El objetivo de la primera parte de la tesis fue el de averiguar qué genes están involucrados en el proceso formación del fruto de tomate mediado por hormonas, para ello se realizó un análisis transcriptómico comparativo del desarrollo temprano tanto de frutos fertilizados, como de ovarios inducidos a fructificar mediante tratamiento hormonal. El análisis de los resultados reveló que los transcriptomas presentan las mayores diferencias en los primeros días tras la inducción, probablemente debido a la mayor rapidez de las auxinas en estimular la fructificación. Posteriormente, los transcriptomas se van acercando gradualmente entre ellos con independencia del estímulo hormonal inductor. El estudio reveló que existen elementos que configuran los programas de desarrollo del fruto tanto en una componente general independiente del agente inductor, como en la componente específica de la hormona. Además, en el caso específico de giberelinas, el estudio transcripcional de frutos silenciados en el gen SlDELLA mostró que este represor controla al menos una parte de la respuesta transcripcional a esta hormona en el fruto. Esta respuesta parece incluir una serie de mecanismos de defensa que se activan en los ovarios alrededor de antesis. Por otra parte, el estudio transcriptómico y metabolómico del pericarpo de los frutos inducidos por tratamiento hormonal en fase de maduración reveló que el efecto del tratamiento hormonal inductor afecta la expresión de genes relacionados con la síntesis de etileno y da lugar a frutos con alteraciones importantes en la expresión de genes del metabolismo de azúcares. Además, y con objeto de ampliar el rango de herramientas disponibles para ingeniería genética en frutos, se aprovechó el análisis de micromatrices para identificar genes de expresión específica en el ovario/fruto y se clonaron sus secuencias promotoras. / Hueso Estornell, L. (2010). Estudio transcriptómico y metabolómico del desarrollo partenocárpico del fruto de tomate y aplicaciones biotecnológicas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7528

El ácido abscísico (ABA) es una hormonal vegetal que tiene un papel crucial en las respuestas adaptativas de las plantas al estrés por sequía, salinidad o frío, además de regular importantes procesos del desarrollo de las plantas. Existen múltiples evidencias de que las proteínas fosfatasas 2C (PP2Cs) son claves para comprender los procesos en los que media esta hormona. Nuestro trabajo se centra en la PP2C HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA) cuyo secuencia genómica fue clonada por homología con ABI1 y ABI2. Realizamos un abordaje de genética reversa, novedoso en el campo de la señalización por ABA, con el aislamiento y caracterización de un alelo de pérdida de función hab1-1 y, con la generación y el estudio de líneas que sobre expresan HAB1. La hipersensibilidad del mutante hab1-1 y la insensibilidad de las plantas 35S:HAB1 proporcionan una nueva evidencia genética del papel de la PP2C HAB1 como regulador negativo de la señalización por ABA. Para profundizar más en los detalles moleculares de la función de HAB1 en la ruta de señalización por ABA, realizamos una búsqueda por doble híbrido de las posibles dianas de interacción de HAB1 en una librería de cDNA de Arabidopsis. HAB1 interacciona con la proteína SWI3B, un homólogo de la subunidad SWI3B del complejo remodelador de cromatina SWI/SNF de levaduras. Estudios previos a esta tesis no habían analizado mutantes de pérdida de función sencillos, dobles y triples en PP2Cs de plantas. El objetivo es determinar su contribución a la ruta de señalización por ABA y desentrañar posibles interacciones génicas y una posible redundancia funcional entre ellas. En esta tesis hemos generado mutantes hipersensibles a ABA tolerantes a la sequía por inactivación combinada de las PP2Cs HAB1 y ABI1. En experimentos de pérdida de agua por transpiración en condiciones de sequía hab1-1abi1-2 y hab1-1abi1-3 muestran una reducción notable en la pérdida de agua respecto a los mutantes parentales sencillos. Estos resultados muestran que la inactivación combinada de PP2Cs específicas involucradas en la señalización por ABA puede ser una herramienta biotecnológica en la mejora de cultivos tolerantes a la sequía. / Saez Somolinos, AE. (2010). Ruta de transducción de señal del ácido abscísico: Regulación por HAB1 y dianas de interacción. La inactivación combinada de PP2Cs como herramienta biotecnológica para incrementar la tolerancia a sequía en plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8658

Mucosal passive immunization is the transfer of active antibodies from one organism to the mucosal surfaces of another organism for preventing or treating infectious diseases. Mucosal passive immunization has a great potential for the prevention and treatment of enteric infections like Rotavirus, which causes more than 114 million episodes of diarrhoea annually with a death toll of more than 450.000 per year. However, the high cost of recombinant antibodies with the current manufacturing systems based on mammalian cells hampers the production of the high antibody quantities required for passive immunization strategies. Alternative expression platforms such as plants could provide higher scalability and reduced costs. Moreover, the use of edible plant organs, which are Generally¿Regarded¿As¿ Safe (GRAS), could reduce manufacturing costs even further by easing the requirements for antibody purification. We analyze here the feasibility of utilizing fruits as inexpensive biofactories of human antibodies that can be orally delivered as crude extracts or partially purified formulations in mucosal passive immunization strategies. In the first section of this thesis, the construction of tomato plants producing a model human Immunoglobulin A (IgA) against rotavirus in their fruits is described. As a result, an elite homozygous line was obtained whose fruits produced on average 41 ¿g of IgA per gram of fresh weigh, equivalent to 0.69 mg IgA per gram of dry tomato powder. Minimally processed products derived from IgA¿expressing tomatoes were shown to strongly inhibit virus infection in an in vitro neutralization assay. Moreover, in order to make IgA¿expressing tomatoes easily distinguishable from wild¿type tomatoes, they were sexually crossed with a transgenic tomato line expressing the genes encoding Antirrhinum majus Rosea1 and Delila transcription factors, which confer purple colour to the fruit. The resulting transgenically¿labelled purple tomatoes contained not only high levels of recombinant neutralizing human IgA but also increased amounts of anthocyanins. In the second section of the thesis the composition of IgA¿expressing tomatoes was analyzed in search of possible unintended effects that could compromise the GRAS status of the final product. To this end, transgenic IgA¿tomatoes were compared with wild type tomatoes and also commercial tomato varieties using proteomic and metabolomic approaches. 2D¿DIGE gels coupled with LC¿MSMS for protein identification showed that all the uptrend differential proteins detected corresponded only to immunoglobulin chains or antibody fragments. On the other hand, non¿targeted metabolite data obtained by UPLC¿MS / Juárez Ortega, P. (2014). Production of recombinant Immunoglobulin A in plants for passive immunotherapy [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/37015

