[EN] Cold is one of the most important abiotic stresses, severely affects the growth and development of plants, and limits their geographical distribution. Given that cold, salinity and drought stresses overlap some of their molecular mechanisms of response, a cDNA library of sugar beet (Beta vulgaris), generated from leaves of plants subjected to saline stress, was used to try to identify genes for tolerance to cold stress by its overexpression in yeast. In this way it was identified, among others, the CRIO4 gene whose characterization has been the work of this thesis. CRIO4 encodes a SEC14-like protein, and it is ortholog to PATL family of Arabidopsis thaliana and it shares a conserved domain with SEC14 and SFH family of yeast. CRIO4 overexpression confers to the yeast cells the ability to grow at low temperatures and tolerance to tunicamycin (an inhibitor of protein glycosylation). The in silico analysis of the CRIO4 sequence confirms several motifs and domains conserved in the protein that seem to direct its function toward the vesicular trafficking, and it reveals multiple potential phosphorylation sites in CRIO4 suggesting a possible role in signaling. Sec14 domain is a phospholipid binding and transfer domain, and the obtained results indicate that CRIO4 binds to phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamine. CRIO4 does not complement the function of Sec14p of yeast, and this could be due to the lack of phosphatidylcholine affinity by CRIO4. Tryptophan transport is the greatest limiting factor for growth at low temperatures in yeast. The results of the yeast coexpression assay of CRIO4 and TAT2 (a high-affinity tryptophan permease) displayed in this thesis, seem to indicate stimulation of Tat2p transport to the plasma membrane by CRIO4, which could develop into an enhanced tryptophan absorption, thereby explaining the greater cold tolerance conferred by overexpression of CRIO4 in yeast. The subcellular localization study has shown that CRIO4 is associated with the plasma membrane and intracellular membranes, being part of vesicles, which seems to confirm the role of CRIO4 in intracellular trafficking, function that it would share with its orthologous genes. The expression pattern of CRIO4 in sugar beet has shown that CRIO4 is expressed in all analyzed tissues, focusing its highest expression in leaf and root. It has also been shown that CRIO4 expression increases after shorter exposure to cold stress and heat stress. Phenotypic studies of several mutant lines of PATLs genes from Arabidopsis thaliana have been carried out and high variability in results was obtained, this could be due to functional redundancy among the members of this multigenic family. Phenotypic studies of transgenic lines of Arabidopsis thaliana overexpressing the CRIO4 gene have also been performed. These lines show an improvement in their growth and development at low temperatures, thereby increasing their tolerance to cold stress. Furthermore, expression of CRIO4, in A. thaliana transgenic lines, increases considerably after cold stress and heat shock. Moreover, accumulation points of CRIO4 were observed along the whole cell, after heat shock. Intracellular recycling of PIN2, a gravitropic response indicator, is affected by decreasing temperature. The results obtained in this thesis suggest that overexpression of CRIO4 reactivates intracellular transport of PIN2 under cold stress, which would imply that its phenotype is related to auxin traffic. / [ES] El frío es uno de los estreses abióticos más importantes, afecta severamente al crecimiento y desarrollo de las plantas, y limita su distribución geográfica. Puesto que el estrés por frío, por salinidad y por sequía solapan algunos de sus mecanismos moleculares de respuesta, se usó una biblioteca de ADNc de remolacha (Beta vulgaris) generada con hojas de plantas sometidas a estrés salino, para tratar de identificar genes de tolerancia a estrés por frío mediante su sobreexpresión en levadura. De este modo se identificó, entre otros, el gen CRIO4 cuya caracterización ha sido el trabajo de esta tesis. CRIO4 codifica una proteína tipo Sec14, y es ortólogo a la familia PATL de Arabidopsis thaliana y tiene un dominio conservado con SEC14 y la familia SFH de levadura. La sobreexpresión de CRIO4 confiere a las células de levadura la capacidad de crecer a temperaturas bajas y tolerancia a tunicamicina (inhibidor de la glicosilación de proteínas). El análisis in silico de la secuencia de CRIO4 confirma diversos motivos y dominios conservados en la proteína que parecen dirigir su función hacia el tráfico vesicular, y revela múltiples potenciales sitios de fosforilación en CRIO4 sugiriendo una posible función en señalización. El dominio Sec14 es un dominio de unión y transferencia de fosfolípidos, y los resultados obtenidos indican que CRIO4 establece unión con fosfatidiolinositol y fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la función de Sec14p de levadura, y esto podría ser debido a la falta de afinidad de CRIO4 por fosfatidilcolina. En levadura, el transporte de triptófano es el mayor factor limitante para el crecimiento a temperaturas bajas. Los resultados del ensayo de coexpresión de CRIO4 con TAT2 (una permeasa de alta afinidad para triptófano) en levadura mostrados en esta tesis, parecen indicar una estimulación del transporte de Tat2p hacia la membrana plasmática por parte de CRIO4, que podría devenir en una absorción de triptófano mejorada, explicando así la mayor tolerancia a frío conferida por la sobreexpresión de CRIO4 en levadura. El estudio de localización subcelular ha mostrado que CRIO4 está asociada a la membrana plasmática y en membranas intracelulares, formando parte de vesículas, lo que parece confirmar el papel de CRIO4 en el tráfico intracelular, función que compartiría con sus ortólogos. El patrón de expresión de CRIO4 en remolacha ha mostrado que CRIO4 se expresa en todos los tejidos analizados, concentrándose su mayor expresión en hoja y raíz. También se ha mostrado que la expresión de CRIO4 aumenta tras tiempos cortos de exposición a estrés por frío y estrés por calor. Se han realizado estudios fenotípicos de diferentes líneas mutantes en genes PATLs de Arabidopsis thaliana, obteniéndose una gran variabilidad en los resultados que podría ser debida a la redundancia funcional entre los miembros de esta familia multigénica. También se han realizado estudios fenotípicos de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen CRIO4. Estas líneas muestran una mejoría en su crecimiento y desarrollo a temperaturas bajas, aumentando por tanto su tolerancia al estrés por frío. Además, la expresión de CRIO4, en las líneas transgénicas de A. thaliana, aumenta considerablemente tras el estrés por frío y tras un choque térmico, observándose en este último caso, acúmulos de CRIO4 a lo largo de toda la célula. El reciclaje intracelular de PIN2, indicador de la respuesta gravitrópica, se ve afectado por la disminución de la temperatura. Los resultados obtenidos en esta tesis parecen indicar que la sobreexpresión de CRIO4 reactiva el transporte intracelular de PIN2 bajo estrés por frío, lo que implicaría que su fenotipo está relacionado con el tráfico de auxinas. / [CA] El fred és un dels estressos abiòtics més importants, afecta severament al creixement i desenvolupament de les plantes, i limita la seua distribució geogràfica. Ja que l'estrès per fred, per salinitat i per sequera solapen alguns dels seus mecanismes moleculars de resposta, es va usar una biblioteca d'ADNc de remolatxa (Beta vulgaris) generada amb fulles de plantes sotmeses a estrès salí, per tractar d'identificar gens de tolerància a estrès per fred mitjançant la seua sobreexpressió en llevat. D'aquesta manera es va identificar, entre d'altres, el gen CRIO4 la caracterització del qual ha estat el treball d'aquesta tesi. CRIO4 codifica una proteïna tipus Sec14, i és ortòleg a la família PATL d'Arabidopsis thaliana i té un domini conservat amb SEC14 i la família SFH de llevat. La sobreexpressió de CRIO4 confereix a les cèl·lules de llevat la capacitat de créixer a temperatures baixes i tolerància a tunicamicina (inhibidor de la glicosilació de proteïnes). L'anàlisi in silico de la seqüència de CRIO4 confirma diversos motius i dominis conservats en