Resumo: Não disponível / Abstract: Not available / Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Christina Ramires Ferreira / Banca: César Roberto Esper / Banca: Felipe Perecin / Banca: Karina Belotti Avelino / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Doutor

Resumo: Foram investigados os efeitos da irradiação com diodos lasers operando em 780 nm (infravermelho) e 660 nm (visível) na maturação, fertilização e cultivo in vitro de embriões bovinos. Verificou-se que a irradiação de oócitos com ambos os lasers, durante 30, 60, 120 e 180 segundos (L30, L60, L120, L180) não afetou (p>0,05) as taxas de maturação nuclear (Infravermelho: L30 - 88,92% vs. C30 - 81,84%; L60 - 83,56% vs. C60 - 87,40%; L120 - 76,06% vs. C120 - 85,30%; L180 - 77,42% vs. C180 - 80,16%; e Visível: L30 - 65,81% vs. C30 - 71,59%; L60 - 62,75% vs. C60 - 69,62%; L120 - 70,38% vs. C120 - 64,04%; L180 - 56,72% vs. C180 - 67,41%), e de maturação citoplasmática, avaliada por meio da distribuição dos grânulos corticais (Infravermelho: L30 - 86,18% vs. C30 - 61,04%; L60 - 66,03% vs. C60 - 56,16%; L120 - 53,75% vs. C120 - 79,81%; L180 - 57,70% vs. C180 - 82,04% e Visível: L30 - 81,08% vs. C30 - 74,42%; L60 - 68,11% vs. C60 - 61,63%; L120 - 75,95% vs. C120 - 48,33%; L180 - 77,77% vs. C180 - 59,52%). As porcentagens de produção embrionária ao sétimo dia de cultivo in vitro não foram alteradas (p>0,05) após a irradiação de oócitos com laser infravermelho (L30 - 29,20% vs. C30 - 42,60%; L60 - 32,0% vs. C60 - 31,0%; L120 - 38,0% vs. C120 - 35,0%; L180 - 37,0% vs. C180 - 32,0%), mas foram reduzidas após a irradiação com laser visível durante 180 seg. (L180 - 36,0% vs. C180 - 56,0 %). A irradiação em espermatozóides com ambos os lasers não afetou (p>0,05) as taxas de clivagem ao terceiro dia de cultivo in vitro (Infravermelho: L30 - 90,0% vs. C30 - 95,83%; L60 - 85,56% vs. C60 - 98,33%; L120 - 90,83% vs. C120 - 90,83%; L180 - 89,72% vs. C180 - 97,50%; e Visível: L30 - 82,96% vs. C30 - 85,61%; L60 - 82,10% vs. C60 - 82,53%; L120 - 80,48% vs. C120 - 82,44%; ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The diodo lasers irradiation effects, operating in 780nm (infrared light) and 660 nm (visible light), were evaluated on in vitro maturation, fertilization and culture rates of bovine embryos. Both infrared and visible laser irradiation on oocytes, during 30, 60, 120 and 180 seconds (30, 60, 120, 180) did not change (p>0,05) the rates of nuclear maturation (Infrared: L30 - 88.92% vs. C30 - 81.84%; L60 - 83.56% vs. C60 - 87.40%; L120 - 76.06% vs. C120 - 85.30%; L180 - 77.42% vs. C180 - 80.16%; and Visible: L30 - 65.81% vs. C30 - 71.59%; L60 - 62.75% vs. C60 - 69.62%; L120 - 70.38% vs. C120 - 64.04%; L180 - 56.72% vs. C180 - 67.41%), and the cytoplasmic cortical granule distribution (Infrared: L30 - 86.18% vs. C30 - 61.04%; L60 - 66.03% vs. C60 - 56.16%; L120 - 53.75% vs. C120 - 79.81%; L180 - 57.70% vs. C180 - 82.04% and Visible: L30 - 81.08% vs. C30 - 74.42%; L60 - 68.11% vs. C60 - 61.63%; L120 - 75.95% vs. C120 - 48.33%; L180 - 77.77% vs. C180 - 59.52%). The in vitro embryo production rates measured on seventh day of culture were not changed (p.0,05) after the infrared laser irradiation (L30 - 29.20% vs. C30 - 42.60%; L60 - 32.0% vs. C60 - 31.0%; L120 - 38.0% vs. C120 - 35.0%; L180 - 37.0% vs. C180 - 32.0%), but they were reduced (p<0,05) after the visible laser irradiation during 180 seconds (L180 - 36.0% vs. C180 - 56.0 %). When spermatozoa were irradiated, both lasers did not change the rates of cleavage (p>0,05) on third day of in vitro culture (Infrared: L30 - 90.0% vs. C30 - 95.83%; L60 - 85.56% vs. C60 - 98.33%; L120 - 90.83% vs. C120 - 90.83%; L180 - 89.72% vs. C180 - 97.50%; and Visible: L30 - 82.96% vs. C30 - 85.61%; L60 - 82.10% vs. C60 - 82.53%; L120 - 80.48% vs. C120 - 82.44%; L180 - 83.53% vs. C180 - 87.15%), the embryo production percentages on seventh day ...