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Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm. / In eukaryotic cells, the processes of RNA and protein synthesis are spatially separated into two distinct compartments. With this division, a complex pathway of nucleocytoplasmic RNA export has evolved, which to date remains poorly understood. Recent advances in single-molecule microscopy have enabled direct studies focused on investigating the dynamics and kinetics of RNA export. In this Master thesis, we present the first real time visualization of mRNA export in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We first generated a GLT1 reporter under the control of the inducible GAL1 promoter, in which the GLT1 mRNA was tagged with an array of PP7 repeats and detected by exogenous PP7-GFP binding protein. Using a single-molecule live cell imaging approach, we were able to visualize and track the behavior of individual mRNAs from the site of transcription to the point of export. Interestingly, we found that once released from the transcription site, single mRNAs diffuse freely in the nucleoplasm, but once they reach the nuclear periphery, they scan the periphery before being exported to the cytoplasm. This scanning behavior was dependent on Myosin Like Proteins (Mlp1p and Mlp2p), which form the basket of the Nuclear Pore Complex (NPC), as mRNAs were not retained at the periphery and were rapidly released into the nucleoplasm in mlp1p/mlp2p double mutant cells. Specifically, we found that the C-terminal part of Mlp1p was important for scanning. Furthermore, mRNAs from cells depleted of the E3 ubiquitin ligase TOM1 had a similar phenotype to mRNAs in mlp1p/mlp2p double mutant cells, suggesting a role for scanning in the Tom1p-mediated release of Yra1p from the RNA. Lastly, we confirmed that endogenous MDN1 and CBL2 mRNAs also exhibit scanning behaviour. Taken together, our results suggest that mRNAs scanning the nuclear periphery is a general behaviour for all mRNAs to initiate the mRNA export process, allowing mRNP arrangement required for export to occur at the nuclear periphery. In addition, we investigated the role of YHR127, a newly identified RNA binding protein, in RNA biogenesis. Notably, we show that GFP-tagged YHR127p formed distinct foci in the nucleus, which were lost upon transcription arrest. Deletion of YHR127 led to an increase in transcript levels of specific genes, but not to a global accumulation of mRNAs in the nucleus, suggesting a role for this protein in regulating transcription and/or mRNA stability.

La leucémie est une forme de cancer qui affecte les cellules du système hématopoïétique. Selon la lignée cellulaire affectée et la vitesse de développement du cancer, la leucémie peut être myéloïde ou lymphoïde, aiguë ou chronique, respectivement. Chez les enfants, elles sont souvent caractérisées par la présence de translocations chromosomiques, impliquant notamment le gène KMT2A. L'impact biologique de ces fusions de gènes, connues pour être des perturbateurs épigénétiques, est encore mal compris. Afin d’étudier spécifiquement les conséquences de la présence de fusion impliquant le gène KMT2A, un modèle leucémique humain chez la souris a été mis en place. Le modèle utilisé consiste à induire de manière rétrovirale l’expression d’une fusion oncogénique dans des cellules souches hématopoïétiques et progénitrices d’un unique donneur sain. Ces cellules sont ensuite injectées dans des souris immunodéficientes pour produire une leucémie aiguë myéloïde ou lymphoïde après quelques semaines. L’utilisation de ce modèle leucémique vise à définir les gènes qui sont régulés de manière épigénétique et essentiels dans le processus de leucémogenèse médié par une translocation chromosomique faisant intervenir le gène KMT2A. La première partie des travaux cartographie les changements génétiques et épigénétiques à chacun des stades de la leucémogénèse causée par la fusion KMT2A-MLLT3. Nous avons cartographié les changements épigénétiques tels que la méthylation de l’ADN (Methyl-seq), les modifications des histones (ChIP-seq) et l’accessibilité de la chromatine (ATAC-seq), puis les avons corrélés avec les niveaux d’expression des gènes (RNA-seq). Nous avons observé que les leucémies myéloïdes aiguës présentent un phénotype global d'hypométhylation tandis que les changements d'expression après l'addition de la fusion ont mis en évidence l’inactivation de gènes associés aux cellules souches et des altérations dans d'autres gènes impliqués dans la leucémogenèse tels que S100A8/9. Nos données d’ATAC-seq ont montré qu'il y avait relativement peu de changements spécifiques à la leucémie myéloïde aiguë et que la grande majorité correspondait à des régions de chromatine ouvertes et à des régions contenant des motifs pour des facteurs de transcription précédemment observés dans d'autres types de cellules sanguines. L’analyse des marques d’histones associées à des promoteurs actifs suggère également un