Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-27T17:57:17Z No. of bitstreams: 1 luciana_s_rodrigues_ioc_bcm_0026_2010.pdf: 8319063 bytes, checksum: 23ce271789168f4d9723b9a7df6ffe11 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-27T17:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 luciana_s_rodrigues_ioc_bcm_0026_2010.pdf: 8319063 bytes, checksum: 23ce271789168f4d9723b9a7df6ffe11 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A lesão neural é uma das principais consequências da hanseníase e responsável pela instal ação de deformidades e incapacidades físicas, al ém de contribuir para o esti gma da doença. O dano ao nervo é exacerbado com o desenvolvimento de episódi os reaci onais (Ti po I e Ti po II) e está correlaci onado à resposta imunol ógi ca desenvolvida pel o indivíduo, contra o Mycobacterium leprae – agente eti ol ógico da hanseníase que apresenta especi al tropismo por macrófagos e células de Schwann (CS) nos nervos periféri cos. Os fatores de crescimento semelhante à Insulina (IGFs) são hormôni os pept ídi cos implicados no metabolismo, indução de proliferação, inibição de apoptose e diferenciação de diferentes ti pos cel ulares. Evi dências da li teratura apontam também propri edades imunomoduladoras e anti -inflamatóri as do IGF-I. O objetivo do presente estudo vi sa a invest i gação da parti cipação do si stema IGF na infecção pel o M. leprae. Ini cialmente, verificamos o efei to anti -apoptóti co da bactéri a sobre CS humanas primárias e da linhagem ST88-14 cul t ivadas em condições livres de soro pel a inibição da at ivação de caspase-3. Demonstramos, ainda, através de ensai os de imunoci toquímica, que o bacil o é capaz de induzir a proliferação da CS, tal efei to provavelmente mediado pel a indução de IGF-I, confi rmado pel a técnica de RT-PCR quant i tativo e pel a detecção da proteína em sobrenadantes de cul tura através de ensai o imunoenzimát i co. Na segunda etapa do trabalho, avaliamos a part i cipação do IGF-I ci rculante na evol ução natural da hanseníase. Utilizando ELISA quimi oluminescente, quantificamos os níveis de IGF-I, da principal proteína ligadora de IGF (IGFBP-3) e TNF-a no soro de indivíduos sadi os e pacientes que desenvolveram ou não quadros reacionais ao l ongo do tratamento. No caso dos pacientes reaci onais, a dosagem de IGF-I, IGFBP-3 e TNF-a fo i realizada em duas etapas: i ) no momento do diagnóstico e ii ) durante o aparecimento da reação, antes do tratamento específico. Ini cialmente, numa comparação entre paci entes que não desenvolveram reação, verificamos que 81% e 72% dos paci entes lepromatosos (LL) apresentaram níveis de IGF-I e IGFBP-3, respectivamente, abaixo do normal por i dade, diferentemente dos paci entes com outras formas clínicas. Dentre os pacientes reaci onais, 93% e 86% do grupo BL também apresentou níveis de IGF-I e IGFBP-3, respectivamente, abaixo do normal por i dade, diferentemente do grupo BL não-reaci onal , que apresentou níveis de IGFs similares aos indivíduos sadi os. Durante o desenvolvimento dos epi sódi os reaci onais, houve uma queda dos níveis de IGF-I, IGFBP-3 e da rel ação IGF/TNF-a no grupo LL com reação ti po II. Já no grupo de paci entes BL, observamos um aumento dos níveis de IGF-I e IGFBP-3, como uma tentativa de alcançar os níveis normais. Nossos dados sugerem a xv parti cipação destes fatores de crescimento endócrinos na ínt ima relação entre bacil o e a CS, como uma estratégi a de obtenção e manutenção de um nicho favorável de mul t iplicação e, ainda, os revelam como potenci ais candidatos a bi omarcadores dos episódi os reaci onais na hanseníase. / Neural injury is a maj or consequence of l eprosy and responsible for the disabili t ies installat i on, beyond to contribute to the st i gma of the disease. The nerve damage is exacerbated by the devel opment or l eprosy react i ons (Type I and Type II) and is correl ated to the immune response against Mycobacterium leprae – et i ol ogi c agent of leprosy that has especial tropism for macrophages and Schwann cells (SC) in peri pheral nerves. Insulin-like growth factors (IGFs) are pept i de hormones involved in metabolism, proliferati on induct i on, apoptosis inhibi t i on and cell different i at i on. Evidence from the li t erature also indicate immunomodulatory and ant i -inflammatory properti es of IGF-I. The aim of this study is to investi gate the involvement of IGF system in the M. leprae infect i on. Ini t ially, we verified the ant i -apoptoti c effect of the bacteria on human primary CS and ST88-14 lineage growing in serum-f ree condi t i ons by inhibi t ing caspase-3 activat i on. It was also demonstrated by immunocytochemistry, that the bacill us is able to induce the SC proliferat i on, this effect i s probably mediated by induct i on of IGF-I, as verified by quant i tative RT-PCR and confirmed by protein detecti on supernatants using immunoenzimat i c assay (ELISA). On the second phase we evaluate the parti cipat i on of ci rculating IGFs in the natural course of leprosy. Through chemi ol uminescent ELISA, we quantified the IGF-I, the main IGF binding protein (IGFBP-3) and TNF-a serum levels in heal t hy individuals and pat i ents who devel oped or not reacti onal states during the treatment. In the case of react i onal pat i ents, the IGF-I, IGFBP-3 and TNF-a was performed in two steps: i ) at the diagnosis of leprosy and ii) during react i onal episode, pri or to specific treatment. Ini t i ally, a comparison of nonreact i onal pat i ents, we found that 81% and 72% of lepromatous l eprosy (LL) showed IGF-I and IGFBP-3 levels, respectively, bel ow normal for age, unlike pat i ents wi th other clinical forms. Among the reacti onal pat i ents, 93% and 86% of BL group also showed IGF-I and IGFBP-3 levels, respectively, bel ow normal for age, unlike the nonreact i onal BL group, wi ch showed similar levels of IGFs to heal thy individuals. During the devel opment of reacti onal episodes, there was a decrease in the levels of IGF-I, IGFBP-3 and the IGF/TNF-a rat i o in the LL group wi t h type II reacti on. In the BL group undergoing type II reacti on, the IGF-I and IGFBP-e levels increased, as an attempt to reach normal levels. Our data suggest the involvement of these growth factors in the relat i onship between bacilli and CS as a strategy for obtaining and maintaining a favorable niche for mul t iplicat i on, and also reveal the IGFs as potencial candidates for bi omarkers of react i onal episodes in leprosy.