la proteïna que semblen dirigir la seua funció cap al tràfic vesicular, i revelen múltiples potencials llocs de fosforilació en CRIO4 suggerint una possible funció en senyalització. El domini Sec14 és un domini d'unió i transferència de fosfolípids i els resultats obtinguts indiquen que CRIO4 estableix unió amb fosfatidiolinositol i fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la funció de Sec14p de llevat, i això podria ser a causa de la falta d'afinitat de CRIO4 per fosfatidilcolina. En llevat, el transport de triptòfan és el major factor limitant per al creixement a temperatures baixes. Els resultats de l'assaig de coexpressió de CRIO4 amb TAT2 (una permeasa d'alta afinitat per triptòfan) en llevat mostrats en aquesta tesi, semblen indicar una estimulació del transport de Tat2p cap a la membrana plasmàtica per part de CRIO4, que podria esdevindre en una absorció de triptòfan millorada, explicant així la major tolerància a fred conferida per la sobreexpressió de CRIO4 en llevat. L'estudi de localització subcel·lular ha mostrat que CRIO4 està associada a la membrana plasmàtica i en membranes intracel·lulars, formant part de vesícules, la qual cosa sembla confirmar el paper de CRIO4 en el tràfic intracel·lular, funció que compartiria amb els seus homòlegs. El patró d'expressió de CRIO4 en remolatxa ha mostrat que CRIO4 s'expressa en tots els teixits analitzats, concentrant-se la seua major expressió en fulla i arrel. També s'ha mostrat que l'expressió de CRIO4 augmenta després de temps curts d'exposició a estrès per fred i estrès per calor. S'han realitzat estudis fenotípics de diferents línies mutants en gens PATLs d'Arabidopsis thaliana, obtenint-se una gran variabilitat en els resultats que podria ser deguda a la redundància funcional entre els membres d'aquesta família multigènica. També s'han realitzat estudis fenotípics de línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana que sobreexpressen el gen CRIO4. Aquestes línies mostren una millora en el seu creixement i desenvolupament a temperatures baixes, augmentant per tant la seua tolerància a l'estrès per fred. A més, l'expressió de CRIO4, en les línies transgèniques d'A. thaliana, augmenta considerablement després de l'estrès per fred i després d'un xoc tèrmic, observant-se en aquest últim cas, cúmuls de CRIO4 al llarg de tota la cèl·lula. El reciclatge intracel·lular de PIN2, indicador de la resposta gravitrópica, es veu afectat per la disminució de la temperatura. Els resultats obtinguts en aquesta tesi semblen indicar que la sobreexpressió de CRIO4 reactiva el transport intracel·lular de PIN2 sota estrès per fred, la qual cosa implicaria que el seu fenotip està relacionat amb el tràfic d'auxines. / Izquierdo García, AC. (2016). Caracterización del gen CRIO4 y su implicación en tolerancia a estrés por frío [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62826

Citrus tristeza virus (CTV) is a viral species of the Closterovirus genus, having a ¿20 kb single-stranded and positive sense genomic RNA (gRNA) organized into 12 open reading frames (ORFs) potentially coding 17 protein products, some of which of unknown function. CTV proteins p25 and p27 belong to a gene block involved in virion assembly. It has been demonstrated that p25, along with p20 and p23, are RNA silencing suppressors in some species of Nicotiana, being the latter a pathogenesis determinant. CTV host range is very restricted and in nature viral infections are limited to the phloem cells of some citrus species. Consequently, working with this virus-host pathosystem requires an appropriate experimental host and an efficient CTV genetic system. In our laboratory we have developed a new CTV genetic system based on the agroinfection of Nicotiana benthamiana plants, a non-natural host, with infectious clones of the T36 isolate. That infection induces characteristic symptoms, some of which correlate with those caused by the virus in citrus plants. CTV-N. benthamiana interactions are very variable and genotype-dependent, so only some isolates can replicate in this species and T36 is unique causing systemic infections. In this work, we studied the function of CTV p20 and p25 proteins from three different isolates differing in its pathogenic characteristics. Transient expression of p20 and p25 fused to fluorescent proteins showed an identical subcellular localization for both N. benthamiana and citrus. The p20 protein of T36, T318A and T385 isolates localized in cytoplasm and nucleus forming amorphous aggregates associated with perinuclear regions, together with nuclear punctuate inclusions. On the other hand, subcellular localization of p25 differed depending on the CTV isolate. While p25 of T36 and T385 localized in the nucleus, that of T318A did it in cytoplasm. A detailed analysis of the protein regions involved in this subcellular localization unveiled a leucine-rich nuclear export signal (NES) in the N-terminus (Nt) of the protein. The pathogenic ability of CTV p20 and p25 in N. benthamiana was tested through a PVX heterologous viral infection, showing that p25 was not a pathogenicity determinant in this species, albeit p20 it was. Besides, the interactome of p25-T36 was more complex and diverse than that of p25-T318A, involving a greater number of metabolic processes, redox activities, homeostasis and cellular transport, biosynthesis and protein degradation, plastid and nucleic acid protein binding, biotic and oxidative stress, jasmonic-mediated defense, methylation, ROS signalling and HSP proteins. On the other hand, most p25-T318A potential interactors were related to transport/localization and stress response, like apoptosis, pathogenesis-related and HSP proteins, Ca+2-binding proteins and redoxins. Moreover, the experimental evolution of CTV in N. bethamiana was achieved through serial passages. The evolution process showed adaptative traits as the increase of graft survival, infectivity rates and viral titers, and a decreased time for the onset of symptom development in this species. Adaptive characteristics of evolved viral populations in N. bethamiana, were also correlated to their genetic variability and population structure. Two different evolved lineages showed convergent evolution processes reflected also at the molecular level. CTV viruses evolved in N. benthamiana were found to be less infectious at initial stages of infection when they were back-inoculated to citrus plants, and showed a decreased viral titer during the first year post-inoculation. This re-adaptation of N. benthamiana viral populations back to citrus was correlated, at a molecular level, with the progressive loss of the mutations appeared during its evolution process in N. benthamiana. / El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) es un closterovirus con un RNA genómico (gRNA) de ssRNA (+) y ¿20 Kb organizado en 12 pautas de lectura abierta (ORFs) que codifican al menos 17 proteínas, algunas de función desconocida. Las proteínas p25 y p27 forman parte de un grupo de genes implicados en el ensamblaje del virión, y se ha demostrado que p25 junto con p20 y p23 son supresores de silenciamiento génico en algunas especies de Nicotiana, y la última es también un determinante de patogénesis. CTV tiene una gama de huéspedes muy restringida y de forma natural sólo infecta el floema de algunas especies de cítricos. Por ello, para trabajar con este patosistema virus-huésped, se requiere un huésped experimental adecuado y un sistema genético eficiente de CTV. Durante los últimos años hemos desarrollado un sistema genético de CTV basado en la agroinfección sistémica de Nicotiana benthamiana, una especie no-natural de este virus, con clones infecciosos del genotipo T36. Dicha infección va acompañada de síntomas característicos, algunos de los cuales son similares a los que el virus induce en cítricos. La interacción CTV-N. benthamiana es muy variable y genotipo-dependiente, sólo algunos aislados se replican en esta especie y únicamente T36 la infecta sistémicamente. En este trabajo, abordamos la función de las proteínas p20 y p25 de tres aislados de CTV que difieren en sus características patogénicas. La expresión transitoria de las p20 y p25 fusionadas a proteínas fluorescentes reveló su idéntica localización subcelular en N. benthamiana y