potentiel rôle du récepteur CCR1 et de son ligand spécifique CCL23. Finalement, nos résultats suggèrent que la transformation leucémique par la fusion KMT2A-MLLT3 implique des modifications épigénétiques minimes qui requièrent également la coopération des réseaux transcriptionnels utilisés dans les cellules sanguines normales. La deuxième partie de cette thèse s’intéresse à la fusion de gènes KMT2A-MLLT4, une translocation chromosomique peu étudiée mais pour laquelle le pronostic vital des patients est connu pour être défavorable et pire que celui des patients porteurs de la fusion KMT2A-MLLT3. L’extension de notre modèle à la fusion KMT2A-MLLT4 nous permet d’appliquer les mêmes approches que précédemment et de détailler les différences génétiques et épigénétiques entre ces deux fusions, jusqu’à maintenant jamais caractérisées. Nous avons pu observer une baisse globale d’expression dans un groupe de gènes intervenant dans les processus ribosomaux et traductionnels. Par ailleurs, PROM1 (CD133) fait office de potentiel candidat biomarqueur permettant la distinction entre ces deux translocations chromosomiques tandis que le gène LPL pourrait jouer un rôle dans la leucémogenèse médiée par la fusion de gènes KMT2A-MLLT4. En conclusion, l’étude des mécanismes à chacun des stades du développement leucémique nous a fourni une meilleure compréhension des changements épigénétiques intervenant dans le processus de leucémogenèse causé par des réarrangements de type KMT2A. Une meilleure caractérisation de la pathophysiologie de la leucémie pourrait permettre d’explorer des avenues thérapeutiques plus ciblées. / Leukemia is a form of cancer that affects blood cells. Depending on the affected cell lineage and the rate at which the cancer grows, leukemia can be myeloid or lymphoid, or acute or chronic, respectively. In children, they are often characterized by the presence of chromosomal translocations, in particular involving the KMT2A gene. The biological impact of these gene fusions, known to be epigenetic disruptors, is still poorly understood. To study the consequences of the presence of gene fusions involving KMT2A, we have developed a human leukemia model. The model consists of transducing hematopoietic stem and progenitor cells (CD34+) from a single healthy donor with a retrovirus bearing an oncogenic fusion. These cells are injected into immunodeficient mice to produce acute myeloid or lymphoid leukemia after a few weeks. By using this model, we aim to define genes that are epigenetically regulated and essential in the process of leukemogenesis mediated by KMT2A gene fusions. The first part of this thesis characterized the genetic and epigenetic changes at each step of leukemogenesis caused by KMT2A-MLLT3 gene fusion. We investigated epigenetic changes such as DNA methylation (Methyl-seq), histone marks (ChIP-seq), and chromatin accessibility (ATAC-seq) and correlated these with expression changes (RNA-seq). We observed that acute myeloid leukemias exhibit a profound hypomethylation phenotype while expression changes after addition of the fusion highlighted the loss of stem cell associated genes and alterations in other genes implicated in leukemogenesis such as S100A8/9 in the early stages of leukemic transformation. Our ATAC-seq data showed that there were relatively few changes specific to acute myeloid leukemia and that the vast majority corresponded to open chromatin regions and clusters of transcription factors previously seen in other types of blood cells. Examination of ChIP-seq data for active histone marks revealed that leukemia specific expression of the chemokine CCL23 can enable autocrine signalling through its cognate receptor, CCR1. Our results suggest that KMT2A-MLLT3 induces minimal changes in the epigenome while co-opting the normal transcriptional machinery to drive leukemogenesis. The second part of this thesis focuses on KMT2A-MLLT4 gene fusion, another chromosomal translocation for which the vital prognosis of patients is known to be worse than that of patients carrying the KMT2A-MLLT3 fusion. The extension of our model to the KMT2A-MLLT4 fusion allows us to apply the same approaches and to characterize the genetic and epigenetic differences between these two different leukemias. We were able to observe a dramatic decrease in the expression level of a group of genes involved in ribosomal and translational processes. Furthermore, PROM1 (CD133) acts as a potential biomarker candidate which might be used to make the distinction between these two leukemias. LPL gene might play a role in leukemogenesis mediated by KMT2A-MLLT4 gene fusion. In conclusion, studying the mechanisms at each stage of leukemic development has provided us with a better understanding of the epigenetic changes involved in the process of leukemogenesis mediated by KMT2A rearrangements. A better characterization of the pathophysiology of leukemia could make it possible to eventually develop more targeted therapeutic treatments.

