Os objetivos desse trabalho foram avaliar in vitro a sensibilidade de zigotos murinos à Brucella abortus, assim como a eficácia das lavagens seqüenciais e do tratamento com tripsina, padronizados pela International Embryo Transfer Society, na sua remoção e/ou inativação, a fim de estabelecer um modelo acessível para o estudo de interações embriões-patógenos. Para a coleta dos zigotos, foram utilizados camundongos fêmeas (Swiss Webster), púberes, nulíparas, 6-8 semanas de idade, acasaladas com machos inteiros da mesma linhagem, após superestimulação ovariana. Para a infecção foi utilizada a bactéria B.abortus 1119.3. A suspensão de bactérias foi preparada no momento da inoculação, na diluição de 106 bactérias/ml. Os zigotos obtidos foram separados em controle e infectados. A infecção dos zigotos foi feita com 30&micro;l da suspensão de bactérias, e após 24h e 96h foram analisados quanto à morfologia e taxa de clivagem. Os procedimentos de lavagem seqüencial e tratamento com tripsina foram realizados após 24h. Para detecção da bactéria após os procedimentos de lavagem, as amostras foram inoculadas em cultura de bactérias e submetidas ao teste de reação em cadeia pela polimerase (PCR). Uma amostra da última gota de lavagem de cada grupo também foi testada. Para analise estatística dos resultados foi utilizado o teste do &chi;2. No grupo controle não foram verificadas alterações morfológicas, já no infectado foi possível verificar a presença de blastômeros irregulares, falha de divisão, citoplasma com granulação e aspecto degenerativo. As taxas de clivagem obtidas foram de 77,4% (controle) e 59,2% (infectados) (&chi;2 de 0,001674; p<0,05) após 24h e após 96h de infecção 14,5% (controle) e 7% (infectados) (&chi;2 de 0,141616; p<0,05). Não foi possível isolar B.abortus em cultura após os procedimentos de lavagem para ambos os grupos. As amostras do grupo controle apresentaram-se negativas na PCR. Já no grupo infectado foram obtidos resultados positivos e negativos, para os embriões e para a alíquota da última gota de lavagem dos grupos tratados com a lavagem seqüencial. Foi verificada apenas em uma amostra a presença de embriões positivos para a B.abortus com amostra da última gota de lavagem negativa. Para outras duas amostras os embriões apresentaram-se livres de B.abortus, mas foram detectadas na alíquota da última gota de lavagem. Apenas em uma amostra foram obtidos resultados negativos tanto para os embriões, quanto para o meio de lavagem. Os resultados da PCR para os grupos infectados tratados com tripsina foram positivos para praticamente todas as amostras, contendo embriões ou apenas da alíquota da última gota de lavagem, com exceção dos embriões de uma amostra que apresentaram-se negativos. As novas tecnologias desenvolvidas em reprodução animal promovem manipulação invasiva do embrião. Portanto, tratamentos preconizados para a remoção de patógenos podem não ser eficazes. O risco a ser considerado é da presença de patógenos associados à zona pelúcida ou nas proximidades, que possam ser introduzidos, ou ter sua entrada facilitada no embrião. Considerando os dados apresentados, torna-se clara a importância do desenvolvimento de um modelo animal para estudos de interações embriões- patógenos, a fim de se evitar a transmissão e disseminação de doenças. / The aim of this study was evaluate in vitro mouse zygotes sensitivity to Brucella abortus, such as the embryo washing procedure and trypsin treatment, recommended by the International Embryo Transfer Society, efficacy in its removal and/or inactivation, with the purpose of established an accessible model for embryo- pathogen interaction studies. The female mice (Balb C) aging 6 to 8 weeks were superovulated and matted with fertile males of the same strain, then the zygote retrieval was performed. The bacterial suspension was prepared in the moment of inoculation and the dilution was 106 brucellas/ml. The zygotes were divided in control and infected groups (30&micro;l of the bacterial suspension); after 24h and 96h their morphology and viability were analised. The zygotes of each group were washed sequentially or treated with trypsin after 24h exposition. To verify the presence of B. abortus pos-washing the zygotes and a sample of the last wash drop of each group were tested on bacterial culture system and polimerase chain reaction (PCR). The statistical analyses was performed with the &chi;2 test. Morphological changes were not observed at the control group, but the infected one presented irregular blastomeres, clivage defective, granular cytoplasm with degenerative like morphology. The clivage rates were 77,4% (control) and 59,2% (infected) (&chi;2 de 0,001674; p<0,05) after 24h and after 96h 14,5% (control) e 7% (infected) (&chi;2 de 0,141616; p<0,05). Our results showed that the bacterial culture presented negative growing for all groups tested. The control group