Venös tromboembolism (VTE) inkluderar både djup ventrombos (DVT) och lungemboli (PE) och är en vanlig och komplex kardiovaskulär sjukdom med allvarliga kortsiktiga och långsiktiga komplikationer. I dagens kliniska praxis skulle diagnoseringen av VTE gynnas av en plasmaproteinpanel som antingen kan utesluta fall av akut VTE på egen hand eller komplettera den nuvarande biomarkören D-dimer, som i sig är begränsad av låg specificitet. På grund av den höga återfallsfrekvensen och de allvarliga post-syndromen skulle en plasmaproteinpanel som kan bedöma risken för återkommande VTE underlätta för kliniker i efterbehandlingsbeslut. Mot denna bakgrund syftade denna studie till att föreslå två separata plasmaproteinpaneler, en för att utesluta akuta VTE-patienter och en annan för att bedöma risken för återkommande VTE. Med 1463 unika plasmaproteiner screenades plasmaproteomet hos 194 individer från två undergrupper av venös tromboembolism-biomarkörstudien (VEBIOS), närmare bestämt VEBIOS ER och VEBIOS Coag, med hjälp av proximity extension assay (PEA). Både genuttryck (DE) -analys och maskininlärning (ML) -algoritmer användes för att identifiera signifikanta respektive viktiga proteiner. För akut VTE identifierades 10 signifikanta proteiner genom DE, samt en panel bestående av fem proteiner tillsammans med D-dimer hade tillsammans en area under kurvan (AUC) på 0,97 genom ML. För återkommande VTE identifierades inga signifikanta proteiner och den bästa proteinpanelen hade en AUC på 0,62. Vissa av dessa proteiner har tidigare rapporterats vara associerade med VTE och vissa inte, vilket resulterar i ortogonal validering eller påvisande av en potentiell ny biomarkör. Sammanfattningsvis hittades flera intressanta plasmaproteiner som potentiellt skulle kunna användas för att utesluta fall av akut VTE. GP1BA och S100A12 var särskilt intressanta då de var återkommande som högt ansenliga enligt DE och ML. Resultaten från denna studie kommer förhoppningsvis bidra till forskningen gällande förbättrad diagnos av VTE-patienter genom användning av plasmaproteinmarkörer och argumentationen för ytterligare undersökningar för dessa identifierade plasmaproteiner. / Venous thromboembolism (VTE) is a common and complex cardiovascular disorder with serious short- and long-term complications, comprising both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE). In current clinical practice, diagnosis of acute VTE would greatly benefit from a plasma protein panel that can exclude cases of VTE on its own or complement the current biomarker, D-dimer, which is limited by low specificity. Because of the high recurrence rate and serious post-syndromes, a protein panel that can assess the risk of VTE recurrence would help clinicians in post-treatment decision-making. Hence, this study sought out to propose two separate plasma biomarker panels, one to exclude acute VTE patients and another to risk-assess VTE recurrence.  To accomplish this, 1463 unique plasma proteins were used to investigate the plasma proteome of 194 individuals from two subgroups of the venous thromboembolism biomarker study (VEBIOS), specifically VEBIOS ER and VEBIOS Coag, using proximity extension assay (PEA). Both differential expression (DE) analysis and machine learning (ML) algorithms were used to find significant and important proteins respectively. For acute VTE, 10 significant proteins were identified through DE, and a panel of five proteins together with D-dimer had together an area under the curve (AUC) of 0.97 through ML. For VTE recurrency, no significant proteins were identified, and the best protein panel had an AUC of 0.62. Some of these proteins have previously been reported as associated to VTE and some not, resulting in some orthogonal validation or novelty. In summary, several interesting plasma proteins were found that could potentially be used to exclude cases of VTE in an acute setting. GP1BA and S100A12 were particularly interesting as they performed well in both DE and ML. The results in this study will hopefully aid the research of improving diagnosis of VTE patients using plasma biomarkers, strengthening the claim and further investigations for these identified plasma proteins.