Orientador: Vânia Nieto Brito de Souza / Resumo: A infecção por Mycobacterium leprae (M. leprae) desencadeia alterações no status funcional das células de Schwann (SCs), responsáveis pela produção da bainha de mielina e homeostasia neural. Estudos prévios indicam que lesões nos nervos periféricos modulam a expressão de fatores-chave envolvidos na diferenciação e maturação das SCs. Na hanseníase, alterações funcionais nessas células podem estar envolvidas na patogênese do dano neural. O presente estudo buscou determinar a expressão dos fatores de transcrição KROX-20, SOX-10, JUN e do receptor p75NTR, envolvidos nos processos de diferenciação e maturação de SCs. Os dados foram obtidos a partir de cultura primária de SCs murinas expostas ao M. leprae durante sete e 14 dias, com diferentes multiplicidades de infecção (MOI 100:1, MOI 50:1). Os mesmos fatores foram avaliados in vivo, em nervos ciáticos de camundongos nude (NUFoxn1nu), após seis e nove meses de infecção. Comparando-se grupos experimentais em relação aos controles, nossos resultados em cultura de SCs demonstram redução significativa de KROX-20 e SOX-10, bem como elevação na frequência de células imunomarcadas por p75NTR. Paralelamente, nervos ciáticos de camundongos nude infectados por M. leprae apresentaram queda de KROX-20 e aumento de p75NTR, quando comparados aos animais não infectados. Em conjunto, nossos resultados corroboram achados prévios sobre a interferência de M. leprae na expressão de fatores-chave envolvidos na maturação celular, favorecendo a manuten... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mycobacterium leprae infection (M. leprae) triggers changes in the functional status of Schwann cells (SCs), which are responsible for the production of myelin sheath and neural homeostasis. Previous studies indicate that peripheral nerve injury modulates the expression of key factors involved in the differentiation and maturation of SCs. In leprosy, functional changes in these cells may be involved in the pathogenesis of neural damage. The present study sought to determine the expression of the transcription factors KROX-20, SOX-10, JUN and the neurotrophic receptor p75NTR, involved in the differentiation and maturation processes of SCs. Data were obtained from primary murine SCs culture exposed to M. leprae for seven and 14 days, with different multiplicities of infection (MOI 100:1, MOI 50:1). The same factors were evaluated in vivo on sciatic nerve of nude mice (NU-Foxn1nu), after six and nine months of infection. By comparing experimental groups versus controls, our SC culture results demonstrate significant reduction of KROX-20 and SOX-10, as well as elevation in the frequency of cells immunolabelled by p75NTR. In parallel, sciatic nerves of nude mice infected with M. leprae showed a decrease in KROX-20 and an increase of p75NTR when compared to uninfected animals. Our results corroborate previous findings on M. leprae interference in the expression of key factors involved in cell maturation, favoring the maintenance of a non-myelinating phenotype in SCs, with possible ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-06-06T12:07:05Z No. of bitstreams: 1 rosane_b_oliveira_ioc_bp_0007_2003.pdf: 28903576 bytes, checksum: 4167a22455a36ea7147bd41b4dc7b566 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-06T12:07:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rosane_b_oliveira_ioc_bp_0007_2003.pdf: 28903576 bytes, checksum: 4167a22455a36ea7147bd41b4dc7b566 (MD5) Previous issue date: 2003 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A principal complicação na hanseníase é o desenvolvimento de deformidades ao longo do curso crônico da doença. Neste estudo, nós utilizamos uma linhagem humana maligna de células de Schwann (ST88-14) para caracterizar a indução do fenômeno de morte celular e a produção de citocinas em células de Schwann (CS) in vivo e in vitro. Têm sido demonstrado que CS tornam-se ativadas e podem produzir citocinas durante injúria experimental e em algumas neuropatias. As funções fisiológicas das células de Schwann e a compreensão de como citocinas, M. leprae e seus componentes causam danos a estas células foram investigados. As células infetadas estimulam a formação do granuloma e subsequentes destruição bacilar e o dano no nervo. A recente descrição dos mecanismos de entrada da bactéria nesta célula e, conseqüentemente, o estudo da interação do M. leprae e da CS no que se refere à resposta imune inata (expressão de receptores Toll - TLR) são essenciais para tentar esclarecer os mecanismos envolvidos no desenvolvimento de lesões do nervo. Assim a expressão do receptor Toll foi avaliado na linhagem ST88-14, em células de Schwann primárias e em biópsias de pele. Investigamos também a possibilidade de células de Schwann humanas serem susceptíveis a morte pela ativação do TLR2. Foi observado a expressão de TLR2 em células de Schwann e a ativaçao destas células com um agonista TLR2, um lipopeptídeo sintético que abrange a porção N-terminal putativa da lipoproteína 19kD de M. leprae induziu a relativa secreção de citocinas IL-6 