RESUMEN La hipusinación es una modificación post-traduccional dependiente de espermidina que activa al factor de traducción eIF5A, y que es esencial en todos los eucariotas. En los últimos años se ha sugerido un importante papel para eIF5A en los procesos de senescencia y respuesta a estrés ambiental en plantas, en el establecimiento de la polaridad celular en levadura y su implicación en enfermedades tales como diabetes, VIH-1 o cáncer en humanos. Con el objetivo de caracterizar a nivel molecular la actividad biológica de eIF5A en plantas, hemos establecido una metodología basada en técnicas bioquímicas e inmunológicas para determinar el patrón de hipusinación de eIF5A en A. thaliana. La puesta a punto de esta metodología nos ha permitido demostrar que el tratamiento con ácido abscísico inhibe la activación por hipusinación de la isoforma eIF5A1. Además, para tratar de estudiar la función de eIF5A durante el desarrollo de A. thaliana, hemos realizado estudios funcionales basados en la caracterización de plantas transgénicas capaces de desactivar genéticamente la ruta dependiente de eIF5A mediante ARN de interferencia, condicionado a la aplicación de dexametasona. La desactivación condicional de la enzima de hipusinación desoxihipusina sintasa, produjo alteraciones durante el desarrollo y en respuesta a condiciones adversas de crecimiento, tales como floración temprana, inhibición del crecimiento de la raíz, alteraciones en los pelos radiculares, ramificación exacerbada del tallo, presencia de elementos traqueales completamente lignificados en hipocotilos, niveles reducidos de óxido nítrico e hipersensibilidad al ácido abscísico, sal y glucosa. Recientemente se ha demostrado que eIF5A es necesario para la traducción de proteínas con más de 3 prolinas sucesivas en su secuencia. El análisis de ontología realizado reveló un enriquecimiento de proteínas con poli-prolinas entre las implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. La alteración de la actividad de eIF5A provocó defectos en la estructuración de los filamentos de actina en A. thaliana, S. cerevisiae y H. sapiens. El estudio de mutantes termosensibles de levadura demostró el requerimiento de eIF5A durante el proceso de reproducción sexual a través de la traducción de la formina Bni1. Los experimentos de regulación traduccional en células HeLa demostraron que el silenciamiento vía ARN de interferencia de eIF5A1 provocaba un defecto en la tasa de traducción de la formina FMNL1 y la proteína ezrina. Estos resultados confirman que la actividad esencial de eIF5A en el ribosoma parece conservada en organismos eucariotas, y afecta fundamentalmente a proteínas con poli-prolinas implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. / Belda Palazón, B. (2014). Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48474

[ES] La ubiquitinación inducida por hormonas desempeña un papel crucial en la vida media de los reguladores negativos clave de la propia señalización hormonal. En la señalización por ABA, los reguladores negativos clave son las PP2Cs del clado A, como PP2CA o ABI1, y su degradación es un mecanismo complementario a la inhibición de su actividad mediada por PYR/PYL/RCAR. El ABA promueve la degradación de ABI1 a través de las E3 ligasas PUB12/13, y PP2CA a través de las E3 ligasas RGLG1/5. Sin embargo, se predice que otras E3 ligasas no identificadas también regularán la vida media de las PP2Cs del clado A. En pasos posteriores de la señalización por ABA, el ABA también induce la regulación positiva de los niveles de transcrito y proteína de las PP2Cs como un mecanismo de retroalimentación negativa. Por lo tanto, restablecer la señalización de ABA también requiere la degradación de las PP2Cs para evitar su acumulación excesiva inducida por el propio ABA. En este trabajo identificamos las proteínas BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadores del sustrato de las E3 ligasas multiméricas CULLIN3-RING E3 (CRL3), como proteínas que interactúan con las PP2Cs. BPM3 y BPM5 interactúan en el núcleo con PP2CA, así como con ABI1, ABI2 y HAB1. Además, BPM3 y BPM5 aceleran la degradación de las PP2Cs de una manera dependiente del ABA y su sobreexpresión conduce a una mayor sensibilidad al ABA. Además, las plantas mutantes bpm3 bpm5 mostraron una mayor acumulación de PP2CA, ABI1 y HAB1, lo que conduce a una sensibilidad global disminuida al ABA. Finalmente, utilizando ensayos bioquímicos y genéticos, demostramos que las BPM aumentaban la ubiquitinación de PP2CA. Dado que la formación de los complejos ternarios receptor-ABA-fosfatasa se ve notablemente afectada por la abundancia de sus componentes proteicos y la concentración de ABA, revelamos que las BPM y las E3 ligasas multiméricas CRL3 son moduladores importantes de los niveles del correceptor PP2C para regular la señalización temprana de ABA, así como durante los consiguientes pasos de restablecimiento. Al contrario que con PUB12/13, no se sabe cómo el ABA aumenta la degradación de PP2CA a través de RGLG1/5. En el caso de RGLG1, esta proteína se encuentra predominantemente en la membrana plasmática, mientras que PP2CA se encuentra predominantemente en el núcleo. Nosotros demostramos que el ABA modifica la localización subcelular de RGLG1, promoviendo la interacción nuclear con PP2CA. En primer lugar, encontramos que RGLG1 está miristoilado in vivo, lo que facilita su unión a la membrana plasmática, sin embargo, el ABA inhibe esta miristoilación. El ABA también regula negativamente a N-myristoyltransferase 1, la enzima activa y central en la miristoilación de proteínas, esto puede ayudar a promover la translocación de RGLG1 al núcleo. Allí, RGLG1 puede interactuar con ciertos receptores monoméricos del ABA, como PYL8. El reclutamiento nuclear de la E3 ligasa también fue promovido por el aumento de los niveles de proteína PP2CA y por la formación de complejos RGLG1-PYL8-PP2CA en presencia de ABA. Además, nosotros encontramos que RGLG1Gly2Ala, mutada en el sitio de miristoilación N-terminal, muestra localización nuclear constitutiva y provoca una respuesta más sensible al ABA y al estrés salino y osmótico. En resumen, proporcionamos evidencia de que una ligasa E3 puede reubicarse dinámicamente en respuesta al ABA, el estrés salino y osmótico, y el aumento de los niveles de su sustrato, lo que revela un mecanismo para explicar cómo el ABA mejora la interacción RGLG1-PP2CA y, por lo tanto, la degradación de PP2CA. / [CA] L' ubiquitinació induïda per hormones té un paper crucial en la vida mitjana dels reguladors negatius clau de la pròpia senyalització hormonal. En la senyalització per ABA, els reguladors negatius clau són les PP2Cs del clado A, com PP2CA o ABI1, i la seva degradació és un mecanisme complementari a la inhibició de la seva activitat mediada per PYR/PYL/RCAR. El ABA promou la degradació de ABI1 a través de les E3 lligases PUB12/13, i PP2CA per mitja de les E3 lligases RGLG1/5. No obstant això, es prediu que altres E3 lligases no identificades també regularan la vida mitjana de les PP2Cs del clado A. En passos posteriors de la senyalització per ABA, l'ABA també indueix la regulació positiva de nivells de transcrit i proteïna de les PP2Cs com un mecanisme de retroalimentació negativa. Per tant, restablir la senyalització d'ABA també requereix la degradació de les PP2Cs per evitar la seva acumulació excessiva induïda pel propi ABA. En aquest treball identifiquem les proteïnes BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadors del substrat de les E3 lligases multimèriques CULLIN3-RING E3 (CRL3), com proteïnes que interactuen amb les PP2Cs. BPM3 i BPM5 interactuen en el nucli amb PP2CA, així com amb ABI1, ABI2 i HAB1. A més, BPM3 i BPM5 acceleren la degradació de les PP2Cs d'una manera dependent del ABA i la seva sobreexpressió porta a una major sensibilitat al ABA. A més, les plantes mutants bpm3 bpm5 van mostrar una major acumulació de PP2CA, ABI1 i HAB1, el que porta a una sensibilitat global disminuïda a ABA. Finalment, utilitzant assajos bioquímics i genètics, aconseguint que les BPM augmentaven l' ubiquitinació de PP2CA. Atès que la formació dels complexos ternaris receptor-ABA-fosfatasa es veu notablement afectada per l'abundància dels seus components proteics i la concentració d'ABA, revelem que les BPM i les E3 lligases multimèriques CRL3 són moduladors importants dels nivells del coreceptor PP2C per regular la senyalització primerenca de ABA, així com durant els consegüents passos de restabliment. Al contrari que amb PUB12/13, no se sap com el ABA augmenta la degradació de PP2CA a través d'RGLG1/5. En el cas de RGLG1, aquesta proteïna es troba predominantment en la membrana plasmàtica, mentre que PP2CA es troba predominantment en el nucli. Nosaltres vam demostrar que l'ABA modifica la localització subcelular de RGLG1, promovent la interacció nuclear amb PP2CA. En primer lloc, trobem que RGLG1 està miristoilado in vivo, el que facilita la seva unió a la membrana plasmàtica, però, el ABA inhibeix aquesta miristoilación. El ABA també regula negativament N-myristoyltransferase 1, l' enzim actiu i central en la miristoilación de proteïnes, això pot ajudar a promoure la translocació de RGLG1 al nucli. Allà, RGLG1 pot interactuar amb certs receptors monomèrics de l'ABA, com PYL8. El reclutament nuclear de l'E3 lligasa també va ser promogut per l'augment dels nivells de proteïna PP2CA i per la formació de complexos