A regeneração in vitro é bastante utilizada em processos biotecnológicos. No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos na aquisição de competência para formação de novos órgãos. Em tomateiro (S. lycopersicum), a alta capacidade de regeneração in vitro é atribuída ao alelo Rg1, vinda de Solanum peruvianum, e que está presente na cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). Os genes de nanismo da cv Micro-Tom (MT) foram passados para MsK, obtendo-se, após 8 gerações de autofecundação (F8), a cv Micro-MsK. No presente estudo, após 6 gerações de retrocruzamentos (BC6Fn), criou-se MT-Rg1, com Rg1 isogênico a MT. Testes de regeneração in vitro mostraram que a formação de gemas caulinares adventícias para MT-Rg1 e Micro-MsK são equivalentes, evidenciando que a alta capacidade de regeneração de Micro-MsK é basicamente devido ao Rg1. Plantas MTRg1 apresentam freqüente formação de 3 cotilédones, excesso de ramificações caulinares e senescência atrasada, características ausentes nos parentais. Esses efeitos pleiotrópicos de Rg1 coincidem com aqueles descritos para alterações no hormônio citocinina. Testes de sensibilidade à citocinina e de tempo de senescência realizados por nós, bem como dosagem desse hormônio feita por outras equipes, descartaram essa hipótese. Enxertias recíprocas evidenciaram que a promoção da ramificação caulinar por Rg1 não é um sinal translocável, mas parece ser uma característica intrínseca do tecido. Rg1 também promoveu uma maior formação de raízes adventícias em estacas ex vitro, sugerindo que ele afeta o processo de competência para formação de órgãos em geral, e não somente a indução específica de gemas caulinares. Duplos mutantes entre Rg1 e mutantes com alteração na sensibilidade/metabolismo hormonal (dgt, brt e pro), ausência de ramificações caulinares (ls) e senescência acelerada (l) foram obtidos e testados quanto ao padrão de ramificações e à capacidade de regeneração in vitro. Além desses parâmetros, a presença de Rg1 suprimiu o fenótipo de folhas pouco recortadas do mutante hipersensível a giberelina (pro) e recuperou o sistema radicular pouco desenvolvido do mutante com baixa sensibilidade à auxina (dgt). Rg1 também foi capaz de reverter a ausência de ramificações laterais de ls, sendo que a mutação Me, o qual representa uma superexpressão de um gene do tipo KNOX, não foi capaz. Esse resultado sugere que Rg1 não é um gene do tipo KNOX, embora esses genes sejam considerados os principais controladores da competência. Analisando diferentes tipos de explantes em experimentos independentes, contatou-se que, em geral, as mutações brt (baixa sensibilidade a citocinina), dgt e ls diminuíram a capacidade de regeneração de Rg1, enquanto l aumentou. Rg1 mostrou-se particularmente epistático à mutação pro, revertendo o fenótipo de baixa formação de gemas caulinares desse mutante. Surpreendentemente, Rg1 provou ser mais sensível à auxina em testes de alongamento de segmentos de hipocótilos, sendo capaz de reverter o fenótipo do mutante dgt nesse mesmo teste. Em conjunto, esses resultados confirmam o papel de Rg1 na fase de aquisição da competência e sugerem uma interação dos hormônios giberelina e auxina nesse processo. / The In vitro regeneration process is widely used in plant biotechnology. However, the mechanisms involved in the acquisition of competence for organ formation are hitherto unknown. In tomato (S. lycopersicum), the high capacity for in vitro regeneration is attributed to the Rg1 allele from S. peruvianum, which is present in the cv MsK (S. lycopersicum x S. peruvianum). The dwarfism genes of the cv Micro-Tom (MT) were transferred to MsK, and, after 8 generations of selfing (F8), the cv Micro-Msk was obtained. Here, after 6 generations of backcrosses (BC6Fn), we created the MT-Rg1, which has Rg1 isogenic to MT. Tests of in vitro regeneration showed that shoot formation in MT-Rg1 and Micro-MsK are equivalent, suggesting that the high capacity of regeneration of Micro-MsK is basically due to Rg1. Comparing MT-Rg1 with the control MT, we noticed a high frequency of 3 cotyledon formation, increased shoot branching and late senescence, which are absent in the parentals. These pleiotropic effects of Rg1 coincide with those described for plants with alterations in the hormone cytokinin. Tests of sensitivity for cytokinin and senescence behavior carried out by us, as well as dosage of that hormone made by other researches, discarded that hypothesis. Reciprocal grafting showed that the promotion of shoot branching by Rg1 is not a transmissible signal, but seems to be an inherent characteristic of the tissue. Rg1 also increases adventitious roots formation of ex vitro cuttings, suggesting that it affects the process of competence, which is common for shoots and roots, instead of the specific induction of shoots. Double mutants between Rg1 and mutants with alteration in the sensitivity/metabolism of plant hormones (dgt, brt and pro), as well as mutants with absence of shoot branching (ls) and accelerated senescence (l) were obtained and tested for the capacity of in vitro regeneration. The presence of Rg1 suppressed the phenotype of less dissected leaves of the mutant hypersensitive to gibberrellin (pro) and rescued the phenotype of poor developed root system of the mutant with low auxin sensitivity (dgt). Rg1 was also able to revert the absence of axillary shoot formation