Diversos delineamentos experimentais que são aplicados correntemente tomam como base experimentos agronômicos. Esses dados experimentais são, geralmente, analisados usando-se modelos que consideram uma variância residual constante (ou homogênea), como pressuposto inicial. Entretanto, esta pressuposição mostra-se relativamente forte quando se está diante de situações para as quais fatores ambientais ou externos exercem considerável influência nas medidas experimentais. Neste trabalho, são estudados modelos para a média e a variância, simultaneamente, com a variância estruturada de duas formas: (i) por meio de um preditor linear, que permite incorporar variáveis externas e fatores de ruído e (ii) por meio de efeitos aleatórios, que permitem acomodar tanto o efeito longitudinal quanto o efeito de superdispersão, no caso de medidas binárias repetidas no tempo. A classe de modelos lineares generalizados duplos (MLGD) foi aplicada a um estudo observacional que consistiu em medir a mortalidade de frangos de corte no fim da condição de espera pré-abate. Nesse problema, é forte a evidência de que alguns fatores influenciam a variabilidade, e consequentemente, diminuem a precisão das análises inferenciais. Outro problema agronômico relevante, associado à horticultura, são os experimentos de cultura de tecidos vegetais, em que o número de explantes que regeneram são contados. Como esse tipo de experimento apresenta um grande número de parâmetros a serem estimados, comparado ao tamanho da amostra, os modelos existente podem gerar estimativas questionáveis ou até levar a conclusões erroneas, uma vez esse que são baseados em grandes amostras para se fazer inferência estatística. Foi proposto um modelo linear generalizados duplo, para os dados de proporções, de uma perspectiva Bayesiana, visando a análise estatística sob pequenas amostras e a incorporação do conhecimento especialista no processo de estimação dos parâmetros. Um problema clínico, que envolve dados binários medidos repetidamente no tempo é apresentado e são propostos dois modelos que acomodam o efeito da superdispersão e a dependência longitudinal das medidas, utilizandos-se efeitos aleatórios. Foram obtidos resultados satisfatórios nos três problemas estudados. Os MLGD permitiram identificar os fatores associados à mortalidade das aves de corte, o que permitirá minimizar perdas e habilitar os processos de manejo, transporte e abate aos critérios de bem-estar animal e exigências da comunidade européia. O MLGD Bayesiano permitiu identificar o genótipo associado ao efeito de superdispersão, aumentando a precisão da inferência de seleção de variedades. Dois modelos combinados foram propostos logit-normal-Bernoulli-beta e o probit-normal-Bernoulli-beta, que acomodaram satisfatoriamente a superdispersão e a dependência longitudinal das medidas binárias. Esses resultados reforçam a importância de se modelar a média e a variância conjuntamente, o que aumenta a precisão na pesquisa agronômica, tanto em estudos experimentais quanto em estudos observacionais. / Several experimental designs that are currently applied are based on agricultural experiments. These experimental data are, usually, analised with statistical models that assume constant residual variance (or homogeneous), as basic assumption. However, this assumption shows hard to stand for, when environmental or external factors exert strong influence over the measurements. In this work, we study the joint modelling for the mean and the variance, the latter being structured on two ways: (i) through a linear predictor, which allows the incorporation of external variables and/or noise factors and (ii) by the use of random effects, that accommodate jointly the possible overdispersion effect and the dependence of longitudinal data in the case of binary measusurements taken over time. The class of double generalized linear models (DGLM) was applied to an observational study where the poultry mortality was measured in the preslaughter operations. With this situation, it can be observed that there is a strong influence from some environmental factors over the variability observed, and consequently, this reduces the precision of the inferential analysis. Another relevant agricultural problem, related to horticulture, is the tissue culture experiments, where the number of regenerated explants is counted. Usually, this kind of experiment use a large number of parameters to be estimated, when compared with the sample size. The current frequentist models are based on large samples for statistical inference and, under this experimental condition, can generate unreliable estimates or even lead to erroneous conclusions. A double generalized linear model was proposed to analyse proportion data, under the Bayesian perspective, which can be applied to small samples and can incorporate expert knowledge into the parameter estimation process. One clinical research, that measured binary data repeatedly through the time is presented and two models are proposed to fit the overdispersion effect and the dependence of longitudinal measurements, using random effects. It was obtained satisfactory results under these three problems studied. the DGLM allowed to identify factors associated with the poultry mortality, that will allow to minimize loss and improve the process, since the catching until lairage on slaughterhouse, agreeing with animal welfare criteria and the European community rules. The Bayesian DGLM allowed to identify the genotype associated with the overdispersion effect, increasing the precision on the inference about varieties selection. Two combined models were proposed, a logit-normal- Bernoulli-beta and a probit-normal-Bernoulli-beta, which have both addressed the overdispersion effect and the longitudinal dependence of the binary measurements. These results reinforce the importance to modelling mean and dispersion jointly, as a way to increase the precision of agricultural experimentation, be it on experimental studies or observational studies.