e IL-8, bem como induziu um aumento no número de células com características de células apoptóticas. A apoptose induzida pelo lipopeptídeo e a produção de citocinas nas CS foi bloqueada com anticorpo monoclonal anti-TLR2. Foi também observado que as CS em lesões de pele de pacientes com hanseníase expressam TLR2 bem como a presença de apoptose in vivo. A capacidade de ligantes de M. leprae induzirem apoptose de CS através de TLR2 proporciona um mecanismo pelo qual a ativação da resposta imune inata contribui para a lesão de nervo na hanseníase. Neste projeto, a capacidade e efeitos de TNFa/TGFb e do M. leprae nas células ST88-14 foram investigados. Neste estudo nós mostramos que as células de Schwann expressam constitutivamente ambos os receptores de TNF. Os resultados demonstraram um índice aumentado de apoptose nas culturas das células na presença de TNFa /TGFb em comparação com controle. Finalmente, um índice aumentado de apoptose também foi observado quando na ST88-14 foi mantida em cultura na presença de M. leprae vivo ou morto. Os dados indicam que TNF-Rs bem como uma resposta específica para TNFa e o efeito sinergístico com TGFb, assim como a infecção pelo M. leprae podem estar implicados na patogênese da lesão do nervo na hanseníase / A major complication in leprosy is the development of deformities along the chronic course of disease. In the present study, a malignant human Schwann cell line (ST88-14) was used to characterize the induction of cell death and the production of cytokines in these in vivo and in vitro SCs. It had previously been shown that, in some neuropathies, SC became activated and produced cytokines during experimental injury. Here, the physiological functions of SC and how cytokines, M. leprae, and M. leprae components possibly cause damage to these cells were investigated. The recent description of the mechanisms utilized by M. leprae to enter SCs and, consequently, the study of M. leprae-SC interaction in the innate immune response (Toll-like receptors - TLR) are essential to understanding what is involved in the development of nerve damage. In this connection, an evaluation was made of TLR expression in skin biopsies and the ST88-14 cell line and whether these cells were susceptible to cell death through TLR2 activation. It was found that TLR2 expression on SCs and their activation by a TLR2 agonist - a synthetic lipopeptide comprising the N-terminal portion of the putative M. leprae 19kD lipoprotein – simultaneously induced IL-6 and IL-8 secretion and triggered increased production of apoptotic cells, which, along with cytokine production, was blocked by an anti-TLR2 monoclonal antibody. Besides demonstrating the presence of TLR2 expression in the SCs of skin lesions of leprosy patients, SCs were also identified in lesions that had undergone apoptosis in vivo. The ability of M. leprae ligands to induce apoptosis of schwann cells through TLR2 provides a mechanism by which activation of the innate immune response contributes to nerve injury in leprosy. Thus, by investigating the capacity and effects of TNFa/TGFb and M. leprae within the human ST88-14 cell line, this study showed that SCs constituitively expressed both TNF receptors and that, in comparison to the controls, their presence triggered increased apoptosis in culture, also observed when ST88-14 was maintained in culture in the presence of live and/or dead M. leprae.. It would, therefore, seem apparent that these observations are clear indications that the TNF-Rs, in conjunction with a specific TNFa response, the synergistic effect with TGFb, and M. leprae infection are all implicated in the pathogenesis of nerve damage

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) lucineia_kontos_ioc_dout_2009.pdf: 75178965 bytes, checksum: 32149962187e4997d9d42f8788cd70c8 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença sistêmica infecto-contagiosa crônica causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que afeta principalmente a pele e nervos periféricos dos seres humanos. Apesar dos intensos e bem controlados programas de terapia multidroga, a transmissão desta doença continua ocorrendo e um grande número de indivíduos acometidos permanece em risco de desenvolver dano ao nervo. A lesão neural na hanseníase é decorrente da capacidade do M. leprae infectar os nervos periféricos, alojando-se preferencialmente no interior de células de Schwann (CS). O presente trabalho teve como objetivo geral contribuir para o entendimento da interação M. leprae - CS, e como objetivos específicos: 1) estabelecer e caracterizar fenotipicamente culturas de CS de rato (CSPR) e humanas primárias (CSHP), comparando com a linhagem de CS humana ST88-14; 2) determinar a cinética de associação do M. leprae a estas células; 3) analisar aspectos morfológicos da interação do M. leprae com a CS; e 4) estudar o efeito do M. leprae sobre a expressão da cadeia a-2 da laminina-2, Beta-distroglicana, Desert Hedgehog (Dhh) e gangliosídeo 9-O-acetil GD3 pela CS. Os resultados deste trabalho mostraram que as CS ST88-14, as CSPR e as CSHP apresentam características de CS