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: César Roberto Esper / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Nivaldo Antonio Parizotto / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Elmo Gomes Diniz / Resumo: O presente trabalho teve como objetivos separar os espermatozóides portadores do cromossomo X viáveis, dos portadores do Y, através de gradiente descontínuo de densidade de PercollTM. Utilizar esse sêmen na produção in vitro de embriões bovinos, substituindo o SFB pela BSA no cultivo. Congelar estes embriões pelo método da congelação lenta. Avaliar a criotolerância dos embriões do sexo feminino pela taxa de eclosão e a eficiência do gradiente pela técnica da PCR, que identificou o sexo dos embriões produzidos. Foram produzidos 133 embriões do tratamento sexado (embriões produzidos a partir de sêmen submetido ao gradiente de densidade de PercollTM) e 100 do tratamento controle (embriões produzidos de acordo com o protocolo utilizado no departamento de Reprodução Animal). Após congelação, descongelação e cultivo destes embriões apenas 8 eclodiram do tratamento sexado e também 8 do tratamento controle, a análise estatística deste resultado demonstrou que o sexo não influenciou na taxa de eclosão pós descongelação. Porém a análise estatística dos embriões produzidos com sêmen sexado e submetidos a PCR demonstrou que o gradiente de densidade de PercollTM foi eficaz na separação dos espermatozóides X viáveis em 62%. / Abstract: The present study had as purposes to separe X and Y sperm by PercollTM descontinuous density gradient. Use the semen on in vitro production bovine embryos, replacing the BFS for BSA on the culture. To freezing the embryos by the slow curve method. Evaluate the female embryos cryotolerance by eclosion rate and the gradient eficience by PCR technique that identify the embryos sex. 133 embryos were produced by the sexed treatment and 100 by control treatment. After freezing, unfreezing and culture of the embryos, only 8 ecloded of each treatment, the result statistics analyses showed that the sex had no influence on the eclosion rate after unfreeze. However the statistics analyses of the sexed semen produced embryos and submitted to PCR showed that the PercollTM density gradient was efficient on the viable X separation sperm in 62%. / Mestre

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Marcus Antônio Rossi Feliciano / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Banca: Felipe Perecin / Resumo: Com o intuito de aperfeiçoar os resultados da criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV), este estudo foi conduzido com o objetivo principal de avaliar o impacto da suplementação do meio de maturação in vitro (MIV) com ácido linolênico (ALA), associado ou não à L-carnitina (L-car), sobre a maturação e qualidade do oócito, especialmente no que se refere ao metabolismo lipídico, e sobre o desenvolvimento e resistência à criopreservação dos embriões produzidos. Para tanto, em uma primeira etapa (Experimentos I e II) foram realizados experimentos de dose-resposta para determinar as concentrações ideais de ALA (0, 10, 50 ou 100 µM) e L-car (0, 1, 5 ou 10 mM) a serem adicionadas ao meio de MIV, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) ou 0,6% de albumina sérica bovina (BSA). Foram avaliados os efeitos do ALA e L-car sobre a maturação nuclear e citoplasmática (avaliação mitocondrial, acúmulo lipídico intracelular e produção de espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) em oócitos bovinos) e o subsequente desenvolvimento embrionário. No Experimento I, a adição de 100 µM de ALA em meio de MIV suplementado com SFB resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático e do acúmulo intracelular de ROS, assim como aumento (P<0,05) do potencial de membrana mitocondrial (PMM), em relação às demais concentrações de ALA. No entanto, nenhum desses efeitos prejudicou (P>0,05) a maturação oocitária e o subsequente potencial de desenvolvimento embrionário. No Experimento II, a suplementação do meio de MIV com L-car resultou em redução (P<0,05) do acúmulo lipídico citoplasmático, na presença de SFB. Somados os efeitos da concentração de 10 mM de L-car na presença de SFB sobre a redução (P<0,05) do PMM e elevação (P<0,05) do conteúdo de ROS e, do efeito negativo (P<0,05) da suplementação