RGLG1-PYL8-PP2CA en presència d'ABA. A més, nosaltres trobem que RGLG1Gly2Ala, mutada en el lloc de miristoilació N-terminal, mostra localització nuclear constitutiva i provoca una resposta més sensible al ABA i l'estrès salí i osmòtic. En resum, proporcionem evidència que una ligasa E3 pot reubicar dinàmicament en resposta al ABA, l'estrès salí i osmòtic, i l'augment dels nivells de la seva substrat, el que revela un mecanisme per explicar com el ABA millora la interacció RGLG1-PP2CA i, per tant, la degradació de PP2CA. / [EN] Hormone-induced ubiquitination plays a crucial role to determine the half-life of key negative regulators of hormone signaling. In case of ABA signaling, the key negative regulators are the clade-A PP2Cs, such as PP2CA or ABI1, and their degradation is a complementary mechanism to PYR/PYL/RCAR-mediated inhibition of their activity. ABA promotes the degradation of ABI1 through the PUB12/13 E3 ligases, and PP2CA through the RGLG1/5 E3 ligases. However, other unidentified E3 ligases are predicted to regulate clade A PP2Cs half-life as well. At later steps of ABA signaling, ABA also induces upregulation of PP2C transcripts and protein levels as a negative feedback mechanism. Therefore, resetting of ABA signaling also requires PP2C degradation to avoid excessive ABA-induced accumulation of PP2Cs. In this work we identified BTB/POZ AND MATH DOMAIN proteins (BPMs), substrate adaptors of the multimeric CULLIN3-RING E3 ligases (CRL3s), as PP2C-interacting proteins. BPM3 and BPM5 interact in the nucleus with PP2CA as well as with ABI1, ABI2 and HAB1. Additionally, BPM3 and BPM5 accelerate the turnover of PP2Cs in an ABA-dependent manner and their overexpression leads to enhanced ABA sensitivity. Moreover, bpm3 bpm5 mutant plants showed increased accumulation of PP2CA, ABI1 and HAB1, which leads to global diminished ABA sensitivity. Finally, using biochemical and genetic assays we demonstrated that BPMs enhance the ubiquitination of PP2CA. Given the formation of receptor-ABA-phosphatase ternary complexes is markedly affected by the abundance of protein components and ABA concentration, we reveal that BPMs and multimeric CRL3 E3 ligases are important modulators of PP2C co-receptor levels to regulate early ABA signaling as well as the subsequent resetting steps. In contrast to PUB12/13, it was not known how ABA enhances the degradation of PP2CA by RGLG1/5. RGLG1 is predominantly found in the plasma membrane whereas PP2CA is predominant in the nucleus. We demonstrate that ABA modifies the subcellular localization of RGLG1, promoting nuclear interaction with PP2CA. Firstly, we found that RGLG1 is myristoylated in vivo, which facilitates its attachment to the plasma membrane, nevertheless, ABA inhibits its myristoylation. ABA also downregulates N-myristoyltransferase 1, the central active enzyme of protein myristoylation, which may help to promote RGLG1 translocation to the nucleus. There, RGLG1 can interact with certain monomeric ABA receptors, as PYL8. Enhanced nuclear recruitment of the E3 ligase was also promoted by increasing PP2CA protein levels and the formation of RGLG1-PYL8-PP2CA complexes in the presence of ABA. Additionally, we found that RGLG1Gly2Ala protein, mutated at the N-terminal myristoylation site, shows constitutive nuclear localization and causes an enhanced response to ABA and salt and osmotic stresses. In summary, we provided evidence that an E3 ligase can dynamically relocalize in response to ABA, salt and osmotic stress, and increased levels of its target, which reveals a mechanism to explain how ABA enhances RGLG1-PP2CA interaction and hence PP2CA degradation. / Julián Valenzuela, J. (2020). Regulation of ABA signaling through degradation of clade A PP2Cs by the RGLG1 and CRL3 BPM E3 ligases [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137777

Tesis por compendio / [ES] La sequía y la salinidad son los factores ambientales que más afectan a las plantas, aunque en general, las plantas mediterráneas están bien adaptadas a las condiciones adversas. Las previsiones estiman que debido al calentamiento global las condiciones ambientales se volverán más estresantes, especialmente en las zonas semi-áridas y áridas como muchas áreas de la Península Ibérica. Estas condiciones pueden afectar a la presencia de muchas especies silvestres, en especial, de las que ya de por si están amenazadas, son raras o endémicas. Tanto la sequía como el estrés salino provocan la activación de una serie de mecanismos de defensa o respuesta de las plantas, que incluyen entre otros, el control del transporte iónico, la acumulación de solutos compatibles u osmolitos, y la activación de sistemas antioxidantes. Para contribuir a la conservación y/o reintroducción de las especies de interés en hábitats prioritarios se ha realizado un estudio multidisciplinar abarcando los parámetros que pueden afectar sus poblaciones, como el clima, el suelo, y la vegetación acompañante, junto a estudios comparativos sobre las respuestas a la sequía y a la salinidad. Para entender mejor los mecanismos de tolerancia se han incluido en el estudio además de los taxones de interés conservacionista, especies relacionadas genéticamente con diferentes niveles de tolerancia. El estudio presenta dos objetivos principales: i) establecer la tolerancia relativa al estrés hídrico y salino de las especies en base a su distribución en la naturaleza y en los análisis realizados en campo y, en función de la inhibición relativa de su crecimiento bajo condiciones provocadas de estrés; y, ii) evaluar los cambios bioquímicos inducidos por el estrés analizando diferentes mecanismos de respuesta (inhibición de la fotosíntesis, transporte iónico, acumulación de osmolitos, mecanismos antioxidantes). / [CA] La sequera i la salinitat són els factors ambientals que més afecten les plantes, encara que en general, les plantes mediterrànies estan ben adaptades a les condicions adverses. Les previsions estimen que a causa del calfament global les condicions ambientals es tornaran més estressants, especialment en les zones semi-àrides i àrides com moltes àrees de la Península Ibèrica. Aquestes condicions poden afectar la presència de moltes espècies silvestres, especialment, de les que ja de per si estan amenaçades, són rares o endèmiques. Tant la sequera com l'estrès salí provoquen l'activació d'una sèrie de mecanismes de defensa o resposta de les plantes, que inclouen entre altres, el control del transport iònic, l'acumulació de soluts compatibles u osmolits, i l'activació de sistemes antioxidants. Per a contribuir a la conservació i/o reintroducció de les espècies d'interès en hàbitats prioritaris s'ha realitzat un estudi multidisciplinari abastant els paràmetres que poden afectar les seues poblacions, com el clima, el sòl, i la vegetació acompanyant, al costat d'estudis comparatius sobre les respostes a la sequera i a la salinitat. Per a entendre millor els mecanismes de tolerància s'han inclòs en l'estudi a més dels tàxons d'interès conservacionista, espècies relacionades genèticament amb diferents nivells de tolerància. L'estudi presenta dos objectius principals: i) establir la tolerància relativa a l'estrès hídric i salí de les espècies sobre la base de la seua distribució en la naturalesa i en les anàlisis realitzades en camp i, en funció de la inhibició relativa del seu creixement sota condicions provocades d'estrès; i, ii) avaluar els canvis bioquímics induïts per l'estrès analitzant diferents mecanismes de resposta (inhibició de la fotosíntesi, transport iònic, acumulació de osmolits, mecanismes antioxidants). / [EN] Drought and salinity are the environmental factors that most affect plants, although in general Mediterranean plants are well adapted to adverse conditions. Predictions estimate that, due to global warming, environmental conditions will become more stressful, especially in semi-arid and arid areas, such as many areas of the Iberian Peninsula. These conditions may affect the presence of many wild species, especially those that are already threatened, rare or endemic. Both drought and salt stress cause the activation of a series of defence or response mechanisms in plants, which include, among others, the control of ionic transport, the accumulation of compatible solutes or osmolytes, and the activation of antioxidant systems. To contribute to the conservation and/or reintroduction of species of interest in priority habitats, a multidisciplinary study has been carried out covering parameters that may affect their populations, such as climate, soil and accompanying vegetation, together with comparative studies on responses to drought and salinity. To better understand tolerance mechanisms, genetically related species with different levels of tolerance have been included in the study, in addition to taxa of conservation interest. The study has two main objectives: i) to establish the relative tolerance to water and salt stress of the species according to their distribution in nature and based on field analyses and, according to the relative inhibition of their growth under stress-induced conditions; and, ii) to evaluate stress-induced biochemical changes by analysing different mechanisms (inhibition of photosynthesis, ionic transport, osmolyte accumulation, antioxidant mechanisms). / This research was partially funded by Project AICO/2017/039 from the Generalitat Valenciana. / González Orenga, S. (2021). Mecanismos de tolerancia a estrés salino e hídrico en plantas endémicas, raras o amenazadas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/168443 / Compendio