com fenótipo amielínico. Através de microscopia eletrônica de varredura foi observado que as CS ST88-14 tratadas ou não com o M. leprae formaram monocamada e que 50 por cento destas células apresentaram M. leprae aderidos com 2 horas de tratamento. As bactérias apresentavam-se aderidas, envolvidas ou não por filopódios, e em processo de internalização. O grau de associação do M. leprae às CSPR e CSHP foi semelhante ao observado nas CS ST88-14. Uma baixa porcentagem de CS ST88-14 mostraram expressão constitutiva do gangliosídeo 9-O-Acetil GD3 Quando tratadas com o M. leprae letalmente irradiado estas células apresentaram uma modulação positiva para esta molécula e seu padrão de expressão, inicialmente difuso tornou-se pontual com o curso temporal do tratamento com as bactérias. A análise do efeito do M. leprae sobre a expressão da cadeia a-2 da laminina-2 em CSHP mostra que o bacilo não modula a expressão desta molécula tanto ao nível traducional como transcricional. Já o M. leprae modulou negativamente a expressão de RNAm de ß-distroglicana em CSHP. Entretanto não afetou o nível da protéina nas condições experimentais utilizadas. O M.leprae também modulou negativamente a expressão de RNAm de Dhh nestas células. Como camundongos ôknockoutõ para o gene dhh apresentam microfasciculação no nervo e 20 por cento das biopsias de nervo de pacientes com hanseníase apresentam microfasciculação, investigamos a expressão de Dhh em nervos de hanseníase com e sem microfasciculação. Biopsias com microfasciculação apresentaram uma considerável diminuição na expressão de RNAm de Dhh quando comparados com pacientes que apresentaram nervo sem microfasciculação. Com os resultados obtidos nesse trabalho mostramos que o M. leprae é capaz interagir com a CS in vitro e que moléculas potencialmente relevantes nesta interação são afetadas por esta bactéria, podendo isso desencadear e/ou promover a patogenia observada na hanseníase / Leprosy is an infectious and contagious disease caused by Mycobacterium leprae, an obligate intracellular parasite. The disease affects predominantly the skin and the peripheral nerves in humans. Despite the control programs implemented and the establishment of multidrug treatment (MDT), the transmission of the disease still occurs in high levels. Individuals affected by the disease are at risk of developing severe disabilities and deformities. The nerve damage observed in leprosy is caused by the presence of M. leprae in the nerves, mainly inside Schwann cells (SCs). The present study aimed to investigate the M. leprae-Schwann cell interaction, consisting of the following objectives: i) establishment and phenotypic characterization of cultures from primary rat Schwann cells (PRSC) and primary human Schwann cells (PHSC); ii) analysis of the capacity of M. leprae to associate these cells; iii) morphological analysis of M. leprae interaction with the ST88-14 human SC cell line by electron microscopy; and iv) investigation of the effect of M. leprae on the Schwann cell expression of α2- laminin, -dystroglycan, desert hedgehog (Dhh) and 9-O-acethyl-GD3. The results showed that ST88-14 SC, PRSC, and PHSC display a non-myelinating phenotype. Scanning electron microscopy showed that ST88-14 SC cultures treated or not with M. leprae formed a monolayer and that 50% of these cells displayed M. leprae on their surface after a two-hour treatment with the bacteria. The bacteria were in contact with the cell surface, amid fillipodia or lying on smooth membrane regions; some of them were in the course of being internalized. A similar degree of association of M. leprae to PRSC and to PHSC was observed. A low percentage of the ST8814 SC constitutively expressed the 9-O-acetyl GD3. After treatment with lethally irradiated M. leprae these cells exhibited an upregulation of this ganglioside, with an additional change in the expression pattern, which was initially difuse and became spotty. The results obtained also suggest that M. leprae is unable to modulate the expression of laminin-α2 in PHSC, both at the transcriptional and at the translational level. In contrast, live M. leprae was able to downregulate the levels of -dystroglican mRNA to in PHSC cultures, although protein levels were unaffected. Moreover, M. leprae stimulus induced downregulation of Dhh mRNA in PHSC. As dhh knockout mice present minifascicles in the nerves, and about 20% of leprosy biopsies display microfasciculation, we ascertained the Dhh expression in leprosy nerve biopsies with microfasciculation, comparing it with the ones without this morphological pattern. Nerve biopsies with microfasciculation exhibited significantly lower levels of this factor, speculatively related to the structural disarrangement usually found in the leprosy nerves. The results of this study showed the possible utilization of Schwann cells in vitro models to study M. leprae-Schwann cell interaction. M. leprae was able to affect the expression of relevant SC molecules involved in the interaction with the bacillus, with a potential link of this modulation with the pathogenesis of the leprosy nerve damage.

