Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. / Made available in DSpace on 2012-10-17T09:23:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-08T23:09:08Z : No. of bitstreams: 1 143074.pdf: 2622024 bytes, checksum: 08ef9e345ee5c31829747228a04f134a (MD5)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T15:09:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 274094.pdf: 2621155 bytes, checksum: ed1393da62ea71d2d47ccd38ff064440 (MD5) / Os vírus entéricos humanos são importantes causas de enfermidades veiculadas através da água. Atualmente, em termos de legislação brasileira, apenas a contagem do número de coliformes é utilizada para determinar a segurança microbiológica de águas tratadas e não tratadas. Os vírus presentes no meio ambiente são, na sua maioria, não adaptados ao cultivo in vitro, tornando-se necessário o desenvolvimento e implementação de métodos que possibilitem a adoção de medidas preventivas para controle de contaminação viral. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram (I) padronizar e estabelecer metodologias de concentração, detecção, quantificação e viabilidade viral no ambiente aquático; (II) realizar a pesquisa de adenovírus humanos (HAdV), norovírus (NoV) genogrupos GI e GII, rotavírus humanos genogrupo A (RV-A) e vírus da hepatite A (HAV) em águas ambientais e ostras de cultivo durante o período de um ano e (III) avaliar por ensaio de placa de lise a sobrevivência de HAdV infecciosos sorotipos 2 e 41 em águas de superfície e subterrâneas. No estudo de padronização dos métodos foram utilizados como modelos os HAdV e HAV inoculados em águas: destilada, de esgoto tratado, do mar e da lagoa. A melhor eficiência de recuperação viral (100%) foi obtida quando as matrizes de água destilada e de esgoto tratado foram utilizadas. A menor eficiência (10%) foi encontrada para a água do mar. No estudo de campo, águas foram coletadas de 8 locais de Florianópolis, Santa Catarina e ostras (Crassostrea gigas) de duas fazendas de cultivo (norte e sul da Ilha) foram também avaliadas no mesmo período. Os resultados de detecção de genomas virais foram HAdV: 75% (esgoto tratado); 64,2% (águas ambientais); 87,5% (ostras); RV-A: 41,6% (esgoto tratado); 19% (águas ambientais); 8,3% (ostras); HAV: 25% (esgoto tratado); 8,3% (águas ambientais); ausência nas ostras; NoV: 50% (esgoto tratado); 19% (águas ambientais); ausência nas ostras. No estudo de viabilidade viral por PCR integrado a cultura celular (ICC-PCR), confirmou-se positividade de HAdV em: 66,6% (esgoto tratado); 83,8% (águas ambientais); de RV-A: ausência em esgoto tratado e 12,5% (águas ambientais); de HAV: 66,6% (esgoto tratado) e ausência nas águas ambientais. Por PCR quantitativo o número de genomas (gc) de NoV nas águas foram médias de 1,8 x 102 (GI) e 1,0 x 103 gc/L (GII) em esgoto tratado e de 1,1 x 102 (GI) e 8,1 x 103 gc/L (GII) nas águas ambientais. Para HAdV obteve-se médias de: 9,8 x 104 (esgoto tratado); 9,8 x 106 gc/L (águas ambientais) e de 9,1 x 104 (ostras sul da ilha) e 1,5 x 105 gc/g (ostras norte da ilha). Os resultados obtidos indicam uma maior prevalência de HAdV no ambiente aquático, seguido de NoV, RV-A e HAV. No estudo de decaimento de infectividade de HAdV em amostras de água houve uma significativa inativação viral somente ao final das 23 semanas a 19°C para os dois sorotipos de adenovírus testados. Estes resultados demonstram a longa taxa de sobrevivência destes vírus em águas ambientais. / Enteric viruses are important cause of gastroenteritis outbreaks transmitted through contaminated water sources. Nowadays, the Brazilian legislation only requires the coliforms counting to determine the microbiologic safety in treated and non treated water. Most viruses present in the aquatic environment are not adaptable to in vitro cultures, becoming necessary to develop and implement methods that could be used in the monitoring and prevention of viral contamination. Therefore, the objectives of this thesis were (I) to standardize and establish methodologies of concentration, detection, quantification and viral viability in the aquatic environment; (II) to access the contamination of human adenovirus (HAdV), norovirus (NoV) genogrups GI e GII, human rotavirus genogrup A (RV-A) and Hepatitis Virus A (HAV) in environmental waters and oysters during one year; (III) to study the survival of infectious HAdV type 2 and 41 in surface and ground waters measured by plaque assay. In the standardization study, HAdV and HAV were used as models and were inoculated in distilled water, treated wastewater, seawater and lagoon water, showing better virus recovery (100%) in distilled water and treated wastewater, and lower recovery (10%) in seawater. In the field study, water samples were collected from 8 sites in Florianopolis, Santa Catarina and oyster samples (Crassostrea gigas) from two oysters' farms (north and south of the Island) were also collected in the same period. The detection results of virus genomes were HAdV: 75% (treated wastewater); 64.2% (environmental waters); 87.5% (oysters); RV-A: 41.6% (treated wastewater); 19% (environmental waters); 8.3% (oysters); HAV: 25% (treated wastewater); 8.3% (environmental waters); absence in oysters; NoV: 50% (treated wastewater); 19% (environmental waters); absence in oysters. In the viability study by integrated cell culture PCR (ICC-PCR), the results confirmed viable HAdV: 66.6% (treated wastewater); 83.3% (environmental waters); RV-A: absence in treated wastewater and 12.5% (environmental waters); HAV: 66.6% (treated wastewater) and absence in environmental waters. By quantitative PCR assays the number of genomes (g.c.) for NoV in waters were averages of 1.8 x 102 (GI) and 1.0 x 103 gc/L (GII) in treated wastewater and 1.1 x 102 (GI) and 8.1 x 103 gc/L (GII) in environmental waters. For HAdV the averages were: 9.8 x 104 (treated wastewater); 9.8 x 106 gc/L (environmental waters) and 9.1 x 104 (oyster farm South) e 1.5 x 105 gc/g (oyster farm North). The surveillance results have shown a higher prevalence of HAdV in the aquatic environment, followed by NoV, RV-A and HAV. In the study of HAdV infectivity decay in water under different temperatures, results showed a significant inactivation only after 23 weeks at 19°C for both HAdV tested. These results have shown a long-term survival of adenoviruses in environmental waters.