Durant l’hématopoïèse, les cellules souches hématopoïétiques peuvent soit s’autorenouveler soit se différencier dans les divers types de cellules matures constituant le système hématopoïétique. Un des modèles prédominants sur le développement du système hématopoïétique postule une différenciation par étape des différentes lignées le constituant. Ce modèle débute avec les cellules souches hématopoïétiques qui donnent naissance à des précurseurs multipotents qui peuvent à leur tour se différencier en précurseurs dédiées à la lignée lymphoïde ou myéloïde. Bien que la dernière décennie ait apporté de nombreuses connaissances sur les principales signalétiques transcriptionnelles impliquées dans le développement hématopoïétique, le détail des mécanismes moléculaires en jeu expliquant comment les cellules souches hématopoïétiques sont initialement amorcées puis complètement engagées vers une voie de différenciation reste toujours à élucider. Le travail de notre laboratoire indique que l’assemblage combinatoire du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF est un élément clé parmi les mécanismes épigénétiques qui gouvernent le destin cellulaire et notamment la famille de sous-unités Smarcd qui comporte 3 membre alternatifs Smarcd1/2/3. Des analyses du transcriptome par séquençage haut débit ont montré que l’expression de la sous-unité Smarcd1 du complexe est élevée dans le compartiment des cellules souches, les précurseurs multipotents et les progénitures lymphoïdes tandis que la sous-unité Smarcd2 est principalement exprimée dans les précurseurs myéloïdes. En utilisant des modèles de délétion conditionnelle dans des modèles murins, nous avons démontré que Smarcd1 et Smarcd2 jouent des rôles critiques et lignés spécifiques durant l’hématopoïèse. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que Smarcd1 collabore avec le facteur de transcription de la famille bHLH E2A pour spécifier le destin lymphoïde des précurseurs multipotents et qu’elle est donc absolument essentielle pour la lymphopoïèse. Notre travail sur les mécanismes moléculaires en jeu a pu montrer que Smarcd1 interagit directement avec E2A et est nécessaire pour l’accessibilité de la chromatine sur un ensemble de régions enrichies avec les modifications d’histones H3K27ac/H3K3me1 qui marquent des régions activatrices (« enhancer ») impliquées dans l’activation d’une signature lymphoïde dans les précurseurs multipotents. Le blocage de l’interaction entre Smarcd1 et E2A inhibe l’amorce de cette signature lymphoïde et bloque l’émergence de précurseurs destinés à la voie lymphocytaire. Concernant la fonction de Smarcd2, nous avons pu montrer que cette sous-unité est absolument nécessaire pour la granulopoïèse. Les souris ayant subi une délétion génétique de Smarcd2 deviennent très rapidement neutropéniques. Ce phénotype découle d'un blocage au stade de différenciation myélocyte/métamyélocyte, tandis que les autres lignées hématopoïétiques restent non affectées par la délétion. Nous avons pu identifier le facteur de transcription C/ebpƐ comme un partenaire essentiel de Smarcd2 qui interagit avec le complexe SWI/SNF sur les promoteurs de gènes de granules secondaires afin d’en activer la transcription. Les analyses du transcriptome que nous avons effectué lorsque l’interaction de Smarcd2 et C/ebpƐ est interrompue dans des précurseurs de granulocytes ont montré une diminution de l’expression des gènes de granules secondaires liée à une maturation incomplète des granulocytes menant au développement d’un syndrome de myélodysplasie au court du temps. / During hematopoiesis, hematopoietic stem cells (HSCs) either selfrenew or differentiate into all mature blood cell types through successive rounds of binary cell fate decisions. The prevailing model of hematopoiesis predicts a step-by-step model of lineage differentiation in which HSCs first give rise to multipotent progenitors that subsequently differentiate into myeloid and lymphoid restricted progenitors. Although key transcriptional pathways controlling hematopoietic development are beginning to be deciphered, detailed molecular mechanisms explaining how HSCs and progenitors are initially primed and then commit to the different hematopoietic cell lineages are lacking. Work from our laboratory indicates that combinatorial assembly of the mammalian SWI/SNF (mSWI/SNF) chromatin remodeling complex is a key epigenetic mechanism that governs cell fate decisions. Transcriptomics analyses revealed that expression