Stem cell therapy and transplantation is a quickly evolving field with many clinical applications. However, several problems need to be overcome before they can be applied on an allogenic scale, and among them is ensuring of the purity of the applied differentiated stem cell culture. Separation using magnetic beads which attach to the wanted cells has proven to be an effective and easy method to separate them from a sample. An important factor with the method is the choice of specific surface antigens on the beads which determines how well the beads are attached to the cell.  This report will provide some fact of the immunotherapy and some of the most important stem cells and their differentiation to an active cell. It will be elucidated which cytokines are important for differentiation, and current clinical studies in the immunotherapeutic field of stem cells and their useful surface antigens. Furthermore, regenerative medicine using stem cells will be covered. A brief overview mesenchymal and induced pluripotent stem cells, their biological markers, and their various uses. Specific projects using regenerative medicine will be described and an overview of ever-expanding market for regenerative medicine will also be included.

I detta examensarbete användes olika bildbehandlingstekniker för detektion och kvantifiering av DNA-mikrobollar, mer specifikt rolling circle amplification-produkter, på mikroskopibilder. Avsikten med detta arbete var att hjälpa Countagen AB utforska pipelines för bildbehandling för sin produkt där de analyserar utfallet av genredigeringsförsök på ett billigare och snabbare sätt än dagens konventionella sekvenseringsmetoder. Två olika metoder för objektdetektion användes i detta arbete. Big-FISH, som bygger på Laplacian of Gaussian och detektion av lokala maxima, samt LodeSTAR, en single-shot, self-supervised djupinlärningsmodell. Förbehandling av bilder var också en central del av detta projekt. DeepSpot, en djupinlärningsmodell för framhävning av punkter, användes för att framhäva mikrobollarna så att de lätt kunde upptäckas, och en top-hat-transform användes för att filtrera bort bakgrunden från bilderna. De olika metoderna utvärderades på ett dataset med manuellt annoterade bilder, en spädningsserie av prover samt prover med samma koncentration. Detta för att få värden på precision, recall och F1-score samt mäta hur robust modellen är när det gäller att detektera punkter. Den modell som presterade bäst var LodeSTAR, med en F1-score på 83% på det annoterade datasetet. / In this thesis project, different image processing techniques were utilized for the detection and quantification of DNA microballs on fluorescence microscopy images. These microballs consisted of rolling circle amplification products, of regions of interest. This was done to aid Countagen AB in exploring image processing pipelines for their product where they analyze gene editing efficiency in a cheaper and faster manner than today's conventional sequencing methods. Two different object detection methods: Big-FISH, which builds on Laplacian of Gaussian and local maxima detection, and LodeSTAR, a single-shot, self-supervised deep learning model, were evaluated for this task of detection and quantification. Image preprocessing was a central part of this project. DeepSpot, a deep learning model for spot enhancement was used to highlight the microballs, and a white top-hat transform was applied to the images for background subtraction. The different methods were evaluated on a test set of manually annotated images, a dilution series of samples, and samples with the same concentration to obtain precision, recall, and F1 scores, as well as gauge the robustness of the model in detecting spots. The best-performing model was LodeSTAR, with an F1-score of 83% on the test set.