cítricos. La proteína p20 se localizó en el citosol y el núcleo celular en agregados amorfos asociados a regiones perinucleares e inclusiones nucleares puntuales. En cambio, la expresión de la p25 de T36, T318A y T385 de CTV reveló una localización diferencial. Mientras la de T36 y T385 fue nuclear, la de T318A fue citosólica. Un análisis detallado de las regiones implicadas en dicha localización, reveló la existencia de una señal de exportación nuclear NES rica en leucinas en la región Nt de la proteína. Un análisis de la capacidad patogénica de p20 y p25 en N. benthamiana en un contexto de infección viral heterólogo a través de PVX, mostró que p25 no es un determinante de patogenicidad en esta especie, pero p20 sí. Por otra parte, el interactoma de la p25-T36 resultó mucho más complejo y diverso que el de la p25-T318A, interviniendo potencialmente en mayor número de procesos metabólicos de fotosíntesis, actividad redox, homeóstasis y transporte celular, biosíntesis y degradación de proteínas, unión a proteínas de los plastidios y ácidos nucleicos o de respuesta a estrés (biótico y oxidativo) o defensa mediada por la ruta del jasmónico, del ciclo de metilación, señalización por ROS y proteínas HSP. Las interacciones mayoritarias de la p25-T318A se relacionaron con transporte/localización y respuesta a estrés, principalmente con interactores implicados en procesos de apoptosis, patogénenis y proteínas HSP, de unión a calcio o redoxinas. También hemos conseguido la evolución experimental de CTV por pases seriados en N. benthamiana. Dicha evolución conlleva un conjunto de características adaptativas significativas como: el aumento del prendimiento de injertos, de la tasa neta de infectividad, del título viral y del adelanto de los síntomas causados en esta especie herbácea con el aumento de los pases. Las características adaptativas también se reflejaron a nivel molecular en la variabilidad genética y estructura de las poblaciones de los virus evolucionados en dos linajes independientes. Virus evolucionados en N. benthamiana resultaron menos infecciosos inicialmente por inoculación mecánica de regreso a cítricos, y se acumularon menos que el virus parental durante el primer año. Dicha re-adaptación de los virus evolucionados se reflejó a nivel molecular en la pérdida progresiva de las m / El virus de la tristesa dels cítrics (CTV) és un closterovirus amb un RNA genòmic de ssRNA(+) i 20 Kb organitzat en 12 pautes de lectura oberta (ORFs) que codifiquen, al menys, 17 proteïnes, algunes de les quals de funció desconeguda. Les proteïnes p25 i p27 formen part d'un grup de gens implicat en l'assemblatge del virió, i s'ha demostrat que p25, junt a p20 i p23, són supressors de silenciament gènic en algunes espècies de Nicotiana, i la última també és un determinant de patogènesi. La gama d'hostes de CTV és molt restringida i de forma natural sols infecta el floema d'algunes espècies de cítrics. Per això, per a treballar amb aquest patosistema virus-hoste, es requereix un hoste experimental adequat i un sistema genètic eficient de CTV. Durant els últims anys hem desenvolupat un sistema genètic de CTV basat en l'agroinfecció sistèmica de Nicotiana benthamiana, una espècie no-natural d'aquest virus, amb clons infecciosos del genotip T36. Aquesta infecció va acompanyada de símptomes característics, alguns dels quals són similars als que el virus indueix en cítrics. La interacció CTV-N. benthamiana és molt variable i genotip depenent, ja que sols alguns aïllats es repliquen en aquesta espècie i únicament T36 la infecta sistèmicament. En aquest treball hem abordat la funció de les proteïnes p20 i p25 de tres aïllats de CTV que difereixen en les seues característiques patogèniques. L'expressió transitòria de les p20 i p25 fusionades a proteïnes fluorescents va revelar la seua idèntica localització subcel·lular en N. benthamiana i cítrics. La proteïna p20 dels aïllats T36, T318A i T385 es va localitzar al citosol i al nucli cel·lular formant agregats amorfs associats a regions perinuclears, i inclusions nuclears puntuals. En canvi, l'expressió de la p25 de T36, T318A i T385 de CTV va revelar una localització diferencial. Mentre la de T36 i T385 fou nuclear, la de T318A fou citosòlica. Una anàlisi detallada de les regions implicades en eixa localització va revelar l'existència d'una senyal d'exportació nuclear (NES) rica en leucines a la regió Nt de la proteïna. L'anàlisi de la capacitat patogènica de p20 i p25 en N. benthamiana en un context d'infecció viral heteròloga a través de PVX, va mostrar que p25 no és un determinant de patogenicitat en aquesta espècie, però p20 sí. D'altra banda, l'interactoma de p25-T36 va resultar molt més complex i divers que el de p25-T318A, intervenint potencialment en un major nombre de processos metabòlics de fotosíntesi, activitat redox, homeòstasi i transport cel·lular, biosíntesi i degradació de proteïnes, unió a proteïnes dels plastidis i àcids nucleics o de resposta a estrés (biòtic i oxidatiu) o defensa mediada per la ruta del jasmònic, del cicle de metilació, senyalització per ROS i proteïnes HSP. Les interaccions majoritàries de la p25-T318A es relacionaren amb transport/localització i resposta a estrés, principalment amb interactors implicats en processos d'apoptosi, patogènesi i proteïnes HSP, d'unió a calci o redoxines. També hem aconseguit l'evolució experimental de CTV per passes seriats en N. benthamiana. Aquesta evolució comporta un conjunt de característiques adaptatives significatives com: l'augment de la supervivència dels empelts, de la taxa neta d'infectivitat, de la càrrega viral i de l'ajornament dels símptomes causats en aquesta espècie herbàcia amb l'augment dels passes. Les característiques adaptatives també es reflectiren a nivell molecular amb la variabilitat genètica i estructura de les poblacions dels virus evolucionats en dos llinatges independents. Virus evolucionats a N. benthamiana resultaren menys infecciosos inicialment per inoculació mecànica de tornada a cítrics, i s'acumularen menys que el virus parental durant el primer any. Aquesta re-adaptació dels virus evolucionats a N. benthamiana de tornada a cítrics es va reflectir a nivell molecular amb / Navarro López, JA. (2017). Estudio preliminar de las interacciones del virus de la tristeza de los cítricos (CTV) y su huésped [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90468

Genetic engineering has allowed the design and production of recombinant antibodies (rmAbs) in plants. Nowadays, rmAbs are used in the treatment of a wide range of pathologies such as infectious diseases, inflammatory diseases and cancer, making rmAbs an important group of biomolecules within the pharmaceutical and biotechnology industry. By the time this study was started, the immunoglobulin G (IgG) was the antibody isotype predominantly expressed in plants. In recent years Modular DNA cloning technology has facilitated antibody engineering, with the development and expression of new rmAbs formats. However, there is hardly any study where different antibody formats are produced and compared in terms of yield and neutralizing capacity. Therefore, the starting point of the first chapter of this thesis is a comparative study where five different formats of the same commercial rmAb (Infliximab) against the human cytokine Tumor Necrosis Factor (TNF-¿) were expressed and compared. The results obtained in Chapter 1 demonstrate that both the isotype and the structure of the chosen rmAb influence the yield and the neutralizing capacity of rmAb. The expression of new antibody formats not only refers to the antibody isotype or structure; the format also refers to the combination of antibody idiotypes, leading to the production of oligo or polyclonal antibodies. Therefore, the possibility of co-expressing different monoclonal antibodies simultaneously in plants (creating oligoclonal or polyclonal formats) was raised. In the second chapter of this thesis, the expression of three rmAbs against the Ebola virus glycoprotein was studied. The three rmAbs were transiently expressed in N. benthamiana individually, by establishing separated production lines; in parallel, all three rmAbs were also co-expressed simultaneously in the same production line. The results obtained in this chapter demonstrated that