of the Smarcd1 subunit is enriched in hematopoietic stem/progenitors and early lymphoid cells, while Smarcd2 is mainly expressed in myeloid progenitors. Using conditional knock-out mouse models, we demonstrated that Smarcd1 and Smarcd2 subunits perform critical and lineage-specific roles during hematopoiesis. First, we found that Smarcd1 collaborates with the bHLH transcription factor E2A to specify lymphoid cell fate during hematopoiesis and, therefore, is absolutely required for lymphopoiesis. Mechanistically, we showed that Smarcd1 physically interacts with E2A and is required for chromatin accessibility of a set of H3K27ac/H3K4me1-enriched enhancers that coordinate activation of the early lymphoid signature in hematopoietic stem cells. Impairing the interaction between Smarcd1 and E2A inhibits lymphoid lineage determination and the emergence of lymphoid-primed multipotent progenitors. Conversely, we showed that Smarcd2 is absolutely required for granulopoiesis. Smarcd2-deficient mice quickly become neutropenic due to a XIII block at the myelocyte/metamyelocyte stage of granulocyte maturation while other lineages remain unaffected. We discovered that Smarcd2 interacts with the transcription factor C/ebpε to recruit the mSWI/SNF complex on the promoter of secondary granule genes, thus inducing their transcriptional activation. As shown by transcriptomic analysis, impairing this interaction results in decreased expression of secondary granule genes, improper granulopoietic maturation, and development of a myelodysplastic-like syndrome over time. Altogether, this work identifies the Smarcd1 and Smarcd2 subunits of SWI/SNF complexes as master chromatin remodelers allowing the recruitment of lineage-specific transcription factors at key regulatory loci controlling lymphoid lineage priming and granulocyte development, respectively. More globally, these studies highlight that combinatorial assembly of alternative subunits of mSWI/SNF complexes is a key epigenetic mechanism controlling cell fate decisions during hematopoiesis.

Les protéines d’échafaudage de la famille Elmo forment des complexes avec les facteurs d’échange de nucléotides de la guanine (GEF) de la famille des protéines Dock. Globalement, le complexe Elmo/Dock est caractérisé par une régulation conformationnelle, où au niveau basal il se retrouve dans un état fermé, en raison de la présence de sites de contact bloquant la liaison des interacteurs d’Elmo et la fonction GEF de Dock qui permet l’activation de Rac1. Une fois dans un état activé, le complexe adoptera une conformation ouverte et les sites de liaison d’Elmo seront disponibles. Par exemple, il a été démontré que la liaison des GTPases RhoG ou Arl4A au domaine RBD d’Elmo induit le recrutement du complexe à la membrane cellulaire. Le domaine DHR-2 étant alors accessible, celui-ci assurera l’activation spécifique de la GTPase Rac1 afin d’induire, entre autres, le remodelage du cytosquelette d’actine. Divers processus cellulaires seront alors d clench s, tels que la migration cellulaire, la phagocytose et la fusion des cellules musculaires (nommées myoblastes). Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié par l’entremise de deux objectifs l’importance de la régulation conformationnelle d’Elmo. Pour le premier objectif, nous avons étudié la régulation conformationnelle d’Elmo durant la myogenèse. La formation de fibres multi-nuclées est fondamentale pour l’établissement du muscle squelettique. Durant ce processus, la fusion des myoblastes est une étape clé pour permettre le développement et la régénération musculaire. Afin d’étudier les fonctions d’Elmo in vivo dans ce contexte, nous avons généré une série de modèles de souris. Tout d’abord, via la génération de souris double knock-out pour Elmo1 et Elmo2 (Elmo1KOElmo2cKO), nous avons démontré la fonction essentielle d’Elmo durant la fusion des myoblastes embryonnaires. En effet, uniquement des myofibres mononuclées sont observées suite à l’inactivation génétique d’Elmo1 et Elmo2. Par la suite, nous avons également généré des lignées de souris knock-in, où des mutations ont été introduites dans des domaines spécifiques d’Elmo2 afin d’induire sa conformation ouverte (Elmo2EID) ou fermée (Elmo2RBD). Nous avons ainsi démontré qu’en présence d’Elmo2EID, la capacité de fusion est augmentée et des fibres musculaires plus larges sont développées. De plus, la régénération musculaire est plus efficace chez ces souris. À l’opposé, lorsqu’Elmo2 a perdu