Diversos delineamentos experimentais que são aplicados correntemente tomam como base experimentos agronômicos. Esses dados experimentais são, geralmente, analisados usando-se modelos que consideram uma variância residual constante (ou homogênea), como pressuposto inicial. Entretanto, esta pressuposição mostra-se relativamente forte quando se está diante de situações para as quais fatores ambientais ou externos exercem considerável influência nas medidas experimentais. Neste trabalho, são estudados modelos para a média e a variância, simultaneamente, com a variância estruturada de duas formas: (i) por meio de um preditor linear, que permite incorporar variáveis externas e fatores de ruído e (ii) por meio de efeitos aleatórios, que permitem acomodar tanto o efeito longitudinal quanto o efeito de superdispersão, no caso de medidas binárias repetidas no tempo. A classe de modelos lineares generalizados duplos (MLGD) foi aplicada a um estudo observacional que consistiu em medir a mortalidade de frangos de corte no fim da condição de espera pré-abate. Nesse problema, é forte a evidência de que alguns fatores influenciam a variabilidade, e consequentemente, diminuem a precisão das análises inferenciais. Outro problema agronômico relevante, associado à horticultura, são os experimentos de cultura de tecidos vegetais, em que o número de explantes que regeneram são contados. Como esse tipo de experimento apresenta um grande número de parâmetros a serem estimados, comparado ao tamanho da amostra, os modelos existente podem gerar estimativas questionáveis ou até levar a conclusões erroneas, uma vez esse que são baseados em grandes amostras para se fazer inferência estatística. Foi proposto um modelo linear generalizados duplo, para os dados de proporções, de uma perspectiva Bayesiana, visando a análise estatística sob pequenas amostras e a incorporação do conhecimento especialista no processo de estimação dos parâmetros. Um problema clínico, que envolve dados binários medidos repetidamente no tempo é apresentado e são propostos dois modelos que acomodam o efeito da superdispersão e a dependência longitudinal das medidas, utilizandos-se efeitos aleatórios. Foram obtidos resultados satisfatórios nos três problemas estudados. Os MLGD permitiram identificar os fatores associados à mortalidade das aves de corte, o que permitirá minimizar perdas e habilitar os processos de manejo, transporte e abate aos critérios de bem-estar animal e exigências da comunidade européia. O MLGD Bayesiano permitiu identificar o genótipo associado ao efeito de superdispersão, aumentando a precisão da inferência de seleção de variedades. Dois modelos combinados foram propostos logit-normal-Bernoulli-beta e o probit-normal-Bernoulli-beta, que acomodaram satisfatoriamente a superdispersão e a dependência longitudinal das medidas binárias. Esses resultados reforçam a importância de se modelar a média e a variância conjuntamente, o que aumenta a precisão na pesquisa agronômica, tanto em estudos experimentais quanto em estudos observacionais. / Several experimental designs that are currently applied are based on agricultural experiments. These experimental data are, usually, analised with statistical models that assume constant residual variance (or homogeneous), as basic assumption. However, this assumption shows hard to stand for, when environmental or external factors exert strong influence over the measurements. In this work, we study the joint modelling for the mean and the variance, the latter being structured on two ways: (i) through a linear predictor, which allows the incorporation of external variables and/or noise factors and (ii) by the use of random effects, that accommodate jointly the possible overdispersion effect and the dependence of longitudinal data in the case of binary measusurements taken over time. The class of double generalized linear models (DGLM) was applied to an observational study where the poultry mortality was measured in the preslaughter operations. With this situation, it can be observed that there is a strong influence from some environmental factors over the variability observed, and consequently, this reduces the precision of the inferential analysis. Another relevant agricultural problem, related to horticulture, is the tissue culture experiments, where the number of regenerated explants is counted. Usually, this kind of experiment use a large number of parameters to be estimated, when compared with the sample size. The current frequentist models are based on large samples for statistical inference and, under this experimental condition, can generate unreliable estimates or even lead to erroneous conclusions. A double generalized linear model was proposed to analyse proportion data, under the Bayesian perspective, which can be applied to small samples and can incorporate expert knowledge into the parameter estimation process. One clinical research, that measured binary data repeatedly through the time is presented and two models are proposed to fit the overdispersion effect and the dependence of longitudinal measurements, using random effects. It was obtained satisfactory results under these three problems studied. the DGLM allowed to identify factors associated with the poultry mortality, that will allow to minimize loss and improve the process, since the catching until lairage on slaughterhouse, agreeing with animal welfare criteria and the European community rules. The Bayesian DGLM allowed to identify the genotype associated with the overdispersion effect, increasing the precision on the inference about varieties selection. Two combined models were proposed, a logit-normal- Bernoulli-beta and a probit-normal-Bernoulli-beta, which have both addressed the overdispersion effect and the longitudinal dependence of the binary measurements. These results reinforce the importance to modelling mean and dispersion jointly, as a way to increase the precision of agricultural experimentation, be it on experimental studies or observational studies.