the individual expression of rmAbs is feasible. However, when all three rmAbs are co-expressed, a drastic decrease in the binding of the antibody to the antigen was observed due to chain shuffling, as each heavy chain (HC) can be bound to any light chain (LC) other than its cognate chain, giving rise to an antibody cocktail with lower activity. With the objective of developing a method that allows co-expression of several rmAb in a single production line, we next proposed to exploit the viral interference phenomenon (also known as superinfection exclusion, SE). The results shown in Chapter three demonstrate that the production of an oligoclonal cocktail composed of 36 rmAbs in plants was possible using a viral expression system showing SE. The data obtained in this chapter showed that the resulting oligoclonal cocktail was active and capable of neutralizing toxic activities of the venom of the snake Bothrops asper in vitro and in vivo, wich was used as a model for studying the efficacy of the oligoclonal antibodies produced. The results of this thesis confirm and support the use of plants as platforms for the expression of alternative formats of antibodies. / La ingeniería genética ha permitido el diseño y la producción de anticuerpos recombinantes (rmAbs) en plantas. Hoy en día, los rmAbs se utilizan en el tratamiento de un amplio rango de patologías como enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias y cáncer, convirtiéndose en un importante grupo de biomoléculas dentro de la industria farmacéutica y biotecnológica. Hasta la fecha de este estudio, en plantas se ha producido mayoritariamente la inmunoglobulina del tipo G (IgG). Gracias al desarrollo de la ingeniería del ADN recombinante y de la ingeniería de anticuerpos, es posible diseñar y producir nuevos formatos de rmAbs. Sin embargo, apenas existen estudios comparativos donde se demuestre si el formato de anticuerpo elegido es el idóneo en términos de rendimiento y capacidad neutralizante. Por tanto, el punto de partida del primer Capítulo de esta tesis consistió en la realización de un estudio comparativo de la expresión en plantas de cinco formatos distintos de un mismo rmAb comercial (Infliximab) frente a la citoquina humana Tumor Necrosis Factor (TNF-¿). Los resultados obtenidos en el Capítulo 1 demuestran que tanto el isotipo como la estructura del rmAb elegido influye en los niveles de rendimiento y en la capacidad neutralizante del rmAb. La expresión de nuevos formatos de anticuerpos no solo afecta al isotipo o a la estructura de las regiones constantes, sino que también se puede incluir en este término la expresión conjunta de distintos idiotipos de anticuerpos recombinantes, dando lugar a anticuerpos policlonales u oligoclonales recombinantes. Por tanto en esta tesis se planteó la posibilidad de co-expresar simultáneamente distintos anticuerpos monoclonales en plantas formando un cóctel oligoclonal. En el segundo Capítulo de esta tesis se diseñaron tres rmAbs frente a la glicoproteína de la cubierta del virus del Ébola. Los tres rmAbs se expresaron transitoriamente en N. benthamiana de manera individual mediante el establecimiento de líneas paralelas de producción y también se co-expresaron los tres rmAbs simultáneamente en una misma línea de producción. Los resultados obtenidos en este Capítulo demostraron que la expresión de los rmAbs de manera individual es factible. Sin embargo, cuando se co-expresan los tres rmAbs se observa una drástica disminución en la unión del anticuerpo al antígeno debido al barajado de cadenas, fenómeno por el cual cada cadena pesada (HC) se puede unir con cualquier cadena ligera (LC) distinta de su acompañante, dando lugar a un anticuerpo con una baja actividad. Finalmente, con el objetivo de desarrollar un método que permita co-expresar en una misma línea de producción varios rmAbs de forma reproducible se propuso explotar el fenómeno de la exclusión viral, un característica propia de los virus de plantas. Los resultados mostrados en el Capítulo 3 demuestran que es posible la producción de un cóctel oligoclonal compuesto por 36 rmAbs en N. benthamiana aprovechando el fenómeno de la exclusión viral. Los datos obtenidos en este capítulo muestran que el cóctel oligoclonal producido de esta forma mantiene intactas las actividades de los anticuerpos individuales y es capaz de neutralizar las actividades tóxicas del veneno de la serpiente Bothrops asper en ensayos in vitro e in vivo. Los resultados de esta tesis confirman y avalan el uso de las plantas como plataformas de expresión de formatos alternativos de anticuerpos. / El desenvolupament de l'enginyeria genètica ha permès el disseny i la producció d'anticossos recombinants (rmAbs) en plantes. Hui en dia, els rmAbs s'utilitzen en el tractament d'un ampli rang de patologies com malalties infeccioses, malalties inflamatòries i càncer convertint-se en un important grup de biomolècules dins de les indústries farmacèutiques i biotecnològiques. Fins a la data, s'han expressat majoritàriament la immunoglobulina del tipus G. Gràcies al desenvolupament de l'enginyeria de l'ADN recombinant i l'enginyeria dels anticossos s'han desenvolupat i expressat formats alternatius de rmAbs. Tanmateix, hi ha molts pocs estudis comparatius on es demostra si el format de l'anticòs elegit influeix en el rendiment i en la capacitat neutralitzant. Per tant, el punt de partida del primer Capítol d'esta Tesi és la realització d'un estudi comparatiu on s'expressen cinc formats diferents d'un mateix anticòs comercial (Infliximab) front a la citocina humana Tumor Necrosis Factor (TNF-¿). Els resultats obtesos demostren que tant l'isotip com l'estructura del rmAb elegit influeix en el rendiment i en la capacitat neutralitzant del rmAb. L'expressió de nous formats d'anticossos no sols afecta a l'isotip o a l'estructura del rmAb sinó que també pot incloure's dins d'aquest concepte l'expressió individual i l'expressió conjunta de diferents rmAbs. Partint d'aquesta hipòtesi, es va plantejar la possibilitat de co-expressar diferents rmAbs (còctel oligoclonal) en plantes. En el segon Capítol d'esta tesi es dissenyaren tres rmAbs front a la glicoproteïna del virus de l'Ébola. Els tres rmAbs s'expressaren transitòriament en N. benthamiana de manera individual mitjançant l'establiment de línies paral·leles de producció i també es co-expressaren els tres rmAbs en la mateixa línia de producció. Els resultats obtesos en este Capítol demostraren que l'expressió dels rmAbs de manera individual és factible. Tanmateix, quan es co-expressaren els tres rmAbs s'observà una dràstica disminució en la unió de l'anticòs a l'antigen com a conseqüència del shuffling chain, pel qual la cadena pesada (HC) s'uneix amb qualsevol cadena lleugera (LC) diferent a la seua acompanyant, formant un anticòs amb una baixa capacitat d'unió a l'antigen. Amb l'objectiu de desenvolupar un mètode que permeta co-expressar, en una mateixa línia de producció, un còctel oligoclonal es proposà explotar el fenomen de l'exclusió viral. Els resultats obtesos en el Capítol 3 demostren que l'expressió d' un còctel oligoclonal format per 36 rmAbs en plantes és possible. Els resultats mostren que el nostre còctel oligoclonal es capaç de neutralitzar activitats tòxiques del verí de la serp Bothrops asper en assaigs in vitro i in vivo. Els resultat obtesos en aquesta Tesi confirmen i avalen l'ús de les plantes com plataformes d'expressió de formats alternatius d'anticossos. / Huet Trujillo, E. (2017). Nuevas metodologías para la producción de anticuerpos recombinantes en plantas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90469