in ls, whereas the mutant Me, which represents an over expression of a KNOX gene was not. This result suggests that Rg1 is not a KNOX gene, although those genes are considered the main controllers of the competence. Analyzing different types of explants in independent experiments, it was verified that, in general, the mutations brt (low sensibility to cytokinin), dgt and ls decreased the regeneration capacity of Rg1, while l increased it. Rg1 was particularly epistatic to the pro mutation, reverting the phenotype of little shoot formation of that mutant. Surprisingly, Rg1 proved to be more sensitive to auxin in the hypocotyl segment elongation test, being able to revert the phenotype of the mutant dgt in the same test. Together, these results confirm the role of the Rg1 in the process of acquisition of the competence and suggest an interaction of the hormones gibberellin and auxin in this process.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil. Como outras culturas de importância econômica, é também afetada por diversos patógenos como fungos, bactérias, vírus e fitoplasmas que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquitismo-da-soqueira da cana-de-açúcar (RSD). Esta doença não apresenta sintomas externos característicos de fácil reconhecimento. Dessa forma, a incidência do RSD pode não ser perceptível durante inspeções visuais de campo e, assim, ser facilmente disseminado de uma região para outra. A bactéria restrita ao xilema é transmitida mecanicamente de plantas infectadas para plantas saudáveis por meio da seiva presente em ferramentas de corte e em outros equipamentos durante o plantio, o cultivo e a colheita da cultura. Em razão da importância da cana-de-açúcar e do dano causado por Lxx, este trabalho visou avaliar a termoterapia e o cultivo in vitro em dois experimentos direcionados à obtenção de plantas de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 livres de Leifsonia xyli subsp. xyli e, assim, fornecer subsídio para o aprimoramento das medidas atuais de controle. O primeiro experimento combinou a termoterapia de toletes de uma gema (52 °C por 30 minutos) com o cultivo de meristemas apicais de três tamanhos (0,5 mm, 1,0 mm e 1,5 mm); o segundo combinou três tempos de termoterapia (1 hora, 2 horas e 3 horas) a 50 °C em gemas laterais imaturas isoladas do tolete com o cultivo in vitro. No primeiro experimento, os resultados de RT-PCR das amostras coletadas aos 15 dias na casa de vegetação mostraram que os três tamanhos de meristemas produziram plantas com títulos bacterianos em média 25 vezes mais baixos que suas genitoras, mas não as isentaram completamente de Lxx, com exceção de 8 plantas que não apresentaram Lxx com 90 dias de cultivo (4 plantas provenientes do cultivo de meristemas de 0,5 mm, 1 planta de meristema de 1,0 mm e 3 plantas de meristemas de 1,5 mm). Além disso, os meristemas de 0,5 mm não necessariamente regeneraram plantas com títulos mais baixos da bactéria quando comparados com os meristemas de 1,0 mm e 1,5 mm, mostrando que estes tamanhos testados não apresentaram correlação direta com o nível de infecção da planta regenerada por eles. Em relação ao segundo experimento, os resultados de RT-PCR mostraram que o incremento no tempo de termoterapia proporcionou maior redução nos títulos bacterianos, sendo os tratamentos de 2 horas e 3 horas os mais bem sucedidos com média de redução de 80,08% e 81,73%, respectivamente, mas não foi capaz de eliminar a bactéria. Portanto, estes experimentos demonstram que a termoterapia associada ao cultivo de tecidos é uma metodologia promissora, pois apresentaram redução da presença da bactéria Lxx em plantas de cana-de-açúcar, mas por não terem sido totalmente efetivos na eliminação da mesma, reforça a necessidade de estudos complementares. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil. Like other crops of economic importance, it\'s also affected by several pathogens such as fungus, bacteria, viruses and phytoplasmas that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting disease in sugarcane (RSD). This disease shows no external symptoms characteristic of easy recognition. Thus, the incidence of RSD may not be noticeable during visual inspection in the field and be easily spread from one region to another. The xylem-limited bacterium is transmitted mechanically from infected plants to healthy plants by the sap present in cutting tools and others equipments for planting, growing and harvesting the crop. Due to the importance of sugarcane and the damage caused by Lxx, this work aimed to evaluate thermotherapy and in vitro culture in two experiments in order to obtain sugarcane plants of variety SP80-3280 free from Leifsonia xyli subsp. xyli and thus provide subsidy for the improvement of current control methods. The first experiment combined thermotherapy on the individual bud (52 °C for 30 minutes) and the cultivation of apical meristems of three sizes (0,5 mm, 1,0 mm and 1,5 mm); the second combined three period of thermotherapy (1 hour, 2 hours and 3 hours) at 50 °C in immature lateral buds totally isolated from the tissue source followed by in vitro culture. In the first experiment, the results of RT-PCR samples collected at 15 days in the greenhouse showed that the three sizes of meristems produced plants with bacterial titers on average 25 times lower than their mother plants, but not completely exempted them