Muitos estudos têm sido direcionados para gerar melhorias na cultura de cana-de-açúcar, sendo uma das alternativas o uso de técnicas biotecnológicas, como a embriogênese somática (ES). O objetivo deste projeto foi estudar a multiplicação celular na ES de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280. Culturas embriogênicas (CE) e não-embriogênicas (CNE) foram monitoradas e parâmetros bioquímicos foram analisados. Foi observado que CE e CNE apresentaram crescimento máximo aos 24 dias de cultivo, sendo que as CE apresentaram maior incremento em matéria fresca. Dos carboidratos analisados, a sacarose foi predominante em CE, enquanto a glicose predominou em CNE. Os conteúdos de glicose e frutose variaram simultaneamente em CE. As concentrações de amido, poliaminas (Pas) totais e a razão entre PAs [Razão PA= Put/(Spd+Spm)] apresentaram maiores valores nas CNE, sendo a espermidina a poliamina predominante em CE e putrescina em CNE. O conteúdo de proteínas totais foi significativamente maior em CE, em todas as fases de crescimento. / Many studies have been directed to generate improvements in the sugarcane cultures, one of the alternative use of biotechnology techniques such as somatic embryogenesis (SE). The objective of this project was to study the cell multiplication in SE of sugarcane, variety SP80-3280. Embryogenic cultures (EC) and non-embryogenic (NEC) were monitored and biochemical parameters were analyzed. Was observed that EC and NEC showed maximum growth to 24 days of culture, and the EC showed greater increase in fresh weight. Of the carbohydrates tested, sucrose was predominant in EC, while glucose was predominant in the NEC. The contents of glucose and fructose varied simultaneously in EC. The concentrations of starch, polyamines (PAs) and the ratio of total PAs [Ratio PA = Put / (Spd + Spm)] showed higher values in the NEC, and the spermidine is predominant polyamine to EC and putrescine is predominant in NEC. The content of total protein was significantly higher in CE, at all stages of growth.

A técnica de cultura de tecidos permite a propagação rápida e maciça de propágulos geneticamente semelhantes, isentos de doenças, sendo amplamente empregada para a obtenção de gemas adventícias e embriões somáticos visando principalmente, a multiplicação clonal sob ação de reguladores de crescimento. Resultados satisfatórios foram obtidos com a espécie Bactris gasipaes Kunth. por meio da regeneração direta de gemas adventícias e de embriões somáticos, no entanto, as consequências decorrentes da prolongada manutenção in vitro de espécies perenes como a pupunheira, não estão elucidadas, sendo que as pesquisas mais expressivas ocorrem com espécies anuais e restritas a órgãos específicos. Considerando que o tempo de cultivo pode promover a senescência e a habituação de determinados tecidos aos reguladores de crescimento, afetando consideravelmente o potencial morfogênico, o objetivo principal do presente trabalho foi investigar a ocorrência destes processos em folhas, raízes e bases caulinares de plântulas e microplantas com um e oito anos de cultivo, respectivamente. Para tanto, o processo de senescência foi monitorado por meio de análises histológicas, ultraestruturais e histoquímicas à detecção de substâncias ergásticas e à fragmentação do DNA, ao passo que o processo de habituação, foi monitorado por meio de análises morfofisiológicas, histológicas e histoquímicas. Os resultados pertinentes ao processo de senescência evidenciaram a ocorrência de intenso processo de morte celular programada nas células de diversos tecidos nas estruturas analisadas das microplantas, sendo que estes eventos foram escassos e limitados às bases caulinares nas plântulas. Além disso, foi observada a presença elevada de plastoglóbulos no interior dos cloroplastos e de compostos fenólicos nas estruturas foliares e radiculares das microplantas. Já, em relação aos resultados obtidos à detecção do processo de habituação nestas microplantas, quando comparados às plântulas, foram detectados problemas relacionados ao alongamento da parte aérea e do sistema radicular, bem como alterações morfológicas nas raízes e uma pronunciada redução no potencial morfogênico das células pré-procambiais em relação às plântulas. Estes resultados evidenciam que a manutenção in vitro de pupunheiras por longos períodos promoveu o envelhecimento dos propágulos em decorrência à senescência generalizada, bem como provavelmente os conduziu ao processo de habituação aos reguladores de crescimento ANA e/ou BAP, inviabilizando a propagação em grande escala desta espécie. / The tissue culture technique allows rapid and massive spread of propagules genetically similar, free from diseases, being the technique widely employed to obtain adventitious buds and somatic embryos mainly targeting the clonal multiplication under the action of growth regulators. Satisfactory results have been obtained with the specie Bactris gasipaes Kunth. through direct regeneration of adventitious buds and somatic embryos, however, the consequences from prolonged in vitro maintenance of perennial species such as peach palm are not clear, and the most significant research occur with annual species and restricted to specific organs. Whereas the cultivation time can promote senescence and habituation of certain tissues to the growth regulators, affecting considerably the morphogenic potential, the main objective of this study was to investigate the occurrence of these processes in leaves, roots and stem bases of seedlings and microplants with one and eight years of cultivation, respectively. Thus, the senescence process was monitored by histological, ultrastructural and histochemical detection of ergastic substances and DNA fragmentation, whereas the habituation process was monitored by analyses histologic, histochemic and morpho-physiological. The relevant results from the senescence process showed the occurrence of an intensive process of programmed cell death in cells of various tissues of the analised microplants structures, and these events were rare and limited to the stem bases in the seedlings. Furthermore, it was observed the high presence of plastoglobules inside chloroplast and phenolic compounds in the leaf and root structure of microplants. Already, the results obtained in relation to the detection of the habituation process in these microplants, when compared to the seedlings, were detected problems related to the elongation of shoots and roots, as well as morphological changes in roots and a pronounced reduction in the morphogenic potential of pre procambial cells compared to seedlings. These results demonstrate that the in vitro maintenance of peach palm for long periods promoted the aging of seedlings due to senescence widespread and probably led to the habituation process, to the growth regulators NAA and/or BAP, difficulting the propagation on a large scale of this species.