En la presente tesis se han estudiado los distintos mecanismos de toxicidad de las micotoxinas citrinina y ocratoxina A y la respuesta adaptativa a xenobióticos en el modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae, concretamente la regulación de los transportadores multidrogas del sistema PDR y sus factores de transcripción. La respuesta a xenobióticos permite a las células eucariotas adaptarse y sobrevivir a la exposición de gran variedad de compuestos exógenos, como toxinas o fármacos. En esta respuesta participan distintos tipos de proteínas, principalmente transportadores de membrana y factores de transcripción. Para estudiar esta respuesta adaptativa sometimos las células de levadura a distintos tratamientos con las micotoxinas citrinina (CIT) y ocratoxina A (OTA), y los oxidantes menadiona (MEN), y peróxido de hidrógeno (H2O2). Las micotoxinas CIT y OTA son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos que contaminan alimentos básicos y que son tóxicas para el ser humano. Aquí, estudiamos sus mecanismos de toxicidad a través de experimentos de expresión génica con reporteros luciferasa, ensayos transcriptómicos, y ensayos fenotípicos con mutantes de pérdida de función para determinadas proteínas involucradas en la defensa antioxidante y de transporte multidroga. Los resultados muestran diferencia de los mecanismos de toxicidad entre ambas micotoxinas. CIT induce la expresión de genes involucrados en el transporte de drogas y la respuesta a estrés oxidativo, mientras que OTA activa, principalmente, la expresión de genes implicados en el desarrollo, como meiosis o esporulación, y en menor medida, genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo y al transporte multidroga. En levadura, los transportadores multidroga de la membrana plasmática que eliminan compuestos tóxicos de la célula forman parte del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Este sistema está compuesto por proteínas conservadas de bacterias a humanos, como transportadores multidroga y factores de transcripción. Cuando estos transportadores son sobreexpresados, da lugar al fenómeno de resistencia pleiotrópica a drogas (PDR) o resistencia a múltiples drogas (MDR). Este proceso de resistencia es de gran importancia en diversos tratamientos médicos, como quimioterapia en cáncer, o antifúngicos, ya que disminuyen su eficiencia. Aquí, hemos estudiado el funcionamiento del sistema PDR en levadura de varios transportadores multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, y Yor1) y factores de transcripción (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, y Stb5) mediante cuantificación de expresión luciferasa. Los resultados muestran que, de entre los transportadores estudiados, Pdr5 y Snq2 son los principales en la respuesta de adaptación frente a CIT, OTA y MEN, mientras que Pdr15 parece actuar como un transportador secundario. Además, la regulación de estos tres transportadores ante la exposición de CIT está dirigida por el factor de transcripción Pdr1. SNQ2 es el único de los cuatro transportadores que se induce al tratar las células con H2O2. Pdr1 activa la transcripción de genes en respuesta a CIT y OTA a través de los sitios específicos PDRE, mientras que Pdr8 e Yrm1, parecen actuar como reguladores negativos en respuesta a CIT. Por último, desarrollamos un sistema binario de plásmidos que nos permite definir las distintas sensibilidades y especificidad a drogas por parte de los factores de transcripción de forma individual. Pdr1 es capaz de reconocer e inducir la activación de la expresión génica en todos los tratamientos, aunque levemente con H2O2. Yrr1 presenta inducción de la expresión génica ante CIT y, especialmente, OTA, indicando su capacidad de discriminación entre estas moléculas. Por último, Stb5 reconoce e induce la expresión génica en el tratamiento con H2O2 en mayor nivel que Pdr1. Los resultados muestran un alto nivel de regulación del sistema PDR, con Pdr1 como factor de transcripción pr / In the present thesis, we have studied the different toxicity mechanisms of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A and the adaptive response to xenobiotics in the yeast model of Saccharomyces cerevisiae, specifically the regulation of the multidrug transporters of the PDR network and its transcription factors. The response to xenobiotics allows eukaryotic cells to adapt and survive the exposure to a wide variety of exogenous compounds, such as toxins or drugs. Different types of proteins participate in this response, mainly membrane transporters and transcription factors. To study this adaptive response we subjected the yeast cells to different treatments with the mycotoxins citrinin (CIT) and ochratoxin A (OTA), and oxidants menadione (MEN), and hydrogen peroxide (H2O2). The mycotoxins CIT and OTA are secondary metabolites produced by several filamentous fungi, which contaminate staple foods and which are toxic to humans. Here, we studied their toxicity mechanisms through gene expression experiments with luciferase reporters, transcriptomic assays, and phenotypic assays with loss-of-function mutants for certain proteins involved in antioxidant defense and multidrug transport. The results show differences in the mechanisms of toxicity between both mycotoxins. CIT induces the expression of genes involved in drug transport and the response to oxidative stress, whereas OTA activates, mainly, the expression of genes involved in development, such as meiosis or sporulation, and to a lesser extent, genes related to response to oxidative stress and multidrug transport. In yeast, multidrug transporters of the plasma membrane that remove toxic compounds from the cell are part of the PDR (pleiotropic drug resistance) network. This system is composed of proteins conserved from bacteria to humans, such as multidrug transporters and transcription factors. When these transporters are overexpressed, it leads to a phenomenon known as pleiotropic drug resistance (PDR) or multidrug resistance (MDR). This resistance process is very important in various medical treatments, such as chemotherapy in cancer, or antifungals, since they reduce their efficiency. Here, we have studied the function of the PDR multidrug transporters (Pdr5, Pdr15, Snq2, and Yor1) and transcription factors (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, and Stb5) by quantifying luciferase expression in promoters or specific recognition sites. The results show that, among the studied transporters, Pdr5 and Snq2 have major roles in the adaptation response to CIT, OTA and MEN, while Pdr15 seems to act as a secondary transporter. Moreover, the regulation of these three transporters upon exposure to CIT is directed by the transcription factor Pdr1. SNQ2 is the only one of the four transporters that is induced by treating cells with H2O2. Pdr1 activates the transcription of genes in response to CIT and OTA through specific PDRE sites, while Pdr8 and Yrm1, appear to act as negative regulators in response to CIT. Finally, we developed a binary plasmid system that allows us to define the different sensitivities and specificity to drugs by the transcription factors individually. Pdr1 is able to recognize and induce the activation of gene expression in all treatments, albeit very slightly with H2O2. Yrr1 shows induction of gene expression with CIT and, especially, OTA, indicating its ability to discriminate between these molecules. Finally, Stb5 recognizes and induces gene expression in H2O2 treatment at a higher level than Pdr1. These results show an important level of regulation of the PDR network, with Pdr1 as the main transcription factor, but with the cooperation of more specific regulators. / En la present tesi s'han estudiat els diferents mecanismes de toxicitat de les micotoxines citrinina i ocratoxina A i la resposta adaptativa a xenobiòtics en el model de llevat Saccharomyces cerevisiae, concretament la regulació dels transportadors multidroga del sistema PDR i els seus factors de transcripció. La resposta a xenobiòtics permet a les cèl·lules eucariotes adaptar-se i sobreviure a l'exposició de gran varietat de compostos exògens, com toxines o fàrmacs. En aquesta resposta participen diferents tipus de proteïnes, principalment transportadors de membrana i factors de transcripció. Per estudiar aquesta resposta adaptativa vam sotmetre les cèl·lules de llevat a diferents tractaments amb les micotoxines citrinina (CIT) i ocratoxina A (OTA), i els oxidants menadiona (MEN), i peròxid d'hidrogen (H2O2). Les micotoxines CIT i OTA són metabòlits secundaris produïts per diversos fongs filamentosos que contaminen aliments bàsics i que són tòxiques per a l'ésser humà. Ací, estudiem els seus mecanismes de toxicitat a través d'experiments d'expressió gènica amb reporters luciferasa, assaigs transcriptòmics, i assajos fenotípics amb mutants de pèrdua de funció per a determinades proteïnes involucrades en la defensa antioxidant i de transport