from Lxx, except 8 plants that showed no Lxx after 90 days of cultivation (4 plants were from cultivation of meristems with 0,5 mm, 1 plant from 1,0 mm meristem and 3 plants from 1,5 mm meristems size). Furthermore, the meristems of 0,5 mm does not necessarily regenerate plants with lower title of the bacteria compared with the meristems of 1.0 mm and 1.5 mm, showing that these sizes tested did not present direct correlation with the level of infection on the plants regenerated from them. Regarding the second experiment, RT-PCR results showed that the increase in time of thermotherapy provided greater reduction in bacterial titers, and the treatments of 2 and 3 hours were the most successful with average reduction of 80,08 % and 81,73%, respectively, but was not able to eliminate the bacteria. Therefore, these experiments showed that thermotherapy associated with tissue culture is a promising methodology because it reduced titer of Lxx in sugarcane, but were not fully effective in eliminating the same, reinforcing the need for complementary studies.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Luciane_Leitzke.pdf: 527181 bytes, checksum: 1bd073c7e15cf594e5e31a8d64217660 (MD5) Previous issue date: 2006-03-05 / The success of mass micropropagation of fruit trees may be reached by using plant tissues culture techniques, since this has showed efficient results on seedlings production with high quality and health. However, for the commercial viability of micropropagation application in the field of horticulture and how this might compete with traditional methods of propagation (cuttings, etc.), it is necessary to decrease production costs. Therefore, the development of photo-autotrophic micropropagation systems (production of micropropagules in sugar-free medium under environmental conditions that promote photosynthesis of the culture) with natural light appear as a possibility to improve the efficiency of micropropagation and to reduce costs. This research aimed the photo-autotrophic multiplication of blackberry (Rubus spp.) cultivar Xavante and raspberry (Rubus idaeus L.) cultivars Batum and Heritage. Preliminary experiments was carried out to define the constitution of culture medium that provides better results, as on multiplication as on in vitro rooting of blackberry and raspberry, under conventional conditions of micropropagation. Then, using the best constitution of culture medium, it was done the study of the photo-autotrophic multiplication by using natural light. The MS medium enriched with BAP at 13 µM was the more efficient treatment on in vitro multiplication of leaves of blackberry Xavante and raspberries Batum and Heritage , inducing a higher number of leaves, shoots and buds. The best rooting condition for explants of the blackberry Xavante was reached by keeping the explants in WPM enriched with 2,5 µM AIB for a week followed by a regulator-free medium growth. Nevertheless, for raspberry Batum rooting, it is necessary the addition of 6,5 µM AIB. Under photo- autotrophic conditions, the aluminum foil was the best sealing material for the flasks. Regarding to in vitro multiplication for blackberry cultivar Xavante the best growth local was in greenhouse with the addition of 22 g L -1 sucrose to the medium; and for raspberry Batum was at 11,5 g L-1 sucrose but kept in growth room. For in vitro rooting of raspberry Batum cotton was the best sealing material, growth room and sugar-free medium were the best condition having a higher rooting percentage and root numbers per explants. / A cultura de tecidos é uma técnica que proporciona com sucesso a micropropagação massal de frutíferas e que já vem sendo utilizada com eficientes resultados para a produção de mudas sadias com alta qualidade. Entretanto, para que a aplicação da micropropagação na fruticultura torne-se viável comercialmente e possa competir com métodos tradicionais de propagação (estaquia, etc), é necessária a redução do custo de produção. Diante disso, o desenvolvimento de sistemas de micropropagação fotoautotrófica (produção de micropropágulos sem adição de sacarose no meio de cultura e sob condições ambientais que promovam a fotossíntese na planta) com o uso de luz natural surge como possibilidade que apresenta potencial para aumentar a eficiência da micropropagação e auxiliar na redução de seu custo. Assim, este trabalho teve como objetivo a multiplicação fotoautotrófica de amoreira-preta (Rubus spp.) cv. Xavante e de framboeseira (Rubus idaeus L.) cvs. Batum e Heritage. Dessa forma, foram realizados os estudos preliminares a fim de definir a constituição do meio de cultura que propicie os melhores resultados, tanto na multiplicação como no enraizamento in vitro de amorapreta e framboesa, sob condições convencionais de micropropagação. A partir daí, foi realizado o estudo da micropropagação fotoautotrófico com o uso da luz natural, utilizando a constituição do meio de cultura que propiciou os melhores resultados. Pelos resultados obtidos, conclui-se que o meio MS adicionado de BAP na concentração de 13µM é o tratamento mais eficiente na multiplicação in vitro de explantes com folhas de amoreira-preta Xavante e framboeseira Batum e Heritage , induzindo maior número de folhas, brotações e gemas. Para o enraizamento in vitro de amoreira-preta Xavante , o meio WPM adicionado de 2,5µM AIB e mantido por uma semana, seguido do cultivo em meio livre de regulador é o melhor meio de enraizamento; para framboeseira Batum , é necessária a adição de 6,5µM de AIB. Em condições fotoautotróficas o alumínio é o melhor modo de vedação dos frascos de cultivo. Para a multiplicação in vitro de amoreira-preta cv. Xavante , o melhor local de cultivo é a casa de vegetação e a adição de 22 g L -1 de sacarose no meio de cultura e de 11,5g L-1 para framboeseira Batum , mantida na sala de crescimento. Para o enraizamento in vitro de framboeseira cv. Batum, o algodão é o melhor modo de vedação dos frascos de cultivo; o melhor local de cultivo é a sala de crescimento, sem a adição de sacarose no meio de cultura, obtendo-se maior porcentagem de enraizamento, número de raízes por explante.