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-24T16:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 265416.pdf: 5561548 bytes, checksum: a7c44ca4b58bfd87bee435b63502e1ac (MD5) / Nos casos forenses, cadáveres ou suas partes são encontrados em diferentes estágios de decomposição, sendo nestes casos o tecido ósseo quase sempre o melhor material biológico disponível para a identificação pelo DNA. Devido às baixas concentrações de DNA endógeno, a recuperação deste é um grande desafio perante aos danos ambientais, bacteriano e pós-morte que a molécula sofre, assim como a presença potencial de inibidores co-extraídos. Várias metodologias têm sido empregadas para obtenção de DNA a partir dos ossos, sendo que o uso do equipamento como o Moinho Criogênico e da coluna concentradora Microcon são os procedimentos-padrão mais utilizados e difundidos, porém, demorados e de custos elevados. Devido à baixa qualidade e à exiguidade destas amostras biológicas que rotineiramente aportam em um laboratório de DNA forense, a metodologia aplicada é baseada na análise de STR. Nos casos de identificação utilizando STR, o laboratório deve possuir uma base de dados de frequências alélicas própria da população a qual presta serviços. Esta base de dados deve ter sido produzida com as mesmas técnicas usadas pelo laboratório em sua rotina e com a mesma população. O objetivo é ampliar as condições técnico-científicas no cenário estadual, pois se pretende, através de técnicas utilizadas em Biologia Molecular, testar e padronizar um novo método econômico e rápido para a obtenção de DNA de ossos e a implementação de um banco de frequências alélicas STR para maior confiabilidade dos resultados gerados. Para nosso estudo, selecionou-se 19 ossos, fornecidos pelo IGP-SC e compreendem casos recebidos durante os anos de 2005 e de 2006. Comparou-se a eficiência e os custos de nove métodos de extração de DNA, mostrando que o método "substitutivo" é o que possui maior custo-benefício entre todos eles. A extração por este método conduziu a uma quantidade aumentada de DNA amplificado (36,84%) quando comparado ao protocolo de fenol-clorofórmio-microcon (12,28%), sendo esta diferença estatisticamente significativa (p=0,0240). Sendo assim, sugere-se que o procedimento "substitutivo" seja a escolha mais acertada quando o material biológico sejam ossos. Em relação à criação da base de dados STR, utilizou-se as frequências alélicas para os 15 marcadores STR incluídos no kit AmpFISTR Identifiler (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51, D5S818, e FGA). A amostra constitui-se de 452 indivíduos não relacionados do estado de Santa Catarina, representando uma população tri-híbrida, composta pela mistura de indivíduos euro-descendentes, africanos-subsaarianos e ameríndios. As distribuições dos genótipos estão em equilíbrio Hardy-Weinberg. As frequências alélicas foram comparadas às existentes em outros estados brasileiros, sendo encontradas diferenças significativas em pelo menos um loco em relação a todos os estados analisados. O poder de exclusão combinado é estimado em 0,99999682066 e o poder da discriminação combinado é de 0,99999999999999999828465. Finalmente, os parâmetros forenses calculados mostraram que o banco de dados de frequências alélicas de Santa Catarina é uma ferramenta útil para a identificação pessoal, justificando seu uso para a população de nosso estado.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T19:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 262881.pdf: 2759896 bytes, checksum: 6c601255ca8f91139751586839b36641 (MD5) / Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para detectar a expressão de mRNA de IL-2, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, visto que estes constituem uma das maiores classes de linfócitos e são importantes na regulação da resposta imune inata e adaptativa. Para isso foi utilizada a linhagem de células Jurkat, que são derivadas do tecido hematopoiético humano e produzem IL-2 após estimulação celular com lectinas. Para a realização da reação de RT-PCR, o RNA foi extraído das células Jurkat utilizando-se o reagente Trizol e posteriormente tratado com DNase para obter maior pureza do RNA . Para a padronização da reação de amplificação, foram testados diferentes tampões de reação e temperatura de ligação do iniciador. Os produtos de IL-2 foram confirmados por sequenciamento. Também foi padronizado o tempo e a concentração de Fitohemaglutinina (PHA) utilizada para estimular as células, que foi de 24 horas e 1 µg/ml, respectivamente. Além disso, a Ciclosporina A (CsA) foi selecionada como controle de inibição celular. Após padronização da RT-PCR, foram testados os galatos e os polissacarídeos de Agaricus blazei. Muitos estudos demonstraram que estes compostos possuem atividades farmacológicas, incluindo ações anticancerígenas, antibacteriana, antivirais, entre outras. A citotoxicidade (CC50) dos compostos utilizados foi determinada pelos ensaios colorimétricos MTT e/ou Vermelho Neutro. Dos 15 galatos testados, somente os galatos de propila, butila, octila, nonila, decila, undecila, dodecila e tetradecila, apresentaram atividade de estimulação celular e dos 15 polissacarídeos de Agaricus blazei, somente 3 mostraram-se positivos: polissacarídeo 3, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 1, polissacarídeo 4, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 2 e o polissacarídeo 7, extraído do micélio em grãos de trigo e separado por membrana de microfiltração. Paralelamente, foi realizada a imunofenotipagem das células Jurkat e feita à avaliação da estimulação celular por citometria de fluxo. Dentre os marcadores celulares testados (CD25/CD3) a frequência de células positivas para CD25 foi a que melhor refletia a ativação das células Jurkat, porém com menor sensibilidade do que a RT-PCR. Neste estudo, portanto, ficou evidenciada a utilidade de uma técnica in vitro para triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, o que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem utilização de animais de laboratório.