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rychelle_medeiros_ioc_mest_2014.pdf: 1978487 bytes, checksum: f4ad898bc71b1f2bac123e0403daac80 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O Mycobacterium leprae, patógeno intracelular causador da hanseníase, infecta com sucesso células da glia do sistema nervoso periférico, denominadas células de Schwann (CS). Estas células são responsáveis pela mielinização e envio de metabólitos, como o lactato e o piruvato, para os axônios, mantendo assim os processos energéticos associados à transdução de sinal nos nervos periféricos. A interação entre o bacilo e sua célula hospedeira vem sendo alvo de muitos estudos de modulação imunológica, desmielinização e de metabolismo lipídico, porém as possíveis modulações sobre o metabolismo energético destas células impostas pelo patógeno permanecem negligenciadas e desconhecidas. Para determinar estas modulações, estudamos o metabolismo energético de uma linhagem de células de Schwann humanas (ST8814) infectadas in vitro por M. leprae purificado a partir de extratos de coxim plantar de camundongos atímicos nu/nu. Analisamos processos de entrada e quebra de glicose, a fermentação, potencial elétrico mitocondrial e biossíntese de lipídios. A internalização de glicose foi avaliada através do seu análogo fluorescente 2-NBDG e o potencial elétrico mitocondrial monitorado através da sonda lipofílica catiônica TMRM Para analisar a fermentação da glicose quantificamos lactato através do kit lactato liquiform (Labtest) e analisamos a atividade da enzima lactato desidogenase (LDH) em suas duas isoformas. Para análises de quebra de glicose e biossíntese de lipídios foram avaliadas atividades de enzimas chaves como fosfofrutoquinase-1 (PFK-1), glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) e ATP citrato liase (ACL) através do monitoramento da redução/oxidação de NADH ou redução de NADP+ em 340 nm. Células infectadas apresentaram aproximadamente o dobro da captação de 2-NBDG e liberaram no sobrenadante a metade do lactato observado nas culturas controle. Este efeito foi acompanhado da diminuição de atividade de LDH- M, isoforma capaz de converter piruvato em lactato. A fluorescência de TMRM indicou redução do potencial elétrico mitocondrial nas células infectadas. Em contrapartida estas células demonstraram aumento significativo de atividade das enzimas G6PD e ACL. Concluímos que o M. leprae é capaz de modular a captação de glicose, fermentação, potencial elétrico mitocondrial e enzimas chaves do metabolismo energético de células de schwann humanas da linhagem ST8814 / Mycobacterium leprae , an intracellular pathogen which causes lep rosy, is able to infect Schwann cells (SC) in peripheral nervous system. These cells are responsible for myelination and release of metabolites such as lactate and pyruvate to axons and signal transduction in peripheral nerves. The host - pathogen interactio n in leprosy has been target of several studies of immune modulation, demyelination and lipid metabolism. However, modulations on the energy metabolism of these cells during infection by mycobacteria remain unknown. Here, we performed an in vitro study of the energy metabolism in the human SC cell line ST8814 infected with M. leprae purified from footpads of athymic mice and evaluate the glucose uptake and cleavage, fermentation, mitochondrial electrical potential and lipid biosynthesis. The glucose uptake was evaluated using a fluorescent analog, 2 - NBDG, and mitochondrial electrical potential monitored using a lipophilic cationic probe, TMRM. Also, fermentation was evaluated by lactate quantification using Liquiform kit (Labtest) and by activity of lactate desidogenase (LDH) enzyme into its two isoforms. Then, we analyzed the activity of key enzymes in the glucose cleavage and lipid biosynthesis: 1 - phosphofructokinase (PFK - 1), glucose - 6 - phosphate dehydrogenase (G6PD) and ATP citrate lyase (ACL) by monitoring the reduction / oxidation NADH or NADP + reduction at 340 nm. We demonstrated infected cells increased 2 - fold the uptake of 2 - NBDG and reduced the lactate production when comparing with uninfected cultures. This effect was followed by a decreased activity of LDH - M isoform, which is converts pyruvate to lactate. The fluorescence of TMRM indicated a reduction of mitochondrial electrical potential in M. leprae - infected SC. Interestingly, these cells showed a significant increase of activity of G6PD and ACL en zymes. Thus, we conclude that M. leprae can modulate glucose uptake, fermentation, mitochondrial electrical potential and key enzymes of energy metabolism of human Schwann cells of lineage ST8814