l’activité de son domaine RBD (Elmo1KOElmo2RBD), des fibres musculaires plus étroites sont retrouvées chez les jeunes souris adultes ainsi qu’une régénération du muscle moins efficace. Finalement, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité de la voie Elmo2-Dock1-Rac1, directement via le contrôle de la régulation conformationnelle d’Elmo2, améliore les phénotypes dystrophiques retrouvés chez les souris DysferlinKO, un modèle récapitulant la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD2B). Ainsi, pour la première fois, nous avons établi la possibilité d’exploiter la fusion des myoblastes en tant que thérapie régénérative pour des maladies musculaires. Pour le deuxième objectif, nous avons étudié Elmo3 dans un cas clinique dans le cadre d’une collaboration internationale. Plus précisément, des mutations bi-alléliques dans le gène Elmo3 ont été identifiées chez un jeune patient atteint d’une déficience intellectuelle. En effectuant des études biochimiques et fonctionnelles, nous avons démontré que ces mutations ont un impact sur l’activation de Rac1, sans toutefois influencer l’interaction entre les protéines du complexe Elmo3/Dock1. Cette étude apporte les premières évidences de fonctions biologiques pour Elmo3. Pour conclure, nos études ont permis de souligner l’importance d’un control approprié de la régulation conformationnelle d’Elmo. En effet, en manipulant cette régulation dans un modèle de muscle squelettique, via l’introduction d’une mutation maintenant la protéine dans une conformation ouverte, cela a permis un effet positif sur la fusion des myoblastes et sur la régénération musculaire, menant à l’amélioration des phénotypes de dystrophie musculaire.   l’opposé, la présence chez l’humain de mutations dans Elmo peut également affecter l’activation de Rac1 par Dock1, contribuant ainsi à une déficience intellectuelle chez le porteur. / The scaffold proteins Elmo forms a complex with guanine nucleotide exchange factors (GEFs) of the Dock family. The Elmo/Dock complex is characterized with a conformational regulation and at the basal level, the complex is found in a closed state, owing to the presence of contact sites blocking the binding of Elmo interactors and the GEF activity of Dock for the activation of Rac1. In their activated state, the complex adopts an open conformation and Elmo binding sites will be available. For example, binding of the GTPases RhoG or Arl4A to the RBD domain of Elmo has been shown to induce the recruitment of the complex at the cell membrane. Likewise, the DHR- 2 domain of Dock being available, the GTPase Rac1 will then be specifically activated by Dock and thus induce the remodeling of the actin cytoskeleton. Various cellular processes will then be triggered, such as cell migration, phagocytosis and muscle cell (named myoblast) fusion. In this thesis, we have emphasized the importance of the conformational regulation of Elmo by achieving two objectives. For the first objective, we studied the conformational regulation of Elmo during myogenesis, i.e. during the establishment of skeletal muscle. The formation of multinucleated myofibers is fundamental for skeletal muscle. During this process, myoblast fusion is a key step to allow the development as well as the regeneration of the muscle. In order to study Elmo in this in vivo context, we generated a series of mouse models. First, through the generation of double knockout mice for Elmo1 and Elmo2 (Elmo1KOElmo2cKO), we demonstrated the essential function of Elmo during embryonic myoblast fusion. Indeed, only mononucleated myofibers are observed following the genetic inactivation of Elmo1 and Elmo2. Subsequently, we also generated knockin mouse lines, where mutations were introduced in specific domains of Elmo to induce its opened (Elmo2EID) or closed (Elmo2RBD) conformation. Thus, we have demonstrated that when Elmo2EID is expressed, the fusion capability is increased and the myofibres are larger. Moreover, muscle regeneration is more efficient in these mice. At the opposite, when Elmo2 has lost its RBD activity (Elmo1KOElmo2RBD), smaller myofibers are observed as well as a less efficient muscle regeneration. Finally, we demonstrated that increasing the Elmo-Dock1-Rac1 pathway activity, directly through the control of the conformational regulation of Elmo, leads to the improvement of the dystrophic phenotypes found in DysferlinKO mice, a mouse model of the limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B). Thus, for