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cerejeira-do-Rio-Grande (Eugenia involucrata DC.) is a Brazilian forest species with traits of economic interest, especially in the forestry, horticulture, landscape, environmental and medicinal sectors. However, it has recalcitrant seeds, which begin to lose viability after two weeks of gathering. Moreover, doesn t known how its genetic variability is distributed. This study aimed to developed methodologies for in vitro culture of E. involucrata and evaluate the genetic variability in accessions maintained in situ and ex situ. In vitro propagation, besides desinfestation, we evaluated aspects of in vitro growth and development after the inoculation of the apical and nodal segments in different nutritive media. We also analyzed the effect of introduction of different growth regulators in the optimization of in vitro multiplication. For callus induction in vitro were evaluated methods of superficial desinfestation, ways of introduction of plant growth regulators, the effect of different light regimes, of the use of antioxidants and of the different cytokinins. The formation of callus on different aspects were evaluated. We tested different methods for extraction of genomic DNA from this specie using different plant tissues. We performed analysis of acess coming from populations maintained in situ and ex situ by the use of markers. It was possible to establish aseptic cultures of E. involucrate. The establishment in vitro can be accomplished with the apical and nodal segments, however, nodal segments offer the best results. The ½ MS is the most appropriate nutritive medium and helps in rooting. The use of high concentrations of TDZ associated with ANA enables shoot multiplication and the emergence of shoots from nodal segments. GA3 does not promote the elongation of shoots and is toxic in high concentrations. Callus formation was obtained in leaf discs of E. involucrata. The best way to grow is maintaining the explants in abaxial position and in the dark. Combinations of auxins and cytokinins generate the highest percentage of callus formation. The association of 2,4-D and TDZ promotes better callus formation and callus candidates to embyogeneis. It is possible to extract good quality genomic DNA from E. involucrata leaves and cambia, using the maceration with the extraction buffer concentrate to 10%. Analysis with molecular markers was efficient in the stratification of genetic variability in accessions of cherry. It was observed that the variability is evenly distributed between the accessions in different in situ populations and that in the ex situ population assessed the variability is not satisfactory. It was possible to generate consistent information to assist in the cultivation and in planning of breeding programs of the species. / A cerejeira (Eugenia involucrata DC.) é uma espécie florestal brasileira com diversas características de interesse econômico, especialmente nos setores de silvicultura, fruticultura, paisagístico, ambiental e medicinal. No entanto, possui sementes recalcitrantes, as quais começam a perder sua viabilidade após duas semanas de coleta. Além disso, não existem informações sobre a variabilidade genética desta espécie. Este trabalho objetivou desenvolver metodologias para o cultivo in vitro de E. involucrata e avaliar a variabilidade genética existente em acessos desta espécie mantidos in situ e ex situ. Na propagação por técnicas de cultura de tecidos, avaliou-se a desinfestação de explantes, bem como foram estudados aspectos de crescimento e desenvolvimento in vitro após a inoculação de segmentos apicais e nodais em diferentes meios nutritivos. Também foi avaliado o efeito de diferentes fitorreguladores na otimização da multiplicação in vitro. Para a calogênese in vitro, foram avaliados métodos de desinfestação superficial, formas de inoculação dos explantes, introdução de reguladores de crescimento, os efeitos de diferentes regimes luminosos, do uso de antioxidantes e de citocininas. Foi analisada a formação de calos sobre diversos aspectos de desenvolvimento. Testaram-se diferentes métodos para a extração de DNA genômico da espécie, utilizando-se diferentes tecidos vegetais. Realizou-se a análise de acessos oriundos de populações mantidas in situ e ex situ por meio do uso de marcadores RAPD. Como resultados, foi possível estabelecer cultivos assépticos da espécie, além disso, o estabelecimento in vitro pode ser realizado com segmentos apicais e nodais, no entanto, segmentos nodais oferecem os melhores resultados. O meio ½ MS é o mais adequado e auxilia na rizogênese, além de outros aspectos de desenvolvimento