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:30:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leticia Reis.pdf: 8581445 bytes, checksum: 82298b67980249e52bd02781fd0c08df (MD5) Previous issue date: 2014-02-05 / significant world production. The true fruits of the strawberry are dry and called achenes while the fleshy and edible portion actually it is the floral receptacle developed. This set of achene and receptacle features the non-climacteric fruit pattern ripening, characterized by not show a peak respiration and ethylene production during the ripening process and also for this fruits not being able to complete the ripening after harvesting. Due to the small size of the plant, rapid propagation and production of fruit, the strawberry became the model plant in studies of non- climacteric fruit ripening, particularly with regard to the ethylene role in this process. Fruit ripening the focused studies have revealed the existence of a family of protein receptors responsible for the plant ethylene perception. In strawberry, have been identified so far three ethylene receptors genes sequences, divided into two subfamilies (FaETR1 and FaERS1 - subfamily I and FaERS2 - subfamily II). Among these genes, based on the literature, we believe that FaETR1 gene, a member of the ethylene receptors subfamily I, can develop a greater role to the other receptors in the control of perception and ethylene signal transduction. To assess the involvement of FaETR1 ethylene receptor in the strawberry ripening and toward an understanding of the relationship between ethylene and nonclimacteric fruits ripening, we seek the silencing of this particular gene. Thus, the objective of this work was the construction of a binary plasmid structure in hairpin format (hpRNA) that induces the activation of RNA interference system (RNAi) on the translation of FaETR1 gene in ethylene receptor protein. Also, knowing the importance of an appropriate regeneration an plant transformed selection method, we seek also develop a proper in vitro regeneration protocol of Camino Real and Festival strawberries cultivar, as well as to assess the sensitivity of these plants to kanamycin (antibiotic) and glufosinate ammonium (herbicide) selective agents, whose genes are present in pCAMBIA 3301 and pCAMBIA2301 cloning vectors used in this study. / O morangueiro (Fragaria x ananassa Duch.) é uma cultura de elevado valor comercial e de expressiva produção mundial. Os frutos verdadeiros do morangueiro são secos e chamados de aquênios enquanto que a porção carnosa e comestível na verdade se trata do receptáculo floral desenvolvido. Este conjunto de aquênio e receptáculo apresenta padrão de maturação de frutos não-climatéricos, caracterizado por não apresentar um pico de respiração e produção de etileno durante o processo de maturação e também, por não serem capazes de completar a maturação após a colheita. Devido o pequeno tamanho da planta, rápida propagação e produção de frutos, o morangueiro se tornou planta modelo nos estudos sobre a maturação de frutos não-climatéricos, principalmente no que se refere ao papel do etileno neste processo.Estudos voltados à maturação de frutos revelaram a existência de uma família de receptores proteicos responsável pela percepção do etileno em plantas. Em morangueiro, foram identificadas até o momento três sequencias de genes de receptores de etileno, divididos em duas subfamílias (FaETR1 e FaERS1 – Subfamília I e FaERS2 – Subfamília II). Dentre estes genes, baseados na literatura, acreditamos que o gene FaETR1, membro da subfamília I dos receptores de etileno, possa desenvolver um papel superior aos demais no controle da percepção e transdução de sinal do etileno. No intuito de avaliar o envolvimento do receptor de etileno FaETR1 na maturação do morangueiro e visando o entendimento da relação entre etileno e maturação de frutos não-climatéricos, buscamos o silenciamento deste gene em específico. Para tanto, o objetivo deste trabalho foi a construção em plasmídeo binário de uma estrutura em formato de grampo (hpRNA) que induza a ativação do sistema de RNA de interferência (RNAi) sobre a tradução do gene FaETR1 em proteína receptora de etileno. Além disso, sabendo da importância de um apropriado método de regeneração e seleção de plantas transformadas, buscamos também desenvolver protocolo de regeneração in vitro de plantas de morangueiro das cultivares Camiño Real e Festival, bem como, avaliar a sensibilidade destas plantas aos agentes seletivos canamicina (antibiótico) e glufosinato de amônia (herbicida) cujos genes estão presentes nos vetores de clonagem pCAMBIA3301 e pCAMBIA2301 utilizados neste trabalho.