presented only negative results on PCR analyses. The infected group presented positive and negative results on PCR, for embryos or last wash drop sample, submitted to the sequential washing procedure. Positive embryos were found in just one sample with the last wash drop negative. To two other samples embryos presented negative PCR results but positive at the last wash drop. Negative results for embryos and last wash drop was found in just one sample. The PCR results for the groups treated with trypsin were almost all positives, for embryos or last wash drop samples, except one embryo sample that presented negative. The recent developed reproductive technologies promote excessive manipulation of the embryo. Therefore, preexistent procedures for microorganisms\' removal could not be efficient. The preeminent risk to be considered here is the potential or probability of the presence of pathogens associated with or in proximity to the zona pelúcida, which could be introduced, or facilitated its entrance on embryo. According to the data presented become clear the importance of develop a model for studies of embryo- pathogen interactions, with the aim of avoid disease transmission.

Foram desenhados três pares de primers, sendo um deles dirigido ao gene que codifica uma proteína periplasmática da Brucella (BP26) e dois outros dirigidos para a região interespaçadora entre os gene 16S e 23S do RNA ribossômico (ITS). Com os primers acima, foram padronizadas três PCRs, potencialmente capazes de detectar qualquer espécie de Brucella e denominadas PCR-ITS1, PCR-ITS2 e PCR-BP26. Soluções de DNA de sangue de cão livre de Brucella foram contaminadas com quantidades decrescentes de DNA de B. canis (RM6/66) e, então, submetidas às PCRs descritas anteriormente. Para a avaliação das PCRs quanto à capacidade de detecção de Brucella spp. em sangue de animais naturalmente infectados, foram utilizadas 75 amostras de sangue de cães provenientes de canis comerciais onde foram registrados casos clínicos sugestivos de infecção por Brucella. As 75 amostras de sangue de cães foram colhidas com anti-coagulante (citrato de sódio) por punção da veia jugular. As amostras foram separadas em duas alíquotas, uma das quais (2 ml) foi submetida ao isolamento e identificação bacteriológica e a outra alíquota (1ml), às PCRs. O DNA total das amostras de sangue foi extraído por método baseado em digestão com proteinase K, SDS e CTAB seguido de purificação com fenol e clorofórmio. Considerando os resultados da PCR de melhor desempenho (PCR-ITS1), entre as 35 amostras positivas pelo isolamento bacteriano, 30 (85,71%) foram positivas pela técnica de PCR, enquanto entre as 40 amostras negativas pelo cultivo bacteriológico, 11 (27,5%) foram positivas pela PCR. A PCR-ITS1 foi capaz de detectar um mínimo de 3,78fg de DNA bacteriano misturado a 450ng de DNA de cão, o que representa, teoricamente, a massa genômica de 1,26 bactérias. Pela aparente superior capacidade de classificar animais positivos que o método de cultura bacteriológica, a PCR-ITS1 parece ser uma técnica promissora para o diagnóstico direto da brucelose em cães. / Three pair of primers were designed against Brucella genetic sequences. Two of them were directed to 16S-23S rRNA interspacer and the other was directed to a periplasmatic protein coding gene (BP26). Three PCRs assays named PCR-ITS1, PCR-ITS2 and PCR-BP26, each one putatively capable of amplifying DNA from any Brucella species were tested using the aforementioned primers. Nucleic acid extracts from whole-blood from naïve dogs were spiked with decreasing amounts of B. canis (RM6/66) DNA and the resulting solutions were tested by PCR. The capability of the PCRs to amplify Brucella spp. genetic sequences from naturally infected dogs was evaluated by using 75 whole-blood samples from dogs raised in commercial kennels were clinically affected animals have already been detected with signs suggestive of Brucella infection. The whole-blood samples were collected with sodium citrate as anti-coagulant by venal puncturing the jugular vein. The samples were split into two aliquots, one of them (2mL) being submitted to bacterial isolation and identification and the remaining sample (1mL) to PCR. The DNA from whole-blood was extracted by using proteinaseK, SDS and CTAB following phenol-chloroform purification. Considering the results from the PCR with the best performance (PCR-ITS1), within 35 isolation positive samples, 30 were positive by PCR. Within 40 isolation negative samples, 11 were positive by PCR. PCR-ITS1 was capable of detecting as few as 3.78fg of bacterial DNA mixed to 450ng of host DNA. Theoretically, 3.78fg of Brucella DNA represents the total genomic mass of 1.26 bacterial cells. The superior ability of PCR-ITS1 on classifying positive animals suggest that PCR-ITS1 is a promising tool for the direct detection of canine brucellosis.

