ont aussi révélé que la méthylation de l'ADN pourrait être impliquée dans la régulation de la DUI. Une deuxième analyse transcriptomique comparative a été réalisée afin de discerner les mécanismes sous-jacents à la détermination du sexe et à la DUI, mais cette fois-ci entre l’espèce à DUI gonochorique U. peninsularis et l’espèce proche parente à SMI hermaphrodite U. imbecillis. Cette étude a permis de supporter l’hypothèse d’une implication des mécanismes d’ubiquitination et de méthylation dans la régulation de la DUI, ainsi que de confirmer un rôle des gènes conservés liés à la détermination du sexe également chez les bivalves hermaphrodites. Nos résultats ont également révélé de nouveaux gènes candidats ayant des rôles potentiels dans la DUI, y compris des nucléases et des facteurs impliqués dans l’autophagie / mitophagie. Finalement, afin d’identifier des éléments génétiques mitochondriaux qui pourraient faire partie des mécanismes sous-jacents à la DUI et la détermination du sexe chez les bivalves, nous avons séquencé les ADNmt F et M complets de deux nouvelles espèces à DUI de deux familles de l’ordre des Venerida, Scrobicularia plana (famille Semelidae) et Limecola balthica (famille Tellinidae). En effet, la description complète des ADNmt chez les espèces à DUI a été effectuée chez plusieurs espèces de moules d’eau douce (ordre Unionoida), mais peu d’espèces l’ont été pour les ordres Mytilida et Venerida. Ces études sont essentielles pour retracer des signatures génétiques mitochondriales partagées par différentes espèces à DUI. Nos résultats ont révélé les plus grosses différences de taille (>10kb) et de divergence nucléotidique (jusqu’à 50% de divergence) entre les ADNmt M et F, parmi toutes les espèces à DUI. Ces différences de taille sont principalement dues à une immense insertion (>3.5kb) dans la séquence du gène cox2 du génome mitochondrial M, chez nos deux espèces, un trait précédemment décrit chez les moules d’eau douce. Le gène cox2 des mâles de S. plana est la plus longue séquence à travers le règne animal. Une autre fonctionnalité importante portés par les ADNmt F et M est la présence de nouveaux gènes spécifiques au sexe, comme reportée chez toutes les autres espèces à DUI jsuqu’à maintenant. Les résultats combinés de cette thèse soutiennent le partage de plusieurs éléments génétiques clés entre les espèces à DUI. De plus, un parallèle avec le système CMS (« Cytoplasmic Male Sterility » ou stérilité cytoplasmique mâle) chez les plantes, les seuls autres organismes possédant un déterminisme sexuel qui implique les mitochondries, est proposé pour expliquer le rôle de l’ADNmt dans la détermination du sexe chez les espèces de bivalves à DUI. / Sexual systems and sex determining mechanisms described among animals are extraordinarily diverses. This amazing diversity is present in bivalves where both environment and genetic factors occur, leading to, among others, gonochoric and simultaneous or sequential hermaphroditic species. The most impressive discovery is a sex-determining system that would involve mitochondria. Specifically, a unique mitochondrial DNA inheritance system, known as Doubly Uniparental Inheritance (DUI), would be related to the maintenance of gonochorism in some bivalve species. DUI involves two mitochondrial DNA lineages, one that is maternally transmitted (F mtDNA) to females and males, and the other that is transmitted paternally (M mtDNA) to males only. The F and M mtDNAs, in DUI species, are characterized by unique traits, such as a modification of the cox2 gene, or the presence of new genes associated with each of the mitochondrial genomes (sex-specific genes) that have a function other than energy production, unlike other typical mitochondrial genes. Since the link between DUI and sex determination is still unclear, three approaches have been proposed to help demystify it, with each of the approaches constituting a chapter of this thesis. The first two chapters focused on freshwater mussel species of the order Unionida, where a correlation between gonochorism and DUI and hermaphroditism and SMI (Strictly Maternally Inheritance) was described. The first approach was to produce a comparative transcriptomic analysis between the male and female gonads of two gonochoric DUI species; Venustaconcha ellipsiformis and Utterbackia peninsularis (Unionidae family), to better understand the mechanisms underlying sex determination and DUI in these bivalves. This study revealed 12,000 orthologous genes, with 2 583 genes differentially expressed in both species, including Sry, Dmrt1, and Foxl2 known to be key sex-determining genes in vertebrates and other bivalve species. Our results were also compared with other DUI species, including the marine clam Ruditapes philippinarum, to identify shared elements between distant species that may be responsible for DUI regulation. Overall, these results support the hypothesis that a modified ubiquitination mechanism may be responsible for the retention of paternal mtDNA in male bivalves. The analyzes also revealed that DNA methylation could be involved in DUI regulation. 