das plantas. A utilização de concentrações elevadas de TDZ associadas à ANA permite a multiplicação de brotos e o surgimento de gemas adventícias em segmentos nodais. GA3 não promove o alongamento dos brotos e, em concentrações elevadas, apresenta-se tóxico. Para a calogênese in vitro, a melhor forma de cultivo é mantendo-se o explante em posição abaxial e na ausência de luz. Combinações entre auxinas e citocininas produzem os melhores índices de calogênese. O emprego da associação 2,4-D e TDZ promove a melhor formação de calos e de calos candidatos à embriogênese. É possível extrair DNA de boa qualidade a partir de folhas e câmbios de cerejeira, utilizando-se a maceração com o tampão de extração concentrado a 10%. A análise com marcadores moleculares RAPD mostrou-se eficiente na estratificação da variabilidade genética de acessos de cerejeira. Observou-se que a variabilidade está bem distribuída entre os acessos nas diferentes populações in situ e que, a população ex situ avaliada, não possui variabilidade satisfatória. Foi possível gerar informações consistentes que poderão auxiliar o cultivo e o planejamento de programas de melhoramento da espécie.

Mimosa scabrella Benth. is a tree from Brazil, growing from Minas Gerais to Rio Grande do Sul. Its wood is used for energy like firewood and coal. The round wood is also very sought for props in civil architecture. Furthermore, since it is an aggressive pioneering species, its plantation is recommended for protection and recovering of weak and erosive soil. The Brazilian plantations of Mimosa scabrella Benth. present reduced productivity, which can be improved by the introduction of trees with larger diameter. The increase of the diameter can be obtained by the manipulation of the levels of vegetable hormones in the cells during the micropropagation. Aiming at contributing for this purpose, the overall goal of this work was to study the Mimosa scabrella Benth. in vitro regeneration considering isolated explants from germinated seeds. The surpassing of the seeds' quiescence was tested by mechanical scarification, immersion in water at environment temperature during 24 h, immersion in hot water (80ºC) during 5 minutes. The disinfestation consisted of the immersion of sodium hypochlorite to 2% during 5, 10 or 15 minutes and inoculation of the seeds in ½ MS or MS agent (Murashige & Skoog). Nodal segments cultivated in MS agent added of benzylaminopurine - BAP (0; 2,5; 5; 7,5 and 10 μM) and of alpha-aceticnaphtalene acid - ANA (0 and 2,2 μM), in the absence or in the presence of estreptomicine, were evaluated according to their multiplication in vitro. The mechanical scarification was the quiescence surpassing method which provided the largest germination percentage. The disinfestation with sodium hypochlorite at 2% during 10 minutes resulted in more than 60% of germinated seeds. The biggest in vitro germination of Mimosa scabrella Benth. s seeds was observed at ¼ MS dilution. In the absence of BAP, there was more formation of buds (1,39) and of leaves (1,62) per explant. There was not any contamination by bacteria in the absence of BAP, independently of the presence of estreptomicine. Calli were not formed in the absence of estreptomicine and of BAP. With the increase of BAP concentrations at the medium of culture, there was a reduction in the fenolic oxidation. For the in vitro multiplication of nodal segments of Mimosa scabrella Benth., it is not necessary to add either ANA or BAP. / A bracatinga (Mimosa scabrella Benth.) é uma árvore nativa do Brasil, ocorrendo desde Minas Gerais até o Rio Grande do Sul. A madeira é usada para energia como lenha e carvão. A madeira roliça é também muito procurada para escoras na construção civil. Além disso, como é uma espécie pioneira agressiva, seu plantio é recomendado para proteger e recuperar solos fracos e erodidos. Os bracatingais brasileiros apresentam reduzida produtividade, que pode ser melhorada pela introdução de árvores com maior diâmetro. O aumento do diâmetro pode ser obtido pela manipulação dos níveis de hormônios vegetais nas células durante a micropropagação. Com a finalidade de contribuir para esse propósito, neste trabalho, o objetivo geral foi estudar a regeneração in vitro da bracatinga por meio de explantes isolados a partir de sementes germinadas. A superação de dormência das sementes foi testada por escarificação mecânica, imersão em água à temperatura ambiente por 24 h, imersão em água quente (80ºC) por 5 minutos. A desinfestação consistiu da imersão em hipoclorito de sódio a 2% por 5, 10 ou 15 minutos e inoculação das sementes em meio ½ MS ou MS (Murashige & Skoog). Foi avaliada também a germinação sob diferentes concentrações do meio MS (1/8, ¼, ½ e integral). Segmentos nodais cultivados em meio MS acrescido de benzilaminopurina - BAP (0; 2,5; 5; 7,5 e 10 μM) e de ácido alfa naftalenoacético - ANA (0 e 2,2 μM), na ausência ou presença de estreptomicina, foram avaliados quanto à multiplicação in vitro. A escarificação mecânica foi o método de superação de dormência que proporcionou a maior porcentagem de germinação. A desinfestação com hipoclorito de sódio a 2% durante 10 minutos resultou em mais de 60% de sementes germinadas. A máxima germinação in vitro de sementes de bracatinga foi observada na diluição ¼ MS. Na ausência de BAP, houve maior formação de gemas (1,39) e de folhas (1,62) por explante. Não houve contaminação por bactérias na ausência de BAP, independente da presença de estreptomicina. Não foram formados calos na ausência de estreptomicina e de BAP. Com o aumento das concentrações de BAP no meio de cultura, houve uma redução na oxidação fenólica. Para a multiplicação in vitro de segmentos nodais de bracatinga, não é necessário adicionar ANA e BAP.