Em parceria com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), a Agencia Estadual de Defesa Agropecuária do Estado da Bahia (ADAB) e o Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, foi realizado um inquérito soroepidemiológico da brucelose bovina no Estado da Bahia, localizado na Região Nordeste do Brasil. Para este estudo, o Estado da Bahia foi dividido em quatro circuitos produtores, com objetivo de estimar a prevalência de fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses soropositivas para a brucelose, além da prevalência de focos em cada circuito produtor e no Estado da Bahia. Além disso, caracterizou-se epidemiologicamente os circuitos produtores e o Estado da Bahia e verificou-se os fatores de risco associados à presença de brucelose bovina. As prevalências de focos de brucelose bovina e de animais soropositivos no Estado da Bahia foram 4,20% [3,10-5,30] e 0,66% [0,41-0,93], respectivamente. Nos circuitos produtores 1, 2, 3 e 4 as prevalências de focos foram de 5,75% [3,64-8,71], 3,07% [1,48-5,56], 6,31% [4,05- 9,33] e 0,60% [0,07-2,16], respectivamente e a prevalência de fêmeas soropositivas nos circuitos produtores 1, 2, 3 e 4 foram de 0,86% [0,41-1,32], 1,17% [0,25-2,09], 1,66% [0,66-2,66] e 0,07% [0,00-0,21], respectivamente. Os fatores de risco para a brucelose bovina no Estado da Bahia foram a compra de reprodutores (OR = 2,26) e 10 presença de áreas alagadiças (OR =1,76). A vacinação entre três e oito meses foi um fator protetor contra a doença em todo o Estado (OR =0,52). / A partnership between the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA), the Bahia Official Animal Health Service (ADAB) and the Department of Preventive Veterinary Medicine and Animal Health (VPS) of the Faculty of Veterinary Medicine (FMVZ) of the University of São Paulo, was made in order to do a seroepidemiological survey of bovine brucellosis was conducted in Bahia State, Northeast region of Brazil. For this study, the Bahia State was divided into four production circuits aiming to estimate the prevalence of seropositive females over 24 months old and the prevalence of positive herds. The epidemiological characterization of production circuits and of the whole State of the Bahia was achieved, as the verification of the risk factors associated with the disease. The prevalence of positives herds and seropositive animals in Bahia State were 4.20% [3.10-5.30] e 0.66% [0.41-0.93], respectively. In the production circuits 1, 2, 3 and 4, the prevalence of positive herds were 5.75% [3.64-8.71], 3.07% [1.48-5.56], 6.31% [4.05-9.33] and 0.60% [0.07-2.16], respectively. In the production circuits 1, 2, 3 and 4, the prevalence of seropositive animals were 0.86% [0.41-1.32], 1.17% [0.25-2.09], 1.66% [0.66-2.66] and 0.07% [0.00-0.21]. The risk factors for bovine brucellosis in State were acquisition of bovine reproductors (OR = 2.26) and the presence of flooding areas (OR = 1.76). The vaccination of heifers between three and eight months of age was a protective factor against the disease in the State (OR =0.52).