[ES] La presente tesis doctoral titulada "Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications" se centra en el diseño, síntesis, caracterización y evaluación de distintos nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos. En concreto, se utilizan como soporte nanopartículas mesoporosas de sílice y nanopartículas de oro para su aplicación biomédica, en concreto en el campo del cáncer de mama. En el primer capítulo se introduce el marco general en el que se engloban los estudios realizados. Se presentan los conceptos relacionados con nanotecnología y nanomedicina, así como la interacción de las nanopartículas a nivel biológico con el organismo y las células. Finalmente, se introducen conceptos básicos del cáncer de mama y la aplicación de nanomateriales como terapia. A continuación, en el segundo capítulo, se exponen los objetivos de la presente tesis doctoral que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. En el tercer capítulo se describe el primer nanomaterial para la liberación controlada de dos inhibidores (navitoclax y S63845) de las proteínas anti- apoptóticas de la familia Bcl-2. Este sistema se ha diseñado con el objetivo de superar la resistencia a navitoclax en un modelo celular de cáncer de mama triple negativo. En concreto, se han preparado nanopartículas mesoporosas de sílice cargadas con navitoclax y S63845, y funcionalizadas con un aptámero dirigido a la proteína de superficie MUC1, que actúa como puerta molecular. En este trabajo hemos demostrado que las nanopartículas diseñadas son internalizadas preferentemente por células tumorales de cáncer de mama. También hemos demostrado la capacidad de las nanopartículas de revertir la resistencia a navitoclax en un modelo celular de cáncer de mama triple negativo. Además, ponemos de manifiesto la disminución del principal efecto adverso (trombocitopenia) asociado a la administración del navitoclax en su formulación libre, gracias a la encapsulación en las nanopartículas. En el capítulo cuatro se presenta un sistema sensible a pH para la liberación controlada de un cargo fluorescente y la maquinaria de edición génica basada en el sistema CRISPR/Cas9, dirigido a la edición del gen codificante de la proteína fluorescente verde (GFP, del inglés gren fluorescent protein). El nanodispositivo está constituido por nanopartículas mesoporosas de sílice cargadas con rodamina B, funcionalizadas con polietilenimina y revestidas con el plásmido codificante del sistema CRISPR/Cas9. En este trabajo se ha demostrado el escape lisosomal de las nanopartículas, mediado por el efecto esponja de protones de la PEI. Asimismo, mostramos un nanodispositivo pionero en su campo, basado en nanopartículas mesoporosas de sílice, capaz de realizar la doble función de llevar a cabo la edición del gen codificante de GFP y la liberación exitosa del cargo fluorescente. En el quinto, y último, capítulo experimental se propone una nueva aproximación para realizar una terapia enzimática prodroga empleando nanopartículas de oro como transportadores enzimáticos. En este caso, se aborda la funcionalización de nanopartículas de oro con la enzima peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horseradish peroxidase), capaz de transformar la prodroga inocua ácido indol-3-acético en especies radicales que resultan tóxicas para las células tumorales. En este capítulo se ha demostrado el efecto terapéutico del nanodispositivo en combinación con la prodroga en modelos celulares de cáncer de mama de los subtipos luminal A y triple negativo. Además, se ha confirmado la eficacia terapéutica del sistema en esferoides tumorales formados por células de cáncer de mama triple negativo. Por último, se presentan en el capítulo seis las conclusiones extraídas del desarrollo de esta tesis doctoral. Los resultados obtenidos en este trabajo contribuirán al desarrollo de nuevos nanomateriales inteligentes con aplicación en diversas áreas de la nanomedicina. / [CA] La present tesi doctoral titulada "Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications" se centra en el disseny, síntesi, caracterització i avaluació de diferents nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics. En concret, s'utilitzen com a suport nanopartícules mesoporoses de sílice i nanopartícules d'or per a la seua aplicació biomèdica, en concret en el camp del càncer de mama. En el primer capítol s'introdueix el marc general en el qual s'engloben els estudis realitzats. Es presenten els conceptes relacionats amb la nanotecnologia i nanomedicina, així com la interacció de les nanopartícules a nivell biològic amb l'organisme i les cèl·lules. Finalment, s'introdueixen conceptes bàsics del càncer de mama i l'aplicació de nanomaterials com a teràpia. A continuació, en el segon capítol, s'exposen els objectius de la present tesi doctoral que són abordats en els següents capítols experimentals. En el tercer capítol es descriu el primer nanomaterial utilitzat per a l'alliberament controlat de dos inhibidors (navitoclax i S63845) de les proteïnes anti-apoptòtiques de la família Bcl-2. Aquest sistema s'ha dissenyat amb l'objectiu de superar la resistència a navitoclax en un model cel·lular de càncer de mama triple negatiu. En concret, s'han preparat nanopartícules mesoporoses de sílice carregades amb navitoclax i S63845, i funcionalitzades amb un aptàmer dirigit a la proteïna de superfície MUC1, que actua com a porta molecular. En aquest treball hem demostrat que les nanopartícules dissenyades són internalitzades preferentment per cèl·lules tumorals de càncer de mama. També hem demostrat la capacitat de les nanopartícules de revertir la resistència a navitoclax en un model cel·lular de càncer de mama triple negatiu. A més, posem de manifest la disminució del principal efecte advers (trombocitopènia) associat a l'administració del navitoclax en la seua formulació lliure, gràcies a l'encapsulació en les nanopartícules. En el capítol quatre es presenta un sistema sensible a pH per a l'alliberament controlat d'una càrrega fluorescent i la maquinària d'edició gènica basada en el sistema CRISPR/Cas9, dirigit a l'edició gènica del gen codificant de la proteïna fluorescent verda (GFP, del anglés gren fluorescent protein). El nanodispositiu està constituït per nanopartícules mesoporoses de sílice carregades amb rodamina B, funcionalitzades amb polietilenimina i revestides amb el plàsmid codificant del sistema CRISPR/Cas9. En aquest treball s'ha demostrat la fuga lisosomal de les nanopartícules, mediat per l'efecte esponja de protons de la PEI. Així mateix, vam mostrar un nanodispositiu pioner en el seu camp, basat en nanopartícules mesoporoses de sílice, capaç de realitzar la doble funció de dur a terme l'edició del gen codificant de la GFP i l'alliberament exitós de la càrrega fluorescent. En el cinqué i últim capítol experimental es proposa una nova aproximació per a realitzar una teràpia enzimàtica prodroga emprant nanopartícules d'or com a transportadors enzimàtics. En aquest cas, s'aborda la funcionalització de nanopartícules d'or amb l'enzim peroxidasa de rave (HRP, del anglés horseradish peroxidase), capaç de transformar la prodroga innòcua àcid indol-3-acètic en espècies radicals que resulten