the first time, we have established the possibility of exploiting myoblast fusion as a regenerative therapy for muscle diseases. For the second objective, we studied Elmo3 in a clinical case, as part of an international collaboration. More specifically, biallelic mutations in Elmo3 gene have been identified in a young patient with intellectual disability. Through biochemical and functional studies, we have shown that the mutations have an impact on the activation of Rac1, without however affecting the interaction between the proteins of the Elmo3/Dock1 complex. This study provides the first evidence of biological functions for Elmo3. In conclusion, our study has emphasis the relevance of the proper control of the conformational regulation of Elmo. In fact, by manipulating this regulation in a skeletal muscle model, through the introduction of a specific mutation promoting the open conformation of Elmo, it promotes myoblast fusion and induce a more efficient muscle regeneration, thus improving the dystrophic phenotypes. In contrast, the presence of human mutations in Elmo can also affect the activation of Rac1 by Dock1, hence contributing to intellectual disability in the carrier.

Protein SUMOylation is a highly dynamic and reversible post-translational modification that targets lysine residues on a wide range of proteins involved in several essential cellular events, including protein translocation and degradation, mitotic chromosome segregation, DNA damage response, cell cycle progression, cell proliferation, and migration. Protein SUMOylation is an ATP-dependent enzymatic process that involves an E1 activating enzyme SAE1/2, a E2 conjugase UBC9, and usually facilitated by SUMO E3 ligases. The SP-RING family is the largest family of SUMO E3 ligases, encompassing seven mammalian protein inhibitor of activated STAT (PIAS) proteins. PIAS family was originally identified as specific inhibitors for signal transducer and activator of transcription (STAT), which involves gene transcriptional regulation. Recent studies showed that PIAS proteins also play important roles in the regulation of protein stability and signal transduction through the SUMOylation of target substrates. In addition, PIAS-mediated protein SUMOylation is also involved in several cellular processes, including DNA damage repair, immune response, cellular proliferation, and motility. Most notably, PIAS proteins are highly expressed in different cancer types and have been implicated in tumorigenesis. Several reports suggest that PIAS proteins could promote cancer cell growth and progression by regulating the SUMOylation of different substrates. To date, a number of substrates of PIAS ligases have been identified from several individual studies, and hundreds of specific SUMO E3 ligase substrates were identified from a human proteome microarray-based activity screen. However, how these substrates are selected, and which SUMOylation sites are targeted by these PIAS are still unknown. To answer these questions, I started my investigation with PIAS1, one of the most well studied SUMO E3 ligases. By changing the expression level of PIAS1 in HeLa cells using gene overexpression or CRISPR/Cas9 gene knockout, I found PIAS1 had a physiological impact on cell proliferation and migration. I took advantage of the previously developed SUMO proteomics workflow to quantitatively profile global SUMOylome changes upon PIAS1 overexpression in a site-specific manner. I identified 983 SUMO sites on 544 proteins, of which 62 proteins were assigned as putative PIAS1 substrates. In particular, Vimentin (VIM), a type III intermediate filament protein involved in cytoskeleton organization and cell motility, was identified as PIAS1 substrates. Two SUMOylation sites mediated by PIAS1 at Lys-439 and Lys-445 residues were further evaluated and found to be necessary for dynamic disassembly and assembly of vimentin intermediate filaments, which further regulates cell migration and motility. In the second study, I extended my investigation to all PIAS ligases and further found that all PIAS proteins impact cell proliferation and migration of breast cancer cell MDA-MB-231 after CRISPR/Cas9 gene knockout. I further optimized my SILAC-based quantitative SUMO proteomics approach and combined it with transcriptomics to gain a system-level understanding of the functional components involved in PIAS regulatory networks. A large subset of proteins/ genes involved in cell proliferation and migration