Para dar suporte à implementação do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose no Estado do Sergipe, foi realizado um estudo para caracterizar a situação epidemiológica da doença. Assim, o Estado foi estratificado em 2 circuitos produtores. Em cada circuito produtor foram amostradas aleatoriamente cerca de 300 propriedades e, dentro dessas foi escolhido de forma aleatória um número pré-estabelecido de animais, dos quais foi obtida uma amostra de sangue. No total foram amostrados 4.757 animais, provenientes de 590 propriedades. Em cada propriedade amostrada foi aplicado um questionário epidemiológico indagando sobre a tipologia da propriedade e sobre práticas zootécnicas e sanitárias que poderiam estar associadas ao risco de infecção pela doença. O protocolo de testes utilizado foi a triagem com o teste do Antígeno Acidificado Tamponado e confirmação dos positivos com o teste do 2-Mercaptoetanol. O rebanho foi considerado positivo, se pelo menos um animal fosse reagente às duas provas sorológicas. As prevalências de focos e nos animais do Estado foram de 12,60% [9,19 - 16,01%] e 3,36% [2,28 - 4,44 %]. As prevalências de focos e animais para os circuitos produtores foram: circuito 1: 11,07% [7,87 - 15,00 %] e 2,58% [1,62 - 3,54 %]. Circuito 2: 12,92% [9,12 - 17,59 %] e 6,25% [3,00 - 9,49 %]. Os fatores de risco associados à condição de foco foram: assistência veterinária (OR = 2,89; [1,15 - 7,23]), tamanho do rebanho &ge; 30 fêmeas adultas (OR = 1,88; [1,07 - 3,28]) e uso de inseminação artificial (OR = 1,92; [0,84 - 4,38]). / To support the planning and implementation of the National Program for the Control and Eradication of Bovine Brucellosis in the State of Sergipe, a study to characterize the brucellosis epidemiological situation was carried out. The State was divided in two regions. Around three hundred herds were randomly sampled in each region, and a pre-established number of animals were sampled in each of these herds. A total of 4757 serum samples from 590 herds were collected. In each herd, it was applied an epidemiological questionnaire focused on herd traits as well as husbandry and sanitary practices that could be associated with the risk of infection. The serum samples were screened by the Rose-Bengal Test (RBT), and all test positives were re-tested by the 2-Mercaptoethanol Test (2-ME). The herd was considered positive if at least one animal tested positive on both RBT and 2-ME tests. The prevalence of infected herds and animals at the State level were respectively 12,60% [9,19 - 16,01%] and 3,36% [2,28 - 4,44 %]. The prevalence of infected herds and animals at the Regional level were respectively: region 1: 11,07% [7,87 - 15,00 %] and 2,58% [1,62 - 3,54 %], region 2: 12,92% [9,12 - 17,59 %] and 6,25% [3,00 - 9,49 %]. The factors associated with the presence of the infection were: veterinary assistance (OR=2,89 [1,15 -7,23]) and herd size &ge; 30 adult females (OR = 1,88 [1,07 - 3,28] and use of artificial insemination (OR=1,92; [0,84-4,38]).

Para dar suporte à implementação do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose no Estado do Mato Grosso do Sul, foi realizado um estudo para caracterizar a situação epidemiológica da brucelose bovina. Considerando as características regionais da produção pecuária, foram definidos três estratos a serem estudados no Estado: Pantanal corte, Planalto corte e Planalto leite, esse último subdividido em Bolsão, Campo Grande e Dourados . Em cada estrato foram amostradas aleatoriamente propriedades, e dentro dessas foi escolhido, também de forma aleatória, um número pré-estabelecido de animais, dos quais foi obtida uma amostra de sangue. No total foram amostrados 14.849 animais, provenientes de 1.004 propriedades. Em cada propriedade amostrada foi aplicado um questionário epidemiológico indagando sobre suas características e também sobre a observação de transtornos reprodutivos que poderiam estar associados à infecção brucélica. O teste utilizado foi o do Antígeno Acidificado Tamponado. O rebanho foi considerado positivo se pelo menos um animal fosse reagente à prova sorológica. Para o Estado, a prevalência de focos foi de 41,5% [36,5% - 44,7%]. As prevalências de focos e animais nos estratos foram respectivamente de: 59,0% [52,8% - 64,9%] e 12,6% [9,1% - 17,2%] para o estrato Pantanal corte, 40,6% [35,8% - 45,5%] e 4,5% [2,1% - 9,0%] para o Planalto corte. No estrato Planalto leite, a prevalência de focos foi de 33,1% [28,4% - 38,1%]. Os fatores associados à condição de foco foram: ter &ge; 500 vacas (OR = 2,46 [1,81 - 3,34]), a ocorrência de bezerros fracos (OR = 1,20 [0,87 - 1,65]) e a inseminação artificial (OR = 0,71 [0,50 - 1,01]). / To support the planning and implementation of the National Program for the Control and Eradication of Brucellosis and Tuberculosis in the State of Mato Grosso do Sul, a study to characterize the epidemiological status of bovine brucellosis was carried out. The State was divided in three regions. Herds were randomly sampled in each region, and a pre-established number of animals were sampled in each of these herds. A total of 14.849 serum samples from 1.004 herds were collected. In each herd it was applied an epidemiological questionnaire focused on herd traits as well as clinical signs that could be associated with the brucellosis infection. The serum samples were tested for antibodies against Brucella spp. by the Rose-Bengal Test (RBT). The herd was considered positive if at least one animal tested positive. The prevalence of infected herds at the State level were 41.5% [36.5% - 44.7%]. The prevalence of infected herds at the Regional level were respectively: 40.6% [35.8% - 45.5%] for the Beef Planalto region, 59.0% [52.8% - 64.9%] for the Beef Pantanal region and 33.1% [28.4% - 38.1%] for the Dairy Planalto region. The factors associated with the presence of the infection were: herd size bigger than 500 cows (OR = 2.46 [1.81 - 3.34]), occurrence of weak calf (OR = 1.20 [0.87 - 1.65]) and use of artificial insemination (OR = 0.71 [0.50 - 1.01]).

O presente trabalho é resultado de uma parceria entre o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a Agência Estadual de Defesa Agropecuária do Maranhão, a Universidade de São Paulo e a Universidade de Brasília, fazendo parte das atividades do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal. Realizou-se um estudo do tipo transversal para estimar a prevalência da brucelose bovina em animais e propriedades no Maranhão e em quatro circuitos produtores de bovinos, oriundos da divisão do estado. Em cada propriedade selecionada para o estudo, foram aleatoriamente coletadas amostras de soro de fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses, assim como, foi aplicado um questionário epidemiológico objetivando caracterizar os tipos de criação de bovinos e determinar os fatores de risco associados à ocorrência da doença no Maranhão. No total foram amostradas 749 propriedades e 6.779 animais. As coordenadas geográficas de cada propriedade foram coletadas para identificação da distribuição espacial das propriedades positivas e de áreas geográficas onde medidas de controle da doença devem ser preferencialmente implementadas. A prevalência de propriedades positivas com, ao menos um animal reagente, foi estimada em 11,42% (9,23 - 14,06%) e a prevalência de animais soropositivos foi de 2,52% (1,73 - 3,65%). Diferenças significativas de prevalência foram observadas entre o circuito produtor 2 e os demais circuitos. As variáveis: rebanho bovino com mais de 54 fêmeas com idade &ge; 24 meses, aluguel de pastos de/para terceiros e presença de áreas alagadiças na propriedade, foram identificadas como fatores de risco para a ocorrência de brucelose no estado. Exploração de corte foi identificada como um fator protetor da doença. A performance do modelo final de fatores de risco, analisada através da área sob a curva ROC, apresentou um valor igual a 0,73, o que significa dizer que a ocorrência de focos da doença é também influenciada por outros elementos não incluídos na análise de fatores de risco. A distribuição de brucelose bovina foi estudada através de análises espaciais de prevalência e efeitos de primeira e segunda ordem. Observou-se uma distribuição heterogênea de focos da doença no estado, com destaque para áreas no centro e nas fronteiras leste e noroeste. Pequenas evidências de efeitos de segunda ordem foram observados na escala de 0 a 10 km. A análise de efeitos de primeira ordem, através dos resíduos do modelo de regressão logística, identificou áreas de maior risco da doença, principalmente no centro do estado, onde a presença de brucelose bovina não foi totalmente explicada pelo modelo de fatores de risco. Maior atenção deva ser preferencialmente prestada a esta área, onde investigações epidemiológicas e intervenções de controle da doença devem ser implementadas. / The present work is the result of a partnership among the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply, the Animal Health State Agency of Maranhão, the University of