tòxiques per a les cèl·lules tumorals. En aquest capítol s'ha demostrat l'efecte terapèutic del nanodispositiu en combinació amb la prodroga en models cel·lulars de càncer de mama dels subtipus luminal A i triple negatiu. A més, s'ha confirmat l'eficàcia terapèutica del sistema en esferoides tumorals formats per cèl·lules de càncer de mama triple negatiu. Finalment, en el capítol sis es presenten les conclusions extretes del desenvolupament d'aquesta tesi doctoral. Els resultats obtinguts en aquesta tesi contriburan al desenvolupament de nous nanomaterials intel·ligents amb aplicació en diverses àrees de la nanomedicina. / [EN] This Ph.D. thesis entitled "Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications" is focused on the design, synthesis, characterisation, and evaluation of several hybrid organic-inorganic nanomaterials. We have developed mesoporous silica nanoparticles and gold nanoparticles for biomedical applications, specifically in the breast cancer area. The first chapter includes an overview of the concepts related to the research performed. Introductory notions about nanotechnology and biomedicine are presented, as well as the basis of the interactions of nanoparticles with biological systems. Finally, breast cancer disease and the application of nanomaterials as therapy are described. Next, in the second chapter, the objectives addressed in the following experimental chapters are displayed. In the third chapter, we present the first nanomaterial for the controlled delivery of two inhibitors (navitoclax and S63845) of the Bcl-2 anti-apoptotic proteins. This nanosystem has been designed to overcome navitoclax resistance in a triple-negative breast cancer cellular model. We have prepared mesoporous silica nanoparticles loaded with navitoclax and S63845 and functionalised with an aptamer targeting MUC1 surface protein as a molecular gate. In this work, the specific targeting of the nanodevice to breast cancer cells has been demonstrated. The ability to overcome navitoclax resistance has been shown in navitoclax-resistant triple-negative breast cancer cells. Furthermore, navitoclax encapsulation in the nanoparticles has proved to reduce the main adverse effect (thrombocytopenia) associated with free formulated drug administration. In the fourth chapter, we describe a pH-responsive nanosystem for the controlled co-delivery of a fluorescent cargo and the genome-editing machinery based on CRISPR/Cas9, which targets the green fluorescent protein (GFP) coding gene. The nanodevice consists of mesoporous silica nanoparticles loaded with rhodamine B, functionalised with polyethyleneimine, and capped with the CRISPR/Cas9 plasmid. In the present work, we have shown the lysosomal scape capacity of the nanodevice enhanced by the proton sponge effect of PEI. We have also demonstrated a pioneering mesoporous silica-based nanodevice efficient in the simultaneous genome editing of the GFP gene (as a model gene) and the successful release of a fluorescent cargo (as a model drug). In the fifth and last experimental chapter, we propose a new approximation to develop enzyme prodrug therapy using gold nanoparticles as enzyme carriers. In this case, we use gold nanoparticles functionalised with the enzyme horseradish peroxidase (HRP), which transforms the non-toxic prodrug indol-3-acetic acid into radical species toxic to tumour cells. In this chapter, the therapeutic effect of the nanodevice in combination with the prodrug has been demonstrated in two breast cancer cell subtypes (luminal A and triple-negative breast cancers). Also, the therapeutic effect of the material has been corroborated in multicellular tumour spheroid-like cultures formed by triple-negative breast cancer cells. Finally, in the sixth chapter, the conclusions derived from the presented studies and the general conclusions of this Ph.D. thesis are released. The obtained results will promote the development of new smart nanomaterials with diverse biomedical applications. / Gema Vivo-Llorca thanks the Generalitat Valenciana for her fellowship ACIF/2017/072. Vicente Candela-Noguera thanks the Spanish Government for his fellowship FPU15/02753. We would like to thank Servier for the workart used in the figures of this manuscript (Servier Medical Art https://smart.servier.com/). We thank the Spanish Government (project RTI2018-100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE); SAF2017-84689-R-B (MCUI/AEI/FEDER, UE)) and the Generalitat Valenciana (project PROMETEO/2018/024 and PROMETEO/2019/065) for support. / Vivo Llorca, G. (2021). Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172713

[ES] El síndrome de Dravet es una epilepsia severa rara causada por mutaciones en el gen SCN1A, el cual codifica para la proteína Nav1.1, subunidad α de los canales de sodio regulados por voltaje. En esta tesis se ha generado mediante recombinación homóloga, una nueva mutación en el gen para que hemos denominado paraKO, el cual cumple la misma función en Drosophila melanogaster. Estas moscas han mostrado un fenotipo epiléptico inducido por altas temperaturas, y muerte súbita en el caso de las crisis de larga duración. También se han observado alteraciones musculares en ensayos de geotaxis negativa, vuelo y locomoción. Del mismo modo, han presentado problemas cognitivos como la ansiedad y dificultades en el aprendizaje. El uso de imanes como terapia contra el fenotipo epiléptico ha tenido buenos resultados retrasando la aparición de las crisis y disminuyendo su duración y la cantidad de moscas que las padecen. El perfil metabolómico de las cabezas de estas moscas mostró un incremento en la concentración de aminoácidos, succinato y lactato, alteraciones que se pueden relacionar con la epilepsia y la disfunción mitocondrial. El neurotransmisor GABA, principal implicado en el síndrome de Dravet, mostró niveles superiores en el modelo generado. El análisis electrofisiológico de las corrientes de sodio de las motoneuronas aCC en estadío de larva señaló aumentos en las corrientes persistentes de sodio y su ratio con las transitorias, lo cual podría justificar las crisis epilépticas. Además, la excitabilidad y el tamaño de estas células fueron menores. Todos estos cambios presentes en los mutantes KO generados hacen de estas moscas un buen modelo para estudio de la epilepsia en general, y del síndrome de Dravet en particular. Este modelo ofrece nuevas herramientas para entender la patofisiología de la enfermedad y la búsqueda de biomarcadores y tratamientos. Finalmente la búsqueda de modificadores genéticos a través de ensayos de supervivencia, tiempo de recuperación a crisis y vuelo empleando el modelo parabss1 obtuvo buenos resultados con los genes nAchRα4 y KCNQ. El gen toy por el contrario resultó ser intensificador. La variabilidad en los resultados obtenidos en este apartado cuestiona la manera de llevar a cabo este tipo de estudios en modelos animales y pacientes del síndrome de Dravet. / [CA] La síndrome de Dravet és una epilèpsia severa rara causada por mutacions en el gen SCN1A, el qual codifica para la proteïna Nav1.1, subunitat α dels canals de sodi regulats por voltatge. En aquesta tesis s'ha generat, mitjançant recombinació homòloga, una nova mutació en el gen para, anomenada paraKO, el qual té la mateixa funció en Drosophila melanogaster. Aquestes mosques han mostrat un fenotip epilèptic induït por altes temperatures, y mort súbdita en el cas de les crisis de llarga duració. També s'han observat alteracions musculars en assajos de geotaxis negativa, vol y locomoció. De la mateixa manera, han presentat problemes cognitius como l'ansietat i dificultats en l'aprenentatge. L'ús d'imants com teràpia contra el fenotip epilèptic ha tingut bons resultats endarrerint l'aparició de les crisis i disminuint la seua durada i la quantitat de mosques que les pateixen. El perfil metabolòmic dels caps d'aquestes mosques mostrà increments en la concentració d'aminoàcids, succinat i lactat, alteracions les quals es poden relacionar amb l'epilèpsia y la disfunció mitocondrial. El neurotransmissor GABA, principal implicat en la síndrome de Dravet, mostrà nivells superiores en el model generat. L'anàlisi electrofisiològic de las corrents de sodi de les motoneurones aCC en estadi de larva assenyalà augments en les corrents persistents de sodi y el seu ràtio amb las transitòries, lo qual podria justificar las crisis epilèptiques. A