do meio de MIV com... / Abstract: In order to improve the results of cryopreservation of bovine in vitro produced (IVP) embryos, this study was conducted with the main objective to assess the impact of in vitro maturation medium (IVM) supplementation with linolenic acid (ALA), associated or not with L-carnitine (L-car), on oocyte maturation and quality, specially regarding to lipid metabolism and on development and cryoresistance of produced embryos. Therefore, in a first step (Experiments I and II) were performed dose-response experiments to determine the optimal concentrations of ALA (0, 10, 50 or 100 μM) and L-car (0, 1, 5 or 10 mM) to be added to IVM medium, supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) or 0.6% bovine sérum albumin (BSA). The effects of ALA and L-car on nuclear and cytoplasmic maturation [mitochondrial evaluation, intracellular lipid accumulation and intracellular production of reactive oxygen species (ROS)] and subsequent embryonic development were evaluated. In Experiment I, the IVM supplementation with 100 mM of ALA in FCS-supplemented medium resulted in reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid and intracellular ROS accumulation, as well as, increased (P<0.05) mitochondrial membrane potential (MMP), relative to the other ALA concentrations. However, none of these effects damaged (P<0.05) oocyte maturation and the subsequent embryo development potential. In Experiment II, the IVM medium supplementation with L-car resulted in significant reduction (P<0.05) of cytoplasmic lipid content even in the FCS presence. Combined effects of 10 mM L-car in FCS-supplemented medium on MMP reduction (P<0.05), ROS production increase (P<0.05), and the negative effect (P<0.05) on embryonic development of BSA IVM medium supplementation, we can conclude that concentration of 5 mM L-car in the presence of FCS exceeded the results of the other groups. Based on previous experiments results, in a second step (Experiment III) ... / Doutor

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Felipe Perecin / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: O presente estudo teve como objetivos avaliar os efeitos de estimuladores da lipólise (Forskolin: Forsk) e inibidores da lipogênese (Ácido Linoléico: LA) durante o cultivo in vitro (CIV) sobre o acúmulo de lipídios intracitoplasmáticos e criotolerância do embrião bovino, bem como avaliar o efeito do tratamento dos embriões com Forsk sobre a taxa de concepção após transferência para receptoras. Oócitos (n=1242) foram maturados in vitro (MIV) durante 22h a 38,5°C e 5% de CO2 em ar em meio TCM-199 bicarbonato com 10% SFB e hormônios. Após fecundação, os prováveis zigotos foram cultivados em meio SOF (grupo Controle) suplementado com: 100 μM LA durante todo o período do CIV (grupo LA); ou 5 μM Forsk a partir do dia 6 do CIV (grupo Forsk); ou com associação de LA e Forsk, como acima descrito (grupo LA+Forsk). O CIV foi conduzido a 38,5°C e 5% de CO2 em ar, por 7 dias. O desenvolvimento embrionário foi avaliado no dia 7 do CIV (D7), quando os blastocistos foram corados com Sudan Black B 1% para determinação do conteúdo lipídico intracitoplasmático. Os embriões foram avaliados em microscopia de luz e as imagens obtidas foram analisadas por Q-Capture Pro Image Software. O grupo Controle foi escolhido como calibrador e a média de cada grupo foi dividida pela média do calibrador para calcular a intensidade relativa de pixels, expressa em unidades arbitrárias. Os blastocistos expandidos foram vitrificados (Vitri Ingá®), aquecidos e cultivados por 24h em SOF para determinação das taxas d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the present study was to evaluate the effects of supplementation of in vitro culture (IVC) medium with drugs that stimulates the lipolysis (Forskolin: Forsk) and inhibit the lipogenesis (Linoleic Acid LA) on the intracytoplasmic lipid content and cryotolerance of bovine embryos, as well as to evaluate the effect of treatment of embryos with Forsk on the pregnancy rates after transfer to synchronized recipients. Oocytes (n=1242) were matured in vitro