I dagsläget utvecklas ständigt nya läkemedel med hjälp av affinitetsprotein. På 90-talet skapades ett nytt sådant protein utvunnet från Protein A på KTH, den så kallade affibodyn. Att arbeta med affibodies är ofta fördelaktigt eftersom de är lätta producera samtidigt som de delar många av de väsentliga egenskaperna hos en antikropp. Affibodies är även kända för att vara mycket stabila, vilket betyder att de i de flesta fall klarar av att vecka sig tillbaka till korrekt struktur efter denaturering. Tyvärr är det inte alltid fallet och ett exempel på det är de affibodies i biblioteket som konstruerats för att binda till spike 1 på SARS-CoV-2 i Johan Rockbergs labb på Proteinteknologi i AlbaNova. I detta projekt har affibodyn ZS1-ORANGE-22, från biblioteket, producerats i tre nya expressionsvektorer som tidigare inte prövats. Vektorerna innehåller olika element som tidigare påvisat öka lösligheten av protein. Resultatet från produktionen visar att vektorn som tidigare använts för produktion av affibodyn producerade den största mängden protein. Däremot uppvisade de tre nya vektorerna som utvärderats i projektet ett större procentuellt utbyte protein efter rening. I kombination med detta har även en studie kring hur buffertars komposition inverkar på proteinlösligheten gjorts. Resultat från denna utvärdering visar att tillsatsen av L-arginin och L-Glutaminsyra till PBS ökar lösligheten av proteinet, men att det även kan en inverkan på dess struktur som gör det mindre lämpligt för tillämpningar samt analys. / Today new drugs based on affinity proteins are constantly developed. In the 90s a new type of affinity protein was discovered from Protein A at KTH, the affibody. Affibodies are often favorable to work with since they are easy to produce and share a lot of essential characteristics with antibodies. They are also known for being stable, meaning they can refold correctly after being denatured. However, this is not always the case and an example of this is the library of affibodies designed to bind to spike 1 on SARS-CoV-2 in Johan Rockbergs lab at Proteintechnology in AlbaNova. In this project the affibody ZS1-ORANGE-22, from said library, has been produced in three new expression vectors which all have elements that previously have shown to help with precipitation. The results show that the vector that has previously been used to produce the affibody produces a larger quantity of protein. However the three new vectors that have been evaluated in this project give a larger percentage yield after purification. In combination with this, a study on how buffer compositions impact protein solubility has been conducted. Results have shown that adding L-Arginine and L-Glutamic acid to a PBS buffer has positively impacted the solubility of the proteins. However, this may also affect their structure making them less suitable for application and analysis.

Omkring 20 miljoner nya cancerfall inträffar över hela världen varje år, och under 2020 uppskattades det att 10 miljoner dödsfall var förknippade med cancer. En av de vanligaste behandlingarna för cancer är cytostatika (cellgifter) som angriper alla snabbväxande celler. Detta kan i sin tur leda till allvarliga biverkningar, exempelvis hematologiska toxicitetsreaktioner som kan vara livshotande och till och med dödliga, men hur allvarligt en patient kommer att reagera på behandlingen är mycket individuellt. För närvarande finns det ingen definitiv förklaring på vad som är den bakom- liggande orsaken till dessa allvarliga toxicitetsreaktioner. Det kan vara en genetisk komponent och det antas att genetiska variationer finns i genomets regulatoriska sekvenser som kan vara bidragande faktorer. För detta examensarbete har det identifierats varianter som finns inom eller nära någon enhancer där motsvarande enhancer kan vara kopplad till gener relevanta för de allvarliga toxicitetsreaktioner som vissa patienter upplever. Syftet är att validera att dessa enhancers faktiskt reglerar genuttrycket av dessa gener genom CRISPR-interferens (CRISPRi). Genom att rikta in sig på de identifierade enhancer-varianterna med CRISPRi-systemet, med hjälp av flera olika sgRNA, skulle en mätbar förändring i genuttryck kunna uppnås. Den slutliga valideringen av dessa enhancers, om de faktiskt modulerar genuttrycket, har inte utförts på grund av tidsbrist. Dock  har  alla  nöd- vändiga komponenter förberetts såsom att integrera de erforderliga sekvenserna för CRISPRi till genomet av cancercellinjen K562 och sorterat ut de celler med framgångsrik integrering, därigenom skapat en stabil cellinje. / Around 20 million new cancer cases occur worldwide every year, and in 2020 alone it was estimated that 10 million deaths were associated with cancer. One of the most common treatments for cancer is the use of chemotherapy drugs which are nonspecific and target all fast dividing cells. This in turn can lead to serious haematological toxicity reactions among other adverse side effects that could be life threatening and even fatal, but how severely a patient will react to the treatment is very individual.  As of now there is no definite answer to what the underlying cause for these severe toxicity reactions is.  There could be a genetic component and it is hypothesised that there are variants residing in the regulatory sequences of the genome that could be contributing factors. For this degree project, variants that are located within or near an enhancer have been identified where the corresponding enhancer might be linked to genes relevant for why some patients might experience severe toxicity re- actions. The aim is to validate that these enhancers do in fact regulate the gene expression of these genes through the use of CRISPR-interference (CRISPRi). By targeting around the identified enhancer variants with the CRISPRi system, using several different sgRNA, there could be a measur- able change in gene expression. The final validation of the enhancers, if these do in fact modulate the gene expression, was not performed due to lack of time. However, all necessary components were prepared such as integrating the required sequences for CRISPRi into the genome of the cancer cell line K562 and sort for successful integration, thereby creating a stable cell line.