were commonly regulated by all PIAS proteins, suggesting a redundancy of regulation within the PIAS family. In addition, each PIAS regulated a unique pool of substrates/genes involved in different cellular processes, such as DNA damage repair, chromatin remodeling, and SUMO chain formation, suggesting that each PIAS specifically regulates cellular functions. The trans-scale analyses between proteomics and transcriptomics shed light on the comprehensive pictures of the regulation networks by PIAS proteins beyond their direct enzymatic activity. Overall, the quantitative SUMO proteomics approach provided a robust method for identifying substrates of PIAS SUMO E3 ligases. The combination of proteomic and transcriptomic analyzes made it possible to draw up a global portrait of the regulatory mechanisms governed by the PIAS proteins. / La SUMOylation des protéines est une modification post-traductionnelle se produisant sur des lysines d’un large éventail de protéines cellulaires. Cette modification est dynamique et régit plusieurs évènement cellulaires essentiels, dont la translocation et la dégradation des protéines, la ségrégation chromosomique mitotique, la réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration. La conjugaison de la protéine SUMO sur son substrat se produit grâce à une triade enzymatique regroupant l’enzyme d’activation E1 SAE 1/2, la conjugase E2 UBC9 et dans la plupart des cas une ligase SUMO E3. Cette cascade enzymatique nécessite une source d’ATP pour son initiation. Parmi la famille des ligases SUMO E3, on retrouve un domaine spécifique nommé SP-RING présent chez une sous population de celles-ci. Parmi ces ligases on retrouve 7 protéines inhibitrices des protéines STAT activées regroupees sous le nom de PIAS. Les ligases PIAS ont été identifiées à l'origine comme des inhibiteurs spécifiques des protéines STAT responsable du signal de transduction et de l’activation de la transcription génique. Des études récentes ont montré que les protéines PIAS jouent également un rôle important sur la stabilité de leurs substrats et la transduction de leur signal. De plus, les substrats SUMOylés par les PIAS sont impliqués dans plusieurs processus cellulaires, notamment la réparation des dommages à l'ADN, la réponse immunitaire, la prolifération et la motilité cellulaire. Ces divers processus cellulaires peuvent être déréglés et entrainer le développement du cancer. Il s’avère que les protéines PIAS sont fortement exprimées dans divers types de cancer et sont impliquées dans la tumorigenèse. Plusieurs rapports suggèrent que les protéines PIAS pourraient favoriser la croissance et la progression des cellules cancéreuses en régulant le niveau de SUMOylation de plusieurs substrats. Initialement, les substrats des ligases PIAS ont été identifiés à partir de plusieurs études individuelles et plus récemment, des centaines de substrats spécifiques de la SUMO E3 ligase ont été identifiés à partir de criblage de micropuces à protéines interrogeant le protéome humain. Cependant, la manière dont ces substrats sont sélectionnés et quels sont les sites de SUMOylation ciblés par ces PIAS demeurent encore méconnus. Afin d’aborder ces questions, j’ai commencé mon étude avec PIAS1, l'une des ligases SUMO E3 les plus étudiées. Pour ce faire, j’ai varié le niveau d'expression de PIAS1 dans des cellules iv HeLa selon l’approche CRISPR/Cas9. Ainsi, deux modèles ont été construit, soit via une surexpression du gène ou via un knockout du gène. Ces mutants ont permis de constater que PIAS1 avait un impact physiologique sur la prolifération et la migration des cellules. J’ai tiré avantage d’une méthode protéomique précédemment développé sur les peptides SUMO pour déterminer les changements de SUMOylation lors de la surexpression de PIAS1. J’ai identifié 983 sites SUMO sur 544 protéines, dont 62 protéines ont été identifiées comme substrats potentiels de PIAS1. Parmi celles-ci, la vimentine (VIM), une protéine de la famille des filaments intermédiaire de type III impliquée dans l'organisation du cytosquelette et la motilité cellulaire, a été reconnu comme un substrat de PIAS1. Afin de valider le rôle de la SUMOylation des lysines Lys-439 et Lys-445 de VIM j’ai effectué des études fonctionelles de motilité cellulaire avec les mutants où ces sites ont été substitués en arginine. Ces expériences m’ont permis de constater que la SUMOylation de VIM aux sites Lys-439 et Lys-445 est nécessaire à l’assemblage et désassemblage dynamique