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T08:15:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 286371.pdf: 1947104 bytes, checksum: 68df212a986afad58f62e633e601bcc8 (MD5) / Patógenos virais humanos têm sido associados a muitos episódios de gastrenterites, bem como a doenças relacionadas ao consumo de moluscos contaminados. O risco pode ser reduzido por um tratamento destes moluscos visando sua auto-limpeza previamente a sua comercialização. A depuração de moluscos reduz os níveis de microrganismos presentes na carne, diminuindo a chance de uma potencial infecção associada ao seu consumo in natura. Em um sistema de depuração, a água do mar pode ser recirculada pelo menos por 24 horas e, durante este ciclo, a água é tratada química ou fisicamente para eliminar a contaminação por microrganismos. Neste trabalho, um sistema fechado de depuração de moluscos foi testado para eliminar os patógenos virais em ostras. Além disso, a capacidade do cloro livre em inativar esses vírus, bem como a estabilidade viral em água do mar, com e sem radiação U.V. foram investigadas. Para os ensaios de depuração, ostras (Crassostrea gigas) foram artificialmente contaminadas em aquários, contendo água do mar semeada com Vírus da Hepatite A (HAV) e Adenovírus Humano (HAdV5). Em seguida, as ostras foram colocadas no tanque de depuração, e foram analisadas após 48h, 72h e 96h. Em cada amostragem, o trato gastrointestinal das ostras foi homogeneizado e processado visando a eluição das partículas virais. Para os estudos de desinfecção pelo uso do cloro, água do mar natural e artificial foram semeadas com Norovírus Murino 1 (MNV-1), HAdV2 e Poliomavírus JC (JCPyV) e tratadas com uma concentração inicial de cloro livre de 2,5 mg/l, por 60min. Para os ensaios de estabilidade viral em água do mar e desinfecção viral por luz U.V., 300L de água do mar foram semeadas com o HAV, MNV-1 e HAdV2 e tratados com U.V. (36W), em um mini-tanque de depuração, com recirculação por 120h. Um litro de água do mar foi coletado a cada 24h em até 120h e as amostras de água foram tratadas pelo método de floculação com leite acidificado para adsorção e concentração das partículas virais. O monitoramento viral nos tecidos das ostras e água do mar foi avaliado por métodos moleculares (PCR e q(RT)-PCR), e por métodos de cultura celular associados a métodos moleculares ou imunológicos (ICC-PCR, RT-PCR ICC, IFA, Citometria de Fluxo e Ensaio de Placas de Lise). A detecção por PCR, em amostras de ostras, mostrou que o genoma de HAdV5 foi detectado em todos os períodos de amostragem, e o genoma do HAV foi detectado até 72 h. Os testes envolvendo viabilidade viral por ICC-PCR, demonstraram uma inativação viral progressiva, nas ostras, ao longo das 96h de recirculação de água do mar tratada com luz U.V. Nos ensaios de desinfecção por cloro, após 30 minutos de tratamento de água do mar, foi observada uma redução de ~2log10 e ~3log10 para MNV-1 e HAdV2, respectivamente, com base nos resultados q(RT) PCR. Quando a infecciosidade viral foi analisada, uma redução de mais de 4log10 foi observada para MNV-1, enquanto HAdV2 apresentou uma redução de ~ 2.3log10, mantendo-se infeccioso após 60 minutos. JCPyV apresentou em média uma redução de 1,6 log10, quando avaliado por qPCR. Não houve diferenças na cinética de desinfecção viral observadas em água do mar natural e artificial. Para os ensaios de estabilidade viral em água do mar tratada ou não com luz U.V., com base nos resultados q(RT)-PCR, foram observadas cinéticas diferentes para cada vírus em 120 horas de contato. Reduções de ~ 5log10 e 3log10, em 120h, para HAdV2 e HAV, respectivamente; para MNV-1, foi observada uma redução de ~4,5 log10 em 72h sob tratamento com luz U.V. Apesar da detecção do genoma, HAdV2 foi capaz de permanecer infeccioso até 72h, de acordo com resultados de ICC-RT-PCR. Ensaios envolvendo estabilidade viral sem radiação U.V. demonstraram uma redução progressiva da carga viral ao longo das 120h de recirculação de água do mar para os três vírus (~ 2log10 para HAdV2; ~ 2,5 log10 para HAV e ~ 3log10 para MNV-1). Esta cinética diferente provavelmente está associada às espécies de cloro presentes, ao tempo de contato com a radiação U.V. e a características estruturais peculiares de cada um dos vírus. A diminuição natural da carga viral pode ser devido à existência de fatores ambientais, tais como força iônica e compostos encontrados naturalmente na água do mar. Este trabalho confirmou que HAdV é um patógeno viral particularmente resistente e exige mais tempo para inativação. Estes dados serão úteis para a otimização de desinfecção da água nos tanques de depuração de moluscos. / Viruses have been linked to nearly all episodes of gastroenteritis as well as outbreaks of illnesses related to consumption of contaminated shellfish. The risk may be reduced by appropriate treatment following harvesting as well as by depuration, which is a method that reduces the levels of microorganisms present in mollusk meat, decreasing the potential for infections associated with mollusk consumption in natura. In a depuration system, seawater may be recirculated for at least 24h, and during this cycle, the water must be chemically or physically treated to eliminate microbial contamination. In this work, a shellfish depuration closed system was tested to eliminate viral pathogens from oysters. Moreover, the chlorine capability to inactivate these viruses, as well as the viral stability and disinfection in seawater with and without U.V. irradiation were investigated. For depuration assays, oysters (Crassostrea gigas) were first artificially contaminated in aquariums containing seawater seeded with Hepatitis A virus (HAV) and Human Adenovirus (HAdV5). Then, the oysters were placed into the depuration tank, and were harvested after 48h, 72h and 96h. After each sampling, the gastrointestinal tracts were homogenized and the viral particles were eluted. To chorine disinfection assays, natural and artificial seawater were seeded with selected viruses (Murine Norovirus 1, MNV-1; HAdV2; JC Polyomavirus, JCPyV) and treated by adding initial free chlorine concentration of 2.5mg/l for up to 60min. For the stability assays, 300L of natural