São Paulo and the University of Brasília, becoming part of the activities of the National Program to Control and Eradicate Animal Brucellosis and Tuberculosis. A cross-sectional study was conducted to estimate the prevalence of bovine brucellosis in animals and farms in Maranhão State and four cattle production circuits, from the arbitrary division of the State. In each farm selected for the study, serum samples were randomly collected from cows aged 24 months or more, as well as an epidemiological questionnaire was applied aiming to characterize the types of cattle production systems and to determine the risk factors associated with occurrence of the disease in Maranhão. In total 749 farms and 6,779 animals were surveyed. Geographic coordinates of each farm were collected for identification of the spatial distribution of positive farms and identification of geographic areas where disease control measures should preferably be implemented. The prevalence of positive farms with at least one reagent animal, was estimated at 11.42% (9.23 - 14.06%) and the prevalence of seropositive animals was 2.52% (1.73 - 3.65% ). Significant differences in prevalence were observed among the circuit number 2 and the others. The variables: cattle herd over 54 cows aged 24 months or more, rent pasture from/to third parties and presence of wetlands on the farm were identified as risk factors for the occurrence of brucellosis in the State. Beef herd was identified as a protective factor of the disease. The performance of the final model of risk factors, analyzed by the area under the ROC curve, was 0.73, which means that the occurrence of disease outbreaks is also influenced by other factors not included in the risk factors analysis. The distribution of bovine brucellosis was studied beyond spatial analysis of prevalence and first and second order effects. An heterogeneous distribution of disease outbreaks in the State was observed, especially some areas in central and eastern and northwestern borders. Little evidence of second order effects were observed on a scale of 0 to 10 km. The analysis of first-order effect, through the residues of the logistic regression model, identified areas of greatest risk of disease, especially in the center of the State, where the presence of bovine brucellosis has not been fully explained by the risk factors model. Greater attention should preferably be paid to this area, where epidemiological investigations and disease control interventions should be implemented.

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

Orientador: Karina Paes Bürger / Banca: Luis Antonio Mathias / Banca: Anna Monteiro Correia Lima / Resumo: Este trabalho teve como objetivo padronizar e avaliar a técnica "dot blotting" para o diagnóstico sorológico da brucelose bovina, comparar os resultados com os encontrados nos testes de antígeno acidificado tamponado (AAT), 2-mercaptoetanol (2-ME) e fixação de complemento (RFC), além de estimar a sensibilidade e a especificidade relativa do "dot blotting" em comparação com os testes de diagnóstico oficiais. Para tanto, utilizaram-se 50 amostras de soro sanguíneo bovino para padronização do teste, e foram avaliados dois antígenos: Brucella abortus B19 obtida a partir da vacina ANABORTINA® B19 - Merial, após processo de ruptura do microrganismo, e extrato polissacarídico obtido de amostra de Brucella abortus S99 pelo método água quente - fenol quente. Ao final da padronização foi estabelecida como ideal para a técnica a utilização de membrana de nitrocelulose no formato de círculo, o antígeno obtido da Brucella abortus após passar por um processo de ruptura do microrganismo, como suporte a placa de cultivo celular de 24 poços e fundo chato, a diluição do soro de 1:100 e do conjugado de 1:30.000, além de 3 lavagens por etapa. A avaliação e a comparação da sensibilidade e especificidade relativa aos testes de AAT, 2-ME e RFC foram feitas utilizando 1.315 amostras, sendo estes resultados comparados por meio do indicador Kappa. A comparação dos resultados do "dot blotting" com o AAT mostrou índice Kappa de 0,9081 (IC95%: 0,8542 - 0,9621), sensibilidade 88% (IC95%: 83,75% - 92,25%) e especificidade 99,45% (IC95%: 98,8% - 99,75%); com o 2-ME, índice Kappa de 0,9939 (IC95%: 0,939 - 1,0484), sensibilidade 99,48% (IC95%: 97,11% - 99,91%) e especificidade 99,91% (IC95%: 99,49% - 99,989%); com a RFC, índice Kappa de 0,8226 (IC95%: 0,7690 - 0,8761), sensibilidade 100% (IC95%: 97,42% - 100,0%) e especificidade 95,40% (IC95%: 94,03% - 