multidroga. Els resultats mostren diferència dels mecanismes de toxicitat entre les dues micotoxines. CIT indueix l'expressió de gens involucrats en el transport de drogues i la resposta a estrès oxidatiu, mentre que OTA activa, principalment, l'expressió de gens implicats en el desenvolupament, com meiosi o esporulació, i en menor mesura, gens relacionats amb la resposta a estrès oxidatiu i al transport multidroga. En llevat, els transportadors multidroga de la membrana plasmàtica que eliminen compostos tòxics de la cèl·lula formen part del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Aquest sistema està compost per proteïnes conservades de bacteria a humans, com transportadors multidroga i factors de transcripció. Quan aquests transportadors es troben sobreexpressats, dóna lloc al fenomen de resistència pleiotrópica a drogues (PDR) o resistència a múltiples drogues (MDR). Aquest procés de resistència és de gran importància en diversos tractaments mèdics, com quimioteràpia en càncer, o antifúngics, ja que disminueixen la seua eficiència. Ací hem estudiat el funcionament del sistema PDR en llevat de diversos transportadors multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, i Yor1) i factors de transcripció (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, i Stb5) mitjançant quantificació d'expressió luciferasa. Els resultats mostren que, d'entre els transportadors estudiats, Pdr5 i Snq2 són els principals en la resposta d'adaptació davant de CIT, OTA i MEN, mentre que Pdr15 sembla actuar com un transportador secundari. A més d'això, la regulació d'aquests tres transportadors davant l'exposició de CIT està dirigida pel factor de transcripció Pdr1. SNQ2 és l'únic dels quatre transportadors que s'indueix en tractar les cèl·lules amb H2O2. Pdr1 activa la transcripció de gens en resposta a CIT i OTA a través dels llocs específics PDRE, mentre que Pdr8 i Yrm1, semblen actuar com a reguladors negatius en resposta a CIT. Finalment, vam desenvolupar un sistema binari de plasmidis que enspermet definir les diferents sensibilitats i especificitat a drogues per part dels factors de transcripció de forma individual. Pdr1 és capaç de reconèixer i induir l'activació de l'expressió gènica en tots els tractaments, encara que lleument amb H2O2. Yrr1 presenta inducció de l'expressió gènica davant CIT i, especialment, OTA, indicant la seua capacitat de discriminació entre aquestes molècules. Finalment, Stb5 reconeix i indueix l'expressió gènica en el tractament amb H2O2 en major nivell que Pdr1. Els resultats mostren un important nivell de regulació del sistema PDR, amb Pdr1 com a factor de transcripció principal, però amb la cooperació d'altres regulador / Vanacloig Pedrós, ME. (2018). Estrategias de defensa a estrés químico en Saccharomyces cerevisiae: regulación genética del transporte multidroga y mecanismos de detoxificación [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111949

Tesis por compendio / [EN] Abstract Introduction Salinity and drought are the most important environmental stress conditions reducing crop yields worldwide and limiting the distribution of wild plants in nature. Soil salinity, especially secondary salinity caused by anthropogenic practices, such as prolonged irrigation, lead to substantial agricultural yield losses, especially in arid and semiarid regions. Drought, caused by reduced water content in the soil, occurs due to disorders in nature's water cycle, chiefly when evapotranspiration exceeds precipitation in a certain area, to the point where soil water reserves can no longer support plant growth. Drought and salt stress trigger the activation of a series of basic stress mechanisms that includes among others, the control of ion transport, exclusion and compartmentalization, as well as the accumulation of compatible solutes ('osmolytes'), and the activation of antioxidant systems. These mechanisms are conserved in all plants, stress tolerant and sensitive alike, and don't necessarily confer tolerance. To decipher those mechanisms and have a better understanding on the contribution of different stress responses to the stress tolerance of a given species, we have carried out comparative studies on the responses to drought and salinity in a number of genetically related taxa with different tolerance potentials. Methodology The experimental approach was mostly based on i) establishing the relative tolerance to water and salt stress in the studied species from their distribution in nature (in the case of wild species) and through the relative inhibition of growth in the presence of stress, and ii) correlating changes in the levels of biochemical 'stress markers' associated to specific response pathways (ion transport, osmolyte accumulation¿) upon stress treatments, with the already established relative tolerance to stress. This strategy proved to be appropriate to distinguish mere general responses to stress from those mechanisms relevant for stress tolerance of the investigated species and cultivars. The work also sheds light on other aspects affected by salt stress, specifically regarding germination and reproductive success or anatomical changes in salt-stressed plants. The expression patterns of the gene NHX1, encoding a vacuolar Na+/H+ antiporter were also studied in the Plantago taxa, as a first step in the full characterisation of this ion transporter, that appears to play an important role in the mechanisms of salt tolerance in this genus. Conclusion The results obtained in this work contribute to a better understanding of general stress tolerance mechanisms in plants, and provides clear insights into the mechanisms conferring tolerance, specifically, to drought and salt stress in some wild species and crops. This work also shed more light on the highly efficient responses to stress in halophytes, plants that could be viewed as nature's answer to the aforementioned adverse environmental conditions via evolution and adaptation. Halophytes can therefore be considered as a suitable source - underutilized at present, in our opinion - of knowledge, genetic resources and biotechnological tools for the needed improvement of stress tolerance in crops. / [ES] Resumen Introducción La salinidad y la sequía son las condiciones de estrés ambiental más importantes, que reducen los rendimientos de los cultivos en todo el mundo y que limitan la distribución de las plantas silvestres en la naturaleza. La salinidad del suelo, especialmente la salinización secundaria causada por prácticas antropogénicas, como la irrigación prolongada, conducen a pérdidas importantes de rendimiento agrícola, especialmente en las regiones áridas y semiáridas. La sequía, provocada por la reducción de contenido de agua en el suelo, se produce debido a alteraciones en el ciclo del agua en la naturaleza, principalmente cuando la evapotranspiración excede la precipitación en un área determinada, hasta el punto que las reservas de agua del suelo ya no pueden soportar el crecimiento de la planta. La sequía y el estrés salino desencadenan la activación de una serie de mecanismos básicos de respuesta, que incluyen entre otros el control del transporte, la exclusión y la compartimentación de iones, así como la acumulación de solutos compatibles ('osmolitos'), y la activación de sistemas antioxidantes. Estos mecanismos están conservados en todas las plantas, tolerantes y sensibles a estrés por igual, y no confieren necesariamente tolerancia. Para descifrar estos mecanismos y conseguir una mejor comprensión de la contribución de diferentes respuestas a estrés a la tolerancia al estrés en una especie dada, hemos llevado a cabo estudios comparativos sobre las respuestas a la sequía y la salinidad, en un número de taxones relacionados genéticamente con diferentes potenciales de tolerancia. Metodología El enfoque experimental se basó principalmente en i) establecer la tolerancia relativa al estrés hídrico y al estrés salino en las especies estudiadas, a partir de su distribución en la naturaleza (en el caso de especies silvestres) y atendiendo a la inhibición relativa de su crecimiento en presencia de estrés, y ii) correlacionar cambios en los niveles de 'marcadores bioquímicos de estrés' asociados a vías específicas de respuesta (transporte de iones, acumulación de osmolitos ...) inducidos por los tratamientos de estrés, con la tolerancia relativa a estrés de las plantas, previamente establecido. Esta estrategia ha resultado ser apropiada para distinguir meras respuestas generales a estrés de los mecanismos relevantes para la tolerancia a estrés de las especies y cultivares investigados. El trabajo también arroja luz sobre otros aspectos afectados por el estrés salino, específicamente en relación con la germinación y el éxito reproductivo, o cambios anatómicos en las plantas tratadas con sal. También se estudiaron los patrones de expresión del gen NHX1, que codifica un antiportador vacuolar Na+/H+, en las especies de Plantago, como un primer paso en la caracterización completa de este transportador de iones, que parece desempeñar un papel importante en los mecanismos de tolerancia a sal en este género. Conclusión Los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen a una mejor comprensión de los mecanismos generales de tolerancia al estrés en plantas, y proporcionan ideas claras sobre los mecanismos que confieren tolerancia, en concreto, a la sequía y al estrés salino, en algunas especies silvestres y cultivadas. Este trabajo también arroja más luz sobre las respuestas a estrés altamente eficientes en halófitas, plantas que podrían ser vistas como la respuesta de la naturaleza a las condiciones ambientales adversas antes mencionadas, a través de la evolución y la adaptación. Por lo tanto, las halófitas pueden ser consideradas como una fuente adecuada - infrautilizada en la actualidad, en nuestra opinión - de conocimiento, recursos genéticos y herramientas biotecnológicas para la necesaria mejora de la tolerancia al estrés en plantas cultivadas. / [CA] Resum Introducció La salinitat i la sequera són les condicions d'estrès ambiental més importants, que redueixen els rendiments dels cultius a tot el món i que limiten la distribució de les plantes silvestres en la naturalesa. La salinitat del sòl, especialment la salinització secundària causada per pràctiques antropogèniques, com la irrigació perllongada, condueixen a pèrdues importants de rendiment agrícola, especialment en les regions àrides i semiàrides. La sequera, provocada per la reducció de contingut d'aigua en el sòl, es produeix a causa d'alteracions en el cicle de l'aigua en la naturalesa, principalment quan la evapotranspiració excedeix la precipitació en un àrea determinada, fins al punt que les reserves d'aigua del sòl ja no poden suportar el creixement de la planta. La sequera i l'estrès salí desencadenen l'activació d'una sèrie de mecanismes bàsics de resposta, que inclouen entre uns altres el control del transport, l'exclusió i la compartimentació d'ions, així com l'acumulació de soluts compatibles ('osmolits'), i l'activació de sistemes antioxidants. Aquests mecanismes estan conservats en totes les plantes, tolerants i sensibles a estrès per igual, i no confereixen necessàriament tolerància. Per a desxifrar aquests mecanismes i aconseguir una millor comprensió de la contribució de diferents respostes a estrès a la tolerància a l'estrès en una espècie donada, hem dut a terme estudis comparatius sobre les respostes a la sequera i la salinitat, en un nombre de taxons relacionats genèticament amb diferents potencials de tolerància. Metodologia L'enfocament experimental es va basar principalment en i) establir la tolerància relativa a l'estrès hídric i a l'estrès salí en les espècies estudiades, a partir de la seua distribució en la naturalesa (en el cas d'espècies silvestres) i atenent a la inhibició relativa de el seu creixement en presència d'estrès, i ii) correlacionar canvis en els nivells de 'marcadors bioquímics d'estrès' associats a vies específiques de resposta (transport d'ions, acumulació d'osmolits ...) induïts pels tractaments d'estrès, amb la tolerància relativa a estrès de les plantes, prèviament establert. Aquesta estratègia ha resultat ser apropiada per a distingir meres respostes generals a estrès dels mecanismes rellevants per a la tolerància a estrès de les espècies i conreus investigats. El treball també llança llum sobre altres aspectes afectats per l'estrès salí, específicament en relació amb la germinació i l'èxit reproductiu, o canvis anatòmics en les plantes tractades amb sal. També es van estudiar els patrons d'expressió del gen NHX1, que codifica un anti-portador vacuolar Na+/H+, en les espècies de Plantago, com un primer pas en la caracterització completa d'aquest transportador d'ions, que sembla exercir un paper important en els mecanismes de tolerància a sal en aquest gènere. Conclusió Els resultats obtinguts en aquest treball contribueixen a una millor comprensió dels mecanismes generals de tolerància a l'estrès en plantes, i proporcionen idees clares sobre els mecanismes que confereixen tolerància, en concret, a la sequera i a l'estrès salí, en algunes espècies silvestres i conreades. Aquest treball també llança més llum sobre les respostes a estrès altament eficients en halòfites, plantes que podrien ser vistes com la resposta de la naturalesa a les condicions ambientals adverses abans esmentades, a través de l'evolució i l'adaptació. Per tant, les halòfites poden ser considerades com una font adequada - infrautilitzada en l'actualitat, en la nostra opinió - de coneixement, recursos genètics i eines biotecnològiques per a la necessària millora de la tolerància a l'estrès en plantes conreades. / Al Hassan, M. (2016). Comparative analyses of plant responses to drought and salt stress in related taxa: A useful approach to study stress tolerance mechanisms [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61985 / Compendio

La salinidad es uno de los estreses ambientales que más incide en la productividad agrícola, especialmente en las regiones semiáridas como la zona mediterránea, donde se ubica la Comunidad Valenciana. Para poder mitigar los efectos perjudiciales de los estreses abióticos resulta necesario conocer las bases moleculares de los fenómenos investigados, ya que soló entonces podrán ser manipulados de la manera más conveniente. En el caso de la tolerancia a la salinidad se conocen una serie de aspectos claves que han contribuido a mejorar las plantas cultivadas, pero es necesaria mucha más investigación para poder obtener resultados adecuados para la practica agrícola. En este trabajo se ha planteado un nuevo abordaje consistente en el uso de norespermidina, una poliamina no metabolizable, como agente de selección para encontrar individuos resistentes a cationes tóxicos. Para ello se ha utilizado una colección de semillas de Arabidopsis mutadas por inserción de un activador transcripcional. Con este abordaje se aisló el mutante par1-1D (polyamine resistant) que presenta un fenotipo pleiotrópico de resistencia a cationes tóxicos como Na+, Li+, norespermidina y espermidina. par1-1D es un mutante dominante que presenta un aumento en la expresión del locus At1g15020. Este locus codifica una proteína perteneciente a la familia de las quiescina sulfidril oxidasas (existen 2 proteínas homólogas de esta familia en Arabidopsis) por lo que se propuso el nombre de QSO2 (quiescina sulfidril oxidasa) para denominar al locus At1g15020. Mediante un análisis de RT-PCR en diferentes partes de la planta se encontró que QSO2 se expresa principalmente en la raíz y el polen, además al expresar de forma transitoria la construcción QSO2::GFP en la epidermis de hojas de N. benthamiana, la expresión de QSO2 se localizó en la pared celular. Por otro lado, se expresó y purificó en S. cerevisae la proteína recombinante QSO2 y se demostró su actividad sulfidril oxidasa. Finalmente, en plántulas y pl / Alejandro Martínez, S. (2007). Identificación de mutantes de Arabidopsis thaliana resistentes a norespermidina. Clonación y caracterización de una sulfidril oxidasa [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1940