seawater were seeded with HAV, MNV-1 and HAdV2, and treated by 36W U.V. lamp, into the mini depuration tank, with recirculation, for up to 120h. One liter of viral seeded seawater was harvested every 24h and viral particles were concentrated by flocculation method using skimmed milk. The kinetics of viral decay in oysters and seawater was evaluated by molecular techniques (PCR and q(RT)-PCR), and by cell culture associated with molecular and immunological methods to access the viral infectivity (ICC-PCR, ICC RT-PCR, IFA, Flow Cytometry and Plaque Assay). The molecular detection by PCR for both viruses showed that the presence of HAdV5 genome was positive in all of the sampling periods, and the HAV genome was detected until 72 h. The tests involving viral viability by ICC-PCR, demonstrated a progressive viral inactivation along the 96h of seawater recirculation under U.V. light irradiation. After 30 minutes of treatment of natural seawater a ~2log10 and ~3log10 reduction where observed for MNV-1 and HAdV2, respectively, based on q(RT)PCR results. When viral infectivity was analyzed, a reduction of more than 4log10 was observed for infectious MNV-1, while HAdV2 presented ~2.3log10 reduction, remaining infective viruses present after 60 minutes. JCPyV presented a average reduction of 1,6 log10, analysed by qPCR. No differences in the disinfection kinetics have been observed between natural and artificial seawater. Based on qPCR results, the kinetics observed were different for each virus, reaching, at 120h of contact time, ~5log10 and ~3log10 reduction for HAdV2 and HAV, respectively; for MNV-1, was observed a ~4,5log10 reduction at 72h under U.V. treatment. Despite the genome detection, HAdV2 was able to remain infectious only up to 72h, according ICC-RT-PCR results. Assays involving viral stability without U.V. irradiation, demonstrated a progressive reduction of viral load along the 120h of seawater recirculation for three viruses (~2log10 for HAdV2; ~2,5log10 for HAV and ~3log10 for MNV). This different kinetics is probably associated to the chlorine species present, the contact time with the U.V. radiation and structural characteristic of each virus. The natural decreasing of viral load can be due to the existence of environmental factors, such as ionic strength and compounds naturally found in seawater. This work confirmed that HAdV is a particularly a resistant viral pathogen and requires longer periods for inactivation. These data will be subsequently useful to plan water disinfection in shellfish depuration tanks.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T09:16:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 286647.pdf: 2822556 bytes, checksum: efcdfec4981831ef957fb764c96e7d5d (MD5) / Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para a detecção da expressão do mRNA dos marcadores TNF-?, IL-10 e iNOS, importantes no contexto de ativação de macrófagos, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre macrófagos, visto que estes constituem uma das principais populações de células do sistema imune. Para isso foi selecionada a linhagem murina RAW 264.7, cultivada in vitro e que responde a estímulos como o LPS. Para a realização da RT-PCR, o RNA foi extraído das células utilizando o reagente Trizol e posteriormente feito reação de transcrição reversa com 1 µg de RNA total, em condições padronizadas. Na etapa de amplificação do cDNA, foram testadas a melhor temperatura de anelamento para cada marcador, concentração dos iniciadores específicos e diluição do cDNA. Determinou-se que o melhor tempo necessário para visualizar os produtos de amplificação era de 6 horas para os ensaios de ativação e foram estabelecidas as concentrações de LPS capazes de estimular as células em cultura, quando avaliadas pela RT-PCR e dosagem de óxido nítrico. Verificou-se que a adição prévia de polimixina B (50 µg/ml) nas amostras é eficiente na inativação de endotoxinas contaminantes. Estabeleceu-se um protocolo para testar a potencial atividade antiinflamatória de compostos químicos, pela adição da substância a ser testada 6 horas após a ativação prévia com LPS, incubação por 18 horas e observação da inibição da expressão dos marcadores. Determinou-se em seguida, a atividade de 15 formulações de polissacarídeos de Agaricus blazei, sendo que todos os extratos mostraram atividade, pela RT-PCR, para a concentração de 10 µg/ml para a citocina TNF-? e nas frações 2, 3, 11 e 12 para a enzima iNOS; enquanto que a dosagem de óxido nítrico realizada em paralelo mostrou-se menos sensível. Também avaliou-se a atividade de 9 galatos sintéticos, e concluiu-se que nenhuma das amostras testadas demonstrava atividade ativadora de macrófagos. Ficou evidenciado neste estudo, portanto, a utilidade de uma técnica in vitro para a triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre macrófagos, que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem a utilização de animais de laboratório. / In this study an RT-PCR to detect mRNA expression of the markers TNF-?, IL-10 and iNOS, relevant in the macrophage activation context, was standardized in order to in vitro screening of natural or synthetic compounds with potential immunomodulatory activity in macrophages, whereas they constitute a major population of immune systems cells. For this, was selected the murine strain RAW 264.7 cultured in vitro, and that responds to stimuli such as LPS. To perform RT-PCR, RNA was extracted from cells using Trizol reagent and subsequently made a reverse transcription reaction with 1 µg of total RNA under standard conditions. In amplification of cDNA step, were tested the best annealing temperature for each marker, the concentration of specific primers and dilution of cDNA. It was determined that the best time to view the amplification products was 6 hours for the testing of activation, and states the concentrations of LPS the cells were responsive to our model of RT-PCR and measurement of nitric oxide. It was found that the previous addition of polymyxin B (50 µg / ml) in samples is efficient in the inactivation of endotoxin contaminants. Was established a protocol to test the potential anti-inflammatory activity of chemical compounds, by adding the substance to be tested after 6 hours prior to activation with LPS, incubated for 18 hours and observing the inhibition of expression of markers. Was determined activity of 15 polysaccharides of Agaricus blazei where all the extracts showed activity in the RT-PCR for the concentration of 10 µg / ml for TNF-? cytokine and for the fractions 2, 3, 11 and 12 for the iNOS enzyme; but not in the dosage of nitric oxide. We also determined the activity of 9 gallates synthetic, and concluded that none of gallates tested showed activity in activating macrophages. Was evidenced in this study, therefore, the usefulness of an in vitro technique for screening of substances with potential immunomodulatory activity on macrophages, which paves the analysis of many of these substances without the use of laboratory animals.