Fagmider är ett kraftfullt verktyg som använts för att uttrycka heterologa proteiner på fagvirus i metoder som exempelvis riktad evolution via fagdisplay av proteinbinliotek. Monovalent uttryck genom fagemider lider av ett överflöd av kala fager som är svåra att rensa bort. Effektiviteten hos detta system kan förbättras genom att använda tekniker för att selektivt fånga uttryckande fag. Biotinylering och infångning med streptavidin kan vara ett användbart verktyg för sådana ändamål och enzymatisk biotinylering med AviTag™-BirA-systemet är ett lovande alternativ. En fagemidvektor skapades genom amplifiering och kloning av sekvensen av AviTag™ in i en linjäriserad pAffi1#336-vektor. Sekvenser av två affikroppar, Zher2 och Zwt, som binder till två olika mål, Her2 och trastuzumab, klonades in i denna Avi-märkta vektor. Denna sammansatta fagemidvektor transformerades därefter till tre Escherichia coli-stammar: XL1Blue, ER2738, TG1. En plasmid innehållande BirA-enzym avsett för platsspecifik biotinylering av proteinerna som bär AviTag™ samtransformerades tillsammans med fagemiden i vissa transformationer för att undersöka biotinylering in vivo. Produktionsnivåerna för var och en av dessa stammar tillsammans med deras tillväxtkurvor beräknades för att analysera om plasmidbelastningen påverkar någon av stammarnas tillväxt. Det observerades att XL1Blue kunde växa i en takt som var jämförbar med de andra stammarna och samtidigt lyckades producera tillräckligt högre titrar. Superinfektion av hjälparfager för dessa produktioner var också mycket lovande. ER2738 och TG1 var avsevärt dåliga, den förra i termer av alla aspekter och den senare saknade bra superinfektionskarraktär men uppvisade anmärkningsvärt högre tillväxt och avsevärt högre titrar. Fagen biotinylerades in vitro genom att använda BirA som producerades och renades internt och dess biotinyleringsgrad jämfördes med den biotinylerade in vivo fagen som producerades i dessa tre stammar. Dessa fager utvärderades för deras förmåga att binda till sina mål och deras grad av biotinylering. Ett märkbart mönster som observerades fag visade minskad bindning till humant serumalbumin, vilket gjorde deras målbindning svår att tolka. / Phagemids have been a convenient and powerful tool used to display heterologous proteins on phage in methods such as directed evolution by phage display of protein libraries. Monovalent display through phagemids suffers from an overabundance of bald phage which are difficult to deplete. The efficiency of this system can be improved by using techniques to selectively capture expressing phage. Biotinylation and capture using streptavidin can be a useful tool for such purposes and enzymatic biotinylation using the AviTag™-BirA system is a promising option. A phagemid vector was created by the amplification and cloning of the sequence of AviTag™ into a linearized pAffi1#336 vector. Sequences of two affibodies, Zher2 and Zwt, binding to two different targets, Her2 and human IgG, were cloned into this Avi-tagged vector. This assembled phagemid vector was subsequently transformed into three Escherichia coli strains: XL1Blue, ER2738, TG1. A plasmid containing BirA enzyme intended for site-specific biotinylation of the proteins that carry the AviTag™ was co-transformed along with the phagemid in some transformations to investigate in vivo biotinylation. The production levels of each of these strains along with their growth curves were calculated to analyse if the plasmid burden impacts either of the strains’ growth. It was observed that XL1Blue was able to grow at a pace comparable to the other strains and managed to produce sufficiently high titers. The superinfection rate of these productions was also very promising. ER2738 and TG1 were considerably poor, the former in terms of all aspects and the latter only lacking in the superinfection rate but notable displaying higher growth and considerably higher titers. The phage was biotinylated in vitro by using BirA that was produced and purified in-house and its biotinylation degree was compared against the in vivo biotinylated phage that were produced in these three strains. The phage were then evaluated for their ability to bind to their targets and their degree of biotinylation. One noticeable pattern that was observed was that the Avi- tagged phage displayed reduced binding to the Human Serum Albumin which made their target binding hard to interpret.