més a més, l'excitabilitat y el tamany d'aquestes cèl·lules va ser menor. Todos aquests canvis presents en els mutants KO generats fan d'aquestes mosques un model per a l'estudi de l'epilèpsia en general, i de la síndrome de Dravet en particular. Aquest model ofereix noves ferramentes per a entendre la patofisiología de la malaltia i la recerca de biomarcadors y tractaments. Finalment la recerca de modificadors genètics a través d'assajos de supervivència, temps de recuperació a crisis y vol mitjançant el model parabss1 va obtindre bons resultats amb els gens nAchRα4 y KCNQ. El gen toy pel contrari resultà ser intensificador. La variabilitat en els resultats obtinguts en aquest apartat qüestiona la manera de fer aquest tipus d'estudis en models animals i pacients de la síndrome de Dravet. / [EN] Dravet syndrome is a severe rare epileptic disease caused by mutations in the SCN1A gene coding for the Nav1.1 protein, a voltage-gated sodium channel alpha subunit. In this thesis we have made a new mutation in a gene called paraKO through homologous recombination, the single Drosophila melanogaster gene encoding this type of protein. These flies showed a heat-induced seizing phenotype, and sudden death in long term seizures. In addition to seizures, neuromuscular alterations were observed in climbing, flight and locomotion tests. Moreover, they also manifested some cognitive alterations such as anxiety and difficulties in learning. Using magnets as a therapy for epileptic phenotype, seizures start was delayed, and its duration and the quantity of flies affected was lower. Metabolomic profile of these flies' brains showed an increase in the amount of aminoacids, succinate and lactate, alterations that could be related with epilepsy and mitochondrial dysfunction. GABA, the main neurotransmitter involved in Dravet syndrome, was higher in the paraKO model. Electrophysiological sodium current analysis from aCC motoneurons in larvae stage revealed an increase in persistent currents and their ratio with transients, which is a symptom for epileptic seizures. Cell size and excitability were lower in these cells too. All these changes in the paralytic knock-out flies indicate that this is a good model for epilepsy and specifically for Dravet syndrome. This model could be a new tool to understand the pathophysiology of the disease and to find biomarkers, genetic modifiers and new treatments. Finally, a search for genetic modifiers through survival, recuperation time and flight using parabss1 flies obtained good results with nAchR¿4 y KCNQ. Otherwise, toy gene was an enhancer. However, variability observed in these type of assays dispute how modifiers search is made with model animals and Dravet syndrome patients. / Tapia González, A. (2022). Generación de nuevos modelos y búsqueda de modificadores para el Síndrome de Dravet en Drosophila Melanogaster [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/186189

Tesis por compendio / [EN] ocp3 mutant plants exhibit an accelerated and intensified callose deposition in response to infection by Botrytis cinerea or Plectosphaerella cucumerina. After phenotypic analysis of a series of double mutants ocp3 we observed that both, the increase callose deposition and resistance, require PMR4 callose synthase and hormone abscisic acid (ABA). In wild plants after infection with any of these necrotrophic fungi, ABA synthesis increases, this increase is even higher in ocp3. The greater resistance observed in ocp3 plants also requires the correct perception of jasmonic acid (JA) through COI1 receptor. However, JA is not required for the synthesis and basal callose deposition. In this way it could propose a model in which OCP3 exerts a specific control for callose deposition regulated by JA and requires, indispensably, ABA. The OCP3 protein, sequence homology, is classified as a nuclear transcription factor family member of Homeobox. However, we found that OCP3 imported and accumulates in the chloroplasts, and colocalized with pentatricopeptide repeat proteins involves in RNA editing. Specifically, OCP3 participates regulating ndhB transcript editing. ndhB encodes one subunit of the multiprotein chloroplast complex NADPH dehydrogenase (NDH). The absence of OCP3 results in a decay of ndhB editing; a fact which entails a reduction of the activity of NDH complex and therefore leads to a defect in the cyclic electron flow (CEF) around the photosystem I (PSI). We were also able to confirm that mutants having altered activity of NDH complex, as crr2 and crr21 turn have an increased resistance to infection by P. cucumerina, and show an increased callose deposition. Moreover, we note that the editing of the mRNA for other subunits encoded in the chloroplast NDH complex are also subject to regulation which is significantly altered in the presence of a pathogenic stimuli. At the same time, the stability of NDH complex also compromised after a pathogenic insult. All these results indicate that the NDH complex is subject to a subtle regulation in accordance with the changing environment. The ABA is a key player in activating plant defense against P. cucumerina infection. Moreover, hemibiotrofos pathogens such as Pseudomonas syringae DC3000 also cause increased synthesis of ABA. However, this increase leads to the suppression of defensive responses, which can be attributed a dual role. The regulation of dual role of this hormone, activator and repressor some other defenses, indicates the existence of a post-regulating hormone synthesis. In this Doctoral Thesis, it has been identified as PYR1 family member receptor ABA PYR/PYL/RCAR perceives this hormone to trigger a response to infection by a pathogen. PYR1 reduces the salicylic acid (SA) dependent response against the biotrophic pathogens attack. Thus exerts a positive control JA-dependent responses required to activate the defenses against necrotrophic pathogens. The loss of the perception of ABA through PYR1 activates the expression of SA-responsive genes, alteration of chromatin remodeling and increase in the activation of MAP kinases after the attack biotrophic pathogens. Thus, the ABA through PYR1 receptor and through an epigenetic control, have a regulatory role in plant immunity depending on the lifestyle of pathogens infecting the plant. / [ES] Las plantas mutantes ocp3, presentan una acelerada e intensificada deposición de calosa en respuesta a la infección producida por Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Tras el análisis fenotípico de una serie de dobles mutantes en el fondo ocp3 observamos que tanto el incremento en la deposición de calosa como de la resistencia requieren de la calosa sintasa PMR4, y de la hormona ácido abscísico (ABA). En las plantas silvestres, tras la infección por alguno de estos hongos necrotrofos, se incrementa la síntesis de ABA, incremento éste que aún es mayor en las plantas ocp3. La mayor resistencia que se observa en las plantas ocp3 también requiere de la correcta percepción del ácido jasmónico (JA) a través del receptor COI1. Sin embargo, el JA no es requerido para la síntesis y deposición de calosa basal. De esta forma se podría proponer un modelo en el que OCP3 ejerce un control específico para la deposición de calosa regulada por JA y que requiere, indispensablemente, de ABA. La proteína OCP3, por homología de secuencia, se clasifica como un factor de transcripción nuclear miembro de la familia de los Homeobox. Sin embargo, encontramos que OCP3 se importa y acumula en los cloroplastos, y se colocaliza con proteínas que contienen motivos de repetición pentatricopeptidos e implicadas en la edición de RNA. Concretamente, OCP3 participa regulando el mecanismo de edición del transcrito ndhB que codifica una de las subunidades del complejo multiprotéico NADPH deshidrogenasa (NDH) del cloroplasto. La ausencia de OCP3 se traduce en una deficiente edición de ndhB; hecho éste que conlleva un deterioro en la funcionalidad del complejo NDH y que por tanto acarrea un defecto en el flujo cíclico de electrones (CEF) alrededor del fotosistema I (PSI). También pudimos confirmar que mutantes que presentan alteraciones en la actividad del complejo NDH, como crr2 y crr21, a su vez presentan un incremento en la resistencia frente a la infección por P. cucumerina, además de mostrar una mayor deposición de calosa. Por otra parte, observamos que la edición de los mRNA para otras