for 22h at 38.5°C and 5% CO2 in air in medium TCM199 with 10% FCS and hormones. After fertilization, presumptive zygotes were cultured in SOF medium (Control group) supplemented with: 100 μM LA throughout the culture period (LA group); or 5 μM Forsk from the 6th day to the end of the culture (Forsk group); or with the association of LA and Forsk, as described above (LA+Forsk group). The IVC was conducted at 38.5°C and 5% CO2 in air, for 7 days. Embryonic development was assessed on day 7 of culture (D7), when blastocysts were stained with 1% Sudan Black B to determine the intracytoplasmic lipid content. The embryos were evaluated by light microscopy and the images were analyzed by Q-Capture Pro Image software. The Control group was chosen as a calibrator and the measured value of each treatment was divided by the mean of the calibrator to generate the relative expression levels of pixels, expressed in arbitrary units. The expanded blastocysts were vitrified (Vitri Ingá®), warmed and cultured for 24h in SOF to eval... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-15Bitstream added on 2014-06-13T18:46:17Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_dr_jabo.pdf: 8403632 bytes, checksum: 32d25390bda4a085595ac038827009d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... / The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:46:32Z : No. of bitstreams: 1 perecin_f_dr_jabo.pdf: 591625 bytes, checksum: f3212bddc59577b0aa73b9d7ef9f1d91 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A clonagem por transferência de núcleo é freqüentemente associada a resultados insatisfatórios devido à reprogramação nuclear anormal da célula somática doadora de núcleo e à expressão gênica alterada. O primeiro objetivo deste trabalho foi estudar a freqüência dos RNAs mensageiros das DNA metiltransferases (DNMT) 1, 3A e 3B, e do gene de expressão constitutiva gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em blastocistos bovinos isolados produzidos in vivo e in vitro por transferência nuclear (TN) de célula somática, ativação partenogenética e fertilização in vitro (FIV). O segundo objetivo foi avaliar a expressão das DNMTs e dos genes imprinted IGF2, IGF2R e H19 em membranas cório-alantóide e fetos bovinos produzidos in vivo e in vitro por TN, ativação partenogenética e FIV e recuperados entre os dias 33 e 36 de gestação. Houve decréscimo (P<0,05) na freqüência do GAPDH nos blastocistos TN e partenogenéticos quando comparados aos embriões fertilizados, e também diferença entre blastocistos TN produzidos com diferentes protocolos de sincronização celular (células em G0 ou G1 do ciclo celular). Com relação às DNMTs, não foram identificados transcritos da DNMT1 nos blastocistos do grupo TN-G0; ocorreu diminuição na freqüência dos transcritos da DNMT3B nos embriões TN quando comparados aos partenotos. Não se observou diferença na freqüência relativa das DNA metiltransferases em membranas cório-alantóide e fetos. Com relação aos genes imprinted, o grupo partenogenético apresentou menor nível de expressão de IGF2 em relação aos os demais grupos; baixos níveis de expressão de IGF2 e IGF2R foram observados, respectivamente, em amostras de feto e de cório-alantóide derivadas de animais clonados por TN, quando comparadas aos grupos fertilizados in vivo e in vitro. / Cloning by nuclear transfer is often associated with poor results due to abnormal nuclear reprogramming of somatic cell donor and altered gene expression. The first objective of this study was to evaluate the frequency of DNA methyltranferases (DNMT) 1, 3A and 3B, and the housekeeping glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNAs in single bovine blastocysts produced in vivo or in vitro by somatic cell nuclear transfer (SCNT), parthenogenetic activation and in vitro fertilization (IVF). The second objective was to evaluate the expression of DNMTs and imprinted genes IGF2, IGF2R and H19 in chorio-alantois membrane of bovine fetuses produced in vivo or in vitro by SCNT, parthenogenetic activation and IVF, and recovered between days 33 and 36 of gestation. There was strong GAPDH