Lungcancer är en heterogen sjukdom som kräver många histopatologiska analyser för att diagnostisera och behandla effektivt. Dessa analyser utförs för närvarande med singelplex immunohistokemi (IHC) vilket kräver mycket vävnadsprovmaterial om flera markörer behöver färgas för. I den här studien testades två tillvägagångssätt för multiplex immunfluorescens (IF) (indirekt sekventiell IF och multiplex tyramide signal amplification med spektral avblandning) för att se om en panel av 7 markörer, som rutinmässigt används kliniskt, kunde färgas i ett enda experiment på samma vävnadsprov. För att göra detta användes COMET- och LabSat-instrumenten från Lunaphore och de utvärderades utifrån kvalité och användarvänlighet. På COMETen kunde alla sju markörer inkluderas i panelen medan tillvägagångssättet med TSA på LabSat var begränsat till sex markörer på grund av protokollet för spektral separation. Panelen optimerades på COMET och sedan gjordes multiplexa färgningar med båda instrumenten. Färgningarna från LabSat avbildades med mikroskopet på PhenoImager Fusion-instrumentet. Alla färgningar på COMET var av god kvalité medan LabSat hade behövt vidare optimering för att prestera på samma nivå. COMETen fanns också vara det mer användarvänliga instrumentet pga det integrerade mikroskopet och mindre behov av användarintervention. Denna studie visade att det är möjligt att översätta singelplexa IHC-analyser till multiplex IF med vissa optimeringar och byte av några antikroppskloner. / Lung cancer is a heterogeneous group of malignancies that requires many histopathological analyses to diagnose and treat efficiently. These analyses are currently performed with singleplex immunohistochemistry (IHC) which needs a lot of tissue sample material if multiple markers have to be stained for. In this study, two different multiplexed immunofluorescence (IF) approaches (indirect sequential IF and multiplexed tyramide signal amplification with spectral unmixing) were tested to see if a panel of 7 markers routinely used in clinic to could be stained in a single experiment on the same tissue sample. To do this, the COMET and LabSat instruments from Lunaphore were used and evaluated in regards to quality and ease of use. With the COMET all seven markers could be included in the panel while the TSA approach on LabSat was limited to six markers due to the spectral unmixing protocol. The panel was optimized on COMET and then multiplexed stainings were performed on both instruments. The LabSat staining was imaged on the PhenoImager Fusion microscope. All the stainings were of good quality on the COMET while the LabSat would have needed further optimization to perform at the same level. The COMET was also found to be the more user-friendly instrument due to its integrated microscope and lesser need for user intervention. This study showed that it is possible to translate singleplex IHC analyses into multiplexed IF with some optimizations and change of a few antibody clones.

Trippelnegativ bröstcancer (TNBC) är den mest maligna formen av bröstcancer utan någon framträdande behandlingsbar biomarkör. Således har den djupa återfallsfrekvensen och bristen på behandlingsalternativ öppnat behovet av att förstå TNBC: s etiopatogenes och molekylära mekanism. Huvudsyftet är att kartlägga det genomomfattande differentiella uttrycket av den förmodade cancergenen (en prenyleringsgen) och dess betydelse vid trippelnegativ bröstcancer. Hi-Cap (Capture Hi-C) är en teknik som genererar högupplösta promotor-förstärkare interak- tioner med nästan en-förstärkare upplösning.Vi arbetade med cancercellinjer, MDA-MB_231, med och utan den förmodade genen. Hi-C-tekniken optimerades i enlighet därmed för cancer- cellinjen för att generera en högupplöst berikad region. Resultaten kan vidare användas för att utföra biblioteksförberedelser och bioinformatikanalys. Dessa fynd kommer att ägnas åt att upptäcka nya vägar involverade i prenylering och TNBC. / Triple-negative Breast cancer (TNBC) is the most malignant form of breast cancer with no prominent treatable biomarker. The profound recurrence rate and lack of treatment options have opened the need to understand the etiopathogenesis and molecular mechanism of TNBC. The main objective of this study is to map the genome-wide differential expression of the putative cancer gene (a prenylation gene) and its importance in Triple-Negative Breast cancer. Hi-Cap (Capture Hi-C) is a technique which generates high-resolution promoter-enhancer interactions with almost single-enhancer resolution. We worked with cancer cell lines, MDA-MB_231, with and without the putative gene. The Hi-C technique was optimized accordingly for the cancer cell line to generate a high-resolution enriched region. The results can be further used to perform library prep and bioinformatics analysis. These findings will devote to discovering novel pathways involved with prenylation and TNBC.