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pinus taeda L. is among the more planted forest species in Brazil due its desirable characteristics of production and industrial quality. Currently, it has been necessary to be developed techniques that make possible the massal production of improved genotypes and the tissue culture techniques offer this possibility. Gotten plants in vitro from seeds possess two important characteristics: the youthfully and the existing variability in lots of seeds. The objective of this work was to evaluate methods of choice of lots of seeds from its characteristics of health and vigor; to optimize the germination and to establish this forest species in vitro. Seeds of three lots supplied by the Klabin Company, deriving of clone orchards of called seeds Celucat (1st Generation), Igaras (1st Generation) and Igaras (2nd Generation) were submitted the sanitary tests through the technique blotter-test ; and analyses of vigor based in the performance of seedling evaluated the variables: hard seeds dead seeds, abnormal seedling, weak normal seedling and heavy normal seedling. Of this last one, it was effected the analysis of the length (cm), fresh weight (g) and dry weight (g). For disinfestations, six treatments had been tested, that were composites of three combinations of disinfestations times and concentration of NaOCl, beyond presence or absence light during first days of the experiment. The seeds were germinated in MS medium (MURASHIGE e SKOOG, 1962). The germination of the seeds in alternative substrata of paper was also tested like filter paper, starch and starch combined with agar at a first moment and, later, the germination in substratum of medium MS with activated charcoal and liquid medium MS having vermiculite as gelling agent. The substrata filter paper, hydrophilic cotton and agarwater had been evaluated how much to the water subsidy that they supply the seeds. As treatment pre-germinative, it was carried through experiments with different times of soak and germination in hydrophilic cotton. The establishment was also evaluated in vitro from node cotyledonar in media MS, WPM (LLOYD e McCOWN, 1981) and reduced MS to the half of the concentration of mineral salts. The health tests had been efficient in the discrimination of the lots, has been more representative the genera Fusarium, Penicillium and Trichoderma. In the same way, variable of the vigor: abnormal seedling, heavy normal seedling and length, dry weight and fresh weight of heavy normal seedling had allowed the stratification of the lots. The disinfestations in 3% NaOCl during 5 minutes and 4% during 3 minutes had demonstrated the best ones performances; however, NaOCl presented toxic to the seeds, inhibiting the germination. The media with different substrata had not presented significant differences for the germination of the seeds. Through the analysis of the water absorption in different substrata it was possible to establish the soak curves and to compare substrata in relation to water suply. The soak for 72 hours of the seeds and posterior inoculation in hydrophilic cotton was efficient in the germination of seeds. It was possible to in vitro establish plants of Pinus taeda L. but the analyses statistics had not demonstrate differences among the media tested for such purpose. / Pinus taeda L. está entre as espécies florestais mais plantadas em todo o Brasil, devido as suas características desejáveis de produção e qualidade industrial. Atualmente, há necessidade de serem desenvolvidas técnicas que possibilitem a produção massal de genótipos melhorados e a cultura de tecidos oferece esta possibilidade. Plantas obtidas in vitro, a partir de sementes, possuem duas características importantes: a juvenilidade e a variabilidade existente em lotes de sementes. O objetivo deste trabalho foi avaliar métodos de escolha de lotes de sementes, a partir de suas características de sanidade e vigor; otimizar a germinação e pré-estabelecer esta espécie florestal in vitro. Sementes de três lotes obtidas com a empresa Klabin, oriundas de pomares clonais de sementes, denominados Celucat (1ª Geração), Igaras (1ª Geração) e Igaras (2ª Geração) foram submetidas a testes de sanidade através da técnica do papel filtro; e análises de vigor, baseadas no desempenho de plântulas, em que se avaliaram as variáveis: sementes mortas, sementes duras, plântulas anormais, plântulas normais fracas e plântulas normais fortes. Dessa última, foi efetuada a análise do comprimento (cm), peso fresco (g) e peso seco (g). Para a desinfestação foram testados seis tratamentos compostos de três combinações entre tempos de desinfestação e concentração de NaOCl, além da presença ou ausência de luz durante os primeiros dias do experimento. As sementes foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) Testou-se também a germinação das sementes em substratos alternativos como papel filtro, amido e amido combinado com ágar em um primeiro momento e, posteriormente, a germinação em substrato de meio de