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 wagner_baetas_ioc_dout_2006.pdf: 6224563 bytes, checksum: b9154dd330ca56ad67886153b5bb6a4f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O receptor para manose receptor (RM) é uma glicoproteína transmembrana que é expressa em vários tipos celulares, mas, pouca ou nenhuma informação sobre RM existe em células de Schwann (CS). Mostramos que CS de rato em culturas primárias de células dissociadas ou em explantes de nervo bem como numa linhagem de Schwannoma humano (ST88-14) liga uma neoglicoproteína manosil/albumina de soro bovino- isotiocianate de fluoresceina (man/BSA-FITC) de uma maneira altamente específica. Após incubação com man/BSA-FITC, a análise por citometria de fluxo demonstra 62% de células ST88-14 e 90% de CS positivas, um aumento dose-dependente de ligantes marcads e inibição quase total pela competição com D-manose 250 mM ou com a proteína (altamente manosilada) peroxidase de raiz forte (HRP) ~ 1.1 µM. O tratamente de SC cultivadas com dexametasona (0.1 µg/ml) ou interferon ? (IFN-?? \2013 100 U/ml) seguido por marcação com man/BSA-FITC e a análise por citometria de fluxo mostra um acréscimo e um decréscimo, respectivamente, da captação do ligante. Explantes de nervo ciático cultivados na presence de IFN-?? mostram colocalização de man/BSA-FITC e imunoreatividade para MHC classe II. A análise ultra-estrutural de células ST88-14 após incubação com HRP- Au coloidal com ou sem subsequente seguimento a 37ºC mostra uma localização inicial na superfície e internalização do traçador dependente de temperatura e de tempo. Células ST88-14 e CS dissociadas bem como nervos recentemente \201Cesgarçados\201D mostram reatividade a um anticorpo policlonal contra o domínio C-terminal do RM de macrófagos murinos (anti-cMR). No caso de nervos \201Cesgarçados\201D, a imunorreatividade é particularmente abundante em regiões topograficamente homólogos a alças paranodais Além disto, a imuno-histoquímica ultra-estrutural de nervo ciático incluído em Lowicryl mostra reatividade ao anti-cMR, com máxima deposição do anticorpo secundário-Au em pericários de CS mielinizantes ou não-mielinizantes. Proteínas de extratos de SC e ST88-14, separadas por SDS-PAGE, e estudadas pela ligação das lectinas endógenas mostram que ambos os tipos celulares compartilham uma proteína ligadora de HRP de ~180 kDa com macrófagos peritoneais. Uma única banda de 180 kDa foi também obtida em \201Cimmunoblots\201D com anti-cMR. Nossos resultados sugerem que células de um Schwannoma e CS expressam uma proteína MR-semelhante em um estado potencialmente funcional e que ambos os tipos podem ser modelos úteis em estudos do papel deste receptor em diferentes estados infecciosos/inflamatórios ou na homeostase do sistema nervoso periférico / The mannose receptor (MR) is a transmembrane glycoprotein that is expressed in several cell types but little or no information is available on Schwann cells (SC). We show that rodent SC in primary cultures of dissociated cells or explant nerve cultures and a human Schwannoma cell line (ST88-14) bind the exogenous MR ligand neoglycoprotein mannosyl/bovine serum albumin-fluorescein isothiocyanate (man/BSA-FITC) in a highly specific manner. After incubation with man/BSA-FITC, flow cytometry demonstrates 62% positive ST88-14 cells and 90% positive SC cells, a dose-dependent increase in tagged ligands and near total inhibition of binding by 250 mM D-mannose or ~ 1.1 μ M of the highly mannosylated protein horseradish peroxidase (HRP). Treatment of cultured SC with dexamethasone (0.1 μ g/ml) or interferon  (IFN-   – 100 U/ml) followed by tagging with man/BSA-FITC and analysis by flow cytometry shows an increase and a decrease, respectively, of the ligand uptake by the putative receptor. Sciatic nerve explants cultured in the presence of IFN-   show colocalization of man/BSA-FITC and MHC class II immunoreactivity. Ultrastructural analysis of ST88-14 cells after incubation with HRP-colloidal gold without or with subsequent chasing at 37ºC mostra localização inicial na superfície cellular e internalização ation on the cell surface and temperature- and time dependent internalization of the probe. ST88-14 cells and dissociated SC and recently teased nerves exhibit reactivity to a polyclonal antibody against the C-terminal domain of the mouse macrophage MR (anti-cMR). In the case of teased nerves, immunoreactivity was particularly abundant in regions topographically homologous to paranodal loops. Furthermore, ultrastructural immunohistochemistry of Lowicryl-embedded sciatic nerve from normal animals showed reactivity to anti-cMR with maximal deposition of Au-tagged secondary antibody in myelinating or non-myelinating SC somata. SDS-PAGE separated proteins studied by endogenous lectin binding of SC and ST88-14 extracts show that both share a unique HRP-binding protein of about 180 kDa with peritoneal macrophages. A single band of 180 kDa was also obtained in immunoblots with anti- cMR. Our results suggest that Schwannoma cells and SC in vitro and in situ express a MR-like protein in a prospectively functional state and that both types may be useful models for studies regarding the role of this receptor in different infectious/inflammatory states or in homeostasis of the peripheral nervous system

Submitted by Mariane Bertolucci Casalenovo null (mary_bc14@hotmail.com) on 2017-09-14T00:20:08Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL.pdf: 10749096 bytes, checksum: 4412c078d6e18d64f519d7ac0952d26d (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-15T13:49:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 casalenovo_mb_me_bot.pdf: 10749096 bytes, checksum: 4412c078d6e18d64f519d7ac0952d26d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T13:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 casalenovo_mb_me_bot.pdf: 10749096 bytes, checksum: 4412c078d6e18d64f519d7ac0952d26d (MD5) Previous issue date: 2017-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A infecção por Mycobacterium leprae (M. leprae) desencadeia alterações no status funcional das células de Schwann (SCs), responsáveis pela produção da bainha de mielina