subunidades del complejo NDH codificadas en el cloroplasto están, también, sujetas a una regulación que se ve notablemente alterada en presencia de un estimulo patogénico. Al mismo tiempo, la estabilidad del complejo NDH también se ve comprometida tras un insulto patogénico. Todos estos resultados indicarían que el complejo NDH está sujeto a una sutil regulación en concordancia con las condiciones cambiantes del entorno. El ABA es determinante en la activación de mecanismos de defensa frente a P. cucumerina. Por otra parte, patógenos hemibiotrofos como por ejemplo Pseudomonas syringae DC3000 también provocan incremento en la síntesis de ABA. Sin embargo, este incremento acarrea la supresión de las respuestas defensivas, por lo que se le puede atribuir un papel dual. La regulación del papel dual de esta hormona, activador de unas defensas y represor de otras, indica la existencia de una regulación posterior a la síntesis de la hormona. En la presente Tesis Doctoral, se ha identificado a PYR1 como el miembro de la familia de los receptores de ABA PYR/PYL/RCAR que percibe esta hormona para desencadenar una respuesta a la infección por un patógeno. PYR1 amortigua la respuesta dependiente de ácido salicílico (SA) frente al ataque de un patógeno biotrofo. De esta forma ejerce un control positivo sobre las respuestas dependientes de JA requeridas para activar las defensas frente a patógenos necrotrofos. La pérdida de la percepción del ABA por PYR1 provoca una activación de los genes de respuesta a SA, una alteración de la remodelación de la cromatina y un incremento en la activación de las MAP quinasas tras el ataque de patógenos biotrofos. De esta forma, el ABA a través del receptor PYR1 y a través de un control epigenético, tendría un papel regulador de la inmunidad vegetal en función del / [CA] Les plantes mutants ocp3, presenten una accelerada e intensificada deposició de calosa en resposta a la la infecció produïda per Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Darrere l'anàlisi d'una sèrie de dobles mutants amb ocp3, observem que tant l'increment en la deposició de calosa com de la resistència requereixen de la calosa sintasa PMR4, i de l'hormona àcid abscisic (ABA). Les plantes silvestres infectades amb algú d'aquests fongs necrotrofs, incrementen la síntesi de ABA, increment aquest que encara és major en les plantes ocp3. La major resitència que s'observa en les plantes ocp3 també requereix de la correcta percepció de l'àcid jasmonic (JA) a través del receptor COI1. No obstant això, el JA no és requerit per a la síntesi i deposició de calosa basal. D'aquesta forma, es podria proposar un model en el qual OCP3 exerceix un control especific per a la deposició de calosa regulada pel JA i que requerix, indispensablement, de l'ABA. La proteïna OCP3, per homologia de seqüència, es classifica com un factor de transcripció nuclear membre de la familia dels Homeobox. No obstant això, trobem que OCP3 s'importa i acumula en el cloroplasts, i es colocaliza amb proteïnes que contenen motius de repetició pentatricopeptids i implicades en l'edició de RNA. Concretament, OCP3 participa regulant el mecanisme d'edició del transcrit ndhB que codifica una de les subunitats del complex multiproteic NADPH deshidrogenasa (NDH) del cloroplast. L'absència d'OCP3 es tradueix en una deficient edició de ndhB; fet aquest que comporta una pèrdua de la funcionalitat del complex NDH i que per tant implica un defecte en el flux cíclic d'electrons (CEF) al voltant del fotosistema I (PSI). També vam poder confirmar que mutants que presenten alteracions en la activitat del complex NDH, com crr2 i crr21, al seu torn presenten un increment en la resistència enfront de la infecció per P. cucumerina, a més de mostrar una major deposició de calosa. D'altra banda, observem que l'edició dels mRNA per a altres subunitats del complex NDH codificades en el cloroplast estan, també, subjectes a una regulació que es ceu notablement alterada en preséncia d'un estimulo patogenic. Tots aquests resultats indicarien que el complex NDH està subjecte a una sutil regulació en concordaça amb les condicions canviants de l'entorn. El ABA es determinatn en l'activació de mecanismes de defensa enfront de P. cucumerina. D'altra banda, patògens hemibiotrofs com per exemple Pseudomonas syringae DC3000 també provoquen increment en la síntesi de ABA. No obstant això, aquest increment implica la supressió de les respostes defensives, per la qual cosa se li pot atribuir un paper dual. La regulació del paper dual d'aquesta hormona, activador d'unes defenses i repressor d'unes altres, indica l'existència d'una regulació posterior a la síntesi de l'hormona. En la present Tesis Doctoral, s'ha indentificat a PYR1 com el membre de la familia dels receptors de ABA PYR/PYL/RCAR que percep aquesta hormona per desencadenar una resposta a la infecció per un patogen. PYR1 esmorteeix la resposta dependent d'acid salicílic (SA) enfornt de l'atac d'un patogen biotorof. D'aquesta forma exerceix un control positiu sobre les respostes dependents de JA requerides per activar les defenses enfront de patògens necrotofs. La pèrdua de la percepció del ABA per PYR1 provoca una activació de les MAP quinases després de l'atac de patògens biotrofs. Així donçs, el ABA a través del receptor PYR1 i a través d'uun control epigenètic, tindria un paper regulador de la immunitat vegetal en funció de l'estil de vida del patogen que infecti a la planta. / García-Andrade Serrano, J. (2016). Función de OCP3 en la resistencia de Arabidopsis frente a hongos necrotrofos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63147 / Compendio

[EN] ABSTRACT This PhD thesis is based on a collaboration between Professor Dr. Ramon Serrano's laboratory and the fertilizer company Fertinagro Nutrientes and it's motivated by the increasing need in agriculture to increase crop productivity while minimizing its impact on the environment. Fertinagro Nutrientes supplied the following six bioestimulants for analyzing its effects on tolerance to abiotic stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae, providing no (or very limited in some cases) information about its composition: Seaweed extract, Vinacillas, Phosphite, Humic Acid, Amino22 and Potassium fulvate. The broad conservation of metabolic pathways and the molecular mechanisms involved in abiotic stress response between yeast and plants allows the use of S. cerevisiae as a suitable model system for this study. All bioestimulants showed, to a greater or lesser extent, positive effects on yeast tolerance against at least one of the abiotic stresses in study. Seaweed extract improves growth under salt stress. Phosphite and Vinacillas protect against salt stress and heat shock. Humic acid increases tolerance to oxidative stress and heat shock. The two most versatile bioestimulants, Amino22 and Potassium fulvate, were further investigated in order to identify their mechanisms of action. Amino22, which is the most effective biostimulant, considerably improves growth in the absence of stress and under osmotic stress and, to a lesser extent, it also enhances growth under salt stress conditions. Amino22 also provides tolerance against oxidative stress and heat shock. By comparison with an acid casein peptone it was confirmed that the active substance in Amino22 are amino acids. Analysis of global gene expression using DNA microarrays showed that Amino22 treatment represses both Gcn4 regulated genes (which are involved in amino acid and vitamin biosynthesis) and Aft1 regulated genes (which are involved in iron homeostasis). The positive effect of amino acids on growth and stress tolerance is related, at least in part, to the activation of TORC1 pathway and it also requires a partial inhibition of GAAC pathway. By contrast, this positive effect is independent of the Aft1 regulon repression. Following the observation that amino acid treatment represses iron regulon expression, we studied more in depth the relationship between amino acid and iron homeostasis in S. cerevisiae. We suggest a regulation model according to which the activation of GAAC pathway induces nuclear localization of Aft1 and subsequent expression of its target genes, whereas inhibition of this pathway by amino acids may have the opposite effect. Aft1 activity may be controlled through eIF2a phosphorylation and, hypothetically, it would involve regulation Fe/S