Atualmente a procura por produtos sustentáveis têm-se mostrado cada vez mais frequente e promissora. Em espécies de importância comercial, procura-se obter a maior produtividade possível dentro de um curto espaço de tempo aliado à preservação do meio ambiente. Dentro disso, a transformação genética de plantas se mostra uma alternativa atrativa para a geração de variedades de cana-de-açúcar que gerem produtos de maneira mais eficaz. O sucesso da transformação genética está diretamente associada a cultura de tecidos de plantas que precisa ser adequada a cada genótipo e situação de cultivo, sendo a luminosidade um dos principais fatores para a produção de plantas vigorosas. Outro fator importante é a seleção das plantas transgênicas, que precisam ser submetidas a uma quantidade de agente seletivo suficiente para identificar as plantas modificadas geneticamente. Em cana-de-açúcar, a identificação de plantas transgênicas por PCR e a definição do número de cópias é um procedimento de difícil execução e muito oneroso. Isto se dá pois no processo transformação via biolística, a inserção de genes é aleatória, produzindo plantas com variados números de cópias. Em consideração a estes fatores envolvidos na eficiência de obtenção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar, os objetivos deste trabalho foram o aperfeiçoamento do protocolo de cultura de tecidos, transformação genética da variedade SP803280 com os genes xth, AtDdm1, como também, definir genes de referência para a quantificação do número de cópias dos genes xth e AtDdm1 inseridos na variedade SP803280 e do gene neo na RB835089, análise de ploidia e tamanho de genoma dos eventos transgênicos comparado com as plantas controle. No estudo a respeito da melhor qualidade de luz durante o cultivo in vitro na fase de regeneração de plantas, tem-se que a luz branca e a junção das luzes LED e branca se mostraram melhores para regeneração e desenvolvimento das plantas enquanto que para plântulas, as luzes LED e branca separadamente foram mais efetivas no crescimento. Para a seleção das plantas uma concentração de geneticina entre 40 e 50 mgL-1 é recomendada. As taxas de sucesso nas transformações genéticas para o gene xth variaram entre 2,5 a 18,3% dependendo do experimento e para AtDdm1 foi de 2,2% em um bombardeamento.Não houveram alterações de ploidia e tamanho do genoma nos transgênicos das duas variedades em relação à planta selvagem. Os genes p4h e prr foram identificados como os melhores para a quantificação relativa de genes inseridos por PCR em tempo real na variedade SP803280 enquanto que para a RB835089 aprt e prr se mostraram mais eficazes. A análise do número de cópias inseridas em eventos transgênicos por PCR em tempo real foi possível através das duas metodologias de cálculo testados por este trabalho, com resultados que concordam com uma tendência nesta determinação de maneira simples e rápida. / Currently the demand for sustainable products has been shown to be frequent and promising. In species of commercial importance, there is an effort to obtain the highest possible productivity in a short time, along with the environment preservation. In this context, genetic transformation of plants appears as an attractive alternative for the development of sugarcane varieties able to generate products in a more effective way. The genetic transformation success is directly associated to plant tissue culture that requires specific condition for each genotype and cultivation process, in which, luminosity is one of the main factors that determines the production of vigorous plants. Another important factor is the selection of transgenic plants, that occur by exposing plants to a sufficient amount of selective agent in order to identify only genetic modified plants. In sugarcane, identification of transgenic plants by PCR and the definition of copy numbers is a difficult procedure to implement and usually is very costly. It is because in the process of genetic transformation by biolistic, the insertion of genes occurs randomly and also produce plants with varied copy numbers. In consideration of these factors directly involved in the efficiency to obtain sugarcane transgenic plants the objectives of this study were the improvement of a tissue culture protocol, the genetic transformation of the variety SP803280 with xth and AtDdm1 genes. Also, the studies include the definition of reference genes for determining the number of copies inserted of xth and AtDdm1 genes into the variety SP803280 and neo gene in RB835089, ploidy analysis and genome size of the transgenic events compared to control plants. In the study related to the best light quality for in vitro plant regeneration, white light and the combination of LED and white lights proved to be better for plants regeneration and development while for seedlings, LED and white light separately were more effective for growth. In order to obtain selection of transgenic plants, geneticin concentration between 40 and 50 mg L-1 is recommended. Success rates in xth genetic transformation ranged from 2.5 to 18.3% depending on the experiment, and for AtDdm1 was only 2.2% in just one biolistic bombardment. There were no changes in ploidy and genome size in transgenic events related to their wild type plant. The genes p4h and prr were defined to be the best for determining the copy number of transgenic events by real time PCR in SP803280 variety, while for RB835089, the genes aprt and prr were the most effective. The analysis of the number of inserted copies was possible using the two calculation methodologies tested by this work, with results that agree with a tendency in a simple and fast quantification methodology.