e homeostasia neural. Estudos prévios indicam que lesões nos nervos periféricos modulam a expressão de fatores-chave envolvidos na diferenciação e maturação das SCs. Na hanseníase, alterações funcionais nessas células podem estar envolvidas na patogênese do dano neural. O presente estudo buscou determinar a expressão dos fatores de transcrição KROX-20, SOX-10, JUN e do receptor p75NTR, envolvidos nos processos de diferenciação e maturação de SCs. Os dados foram obtidos a partir de cultura primária de SCs murinas expostas ao M. leprae durante sete e 14 dias, com diferentes multiplicidades de infecção (MOI 100:1, MOI 50:1). Os mesmos fatores foram avaliados in vivo, em nervos ciáticos de camundongos nude (NUFoxn1nu), após seis e nove meses de infecção. Comparando-se grupos experimentais em relação aos controles, nossos resultados em cultura de SCs demonstram redução significativa de KROX-20 e SOX-10, bem como elevação na frequência de células imunomarcadas por p75NTR. Paralelamente, nervos ciáticos de camundongos nude infectados por M. leprae apresentaram queda de KROX-20 e aumento de p75NTR, quando comparados aos animais não infectados. Em conjunto, nossos resultados corroboram achados prévios sobre a interferência de M. leprae na expressão de fatores-chave envolvidos na maturação celular, favorecendo a manutenção de fenótipo não mielinizante nas SCs, com possíveis implicações na reparação de nervos periféricos adultos. / Mycobacterium leprae infection (M. leprae) triggers changes in the functional status of Schwann cells (SCs), which are responsible for the production of myelin sheath and neural homeostasis. Previous studies indicate that peripheral nerve injury modulates the expression of key factors involved in the differentiation and maturation of SCs. In leprosy, functional changes in these cells may be involved in the pathogenesis of neural damage. The present study sought to determine the expression of the transcription factors KROX-20, SOX-10, JUN and the neurotrophic receptor p75NTR, involved in the differentiation and maturation processes of SCs. Data were obtained from primary murine SCs culture exposed to M. leprae for seven and 14 days, with different multiplicities of infection (MOI 100:1, MOI 50:1). The same factors were evaluated in vivo on sciatic nerve of nude mice (NU-Foxn1nu), after six and nine months of infection. By comparing experimental groups versus controls, our SC culture results demonstrate significant reduction of KROX-20 and SOX-10, as well as elevation in the frequency of cells immunolabelled by p75NTR. In parallel, sciatic nerves of nude mice infected with M. leprae showed a decrease in KROX-20 and an increase of p75NTR when compared to uninfected animals. Our results corroborate previous findings on M. leprae interference in the expression of key factors involved in cell maturation, favoring the maintenance of a non-myelinating phenotype in SCs, with possible implications for the repair of adult peripheral nerves.

OBJETIVO: avaliar o efeito das neuregulinas 1-alfa e 1-beta na regeneração de nervos ciáticos de camundongos C57BL/6J, adultos, machos, através da técnica de tubulização. MÉTODOS: Utilizaram-se 18 animais, divididos em 3 grupos, implantando-se prótese de polietileno em falhas de 4,0 mm no nervo ciático esquerdo: grupo 1 contendo apenas colágeno purificado (Vitrogen®); grupo 2, colágeno associado a neuregulina 1-alfa; grupo 3 com colágeno e neuregulina 1-beta. O grupo controle foi formado por 6 segmentos de nervos ciáticos direitos. Após 4 semanas, os animais foram sacrificados; extraiu-se segmento do ponto médio do nervo regenerado no interior das próteses, padronizaram-se cortes histológicos e confecção das lâminas para análise histomorfométrica. Confrontaram-se os resultados estatisticamente. RESULTADOS: Os animais tratados com neuregulinas tiveram maior número de axônios mielinizados, com diferença estatisticamente significante quando comparados ao grupo colágeno. Não houve diferença estatística entre os grupos de neuregulinas 1-alfa e 1-beta. CONCLUSÃO: a adição de neuregulinas proporcionou aumento significativo do número de fibras mielinizadas. / PURPOSE: To evaluate the effect of neuregulins 1-alpha and 1-beta on the regeneration the sciatic nerves of male adult C57BL/6J mice, using the tubulization technique. METHODS: Eighteen animals were used, divided into three groups. A polyethylene prosthesis was implanted in a 4.0 mm defect of the left sciatic nerve, as follows: group 1 containing only purified collagen (Vitrogen®); group 2, collagen with neuregulin 1-alpha; group 3, collagen with neuregulin 1-beta. The control group was formed by six segments of right sciatic nerves. Four weeks later, the animals were sacrificed. A segment from the midpoint of the nerve regenerated inside the prostheses was extracted, histological sections were standardized and slides were made up for histomorphometric analysis. The results were statistically compared using the Tukey multiple comparisons test and Students t test. RESULTS: The animals treated with neuregulins had greater numbers of myelinized axons, with a statistically significant difference in relation to the collagen-only group. There was no statistical difference between the neuregulin 1-alpha and 1- beta groups. CONCLUSION: It was concluded that the addition of neuregulins provided a significant increase in the number of myelinized fibers.