downregulation (P<0.05) in parthenogenetic and cloned by SCNT blastocysts when compared to fertilized ones, and also differences between cloned blastocysts produced with different cell synchronization (G0 or G1) protocol. Regarding DNMTs expression, we did not identify DNMT1 transcrips in SCNT-G0 derived blastocysts, and observed DNMT3B downregulation in SCNT-derived embryos when compared to parthenotes. No differences in DNA methyltransferase relative frequency were seen in chorio-alantois membrane and fetuses. Regarding imprinted genes expression, downregulation of IGF2 in the parthenogenetic group was observed in comparision to all other groups, and also, downregulation of IGF2 and IGF2R in the cloned-derived fetuses and chorio-alantois samples, respectively, were observed comparing to in vivo and in vitro fertilized groups.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-19Bitstream added on 2014-06-13T19:24:36Z : No. of bitstreams: 1 niciura_scm_dr_jabo.pdf: 1029270 bytes, checksum: 8a93cc4207fdb3426be68df4fa064ef9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A maturação oocitária é marcada pela retomada da primeira divisão da meiose, com progressão do estádio de Vesícula Germinativa (GV) da Prófase I até a Metáfase II (MII), e inclui todos os eventos necessários para que o oócito expresse seu potencial máximo de desenvolvimento após a fecundação. Para avaliarmos a eficiência da maturação in vitro (MIV), utilizamos oócitos classificados em viáveis (graus I, II e III) e inviáveis (atrésico e desnudo), e acompanhamos a progressão nuclear e a distribuição dos grânulos corticais (GC) como indício de maturação citoplasmática, após MIV em TCM 199 com soro fetal bovino, hormônios, antibiótico e piruvato, por 24h em 5% de CO2 em ar. Maturação nuclear (78,4-87,8%) e citoplasmática (GC periféricos; 67,2-79,3%) foram semelhantes entre as diferentes classes de oócitos e apresentaramse como eventos independentes. Para o acompanhamento dos eventos desencadeados pelo espermatozóide, avaliamos a dinâmica nuclear e de microtúbulos, em intervalos de 2h, após fecundação in vitro (FIV), em meio TALP com heparina, PHE e sêmen preparado em gradiente de Percoll. Observamos que o estádio de MII foi predominante de 2 a 8h; MII e Anáfase/Telófase (A/T) predominaram às 10h; MII, A/T e estádio pronuclear (PN) de 14 a 16h; e PN a partir de 18h. A penetração do espermatozóide ocorreu após 4h da inseminação dos oócitos; a diferenciação dos PN 14 masculino e feminino pelo tamanho foi possível de 14 a 18h e a singamia ocorreu a partir de 24h. O período de 10h pode ser suficiente para que a FIV seja efetiva em oócitos bovinos, nas condições aqui descritas. / We aimed to evaluate events involved in in vitro maturation, fertilization and development, and parthenogenetic activation of bovine oocytes assessed by nuclear-cytoplasmic interaction and gene expression. Oocyte morphological selection did not affect nuclear maturation (78.4-87.8%) and cytoplasmic cortical granule distribution (67.2-79.3%). Following nuclear and microtubular dynamics after fertilization (IVF), we observed sperm penetration 4h after insemination; male and female pronuclei differentiation by size from 14 to 18h; syngamy after 24h; and sufficient co-incubation of spermatozoa and oocytes for 10h. Pronuclear transfer to study the interaction between nucleus (N) and cytoplasm (C) in parthenogenetic embryos produced by ionomycin followed by strontium (S) or 6-DMAP (D) was assessed by cleavage, eight-cell, and blastocyst development rates: CSND (76.5, 36.4, and 6.8%) and CDNS (69.5, 25.0, and 4.9%). S cytoplasm promoted dominant effect on D nucleus. Higher rates of developmental arrest up to the eight-cell stage were observed by the combination of cytoplasm and nucleus produced by the two different activation treatments. We recovered parthenogenetic D fetuses on Day 35, which were small but normal in formation and in appearance of chorio-alantoic membranes. Genomic imprinting of IGF2 was observed, but XIST was maternally expressed in extra-embryonic tissues. In vitro culture promoted higher expression of IGF2 and H19 genes and also increased IGF2/IGF2r ratio in IVF embryos compared to in vivo produced ones.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:46:13Z : No. of bitstreams: 1 barretto_lss_dr_jabo.pdf: 796760 bytes, checksum: 1b897563a911eb0bb996aa629ab300d1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear... / The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address)