As características físico-químicas da parede celular constituem um grande gargalo na obtenção dos açúcares fermentáveis a partir dos polissacarídeos de parede celular presentes na biomassa, fato conhecido como recalcitrância da biomassa vegetal. A utilização da biomassa na produção de biocombustíveis requer um melhor entendimento sobre os mecanismos que permeiam os processos de deposição de parede celular e metabolismo de lignina. Nesse contexto, a maior parte do conhecimento foi gerado em espécies eudicotiledôneas, havendo uma significativa lacuna para gramíneas, apesar do seu grande potencial para acúmulo de biomassa. Portanto, há uma necessidade de se estabelecer ferramentas-modelos que permitam elucidar características exclusivas da parede celular secundária de gramíneas C4, cujo conhecimento não pode ser extrapolado a partir de eudicotiledôneas. O presente trabalho propôs estabelecer um sistema de células em suspensão como ferramenta-modelo em estudos sobre parede celular secundária em gramíneas C4. Para tal, três espécies foram inclusas: Sorghum bicolor, Setaria viridis e cana-de-açúcar. Devido às características recalcitrantes do sorgo, apenas as suspensões celulares de S. viridis e cana-de-açúcar foram estabelecidas. Subsequentemente, estas culturas foram utilizadas na tentativa de se desenvolver duas aplicações para o estudo de parede secundária: i) culturas xilogênicas, em que as células em suspensão são induzidas a se transdiferenciar em elementos traqueais; e ii) sistema de protoplastos para ensaios de transativação para testar o potencial papel de fatores de transcrição na regulação transcricional da deposição de parede celular. Somente as culturas de cana-de-açúcar responderam aos tratamentos testados para indução da transdiferenciação de elementos traqueais, baseados em protocolos estabelecidos para outras gramíneas. Análises de expressão gênica por RT-qPCR foram utilizadas para caracterizar a variação da expressão de genes-alvo durante este processo. Ademais, as paredes celulares das células em suspensão de cana-de-açúcar foram digeridas com um coquetel de hidrolases para a produção de protoplastos. A cultura de células em suspensão de cana-de-açúcar e suas aplicações aqui estabelecidas poderão ser utilizadas na elucidação de aspectos únicos do processo de deposição de parede celular secundária em gramíneas C4 / The physicochemical features of the cell wall represent a major bottleneck for the processing of cell wall polysaccharides present in biomass into fermentable sugars, a fact known as plant biomass recalcitrance. Biofuels production from biomass requires a better understanding on the molecular mechanisms underlying secondary cell wall deposition and lignin metabolism. In this context, most of the current knowledge has been generated in eudicots species, whereas significantly less is known for grasses, despite of their great potential for biomass accumulation. Therefore, the development of tools that allow the discovery of specific aspects of C4 grasses secondary cell walls is of great interest, because this knowledge cannot be extrapolated from data generated for eudicots. In the present work, we aimed to develop suspension cell cultures as a tool for the study of secondary cell wall metabolism in C4 grasses. For this purpose, three species were employed: Sorghum bicolor, Setaria viridis and sugarcane. Because of the recalcitrant nature of sorghum, only suspensions cells of S. viridis and sugarcane were successfully established. Subsequently, these cultures were used in an attempt to develop two applications to study secondary cell walls: i) xylogenic cultures, in which the suspension cells are induced to transdifferentiate into tracheary elements; and ii) a protoplast system to be used in transactivation assays to test the potential role of transcriptional factors in the regulation of secondary wall deposition. Only the suspension cultures of sugarcane showed a positive response to the tested treatments for the induction of tracheary elements formation, which were based on modifications of previous protocols established for other grasses. Gene expression analysis by RT-qPCR was used to characterize the variation of the expression of target genes during this process. Moreover, the cell walls of sugarcane suspension cells were digested with a cocktail of hydrolases to produce protoplasts, which were used in transactivation assays between transcriptional factors known to be involved in secondary cell wall deposition and their putative target genes, as a proof-of-concept. The sugarcane suspension cells and their applications established in this work might be used to further elucidate unique aspects of secondary cell wall deposition in C4 grasses

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Outra planta ornamental de destaque é a Dracaena sanderiana, conhecida como Bambu-da-sorte, sendo atualmente uma das plantas de vaso mais populares em todo o mundo. Os arranjos formados foram popularizados segundo a tradição chinesa do Feng Shui, sendo oferecidos como presentes com intuito de trazer sorte, energizar ambientes e dissipar fluxos negativos. A tecnologia da cultura de tecidos pode auxiliar na propagação destas espécies, visando à produção de mudas com elevada qualidade genética e sanitária, substituindo assim, os métodos de propagação por sementes ou estacas. Tanto as técnicas convencionais de micropropagação, como o uso de biorreatores podem ser utilizadas para a propagação destas espécies ornamentais, viabilizando aumentar a oferta de mudas para o mercado. Os estudos foram conduzidos em experimentos que visaram à multiplicação de G. paniculata, em meios MS semissólido