Orientador: Vânia Niéto Brito de Souza / Resumo: A infecção pelo Mycobacterium leprae (ML) estimula um processo de desdiferenciação e proliferação das células de Schwann (SCs) que pode contribuir para a disseminação do bacilo. Os macrófagos (MOs) são células efetoras da resposta imune que promovem a eliminação de patógenos, entretanto, na hanseníase são colonizados pelo ML. Sabe-se que os MOs podem apresentar uma polarização funcional na qual os MOs M1 apresentam características pró-inflamatórias e microbicidas enquanto os MOs M2 atuam na reparação tecidual e possuem perfil anti-inflamatório. SCs infectadas pelo ML produzem mediadores capazes de interferir com a função dos MOs aumentando sua sobrevida e promovendo sua migração. Embora diferentes programas funcionais tenham sido observados em MOs de pacientes com formas polares da hanseníase a influência de SCs nesse processo não é sabida. Neste estudo avaliamos se SCs infectadas pelo ML podem interferir na polarização de MOs murinos derivados de medula óssea. Para tanto, culturas primárias de SCs murinas foram infectadas experimentalmente com bacilos viáveis e cocultivadas com MOs. Nossos resultados indicam que a produção de óxido nítrico foi baixa nas culturas de MOs após a infecção com o bacilo, mas mostrou-se aumentada nas coculturas de MOs e SCs infectadas pelo ML. A infecção com ML não induziu produção significante das citocinas IL-6, IL-10 e TNF em culturas de MOs e SCs, entretanto, a interação entre MOs e SCs infectadas com o bacilo resultou em aumento na produção de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mycobacterium leprae (ML) infection stimulates dedifferentiation and proliferation of Schwann cells (SCs) that may contribute to the spread of the bacillus. Macrophages (MOs) are effector cells of the immune response that promote the elimination of pathogens, however, in leprosy they are colonized by ML. It is known that MOs can present a functional polarization in which M1 MOs show pro-inflammatory and microbicidal activities while M2 MOs act in tissue repair presenting an anti-inflammatory profile. SCs infected by ML produce mediators able to interfere with MOs function, increasing their survival and promoting their migration. Although different functional programs have been observed in MOs from patients with polar forms of leprosy, the influence of SCs in this process is not known. In this study we evaluated whether SCs infected with ML could interfere in the polarization of murine MOs derived from bone marrow. For this purpose, primary cultures of murine SCs were experimentally infected with viable bacilli and co-cultivated with MOs. Our results indicate that nitric oxide production was low in cultures of MOs after infection with the bacillus, but it was increased in the co-cultures of MOs and ML-infected SCs. The infection with ML did not induce significant production of IL-10, TNF and IL-6 in cultures of MOs and SCs, however, the interaction between MOs and ML infected-SCs resulted in increased production of cytokines, mainly IL-10, inducing a decrease in the TNF/IL-10 ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T14:51:55Z No. of bitstreams: 1 Priscila.pdf: 5312265 bytes, checksum: e6fe06db27bb77797bf4afbd3f7e4d5b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T14:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Priscila.pdf: 5312265 bytes, checksum: e6fe06db27bb77797bf4afbd3f7e4d5b (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma das doenças mais antigas a acometer o homem e tem como agente etiológico o Mycobacterium leprae (ML), um patógeno intracelular obrigatório que infecta principalmente, macrófagos e células de Schwann (CS). As CS estão envolvidas na imunomodulação da lesão neurológica causada pelo ML, podendo, assim, desencadear uma resposta inflamatória frente à presença da bactéria. Entre as citocinas que participam dessa resposta está o Fator de Necrose Tumoral (TNF- ), molécula envolvida na patogênese de diversas doenças que acometem os sistemas nervosos central (SNC) e periférico (SNP). Foi descrito recentemente que o TNF- pode atuar como um mediador autócrino na lesão neural, sendo capaz de ativar CS na ausência do patógeno. Nesse trabalho foi avaliada a contribuição do TNF- e do ML para a injúria nervosa da hanseníase, através da análise da participação do efeito autócrino dessa citocina na resposta a infecção pelo ML e no processo de ativação sustentada das CS, utilizando a linhagem humana ST88-14. Nossos resultados sugerem que no dano neural da hanseníase, a infecção pela micobactéria pode contribuir para ativação sustentada das CS, ativando vias de sinalização com participação de ERK 1/2, e induzindo a produção de TNF- , que por sua vez, promove seus diversos efeitos através da interação com outras células do espaço endoneural, não sendo, imediatamente secretada. Além disso, foi abservada a participação do mecanismo de retroalimentação positiva dessa citocina na ativação dessas células, que pode não só aumentar os níveis dessa molécula no meio, como também a secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-1 , IL-6 e IL-8, que cooperam com a resposta imune e com o estado de ativação prolongado das CS. / Leprosy is one of the oldest diseases to afflict humankind. Its pathological agent is Mycobacterium leprae (ML), an obligatory intracelular bacterium that infects, mainly, macrophages and Schwann cells (SC). SC are glial cells envolved in the imune response regulation that occurs during the peripheral neural damage caused by ML. Among the citokynes that contribute to this response, there is the Tumor Necrosis Factor (TNF- ), a molecule related to the pathogenesis of many diseases of the central (CNS) and peripheral nervous systems (PNS). It has been described that TNF- may act as an autocrine mediator in neural injury, and therefore, may activate SC in the absence of ML. This study evaluated the contribution of TNF- and ML to nerve injury in leprosy, by analysing the participation of the citokyne´s positive feedback mechanism in ML infection and in the SC sustained activation state, using the human lineage ST88-14. Our results suggest that in the leprosy neural injury, ML can induce SC activation by recruting ERK pathways, and promoting TNF- production, which instead of acting as secreted cytokine, evokes its biological effects through interactions with other cells in the endoneural space. In addition, it was also observed the participation of TNF- `s positive feedback mechanism in SC activation, which increased the secretion of this molecule and other proinflamatory cytokines, such as IL-1 , IL-6 and IL-8.