96,47%). Usando a combinação dos resultados do 2-ME e da RFC para ... / Abstract: This study aimed to standardize and evaluate the dot blotting technique for the serologic diagnosis of bovine brucellosis, compare the results with those found in the Bengal test (AAT), 2-mercaptoethanol (2-ME) and complement fixation (CF) and also estimate the relative sensitivity and specificity of dot blotting in comparison with the official diagnostic tests. In order to do this, 50 samples of bovine blood serum were used for test standardization, and two antigens were evaluated: Brucella abortus B19 bacteria obtained from ANABORTINA® B19 vaccine - Merial, after the rupture process of the microorganism, and a polysaccharide extract obtained from a sample of Brucella abortus S99 by the hot water method - hot phenol. At the end of standardization, the use of nitrocellulose membrane in a circle format was established as ideal for the technique, the antigen obtained from B. abortus bacteria after going through the rupture process of the microorganism, as a support a cell culture plate with 24 flat bottom wells was used, a dilution serum of 1:100 and the conjugate of 1:30,000, and washing 3 times per step. The evaluation and comparison of relative sensitivity and specificity with the AAT, 2-ME and CF tests was done using 1,315 samples, and these results were compared using the Kappa indicator. The comparison between the results of dot blotting and the AAT showed a Kappa index of 0.9081 (IC95%: 0.8542 - 0.9621), sensitivity of 88% (IC95%: 83.75% - 92.25%) and specificity of 99.45% (IC95%: 98.8% - 99.75%); 2-ME test, Kappa index of 0.9939 (IC95%: 0.939 - 1.0484), sensitivity of 99.48% (IC95%: 97.11% - 99.91%) and specificity of 99.91% (IC95%: 99.49% - 99.989%); complement fixation test, Kappa index of 0.8226 (IC95%: 0.7690 - 0.8761), sensitivity of 100% (IC95%: 97.42% - 100%) and specificity of 95.40% (IC95%: 94.03% - 96.47%). Using the combination of the results of 2-ME and RFC to establish the true condition of the animal, the ... / Mestre

O objetivo do estudo foi caracterizar a situação epidemiológica da brucelose e tuberculose bovinas na região três do Estado de São Paulo. Assim, 260 rebanhos com atividade reprodutiva foram aleatoriamente selecionados e, dentro de cada um deles, 10 ou 15 fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses foram aleatoriamente escolhidas e testadas para o diagnóstico da brucelose. Foi utilizado um protocolo de testes em série, tendo o teste do antígeno acidificado tamponado como método de triagem e o teste de fixação de complemento como confirmatório. Para o diagnóstico da tuberculose foi utilizado o teste tuberculínico cervical comparativo em 20 ou 40 fêmeas bovinas com idade igual ou superior a 24 meses. A prevalência de focos, tanto de brucelose quanto de tuberculose, foi de 7,3% [4,44%; 11,17%]; a prevalência de animais positivos foi de 1,37% [0,91%; 2,00%] para brucelose e 1,05% [0,73%; 1,46%] para tuberculose. Em cada propriedade foi aplicado um questionário epidemiológico para individualizar possíveis fatores de risco para as duas doenças. A variável associada à condição de foco de brucelose foi a propriedade ter 23 ou mais bovinos com idade igual ou superior a 24 meses (OR=5,0 [1,83; 13,7]); a aquisição de bovinos emergiu como fator de risco para a tuberculose (OR= 4,46 [1,55; 12,78]) . / The purpose of this study is to propound bovine brucellosis and tuberculosis epidemiological situation at region 3 in São Paulo. Thus, 260 reproduce activity cattle were been randomly chosen and, among it, 10 or 15 female bovine at the same age or up 24 months were randomly chosen and tested for the brucellosis diagnosis. Test serial protocol was made using, having the test buffered acidified as a screening method and complement fixation test as a confirmatory. Comparative cervical tuberculin test was made using in 20 or 40 female bovine at the same age or up 24 months. The prevalence of focus at both brucellosis and tuberculosis was been7,3% [4,44%; 11,17%]; the prevalence of positive animals was been 1,37% [0,91%; 2,00%] for brucellosis and 1,05% [0,73%; 1,46%] for tuberculosis. A epidemiological questionnaire has been applied on each property as a purpose to individualize possible risk factors at both disease. The variable associated with tuberculosis condition was the property has 23 or more female bovine at the same age or up 24 months (OR=5,0 [1,83; 13,7]); cattle purchase has emerged as a risk factor for tuberculosis (OR= 4,46 [1,55; 12,78]) .