des filaments intermédiaires de VIM, lesquels regulent la migration et la motilité cellulaire. Dans la deuxième étude, j’ai élargi mon recherche sur toutes les ligases PIAS et avons découvert que ces dernières avaient toutes un impact sur la prolifération cellulaire et la migration des cellules du cancer du sein MDA-MB-231 suite à un knockout de ces gènes par CRISPR / Cas9. De plus, j’ai optimisé mon approche de protéomique quantitative SUMO via SILAC et l'avons complémenté d’une analyse transcriptomique. Cette combinaison a permis d’acquérir une compréhension des composants fonctionnels impliqués dans les réseaux de régulation PIAS. Il s’avère qu’un grand sous-ensemble de gènes / protéines impliqués dans la migration et la prolifération des cellules sont régulés par tous les membres de la famille PIAS, et suggère une certaine redondance fonctionnelle parmi ces ligases. De plus, chaque PIAS régule un ensemble unique de substrats / gènes impliqués dans plusieurs processus cellulaires différents, tels que la réparation des dommages de l'ADN, le remodelage de la chromatine et la formation de la chaîne SUMO. Ces résultats suggèrent que chacune des PIASs régule de façon spécifique les fonctions cellulaires. La combinaison des analyses protéomiques et transcriptomiques ont permi de dresser un portrait global des mécanismes de régulation régit par les protéines PIAS et ce au-delà de leur activité enzymatique directe.

Chez l’embryon précoce, une vague de reprogrammation majeure survient et permet de réinitialiser les profils de méthylation d’ADN de l’ensemble du génome. Lors de cette reprogrammation, les régions différentiellement méthylées (DMRs) (i.e., gènes empreintes) doivent toutefois être protégées de la déméthylation par une action continue de DNMT1 (Méthyltransférase d’ADN 1) pour assurer le développement adéquat de l’épigénome du fœtus. Sachant que l’induction d’une perte temporaire d’expression de Dnmt1 dans un modèle de cellules souches embryonnaires de souris entraîne la perte permanente des patrons de méthylation d’ADN aux régions DMRs et DMR-like, mon projet de recherche vise à comprendre pourquoi ces régions sont incapables de retrouver leurs patrons de méthylation d’ADN initiaux. Notre hypothèse est qu’une adaptation épigénétique (i.e. réarrangement erroné de certaines modifications d’histones) survient aux régions régulatrices de l’expression des gènes (promoteurs et enhancers) et empêche directement ou indirectement le retour au paysage épigénétique initial aux régions affectées. L’objectif du projet est donc de précisément définir comment la perte temporaire de Dnmt1 remodèle le paysage épigénétique aux régions promotrices (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, méthylation d’ADN) et comment les adaptations épigénétiques sont associées avec des changements de l’expression des gènes (ex : gènes des régions DMRs et DMRs-like). / In early embryos, a major reprogramming wave occurs and permits to reset DNA methylation profiles genome-wide. During the reprogramming wave, differentially methylated regions (DMRs) (imprinted genes) must be protected from demethylation by the continuous action of DNMT1 (DNA Methyltransferase 1) to ensure the proper development of the foetal epigenome. As the induction of a temporary loss of Dnmt1 expression in a mouse embryonic stem cell model leads to permanent losses of DNA methylation at DMR and DMR-like regions, my project aims to understand why those regions are unable to re-establish their initial DNA methylation patterns. Our hypothesis is that an epigenetic adaptation (erroneous rearrangement of certain histone modifications) occurs at regulatory regions controlling gene expression (promoters and enhancers) and impede directly or indirectly the affected regions to return to their initial epigenetic landscape. The goal of this project is thus to define how the temporary loss of Dnmt1 remodels the epigenetic landscape at promoter regions (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, DNA methylation) and how the epigenetic adaptations are associated with changes in gene expression (ex: genes in DMR and DMR-like regions).

Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine, favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy. Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC. Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake. Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure. Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.