High-throughput Sequencing (HTS)-tekniker fortsätter att utvecklas snabbt, vilket ökar genomströmningen och minskar sannolikheten för fel. MGI Tech Co., Ltd. (MGI) är ett ledande HTS-varumärke som använder DNBSEQ-teknologi och finns i Center for Translational Microbiome (CTMR). MGI:s sequencers har en hög känslighet och det är viktigt att följa protokollen när proverna hanteras för att undvika introduktion av kontaminering. Detta projekt kommer att utforska tidigare genererade data vid CTMR för att fastställa hur och var i sekvenseringsprocessen kontaminering har introducerats. Data delas in i två huvudkategorier: primärdata, eller verkliga data (RD), och sekundära data, vidare uppdelad i Never Used Barcodes (NUB) och Non-Sequenced (NS). RD:n är sann mot provet, medan NUB och NS anses vara hämtade från bakgrundsbrus. RD, NUB och NS var föremål för taxonomiska analyser, på släkt- och artnivå, och streckkodsanalyser med hjälp av RStudio-gränssnittet för att identifiera och kontrastera de vanligaste i varje kategori. Dessutom var RD också föremål för dekontamineringsanalys på två databaser, VaMyGyn och KOLBIBAKT. Dekontaminering används för att identifiera förorenande arter i ett samhälle. Efter analysen fanns det inga starka bevis som tydde på laboratoriekontamination eller kontaminerade reagenser. Några av dessa NUB delade subsekvenser med RD barcodes, där antal reads för varje par var korrelerade mellan prover. Det kan vara en indikation på att RD barcoded med sekvenseringsfel blir inkorrekt tolkade som NUB. En djupare analys skulle krävas för att bekräfta det.CTMR är numera medveten om att kontaminering från laboratoriet, reagenser eller manipulation inte är orsaken till hämtning av bakgrundsljud. / High-throughput sequencing (HTS) technologies keep developing rapidly, increasing throughput and lowering probabilities of errors. MGI Tech Co., Ltd. (MGI) is a leading HTS brand that uses DNBSEQ technology and is present in the Centre for Translational Microbiome (CTMR). MGI’s sequencers have a high sensitivity and it is critical to follow the protocols when the samples are being handled to avoid introduction of contamination. This project will explore the previously generated data at CTMR to determine how and where in the sequencing process contamination has been introduced. Data is divided into two main categories: the primary data, or real data (RD), and secondary data, further divided into Never Used Barcodes (NUB) and Non-Sequenced (NS). The RD is true to the sample, while NUB and NS are considered background noise retrieved. The RD, NUB, and NS were subject to taxonomic analyses, at genus and species level, and barcode analyses using the RStudio interface to identify and contrast the most frequent in each category. Moreover, RD was also subject to decontam analysis on two databases, VaMyGyn and KOLBIBAKT. Decontam is used for the identification of contaminant species in a community. After the analysis, there was no strong evidence suggesting lab contamination or contaminated reagents. Some of the barcodes from NUB shared substrings with RD barcodes for which the amount of reads were correlated across samples. This may indicate that RD barcodes with sequencing errors are falsely identified as NUB, however, more analyses are needed to verify this. CTMR is now aware that contamination from the lab, reagents, or manipulation are not the causes for the background noise retrieval.