7 A second comparative transcriptomic analysis was performed to discern the mechanisms underlying sex determination and DUI between the gonochoric DUI species, U. peninsularis, and the closely related SMI hermaphroditic species, U. imbecillis. This study supported the hypothesis of an involvement of ubiquitination and methylation mechanisms in DUI regulation, as well as confirmed a role of conserved genes related to sex determination in hermaphroditic bivalves. Our results also revealed novel candidate genes with potential roles in DUI, including nucleases and factors involved in autophagy / mitophagy mechanisms. Finally, to identify mitochondrial genetic elements that could be part of the mechanisms underlying DUI and sex determination in bivalves, we sequenced the complete F and M mtDNAs of two new DUI species, from two families of the order Venerida; Scrobicularia plana (Semelidae family) and Limecola balthica (Tellinidae family). The complete description of mtDNAs in DUI species has been carried out for several species of freshwater mussels (Unionoida order), but very few species have been described for the orders Mytilida and Venerida. Such studies are essential for tracing mitochondrial genetic signatures shared by different DUI species. Our results revealed the largest differences in size (>10kb) and nucleotide divergence (up to 50% divergence) between M and F mtDNAs, among all DUI species. These differences in size are mainly due to a huge insertion (> 3.5kb) in the cox2 gene of the M mtDNA from both species, a trait previously described in freshwater mussels. The cox2 gene in S. plana males represents the longest cox2 sequence across the animal kingdom. Another important feature of F and M mtDNAs is the presence of new sex-specific genes, as reported in all other DUI species so far. The combined results of this thesis support the sharing of several key genetic elements among DUI species. In addition, a parallel with the Cytoplasmic Male Sterility (CMS) system in plants, the only other organisms with a sex determination system that involves mitochondria, is proposed to explain the role of mtDNA in sex determination in DUI bivalve species.

L’ischémie/reperfusion (I/R) occurrente à toutes transplantations d’organe solide, constitue un stimulus pro-autophagique/pro-apoptotique pour les cellules endothéliales. Nous avons récemment démontré que les cellules endothéliales apoptotiques (CEapo) sécrètent des vésicules apoptotiques exosome like (ApoExo) qui induisent une réponse auto-immune et accélèrent le rejet vasculaire dans un modèle de greffe aortique chez la souris. Ces ApoExo qui diffèrent des corps apoptotiques classiques par leur structure et leur contenu protéique contiennent le fragment C-terminal du perlécan, LG3. Le LG3, un auto-antigène d’importance en transplantation, favorise le remodelage vasculaire et est augmenté en circulation chez les patients greffés rénaux atteints d’un rejet vasculaire. De plus, la présence d’anticorps anti-LG3 avant la transplantation est associée à un risque plus élevé de développer un rejet vasculaire chez des patients greffés du rein et à la perte du greffon à long terme. Il est connu que la génération du fragment LG3 implique la protéolyse du perlécan par la cathepsine L, une protéase lysosomiale, mais le mécanisme de transport de ce fragment au sein des ApoExo est encore inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité lysosomiale et l’autophagie jouent un rôle important dans la maturation et le chargement du LG3 dans les vésicules ApoExo sécrétées par les CEapo. Une étude longitudinale de microscopie électronique chez les cellules endothéliales humaines carencées en sérum pendant 1h, 2h et 3h, nous a révélé la présence du perlécan / fragment LG3 au sein de compartiments autophagiques (autophagosomes et autophagolysosomes) à différentes étapes du processus autophagique. Après 3 heures de carence en sérum, nous avons identifié le fragment LG3 dans des vésicules membranaires situées au sein de grands réseaux vacuolaires s’apparentant à des autophagolysosomes. L’inhibition de la cathepsine L, de l’acidification du lysosome et de l’autophagie diminuent la présence du fragment LG3 dans les vésicules ApoExo sans affecter la sécrétion de vésicules démontrant donc le rôle de l’autophagie dans l’intégration du fragment LG3 au sein des ApoExo. Toutefois, l’injection de vésicules ApoExo LG3-, provenant de cellules murines aortiques traitées à la bafilomycine, dans un modèle murin de greffe aortique induit une réponse auto-immune anti-LG3 ainsi qu’un remodelage vasculaire à des niveaux similaires aux