sais minerais MS, contendo carvão ativado; e meio MS líquido, tendo como solidificante vermiculita. Os substratos papel filtro, algodão hidrófilo e ágar-água foram avaliados quanto ao subsídio hídrico que fornecem para as sementes. Como tratamentos pré-germinativos, foram realizados experimentos com diferentes tempos de embebição e germinação com ou sem desinfestação em algodão hidrófilo. Avaliou-se também o estabelecimento in vitro a partir de nós cotiledonares em meio MS, WPM (LLOYD e McCOWN, 1981) e MS reduzido à metade da concentração de sais. Os testes de sanidade foram eficientes na discriminação dos lotes, sendo os fungos mais representativos para esta finalidade pertencentes aos gêneros Fusarium, Penicillium e Trichoderma. Da mesma forma, as variáveis de vigor: plântulas anormais, plântulas normais fortes e comprimento, peso seco e peso fresco de plântulas normais fortes, permitiram a estratificação dos lotes. A desinfestação em NaOCl a 3% durante 5 minutos e a 4% durante 3 minutos demonstraram os melhores resultados, porém, NaOCl apresentou toxidez às sementes, inibindo a germinação. Os meios de cultivo com diferentes substratos não apresentaram diferenças significativas para a germinação das sementes. Através da análise da absorção de água em diferentes substratos, foi possível estabelecer as curvas de embebição e comparar substratos quanto ao fornecimento hídrico. A embebição das sementes por 72 horas e posterior inoculação em algodão hidrófilo, sem prévia desinfestação, foi eficiente na germinação. Foi possível estabelecer, in vitro, plantas de Pinus taeda L., porém, as análises estatísticas não demonstraram diferenças entre os meios testados para tal finalidade.

As características físico-químicas da parede celular constituem um grande gargalo na obtenção dos açúcares fermentáveis a partir dos polissacarídeos de parede celular presentes na biomassa, fato conhecido como recalcitrância da biomassa vegetal. A utilização da biomassa na produção de biocombustíveis requer um melhor entendimento sobre os mecanismos que permeiam os processos de deposição de parede celular e metabolismo de lignina. Nesse contexto, a maior parte do conhecimento foi gerado em espécies eudicotiledôneas, havendo uma significativa lacuna para gramíneas, apesar do seu grande potencial para acúmulo de biomassa. Portanto, há uma necessidade de se estabelecer ferramentas-modelos que permitam elucidar características exclusivas da parede celular secundária de gramíneas C4, cujo conhecimento não pode ser extrapolado a partir de eudicotiledôneas. O presente trabalho propôs estabelecer um sistema de células em suspensão como ferramenta-modelo em estudos sobre parede celular secundária em gramíneas C4. Para tal, três espécies foram inclusas: Sorghum bicolor, Setaria viridis e cana-de-açúcar. Devido às características recalcitrantes do sorgo, apenas as suspensões celulares de S. viridis e cana-de-açúcar foram estabelecidas. Subsequentemente, estas culturas foram utilizadas na tentativa de se desenvolver duas aplicações para o estudo de parede secundária: i) culturas xilogênicas, em que as células em suspensão são induzidas a se transdiferenciar em elementos traqueais; e ii) sistema de protoplastos para ensaios de transativação para testar o potencial papel de fatores de transcrição na regulação transcricional da deposição de parede celular. Somente as culturas de cana-de-açúcar responderam aos tratamentos testados para indução da transdiferenciação de elementos traqueais, baseados em protocolos estabelecidos para outras gramíneas. Análises de expressão gênica por RT-qPCR foram utilizadas para caracterizar a variação da expressão de genes-alvo durante este processo. Ademais, as paredes celulares das células em suspensão de cana-de-açúcar foram digeridas com um coquetel de hidrolases para a produção de protoplastos. A cultura de células em suspensão de cana-de-açúcar e suas aplicações aqui estabelecidas poderão ser utilizadas na elucidação de aspectos únicos do processo de deposição de parede celular secundária em gramíneas C4 / The physicochemical features of the cell wall represent a major bottleneck for the processing of cell wall polysaccharides present in biomass into fermentable sugars, a fact known as plant biomass recalcitrance. Biofuels production from biomass requires a better understanding on the molecular mechanisms underlying secondary cell wall deposition and lignin metabolism. In this context, most of the current knowledge has been generated in eudicots species, whereas significantly less is known for grasses, despite of their great potential for biomass accumulation. Therefore, the development of tools that allow the discovery of specific aspects of C4 grasses secondary cell walls is of great interest, because this knowledge cannot be extrapolated from data generated for eudicots. In the present work, we aimed to develop suspension cell cultures as a tool for the study of secondary cell wall metabolism in C4 grasses. For this purpose, three species were employed: Sorghum bicolor, Setaria viridis and sugarcane. Because of the recalcitrant nature of sorghum, only suspensions cells of S. viridis and sugarcane were successfully established. Subsequently, these cultures were used in an attempt to develop two applications to study secondary cell walls: i) xylogenic cultures, in which the suspension cells are induced to transdifferentiate