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T10:20:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276167.pdf: 8668613 bytes, checksum: 3bae411187920f0e4eadbc2a39057abb (MD5) / Na medicina popular brasileira, a casca de banana tem um histórico de uso na cura de lesões por queimadura. Compostos antioxidantes têm sido isolados de diferentes fontes naturais e possuem um papel importante na prevenção e cura de doenças, como o câncer por exemplo. O objetivo deste estudo foi avaliar os extratos provenientes da casca de banana (Musa spp.) (EBAQ: extrato bruto aquoso; EBHE: extrato bruto hidroetanólico; ESC: extrato derivado de extração supercrítica) no processo de cicatrização de lesões, considerando seu potencial antioxidante, e quanto a sua atividade antitumoral in vitro e in vivo. Para avaliar o potencial cicatrizante dos extratos, camundongos isogênicos Balb/C (peso 20 ± 2g, n = 6) foram submetidos ao modelo de excisão e foram divididos em grupo controle negativo (CN), que receberam topicamente água durante 3, 6, 9, 12 e 15 dias, grupo controle positivo (CP), que receberam topicamente solução de alantoína (50 mg/kg/dia) durante 3, 6, 9, 12 e 15 dias e grupos tratados topicamente com os EBAQ e EBHE (50 mg/kg/dia), conforme os grupos controle. O potencial cicatrizante e as defesas antioxidantes foram avaliados. Os resultados foram estatisticamente significativos quando comparados com os grupos CN e CP. Os tratamentos com EBAQ e EBHE foram capazes de diminuir o período de epitelização e a cicatrização das lesões se deu em 9 dias, aumentar o teor de hidroxiprolina, diminuir a peroxidação lipídica e o conteúdo de proteína carbonilada nos tecidos cicatriciais, aumentar o teor de glutationa reduzida tendendo ao nível básal, diminuir as atividades das enzimas catalase, glutationa peroxidase e glutationa S-transferase e diminuir a atividade da superóxido dismutase demonstrando uma tendência ao nível basal. O estudo histológico da lesão foi realizado com o emprego do EBAQ para o tratamento das lesões, o qual foi o mais eficaz na análise de atividade cicatrizante, quando comparado ao tratamento com EBHE. Os resultados do estudo histológico da lesão confirmaram o potencial cicatrizante do EBAQ, uma vez que mostraram proliferação de fibroblastos e indução do processo de reepitelização. EBAQ, EBHE e ESC foram analisados em relação a atividade antitumoral in vitro. Apenas o EBAQ apresentou citotoxicidade in vitro contra as células d tumor ascítico de Ehrlich (TAE), com CI50 correspondente a 152,83 mg/mL. O EBHE não apresentou atividade no ensaio de citotoxicidade in vitro e não foi analisado no modelo in vivo para avaliar a atividade antitumoral. O ESC também não apresentou atividade no ensaio de citotoxicidade in vitro contra as células do TAE. Porém, apresentou elevada toxicidade quando aplicado no modelo de excisão em camundongo para avaliação do potencial cicatrizante. Por isso, foi aplicado aos ensaios de atividade antitumoral in vivo. Avaliações morfológicas em camundongos isogênicos Balb/C portadores de TAE (peso de 20 ± 2g, n = 6) mostraram que os animais tratados com o EBAQ e o ESC apresentaram diminuição significativa do peso corporal (~ 67 % e ~ 79 %, respectivamente) e no crescimento do TAE (~ 57 % e ~ 49 %, respectivamente), quando comparados ao grupo CN. EBAQ e ESC foram capazes de aumentar o número de células inviáveis (4 vezes e 2 vezes, respectivamente) e a porcentagem média de sobrevivência dos animais (~ 23 % e ~ 22 %, respectivamente), quando comparados ao grupo CN. Esses achados indicam que os EBQA e EBHE têm potencial cicatrizante que pode estar associado às suas propriedades antioxidantes. Além disso, os resultados dos testes de citotoxicidade in vitro e de atividade antitumoral in vivo são importantes indícios de uma possível aplicação de extratos da casca de Musa spp. casca (EBAQ e ESC) no tratamento do câncer. / In Brazilian popular medicine banana peel has a history of utility in burn healing. Antioxidant compounds have been isolated from different natural sources and play an important role in disease prevention and cure, such as cancer. The aim of this study was to evaluate Musa spp. peel extracts (ACE: aquous crude extract; HCE: hydroethanol crude extract; SCE: supercritical extract) in wound healing process, considering its antioxidant potential, and its antitumoral activity in vitro and in vivo. To evaluate wound healing potential, Balb/C mice (weight 20±2g, n=6) were cutaneous by injured and were divided in negative control group (NC), which received topically water during 3, 6 ,9, 12 and 15 days, positive control group (PC), which received topically allantoin solution (50 mg/kg/day) during 3, 6 ,9, 12 and 15 days, and treated groups which, received topically ACE and HCE (50 mg/kg/day), as in the control groups. Results were statistically significant when compared with NC and PC groups. ACE and HCE treatments were able to decrease the epithelization period and healing the lesions in 9 days, to increase the hydroxyproline content, to decrease lipid peroxidation and carbonyl protein contents in healing tissues, to increase reduced gluthatione content with a basal level tendency, to decrease catalase activity, decrease superoxide dismutase activity showing a tendency to basal level and to decrease gluthatione peroxidase and gluthatione S-transferase activities during all treatment period. Lesion