Typ 2-cytokiner, IL-4 och IL-13 är kända för att spela en viktig roll i airway hyperresponsiveness (AHR) eller luftvägshyperreaktivitet, där de glatta muskelcellerna (ASM) drar ihop sig för lätt och för mycket som svar på direkta eller indirekta stimuli. Detta gör AHR till en avgörande egenskap hos astmatiker. Det har gjorts studier som har visat involvering av typ 2-cytokiner i AHR, men deras specifika inflammatoriska mekanismer är ännu outforskade. Denna experimentella studie på glatta muskelceller från luftvägarna (ASM) syftade till att undersöka involveringen av typ 2-cytokin inducerad kontraktilitet genom att fokusera på receptoraktivering, receptoruttryck samt ge insikter om frisättning av proteiner relaterade till luftvägsfibros, så kallad remodelling. Dessutom studerar den också effekten av IL- 4/IL-13 receptor antagonisten Dupilumab (anti-IL4Ra) på cytokinbehandlade HASM. Efter stimulering av HASM med IL-13 under 24 timmar visade resultaten att IL-13 orsakar en ospecifik, icke-receptormedierad ökning av intracellulärt kalciumflöde som svar på kalciumjonoforen A23187. Detta skulle potentiellt kunna öka kontraktiliteten hos glatta muskelceller som svar på flera olika kontraktila stimuli. Denna forskning ger också preliminära resultat som tyder på att IL-13 och IL-4 också ökar kalciumflödet som svar på aktivering av receptorer för specifika kontraktila mediatorer (Histamin, Carbachol, Leukotriene D4 och Substance P), och att effekten förmedlas via IL-4/IL-13-receptorn vilket blockeras med dupilumab som verkade minska effekten. Närvaron av fler receptorer för kontraktila mediatorer kan också öka kontraktiliteten hos glatta muskelceller som svar på IL-4 och IL-13. Återigen sågs ökat uttryck av receptorer för kontraktila stimuli efter behandling med cytokinerna som inhiberades av dupilumab. Dessutom undersökte vi effekten av IL-13 och IL-4 på frisättning av prokollagen 1 (en prekursor för mogna kollagena former) från mänskliga glatta muskelceller i luftvägarna. Våra resultat visade inte några signifikanta effekter på frisättningen av just detta kollagenprotein. Sammantaget visar vi att typ 2 cytokiner kan på flera olika sätt öka kontraktiliteten av glatta muskelceller vilket ökar vår kunskap om mekanismerna som orsakar luftvägshyperreaktivitet hos astmatiker. / Type 2 cytokines, IL-4 and IL-13 are known to play an essential role in airway hyperresponsiveness (AHR) - in response to direct or indirect stimulus the smooth muscle cells (ASM) contract too easily and too heavily. This makes AHR a defining feature of asthma. There have been studies that have demonstrated involvement of type 2 cytokines in AHR. However, the specific mechanisms involved remain undefined. This experimental study in airway smooth muscle (ASM) was aimed to investigate the involvement of type 2 cytokine on AHR by focusing on the expression and activation of receptors for contractile mediators as well as provide insights on the release of proteins related to airway remodelling. Experiments were performed where human airway smooth muscle cells were treated with IL-4 and/or IL-13, with or without Dupilumab, an antagonist of the joint IL-4/IL-13 receptor (anti-IL4Ra). After stimulating HASMs with IL-13 for 24 hours, results showed that IL-13 caused a non-specific, non-receptor-mediated increase in intracellular calcium flux in response to the calcium ionophore A23187. This could potentially increase the contractility of smooth muscle cells in response to any contractile stimulus. This study also suggests that IL-13 and IL-4 increased calcium flux in response to activation of receptors for specific contractile mediators (Histamine, Carbachol, Leukotriene D4 and Substance P). The mechanism involved likely involves the common IL-4/IL-13 receptor as blocking this with dupilumab seemed to reduce the effect. The presence of more receptors for contractile mediators could also increase contractility of smooth muscle cells in response to IL-4 and IL-13. Preliminary results show that mRNA expression of receptors for Histamine (H1) and LTD4 (CYSLT1) were upregulated by type 2 cytokines and again, this upregulation appeared to be inhibited by dupilumab. Moreover, we examined the effect of IL-13 and IL-4 on release of procollagen 1 (a precursor of mature collagen forms) from human airway smooth muscle cells. Our results did not show any significant effects on the release of this particular collagen protein. Taken together these findings increase our understanding of the mechanisms whereby type 2 cytokines may increase the contractility of airway smooth muscle and provide a basis for follow-up investigations. Improved knowledge of the mechanisms underlying AHR could ultimately lead to improved treatment of asthma.