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-15Bitstream added on 2014-08-27T15:57:17Z : No. of bitstreams: 1 000779820.pdf: 7636663 bytes, checksum: 221e2960f370d289d0928952e2d4eb9c (MD5) / É sabido que alguns patógenos podem desencadear o processo de apoptose em determinadas células do organismo, entretanto, o BHV-5 inibe a apoptose em embriões bovinos com sete dias de desenvolvimento. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi investigar a interação vírus-embrião no mecanismo de morte celular programada. Oócitos bovinos foram divididos em dois grupos, sendo: I (controle) e II (exposto ao BHV-5). Após 24 horas de maturação in vitro, 100 oócitos de cada grupo foram desnudados e observados em microscópio invertido para verificação da extrusão do primeiro corpúsculo polar, sendo o restante dos oócitos incubados com espermatozoides, por 18 a 20 horas, para que ocorresse o processo de fertilização in vitro. Transcorrido este período, os prováveis zigotos foram desnudados e transferidos para gotas contendo meio de cultivo (mSOF), até o dia sete pós-inseminação. Os embriões produzidos in vitro foram submetidos à técnica de PCR em tempo real para pesquisa do BHV-5 e análise da transcrição dos genes Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 e Apaf-1 relacionados à apoptose, além do teste de MTT ((3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), para avaliação da atividade mitocondrial. A análise estatística para a taxa de maturação nuclear dos oócitos foi feita pelo teste de x2. A produção in vitro de embriões, MTT e transcrição gênica foi avaliada pelo teste t não pareado. Observou-se que o BHV-5 não interferiu na taxa de maturação nuclear dos oócitos e no desenvolvimento embrionário, entretanto os embriões do grupo I apresentaram maior viabilidade mitocondrial e os embriões do grupo II tiveram a expressão dos genes Bax e caspase-2 diminuídos, comprovando que o vírus inibiu o processo de morte celular programada nos embriões bovinos sete dias pósinseminação, a fim de favorecer a disseminação viral / It is known that some pathogens can initiate apoptosis in certain cells of the organism, however, BHV-5 inhibits apoptosis in bovine embryos after seven days of development. Therefore, the aim was to investigate the interaction virus-embryo in the mechanism of programmed cell death. Bovine oocytes were divided into two groups: I (control) and II (exposed to BHV-5). After 24 hours of in vitro maturation, 100 oocytes of each group were denuded and observed under inverted microscope to check the extrusion of the first polar body, and the other oocytes were incubated with spermatozoa for 18 to 20 hours, for in vitro fertilization. After this period, presumptive zygotes were denuded and transferred to drops containing culture medium (mSOF), until day seven postfertilization. In vitro produced embryos were submitted to real time PCR to evaluated the presence of BHV-5 and expression of Mcl-1, Bax, caspase-2, -3 and Apaf-1 related to apoptosis, also the MTT assay ((3 - [4,5-dimethylthiazol 2-yl] -2,5-diphenyl tetrazolium bromide)) was performed for the evaluation of mitochondrial activity. Statistical analysis for nuclear maturation of oocytes was performed by x2 test. In vitro embryo production, MTT and gene expression were analyzed by unpaired t test. It was observed that BHV-5 did not influence nuclear maturation rate of oocytes or embryonic development, however embryos of group I showed greater mitochondrial viability, and embryos of group II had a decrease in genes expression of Bax and caspase-2, suggesting that the virus inhibited the process of programmed cell death in bovine embryos seven days post-fertilization, in order to promote viral spread