histological study was performed with ACE treatment which was the most effective in wound healing evaluation when compared to HCE treatment. The results of lesion histological study confirmed the ACE healing potencial, since it showed fibroblast proliferation and induction of reepithelialization process. ACE, HCE and SCE were analyzed in respect to in vitro antitumoral activity. Only ACE showed in vitro cytotoxicity to Ehrlich ascites tumor (EAT) with IC50 corresponding to 152.83 mg/mL. HCE did not show in vitro cytotoxicity to EAT and it was not applied to the in vivo model to evaluate antitumoral activity. SCE did not show in vitro cytotoxicity to EAT, however, it showed high toxicity when applied in wound healing model. Because of this, SCE was applied to in vivo antitumoral assays. Morphological evaluations in EAT-bearing Balb/C mice (weight 20±2g, n=6) showed that animals treated with ACE and SCE presented significant reduction in the body weight (~ 67 % and ~ 79 %, respectively), and in EAT growth (~57 % and 49 %, respectively) when compared to the NC group. ACE and SCE were able to increase the inviable cell number (~ 4 times and ~ 2 times, respectively), the average percentage of survival of animals (~ 23 % and ~22 %, respectively) when compared to the NC group. These findings indicate that ACE andf HCE have a wound healing potential that may be associated to their antioxidant activity. They also indicate that in vitro cytotoxicity and in vivo antitumoral activity are important indications of a possible application of extracts of Musa spp. peel (ACE and SCE) in cancer treatment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Jurídicas, Programa de Pós-Graduação em Direito, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T19:30:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294694.pdf: 1402487 bytes, checksum: f69c9fd8d97439a3f8766d4805423b0c (MD5) / Tendo como foco as tensões comerciais da aplicação do princípio da precaução, o presente trabalho investigou se um mecanismo de responsabilidade e compensação no âmbito do Protocolo de Cartagena pode contribuir para conciliar comércio e meio ambiente e reforçar vínculos de confiança para com os organismos geneticamente modificados. O método utilizado foi o dedutivo e o procedimento bibliográfico e documental. Os resultados foram que mecanismos de responsabilidade e compensação foram pensados para promover a internalização dos riscos, dissuadir os agentes econômicos e reforçar os vínculos de confiança com novas tecnologias, evitando posturas extremas e contribuindo para maximizar benefícios e diminuir riscos. Porém, a biotecnologia moderna, considerando as suas peculiaridades e a sua inserção no contexto de modernidade reflexiva, demanda um mecanismo de responsabilidade capaz de acomodar essas especificidades. O Protocolo Suplementar de Nagoya-Kuala Lumpur, que estabelece um mecanismo de responsabilidade e compensação no âmbito do Protocolo de Cartagena, não satisfaz plenamente as exigências de regras internacionais claras e precisas, em virtude do nível de controvérsia científica e política que o tema gera. Além disso, o referido Protocolo Suplementar reenvia várias questões cruciais, que demandavam padrões internacionais, às legislações domésticas. Desse modo, o Protocolo Suplementar de Nagoya-Kuala Lumpur sinaliza um mínimo consenso na comunidade internacional, mas terá um alcance limitado em desencorajar medidas extremas de precaução, reforçar vínculos de confiança e facilitar o comércio internacional. / Focusing on trade tensions around the precautionary principle, this study investigated whether a mechanism of liability and redress under the artagena Protocol can help reconcile trade and environment, and strengthen confidence towards genetically modified organisms. The method was deductive, and the procedure was bibliographic and documentary. The results showed that liability and compensation mechanisms were thought to promote the internalisation of risk, deter economic agents and strengthen the bonds of trust with new technologies, avoiding extreme positions and helping to maximize benefits and mitigate risk. However, modern biotechnology, considering their peculiarities and its inclusion in the context of reflexive modernity, demand a liability mechanism able to accommodate these specificities. The Nagoya- Kuala Lumpur Supplementary Protocol, which establishes a mechanism for liability and compensation under the Cartagena Protocol, does not fully satisfy the requirements of clear and precise international rules because of the level of political and scientific controversies that the issue generates. In addition, the Supplementary Protocol sends several crucial issues, which required international standards, to domestic legislation. Thus, the Nagoya-Kuala Lumpur Supplementary Protocol signals a minimum consensus on international community, but it will have a limited effect in discouraging extreme measures of precaution, to strengthen bonds of trust and facilitate international trade.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T21:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294464.pdf: 1881404 bytes, checksum: 8a3fdfdae373243bd664de40046a7ecb (MD5) / Cedrela fissilis Velloso (Meliaceae) é uma árvore nativa da Floresta Atlântica (Sul do Brasil) de grande interesse econômico devido à sua madeira de qualidade e seu crescimento rápido, ideal para programas de reflorestamento e arborização de espaços urbanos. Assim como as demais espécies da Família Meliaceae, seu metabolismo secundário é caracterizado pela produção de terpenos, que tem despertado grande interesse industrial e medicinal pelas suas atividades inseticida, anti-tumoral, antibiótica, anti-viral, anti-fúngica e anti-malárica. No entanto, as áreas de Floresta Atlântica têm sido suprimidas pela expansão das cidades e da agropecuária no Brasil, colocando em risco toda a biodiversidade deste ecossistema e tornando inviável a exploração sustentável de seus recursos. A cultura vegetal in vitro, através de técnicas de cultura de calos e suspensões celulares, é uma alternativa viável que permite a produção de compostos vegetais de interesse econômico sem que haja a necessidade da