biosynthesis. Potassium fulvate improves tolerance to osmotic, oxidative and heat stress. Microarray and qRT-PCR expression analysis indicate that Potassium fulvate represses Aft1 regulon. This repression can be explained by an increase in intracellular iron content, whose absorption depends on an oxidoreductase encoded by the FET3 gene. Tolerance to abiotic stress by Potassium fulvate also depends on FET3, therefore it is concluded that the mechanism of action of this biostimulant is based on an increased iron availability, which is accumulated in yeast cells without causing oxidative damage. / [ES] RESUMEN Este trabajo se basa en una colaboración entre el laboratorio del profesor doctor Ramón Serrano y la empresa de fertilizantes Fertinagro Nutrientes y está motivado por la necesidad creciente de incrementar la productividad de los cultivos agrícolas al mismo tiempo que se minimiza el impacto que la agricultura tiene sobre el medio ambiente. Fertinagro Nutrientes facilitó los siguientes seis bioestimulantes para el análisis de sus efectos sobre la tolerancia a estrés abiótico en la levadura Saccharomyces cerevisiae, aportando escasa (o nula en algunos casos) información acerca de su composición: Extracto de algas, Vinacillas, Fosfito, Ácido húmico, Amino22 y Fulvato potásico. La amplia conservación de rutas las metabólicas y de los mecanismos moleculares de defensa frente a estrés abiótico entre levadura y plantas justifican el uso de S. cerevisiae como sistema modelo para este estudio. Todos los bioestimulantes tienen, en mayor o menor medida, efectos positivos sobre la tolerancia de la levadura frente a al menos uno de los tipos de estrés abiótico estudiados. El Extracto de algas mejora el crecimiento en condiciones de estrés salino. El Vinacillas y el Fosfito protegen frente a estrés salino y choque térmico. El Ácido húmico incrementa la tolerancia a estrés oxidativo y choque térmico. Los dos bioestimulantes más polivalentes, el Amino22 y el Fulvato potásico, fueron estudiados en mayor profundidad con el objetivo de identificar sus mecanismos de acción. El Amino22, que es el bioestimulante más efectivo de los estudiados, mejora considerablemente el crecimiento en ausencia de estrés y bajo estrés osmótico y, en menor medida, también resulta beneficioso para el crecimiento en condiciones de estrés salino. Asimismo, el Amino22 proporciona tolerancia frente a estrés oxidativo y choque térmico. Mediante la comparación con una peptona de caseína ácida se comprobó que el principio activo responsable del efecto del Amino22 son los aminoácidos que contiene. El análisis del efecto del Amino22 sobre la expresión global de genes empleando micromatrices de DNA muestra que el bioestimulante reprime tanto genes regulados por Gcn4 e involucrados en la biosíntesis de aminoácidos y vitaminas como genes regulados por Aft1, implicados en la homeostasis de hierro. El efecto positivo de los aminoácidos sobre el crecimiento y tolerancia a estrés está relacionado, en parte al menos, con la activación de la ruta TORC1 y, además, requiere la inhibición parcial de la ruta GAAC. En cambio, dicho efecto positivo es independiente de la represión del regulón de Aft1. A raíz de la observación de que los aminoácidos reprimen el regulón de hierro, se profundizó en el estudio de la relación entre la homeostasis de aminoácidos y la de hierro en S. cerevisiae llegando a un modelo de regulación según el cual la activación de la ruta GAAC induciría la localización nuclear de Aft1 y la consiguiente expresión de sus genes diana, mientras que la inhibición de dicha ruta por la presencia de aminoácidos tendría el efecto contrario. La actividad de Aft1 sería controlada a través del estado de fosforilación de eIF2a e, hipotéticamente, implicaría la regulación de la formación de complejos Fe/S. El Fulvato potásico mejora la tolerancia a estrés osmótico, oxidativo y térmico. Los análisis de expresión mediante micromatrices y qRT-PCR indican que el tratamiento con Fulvato potásico reprime el regulón de Aft1. Esta represión se puede explicar por un aumento en el contenido intracelular de hierro, cuya entrada depende de la oxidorreductasa codificada por el gen FET3. La tolerancia a estrés abiótico que proporciona el Fulvato potásico también depende de FET3, por lo que se concluye que el mecanismo de acción de este bioestimulante se basa en un incremento de la disponibilidad de hierro, el cual se acumula en las células sin producir daño oxidativo extra. / [CA] RESUM Aquest treball es basa en una col·laboració entre el laboratori del professor doctor Ramón Serrano i l'empresa de fertilitzants Fertinagro Nutrientes i està motivat per la necessitat creixent d'incrementar la productivitat dels cultius agrícoles al mateix temps que es minimitza l'impacte de l'agricultura sobre el medi ambient. Fertinagro Nutrientes va facilitar els següents sis bioestimulants per a l'anàlisi dels seus efectes sobre la tolerància a estrés abiòtic en el llevat Saccharomyces cerevisiae, aportant escassa (o nul·la en alguns casos) informació sobre la seua composició: Extracte d'algues, Vinacillas, Fosfit, Àcid húmic, Amino22 i Fulvat potàssic. L'àmplia conservació de les rutes metabòliques i dels mecanismes moleculars de defensa front a l'estrés abiòtic entre llevat i plantes justifiquen l'ús de S. cerevisiae com a sistema model per a este estudi. Tots els bioestimulants tenen, en major o menor mesura, efectes positius sobre la tolerància del llevat front a almenys un dels tipus d'estrés abiòtic estudiats. L'Extracte d'algues millora el creixement en condicions d'estrés salí. El Vinacillas i el Fosfit protegeixen front a l'estrés salí i xoc tèrmic. L'Àcid húmic incrementa la tolerància a estrés oxidatiu i xoc tèrmic. Els dos bioestimulants més polivalents, l'Amino22 i el Fulvat potàssic, van ser estudiats en major profunditat amb l'objectiu d'identificar els seus mecanismes d'acció. L'Amino22, que és el bioestimulant més efectiu dels estudiats, millora considerablement el creixement en absència d'estrés i baix estrés osmòtic i, en menor mesura, també resulta beneficiós per al creixement en condicions d'estrés salí. Així mateix, l'Amino22 proporciona tolerància front a l'estrés oxidatiu i xoc tèrmic. Mitjançant la comparació amb una peptona de caseïna àcida es va comprovar que el principi actiu responsable de l'efecte de l'Amino22 són els aminoàcids que conté. L'anàlisi de l'efecte de l'Amino22 sobre l'expressió global de gens emprant micromatrius de DNA mostra que el bioestimulant reprimeix tant gens regulats per Gcn4 i involucrats en la biosíntesi d'aminoàcids i vitamines com gens regulats per Aft1, implicats en l'homeòstasi del ferro. L'efecte positiu dels aminoàcids sobre el creixement i tolerància a estrés està relacionat, en part almenys, amb l'activació de la ruta TORC1 i, a més, requereix la inhibició parcial de la ruta GAAC. En canvi, aquest efecte positiu és independent de la repressió del reguló de Aft1. Arran de l'observació que els aminoàcids reprimeixen el reguló de ferro, es va aprofundir en l'estudi de la relació entre l'homeòstasi d'aminoàcids i la de ferro en S. cerevisiae arribant a un model de regulació segons el qual l'activació de la ruta GAAC induiria la localització nuclear de Aft1 i la consegüent expressió dels seus gens diana, mentre que la inhibició d'aquesta ruta per la presència d'aminoàcids tindria l'efecte contrari. L'activitat de Aft1 seria controlada a través de l'estat de fosforilació d' eIF2a i, hipotèticament, implicaria la regulació de la formació de complexos Fe/S. El Fulvat potàssic millora la tolerància a estrés osmòtic, oxidatiu i tèrmic. Les anàlisis d'expressió mitjançant micromatrius i qRT-PCR indiquen que el tractament amb Fulvat potàssic reprimeix el reguló de Aft1. Aquesta repressió es pot explicar per un augment en el contingut intracel·lular de ferro, l'entrada del qual depén de la oxidorreductasa codificada pel gen FET3. La tolerància a estrés abiòtic que proporciona el Fulvat potàssic també depén de FET3, per la qual cosa es conclou que el mecanisme d'acció d'aquest bioestimulant es basa en un increment de la disponibilitat de ferro, el qual s'acumula en les cèl·lules sense produir dany oxidatiu extra. / Caballero Molada, M. (2016). Estudio de efectos protectores y mecanismos de acción frente a estrés abiótico de bioestimulantes de fertilizantes en Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/67390