e líquido em biorreatores com sistema de imersão temporária (STI) e o estabelecimento e indução inicial de brotações de D. sanderiana, testando diversos explantes e reguladores de crescimento, bem como avaliar o estresse oxidativo, ocorrido in vitro na fase de estabelecimento. Neste contexto, o trabalho teve como objetivos: a) realizar uma análise comparativa entre a multiplicação de G. paniculata in vitro pelo sistema convencional e por biorreatores com sistema de imersão temporária; b) definir um protocolo eficiente para o estabelecimento de D. sanderiana e analisar a atividade das enzimas antioxidantes da mesma, durante o processo de estabelecimento in vitro. Quanto aos resultados de micropropagação e multiplicação de G. paniculata, o sistema de biorreator de imersão temporária foi mais eficiente, demonstrando maior proliferação de brotações e maior número de folhas. Para D. sanderiana os resultados obtidos mostraram que o procedimento de desinfestação mais promissor para a espécie foi com hipoclorito de sódio a 2% por 15 minutos e lavagens de 10 minutos com Cetazima 250 mgL-1, com adição de PPM (Plant Preservative Mixture) ao meio de cultura. Dentre os meios testados, o meio MS semissólido suplementado com 15 mgL-1de 2ip e 0,5 mgL-1 AIA e posterior diminuição para 2mgL-1de 2ip, foram os que apresentaram os melhores resultados quanto ao estabelecimento e indução de gemas. Quanto às análises enzimáticas, após 20 dias in vitro, os explantes de D. sanderiana já apresentaram uma adaptação ao ambiente, independente de serem expostos a luz ou ao escuro. / Floriculture brings many social and economic benefits, since it is possible to produce in small areas, fostering employment and thus keeping the man in the country. Brazil, by presenting very diverse climates and soils, is a nation that enables the growth of a wide variety of flowers and ornamental plants, both from native and exotic origins, and from temperate and tropical climates. The Gypsophila paniculata is a species that provides a large market among the cut flowers and can be commercially disseminated by vegetative methods such as rooting. Another outstanding ornamental plant is the Dracaena sanderiana, known as lucky bamboo, being currently one of the most popular pot plants worldwide, whose arrangements were popularized according to the Chinese tradition of Feng Shui, being offered as a gift with the intention of bringing luck, energizing environments and dispel negative flows. The tissue culture technology can aid spreading these species, aiming at producing seedlings with high genetic quality and health, thus taking the place of the methods of propagation by seeds or cuttings. Both conventional micropropagation techniques and the use of bioreactors can be used for the propagation of these ornamental species, enabling to increase the supply of seedlings to market. These studies were conducted through experiments which aimed at the reproducing of G. paniculata in semisolid and liquid media in bioreactors with a temporary immersion system (TIS) and the establishment and initial shoot induction of D. sanderiana, testing several explants and growth regulators, as well as at evaluating oxidative stress in vitro, occurred in the establishment phase. In this context, the study aimed at: a) conducting a comparative analysis between the multiplication of Gypsophila paniculata in vitro, both by conventional system and through bioreactors with temporary immersion system; b) defining an efficient protocol for in vitro establishment of Dracaena sanderiana and analyzing the activity of its antioxidant enzymes during the establishment process. Regarding the results of G.paniculata’s micropropagation and multiplication, the temporary immersion bioreactor system was more efficient, demonstrating greater proliferation of shoots and a greater number of leaves. Concerning D. sanderiana, results showed that the most promising decontamination procedure for the species was with sodium hypochlorite 2% for 15 minutes and 10 minute washes with Cetazima 250 mgL-1, with the addition of PPM to the cultural environment. Among the media tested, MS semisolid environment supplied with 15 mgL-1 2ip and 0.5 mgL-1 AIA and subsequent decrease to 2mgL-12ip presented the best results regarding the bud establishment and formation. In the enzymatic analysis, after 20 days in vitro, D.sanderiana explants already presented an adaptation to the environment, whether it be exposed to light or dark.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Cleome rosea é uma espécie nativa, de porte herbáceo, ocorrente em restingas brasileiras. Estudos recentes têm revelado o potencial medicinal da espécie para importantes propriedades farmacológicas, como por exemplo, as atividades anti-inflamatória, antigenotóxica, antiviral e antibacteriana. Porém, nos últimos anos, C. rosea não tem sido encontrada em várias regiões de seu ambiente natural, devido, principalmente, às ações antrópicas. Dessa forma, torna-se relevante o desenvolvimento de métodos de conservação que permitam o estudo e exploração das propriedades medicinais da espécie. O cultivo in vitro de raízes representa uma forma eficiente para produção de biomassa, devido ao rápido crescimento, produção estável de metabólitos, além de representar uma potencial fonte de explantes para a propagação em massa de diferentes espécies. O presente trabalho teve como objetivo a produção in vitro de culturas de raízes de C. rosea, associada à criopreservação, como forma de manutenção em longo prazo das culturas, monitorada através da análise de estabilidade genética. As culturas estabelecidas a partir de explantes radiculares de plantas