exploração dos recursos vegetais in loco, permitindo a conservação das florestas. Assim, este trabalho teve como objetivos estudar o efeito de diferentes condições de cultivo sobre o crescimento, o perfil metabólico e a histologia de calos de C. fissilis. O regulador de crescimento 2,4-D promoveu o crescimento de calos a partir de segmentos nodais cotiledonares e de hipocótilo com uma frequência entre 53,8 # 97,1%, porém demonstrou ser tóxico para segmentos foliares e cotiledonares. Os meios de cultura contendo glucose ou frutose promoveram melhor indução de calos do que os meios de cultura suplementado com sacarose. Calos crescidos na presença de glucose ou frutose formaram maior massa fresca e possuíam elevados teores de água. No entanto, calos crescidos em meio de cultura contendo sacarose formaram maior quantidade de massa seca. Diferentes combinações de BAP e ANA foram testadas e todas apresentaram elevados índices de crescimento de calos na presença de glucose ou frutose no meio de cultura. No meio de cultura contendo sacarose, a calogênese variou entre 48,3 # 86,7%, sendo que a combinação de 5 µM de BAP com 2,5 µM de ANA apresentou a maior taxa de calogênese. Foi observado que a posição do explante interfere na calogênese, e os segmentos nodais cotiledonares inoculados na posição vertical apresentaram maior frequência de calogênese (86,7%) do que os explantes inoculados na posição horizontal (63,3%). Segmentos nodais cotiledonares, segmentos apicais e segmentos de hipocótilo formaram calos em maior frequência e com maior massa fresca e seca. Segmentos de raízes formaram calos com menor massa seca, e segmentos foliares e cotiledonares formaram elevadas taxas de calos com raízes e com menor massa seca. O cultivo dos calos no escuro aumentou a frequência de calogênese em todos os tipos de explantes, mas provocou uma redução de massa seca. O aumento da concentração de glucose, frutose e sacarose no meio de cultura e do período de cultivo dos calos resultaram em maiores quantidades de massa fresca e seca. A adição de glutamina ao meio de cultura teve efeito inibitório sobre a indução e o crescimento dos calos. Sete formulações salinas de meio de cultura foram testadas, mas apenas no meio de cultura MS foi observava a calogênese. As curvas de dissimilação demonstraram que o crescimento dos calos na presença de frutose ocorre de maneira mais rápida e atinge o estágio estacionário antes dos calos crescidos em meio de cultura contendo glucose ou sacarose, e que a adição de glutamina ao meio de cultura, indiferentemente do açúcar utilizado, aumenta a fase lag e reduz o crescimento dos calos. A análise de varredura em UV-vis apontou a presença de compostos fenólicos, clorofilas e carotenóides nos calos e permitiu comparar a ocorrência destes metabólitos entre diferentes tratamentos. A dosagem de metabólitos secundários demonstrou que os calos crescidos em meio de cultura contendo frutose possuíam o maior teor de clorofila (116 µg/g MF), e que os calos crescidos em meio de cultura contendo sacarose e glutamina possuíam o maior conteúdo de compostos fenólicos totais (17,9 µg/g MS) e de flavonóides (2,89 µg/g). A espectroscopia por FTIR permitiu comparar o perfil metabólico primário e secundário de calos crescidos em diferentes condições de cultivo, evidenciando diferenças quali-quantitativas a nível molecular que podem ajudar a caracterizar os diferentes tratamentos avaliados. Na análise histoquímica de diferentes morfologias de calos foi possível observar que as células possuem grandes vacúolos e que ocorre a formação de arranjos concêntricos de células que caracterizam o início da formação de órgãos. A coloração com PAS reagiu com os carboidratos neutros da parede celular e com os grânulos de amido no citoplasma das células, presentes em grande quantidade nos calos com morfologia nodular. A coloração de AT-O teve apenas uma leve reação metacromática na parede celular das células, indicando pouca ocorrência de açúcares ácidos. A coloração de CBB tingiu de maneira uniforme o citoplasma das células devido à presença de proteínas livres e em organelas e destacou a presença de alguns grânulos protéicos. A calogênese é influenciada pela composição do meio de cultura, condições ambientais de cultivo e por fatores endógenos, como o balanço hormonal de cada tecido e o genótipo da planta doadora dos explantes. As curvas de dissimilação, a análise de metabólitos primários e secundários através de espectroscopia de UV-vis e FTIR e o conhecimento da organização celular através da histoquímica fornecem suporte para a otimização das culturas de calos e para a identificação e seleção de culturas com potencial para a produção de compostos de interesse. / Cedrela fissilis Velloso (Meliaceae) is a fast growing timber tree from Atlantic Forest (South Brazil) which has great economic value due to its high quality wood and its uses in reforestation programs and landscaping of urban areas. As other Meliaceae species, its secondary metabolism is characterized by the production of terpenes of industrial and medicinal interests for its insecticidal, anti-tumor, antibiotic, anti-viral, anti-fungal e anti-malarial activities. However, Atlantic Forest areas have been suppressed by urban and agriculture expansion, which endangers the biodiversity of this ecosystem and make unfeasible the sustainable exploitation of natural resources. In vitro plant tissue cultures, through the use of callus and cell suspension cultures, is a practicable alternative that allows the production of plant compounds of economic interest without the need of plant resources in loco, allowing forests conservation. This work aimed the study the effects of different culture conditions on growth, metabolic profile and histology of C. fissilis callus cultures. The plant growth regulator 2,4-D promoted callus growth from cotyledonary nodal segments and hypocotil segments with a frequency between 53,8 # 97,1%, but showed to be toxic to cotyledon and leaf segments. Culture media containing glucose or fructose promoted higher callus formation than culture medium containing sucrose. Callus growth in the presence of glucose or fructose formed superior fresh weight and had higher water content. In