Foi realizado um estudo para determinar a situação epidemiológica da brucelose bovina no estado de Santa Catarina. O estado foi divido em cinco regiões conforme as características de produção pecuária. Para cada região foi estipulado o valor mínimo de 300 propriedades, sendo distribuídas de forma proporcional em todos os municípios. Como unidade primária da amostra, as propriedades foram amostradas aleatoriamente em cada município e, dentro delas, escolhida aleatoriamente uma quantidade pré-determinada de fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses, que foram testadas para o diagnóstico sorológico da brucelose. Este estudo utilizou amostras colhidas de 8.630 animais provenientes de 1.653 propriedades. Em cada propriedade sorteada, foi aplicado um questionário epidemiológico para verificar fatores de risco associados à infecção brucélica. O protocolo de testes utilizado foi a triagem com o Antígeno Acidificado Tamponado, seguido do teste dos reagentes com o 2-Mercaptoetanol (2-ME). Os animais com resultados inconclusivos no 2-ME foram retestados após 30 dias. A prevalência de focos foi de 0,912% [0,297 - 2,11]. As prevalências de focos, conforme a região, foram de 0,322% [0 - 0,959] na região 1, de 2,134% [0,862 4,348] na região 2, de 1,087% [0,297 - 2,760] na região 3, de 0,325% [0,0 - 0,968] na região 4 e de 0,293% [0 0,875] na região 5. A prevalência em animais em Santa Catarina foi de 1,21% [0,0951 4,97]. A prevalência em animais nas regiões 1, 4 e 5 foi igual a 0%, na região 2 foi de 1,02% [0,280 2,57] e na região 3 foi de 1,97% [0,106 - 8,84]. Este estudo revelou que os fatores de risco associados à condição de foco de brucelose no Estado foram: o tamanho do rebanho &gt; 12 fêmeas (OR = 7,47 [2,14 - 34,34]) e a presença de áreas alagadas (OR = 5,68 [1,62 - 26,13]). Utilizando um teste de duas proporções comparou-se as prevalências encontradas neste estudo e no estudo anterior (2002), sendo encontrada diferença significativa apenas na região 2, com valor de P&lt;0,05 (P=0,031). Dada a baixa prevalência encontrada, o sistema de vigilância deve ser incrementado visando a eliminação da doença no Estado / This study was planned to assess the epidemiological situation of bovine brucellosis in Santa Catarina State, Brazil. The State was divided into five regions (regions 1 to 5) according to characteristics of animal husbandry (livestock production). A sample size of 292 herds was predefined for each region. The herds were randomly sampled and, within them, a preset number of females aged over 24 months were also randomly selected for the serological diagnosis of brucellosis. A total of 8,630 animals, from 1,653 farms, were tested. In all selected farms, an epidemiological questionnaire was applied to verify risk factors for brucellosis. The test protocol was a screening by the Rose Bengal Test. If positive, followed by a 2-Mercaptoethanol test. The inconclusive results were tested again after 30 days. In a total of 11 herds, 16 animals were diagnosed as brucellosis positive. The prevalence of infected herds in the State was 0.912% [0.297 2.11]. The prevalence of infected herds in each of regions were as follows: region 1, 0.322% [0 0.959]; region 2, 2.134% [0.862 4.348]; region 3, 1.087% [0.297 2.760]; region 4, 0.325% [0 0.968]; region 5, 0.293% [0 0.875]. The total prevalence of positive animals was 1.21% [0.0951 4.97]. The animal prevalence in regions 1, 4 and 5 was equal to 0.0%; in region 2 was 1.02% [0.280 2.57], and in region 3 was 1.97% [0.106 8.84]. The risk factors associated with brucellosis were: herd size higher than 12 females over 24 months (OR = 7.47 [2.14 to 34.34]) and drenched areas (OR = 5.68 [1.62 to 26.13]). After using a two-proportion test to compare the prevalence in this study and in a prior study in the same State, a statistically significant difference was found between the prevalence results only in region 2 (P=0.031). Given the low prevalence (less than 1%), the implementation of eradication strategies, based on a surveillance system, should be encouraged