souris ayant reçu des ApoExo véhicule. Une analyse protéomique de ces vésicules ApoExo LG3-, nous a révélé que la bafilomycine modifie le contenu protéique des ApoExo en induisant une augmentation de la présence de protéines lysosomiales et de la matrice extracellulaire dont le perlécan. Ceci suggère que la présence du motif LG3 au sein du perlécan natif non clivé dans les ApoExo LG3- pourrait être responsable de la mise en place de la réponse anti-LG3 observées chez les souris. Les travaux de ce doctorat ont permis de mettre en évidence que l’autophagie dans les cellules endothéliales productrices d’ApoExo ne régule pas l’immunogénicité des ApoExo. Cependant, elle régule au sein des cellules endothéliales apoptotiques le transport et le clivage du perlécan qui lui est immunogène. En effet, l’autophagie module les différentes formes de perlécan natif et clivé sécrétées dans les ApoExo. L’étude chez la souris greffée nous a donc permis de considérer non plus l’implication du fragment LG3 mais l’implication du motif LG3 présent au sein du perlécan natif non clivé et de ses différentes formes intermédiaires dans la réponse auto-immune anti-LG3 et le rejet vasculaire. La modulation de la sécrétion du perlécan et du LG3 dans les ApoExo constitue une cible thérapeutique potentielle afin de diminuer la réponse auto-immune pouvant augmenter le dommage vasculaire après la greffe / Ischemia/reperfusion (I/R) occurring in all solid organ transplantation, constitute a proautophagic / pro-apoptotic stimulus on endothelial cells. We recently demonstrated that apoptotic endothelial cells (CEapo) secrete apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) that induce autoimmune response and accelerate vascular rejection in a mouse aortic transplant model. These ApoExo, that differ from classical apoptotic bodies in structure and protein content, contain the C-terminal fragment of perlecan, LG3. LG3, an autoantigen of importance in transplantation, promotes vascular remodeling and is increased in circulation in renal transplant patients undergoing vascular rejection. In addition, the presence of anti-LG3 antibodies prior to transplantation is associated with a higher risk of developing vascular rejection in kidney transplant patients and long-term graft loss. It is known that the generation of LG3 fragment involves the proteolysis of perlecan by cathepsin-L, a lysosomal protease, but the mechanism of export of this fragment within ApoExo is still unknown. We hypothesized that lysosomal activity and autophagy play an important role in the maturation and the secretion of LG3 in ApoExo vesicles secreted by CEapo. Longitudinal electron microscopy study after 1h, 2h and 3h in serum starved endothelial human cells revealed the presence of perlecan / LG3 fragment within autophagic compartments (autophagosomes and autophagolysosomes) at different stages of the autophagic process. After 3 hours of serum starvation, we identified LG3 fragment in membrane vesicles located within large vacuolar networks reminiscent of autophagolysosomes. Inhibition of cathepsin-L, of lysosomal acidification and of autophagy decrease the presence of LG3 fragment in ApoExo vesicles without affecting vesicle secretion thus demonstrating the role of autophagy in the secretion of LG3 fragment within ApoExo. However, Injection of ApoExo LG3- vesicles from bafilomycin-treated aortic murine cells into a murine aortic transplant model induces autoimmune anti-LG3 response and vascular remodeling at levels similar to the ApoExo vehicle mice control group. Proteomic analysis of ApoExo from bafilomycin-treated aortic murine cells has demonstrated that bafilomycin modifies ApoExo protein content by inducing an increase of the presence of lysosomal proteins and the extracellular matrix, including perlecan. This suggests that the presence of LG3 motif in uncleaved native perlecan in ApoExo LG3- could be responsible for the establishment of the anti-LG3 response as well as the vascular remodeling observed in mice. Collectively, these results demonstrate that autophagy in endothelial cells producing ApoExo does not regulate the immuogenicity of ApoExo. However, it regulates within apoptotic endothelial cells the processing and cleavage of perlecan who is immunogenic. Indeed, autophagy modulates the different forms of native and cleaved perlecan secreted in ApoExo. Grafted mice study thus allowed us to consider neither the involvement of the LG3 fragment but the implication of the LG3 motif present in the uncleaved native perlecan and its intermediate forms in the anti-LG3 autoimmune response and vascular rejection. Modulating perlecan and LG3 secretion in ApoExo vesicles is a potential therapeutic target to reduce the autoimmune response that can increase vascular damage after transplantation.

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