the other hand, callus growth on culture media containing sucrose formed higher dry matter. Different combinations of BAP and ANA were tested and all of them promoted callus growth in culture media containing glucose or fructose. In the presence of sucrose, callus formation ranged between 48,3 # 86,7%, and the combination of BAP 5 ìM with ANA 2,5 ìM induced the best calogenesis frequency. The explant position interfered on callus formation, and the cotyledonary nodal segments inoculated in the vertical position promoted higher callus induction (86,7%) than those inoculated in the horizontal position (63,3%) but no differences on callus growth were observed. Cotyledonary nodal segments, apical segments and hypocotil segments formed callus in a higher frequency and with major fresh and dry matter. Callus from root segments formed less dry matter, and cotyledon and leaf segments formed callus and roots. The increase of sugar concentration in the culture medium and of the culture period promoted the increase in fresh and dry matter. The addition of glutamine to the culture media inhibited callus induction and growth. Seven culture media formulas were tested, but callus formation occurred only in the MS culture medium. Dissimilation curves showed that callus growth is faster in culture medium containing fructose, but cultures reach stationary period earlier. The addition of glutamine to the culture media increased the lag phase and reduced callus growth. The UV-vis screen showed the presence of phenolic compounds, chlorophyll and carotenoids in callus cells and allowed the comparison of these metabolites between calluses from different treatments. The secondary metabolites quantification showed that callus grown in the presence of fructose had the higher chlorophyll content (116 ìg/g FM), whilst callus growth in the presence of sucrose and glutamine had higher phenolic compounds (17,9 ìg/g DM) and flavonoids content (2,89 ìg/g). FTIR spectroscopy allowed the comparison between primary and secondary metabolic profile of calluses grown under different culture conditions and showed qualitative and quantitative differences. The histochemical analysis of different callus morphologies showed cells containing large vacuoles and concentrically cells arrangements that characterizes first stages of organ formation. PAS staining has reacted with neutral carbohydrates of cell walls and starch grains in cells cytoplasm, which were numerous in nodular callus morphology. TB-O staining had a weak metachromatic reaction with cell walls, indicating that acid carbohydrates occurs in low quantity in callus cells. CBB staining reacted with cytoplasm proteins and organelles and with few protein grains. Callus inductions and growth are determined by culture medium composition, environmental conditions and endogenous factors, such as hormonal balance and genotype. Dissimilation curves, primary and secondary metabolites analysis through UV-vis and FTIR spectroscopy, and the study of callus cell organization by histochemistry provided the background for further studies on callus culture optimization and for identification and selection of cultures with potential to produce compounds of economic interest.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T23:23:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 297043.pdf: 1842359 bytes, checksum: 1d48884fc3dac8252b93652ea00a8693 (MD5) / Litopenaeus vannamei e a especie de camarao marinho mais cultivado no mundo e no Brasil. Essa especie e considerada bastante resistente a variacoes ambientais adversas. Entretanto, parece ser bastante susceptivel a patogenos de origem viral. Com o objetivo de estudar os efeitos de estressores ambientais e sua susceptibilidade a patogenos virais, camaroes L. vannamei foram submetidos a condicao hiposmotica do meio e desafiados com o virus da mancha branca. Um total de quarenta e seis genes foi identificado pela tecnica de hibridizacao subtrativa supressiva como diferencialmente transcritos em branquias de L. vannamei submetidos ao estresse osmotico. Os transcritos identificados codificam proteinas envolvidas com processos de defesa, sinalizacao celular, transferencia de eletrons, proliferacao e diferenciacao celular, apoptose, metabolismo intermediario, proteinas de citoesqueleto e atividade metallopeptidase. A partir do perfil transcricional obtido, alguns genes foram avaliados por PCR quantitativo em camaroes submetidos ao estresse osmotico e ao patogeno viral. Foi observada uma inducao significativa dos genes da proteina nuclear 1 induzida por TGF-beta, proteina QM, ciclofilina, lectina-C, malato desidrogenase e duas ATPs sintase mitocondriais nos camaroes submetidos ao estresse osmotico. Um segundo estressor ambiental avaliado no camarao foi a hepatotoxina microcistina (MC). Essa toxina e sintetizada por cianobacterias e liberada no ambiente. Frequentemente e detectada em ambientes eutrofizados e em areas de cultivo de camarao. A conjugacao com glutationa reduzida (GSH) pela glutationa S-transferase (GST) e enzimas de defesa antioxidante, como a catalase (CAT), sao importantes mecanismos de defesa contra a toxicidade bioquimica de MCs. Foi investigada a atividade das enzimas CAT e GST e os niveis de transcricao genica de CAT e oito isoformas GST no hepatopancreas do camarao apos 48h de uma injecao intramuscular com 100 Êg kg-1 de extrato toxico de Microcystis aeruginosa. MC foi capaz de induzir significativamente tres isoformas de GST (Ö, m e MAPEG) em 12, 2,8 e 1,8 vezes, respectivamente, e aumentou a atividade enzimatica total da GST e CAT. A partir dos resultados obtidos, podemos sugerir que o estresse osmotico em L. vannamei parece alterar principalmente genes envolvidos em mecanismos de defesa e de energia celular, e a MC altera a transcricao e expressao de GSTs e CAT que parecem estar envolvidas na biotransformacao e eliminacao da toxina e em processos de protecao celular. Esses estudos reforcam a importancia de caracterizar ainda mais o perfil transcricional e as regulacoes postranscricionais em L. vannamei exposto a estressores ambientais e a patogenos infecciosos para uma melhor compreensao dos principais mecanismos envolvidos nas defesas do camarao.