propagadas in vitro de C. rosea demonstraram excelente capacidade de multiplicação de raízes em meio de cultura suplementado com o fitorregulador ANA, com manutenção dessa capacidade ao longo de sucessivas subculturas. Associado a esses resultados, o estabelecimento de protocolos de criopreservação pelo método de vitrificação resultou em elevados valores de frequência de recuperação do material após congelamento em nitrogênio líquido com as soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Os estudos de monitoramento da estabilidade genética, pela técnica de marcadores moleculares RAPD, revelaram a presença de polimorfismos significativos em uma das três culturas iniciadas a partir de raízes de C. rosea criopreservadas. Esses resultados demonstram as possibilidades de produção de raízes de C. rosea e conservação em longo prazo através da criopreservação, iniciando estudos inéditos para a espécie. / Cleome rosea is an herbaceous species found in the restinga vegetation of Brazil. Recent studies have reported its medicinal potential for important pharmacological properties, such as anti-inflammatory, antigenotoxic, antiviral and antibacterial activities. However, in recent years, no C. rosea plants have been found in their natural habitat, mainly due to human impact. Thus, it becomes applicable to the development of conservation methods that facilitate the study and exploration of the medicinal properties of C. rosea. The in vitro roots culture represents an efficient way to produce biomass, due to rapid growth, stable production of metabolites and represent a potential source of explants for mass propagation of different species. This study aimed to produce in vitro root cultures of C. rosea, associated with cryopreservation, as form of long-term maintenance of cultures, monitored by analysis of genetic stability. Cultures established from root explants of in vitro propagated plants of C. rosea showed excellent ability to multiplication of roots in culture medium supplemented with NAA plant regulator, maintaining this capacity during successive subcultures. Associated with these results, the establishment of protocols for cryopreservation by vitrification method resulted in high values of recovery frequency of the material after freezing in liquid nitrogen with vitrification solutions PVS2 and PVS3. Studies to monitoring the genetic stability by RAPD technique revealed the presence of significant polymorphisms in one of three cultures initiated from cryopreserved roots of C. rosea. These results demonstrate the potential production of roots of Cleome rosea and long-term conservation through cryopreservation, starting unpublished studies for the species.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticÃferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasnât any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation. / Plantas laticÃferas tÃm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteÃnas relacionadas à defesa vegetal em seu lÃtex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteÃnas e atividades descritas para o lÃtex de duas espÃcies laticÃferas. Tecidos de calos e raÃzes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos atravÃs de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à anÃlise histolÃgica para caracterizaÃÃo de laticÃferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas anÃlises. NÃo foi detectada qualquer estrutura laticÃfera em calos ou raÃzes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticÃferos se formam nas raÃzes. ProteÃnas solÃveis foram extraÃdas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimÃticos, tÃcnicas bioquÃmicas, imunolÃgicas e espectrometria de massas. A presenÃa de atividade contra fungos fitopatogÃnicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os lÃtex das espÃcies estudadas. ProteÃnas dos calos e raÃzes de C. procera, apresentaram atividade antifÃngica sobre fungos fitopatogÃnicos. Os percentuais de inibiÃÃo do crescimento vegetativo de hifas na presenÃa de proteÃnas de calos e raÃzes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, nÃo demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteÃnas de calos e raÃzes de C. grandiflora nÃo apresentaram qualquer efeito inibitÃrio sobre o crescimento de hifas ou germinaÃÃo de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescÃncia, foi possÃvel demonstrar que as proteÃnas extraÃdas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteÃdo citoplasmÃtico, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de aÃÃo contra fungos esteja relacionado à alteraÃÃo na permeabilidade da membrana plasmÃtica. TambÃm foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteÃnas de calos e raÃzes de C. procera atravÃs da produÃÃo de perÃxido de hidrogÃnio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raÃzes de C. procera, porÃm, osmotinas e proteases nÃo foram observadas em calos e raÃzes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticÃferas de C. grandiflora foram demonstradas exercer aÃÃo contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausÃncia de atividade antifÃngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausÃncia de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteÃnas antifÃngicas. Em calos e raÃzes de C. procera, alÃm de proteases, outras proteÃnas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifÃngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que nÃo diferenciam laticÃferos à um interessante modelo para estudar atividades associadas Ãs proteÃnas encontradas no lÃtex. Proteases antifÃngicas presentes no lÃtex de C. grandiflora nÃo foram encontradas nos tecidos sem formaÃÃo laticÃfera.