La citricultura es una de las ramas de la fruticultura de mayor producción a nivel mundial, siendo España el cuarto productor y primer país exportador mundial de cítricos para consumo en fresco (FAO, 2005). La obtención de nuevas variedades que se adapten a las exigencias de mercado y de cultivo es la clave para continuar siendo competitivos. La reducción de las precipitaciones en muchas zonas agrícolas provoca que el estrés hídrico sea uno de los estreses abióticos que más limita la producción de los cultivos, entre ellos los cítricos. Aunque son numerosos los estudios orientados a conocer mejor la respuesta de la planta ante el estrés hídrico a nivel molecular en especies modelo, son pocos los trabajos realizados en relación a la respuesta al estrés hídrico en cítricos. Este trabajo tiene como objetivo el desarrollo de herramientas que nos permitan conocer mejor la respuesta de los cítricos frente a este estrés que en un futuro puedan utilizarse para conseguir cítricos que sean capaces de aprovechar mejor el agua disponible en condiciones adversas, evitando las importantes pérdidas de cosecha. El análisis global de la respuesta a estrés hídrico en cítricos se ha llevado a cabo a través de un estudio del transcriptoma de los cítricos sometidos a este estrés. Para ello se han utilizado dos abordajes, la generación de ESTs y la hibridación de micromatrices de cDNA, que han permitido identificar genes candidatos a estar implicados en la respuesta a estrés hídrico. La generación de ESTs se ha realizado a partir de la secuenciación de un total de 2296 clones aislados de dos bibliotecas de cDNA sustraido, Drought1 y Drought2, construidas a partir de hojas y raíces de plantas sometidas a estrés hídrico respectivamente. Las ESTs obtenidas han pasado a formar parte de la colección del CFGP (Citrus Functional Genomics Project). Como resultado del estudio de los unigenes resultantes de las bibliotecas construidas con material sometido a estrés hídrico, en relación con el r / Gimeno Romeu, J. (2007). Respuesta transcripcional al estrés hídrico en mandarino. Estudio genómico-funcional con micromatrices de cDNA [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1993

Con el fin de investigar los efectos en la homeostasis de iones de un aumento en la concentración celular de peróxido de hidrógeno, se aisló un mutante de inserción de T-DNA en el gen CATALASA 2 de Arabidopsis. El mutante cat2-1 presenta una reducción del 80% de la catalasa de hoja en comparación con genotipos silvestres y acumula más peróxido de hidrógeno en condiciones sin estrés. Además de presentar un tamaño reducido, un color verde más pálido y gran reducción en el número de raíces secundarias, el mutante cat2-1 presenta una marcada sensibilidad a peróxido de hidrógeno, cloruro sódico, norespermidina, alta intensidad lumínica y estrés por frío. Por otra parte, el mutante cat2-1 presenta una tolerancia parcial cuando es crecido en medios con cloruro de litio en comparación con el genotipo silvestre. Este novedoso fenotipo no puede ser explicado por cambios en el transporte de este catión. Realmente, la toma de litio y de otros cationes tóxicos como sodio y norespermidina es mayor en el mutante cat2-1, mientras que los niveles de potasio de la planta son inferiores. La tolerancia a litio de este mutante parece ser resultado de una insensibilidad a la inhibitoria respuesta de etileno producida por el catión y a su reducida capacidad de producción de etileno. De acuerdo con esto, la inducción por etileno de genes de respuesta tales como PR4 y EBP/ERF72 es menor en el mutante cat2-1. Mutantes insensibles a etileno como etr1-1 y ein3-3 son tolerantes a litio y la inhibición de la biosíntesis de etileno con 2-aminoisobutirato protege contra la toxicidad del litio. Análisis de la expresión génica con micromatrices indican que la expresión de genes relacionados al transporte de cationes y a la síntesis y percepción de etileno no están alterados en el mutante cat2-1, lo que nos hace suponer que el peróxido de hidrógeno modula estos procesos a nivel de proteína. Todos estos resultados descubren una estrecha relación entre estrés oxidativo, la homeostasis de cationes y el / Bueso Ródenas, E. (2008). La tolerancia a litio del mutante cat2 de arabidopsis revela una estrecha relación entre estrés oxidativo y etileno [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2341

El fallado del arroz, producido por Pyricularia oryzae, es una importante enfermedad de este cereal que, en los años en que se presenta, causa graves pérdidas económicas. Por ello, actualmente, se utilizan sistemáticamente fungicidas para prevenir su posible aparición, tratamientos que en la mayor parte de los casos están injustificados, debido a que no se dan las condiciones necesarias para el desarrollo de este patógeno. Los tratamientos fitosanitarios, conllevan la emisión periódica o puntual de xenobióticos que, como residuos procedentes de estas tareas, llegan a los ecosistemas acuáticos a través de acequias, canales de desagüe e incluso vía aérea, ocasionando con ello importantes efectos sobre la biota. Estas sustancias pueden ser bioacumuladas por diferentes eslabones de las cadenas tróficas y llegar a alcanzar niveles altamente perjudiciales para el ecosistema. Aunque los niveles de la gran mayoría de productos fitosanitarios suelen encontrarse en proporciones suficientemente bajas como para no causar la muerte directa y repentina de los organismos acuáticos, es necesario conocer la capacidad de las especies para resistir y por lo tanto vivir en estos medios periódicamente contaminados y, además, acumular en sus tejidos los tóxicos del mismo (bioconcentración), sobre todo cuando el destinatario final puede ser el hombre. Para establecer el riesgo derivado del uso de plaguicidas es necesario realizar una serie de estudios encaminados a evaluar el riesgo potencial para el medio ambiente (ERA), para dicha evaluación del riesgo se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1. Determinar las pautas de evolución de los fungicidas considerados, en sistemas acuáticos, estudiando experimentalmente sus constantes de degradación por hidrólisis, biodegradación por microorganismo y algas. 2. Determinar la toxicidad, efectos subletales y actividad bioacumulativa de los plaguicidas empleados contra Pyricularia oryzae en P.N. de L'Albufera de Valencia en diferentes organ / Andreu Sánchez, OE. (2008). Evaluación de riesgos ambientales del uso de plaguicidas empleados en el cultivo del arroz en el Parque Natural de la Albufera de Valencia [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2342

El gen OCP3 codifica un factor de transcripción de la familia Homeobox. En trabajos anteriores se ha demostrado que la pérdida de función de este gen en Arabidopsis thaliana causa un notable incremento de la resistencia a infecciones por hongos necrotrofos como Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Además esa resistencia es dependiente de la correcta señalización mediada por ácido jasmónico (JA), una de las fitohormonas más ampliamente relacionadas con el establecimiento de las respuestas defensivas en plantas junto con el ácido salicílico (SA). A través del balance entre las señalizaciones de estos dos reguladores (JA y SA), la planta es capaz de disparar la respuesta defensiva más apropiada dependiendo del tipo de patógeno que la ataca. Así pues, el estudio de las interrelaciones entre JA y SA y los componentes que transducen las respectivas señales es de gran utilidad para desentramar la compleja red de regulación que compone la respuesta inmune de las plantas. Mediante el estudio de dobles mutantes, se ha demostrado un nuevo papel de OCP3 en la interconexión entre SA y JA en respuesta a Pseudomonas syringae e Hyaloperonospora arabidopsidis, dos patógenos de tipo biotrofo. Además se propone a OCP3 como un nuevo componente de la denominada Resistencia Sistémica Inducida (ISR). Existe cierto grado de solapamiento entre las respuestas de las plantas frente a estreses bióticos y abióticos. La identificación de los componentes comunes a estas dos rutas es de gran valor para conocer cómo las plantas se adaptan ante situaciones de estrés diferentes. Mediante un rastreo por doble híbrido en levadura, se identificaron cuatro proteínas que interaccionan con OCP3. Todas ellas están implicadas en la señalización mediada por ABA, una fitohormona que regula, entre otros procesos, la respuesta frente al estrés hídrico. En el presente trabajo se aportan numerosas evidencias que indican que OCP3 regula el cierre estomático promovido por ABA, y con ello la tolerancia a / Ramirez Garcia, V. (2008). Análisis funcional del gen OCP3 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4683