into tracheary elements; and ii) a protoplast system to be used in transactivation assays to test the potential role of transcriptional factors in the regulation of secondary wall deposition. Only the suspension cultures of sugarcane showed a positive response to the tested treatments for the induction of tracheary elements formation, which were based on modifications of previous protocols established for other grasses. Gene expression analysis by RT-qPCR was used to characterize the variation of the expression of target genes during this process. Moreover, the cell walls of sugarcane suspension cells were digested with a cocktail of hydrolases to produce protoplasts, which were used in transactivation assays between transcriptional factors known to be involved in secondary cell wall deposition and their putative target genes, as a proof-of-concept. The sugarcane suspension cells and their applications established in this work might be used to further elucidate unique aspects of secondary cell wall deposition in C4 grasses

Muitos estudos têm sido direcionados para gerar melhorias na cultura de cana-de-açúcar, sendo uma das alternativas o uso de técnicas biotecnológicas, como a embriogênese somática (ES). O objetivo deste projeto foi estudar a multiplicação celular na ES de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280. Culturas embriogênicas (CE) e não-embriogênicas (CNE) foram monitoradas e parâmetros bioquímicos foram analisados. Foi observado que CE e CNE apresentaram crescimento máximo aos 24 dias de cultivo, sendo que as CE apresentaram maior incremento em matéria fresca. Dos carboidratos analisados, a sacarose foi predominante em CE, enquanto a glicose predominou em CNE. Os conteúdos de glicose e frutose variaram simultaneamente em CE. As concentrações de amido, poliaminas (Pas) totais e a razão entre PAs [Razão PA= Put/(Spd+Spm)] apresentaram maiores valores nas CNE, sendo a espermidina a poliamina predominante em CE e putrescina em CNE. O conteúdo de proteínas totais foi significativamente maior em CE, em todas as fases de crescimento. / Many studies have been directed to generate improvements in the sugarcane cultures, one of the alternative use of biotechnology techniques such as somatic embryogenesis (SE). The objective of this project was to study the cell multiplication in SE of sugarcane, variety SP80-3280. Embryogenic cultures (EC) and non-embryogenic (NEC) were monitored and biochemical parameters were analyzed. Was observed that EC and NEC showed maximum growth to 24 days of culture, and the EC showed greater increase in fresh weight. Of the carbohydrates tested, sucrose was predominant in EC, while glucose was predominant in the NEC. The contents of glucose and fructose varied simultaneously in EC. The concentrations of starch, polyamines (PAs) and the ratio of total PAs [Ratio PA = Put / (Spd + Spm)] showed higher values in the NEC, and the spermidine is predominant polyamine to EC and putrescine is predominant in NEC. The content of total protein was significantly higher in CE, at all stages of growth.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2016-09-15T22:23:03Z No. of bitstreams: 1 Tese-Maria do Socorro.pdf: 2248544 bytes, checksum: 195ed518eb9bcdd7d8346e1af11ce2bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T22:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese-Maria do Socorro.pdf: 2248544 bytes, checksum: 195ed518eb9bcdd7d8346e1af11ce2bc (MD5) Previous issue date: 2015-10-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Brazil is one of the main centers of genetic diversity and dispersion of the genus Passiflora. In the present work, several species and interspecific hybrids of Passiflora were characterized through cytogenetic techniques and ISSR markers, as well as these genotypes were evaluated for in vitro multiplication and establishment. Chromosomal preparations were submitted to conventional staining, CMA3/DAPI banding, FISH using 45S/5S rDNA probes and GISH. Genomic DNA of P. edulis and P. cincinnata were used as genomic probes in the GISH. Twenty ISSR primers were used for the characterization by molecular markers. Nodal segments of P. cincinnata, P. laurifolia, P. setacea and P. luetzelburgii were collected and evaluated in the WPM, DKM and MS culture media to establishment of in vitro culture; for in vitro multiplication, explants were inoculated in DKW culture media under different concentrations of BAP, KIN and 2iP cytokinins. The results showed 2n = 18 chromosomes for the species and hybrids, regular meiosis, one pair of 5S rDNA sites and two or three pairs of 45S rDNA sites co-localized with the CMA3+/DAPI- bands. It is the first chromosomal counting recorded for P. luetzelburgii. Three groups distinct of chromosomes were revealed by GISH. The hybrid origin and the relationship with the parental species were also confirmed by using of the ISSR markers. DKW culture medium provided the better development of the explants, P. cincinnata CPE16 showed the better in vitro morphogenetic response, and KIN showed to be more efficient in obtaining increased shoots length. / O Brasil ? um dos principais centros de dispers?o da variabilidade gen?tica do g?nero Passiflora. O presente trabalho objetivou caracterizar esp?cies e h?bridos interespec?ficos de Passiflora, atrav?s de t?cnicas citogen?ticas e por marcadores ISSR, al?m de avaliar o estabelecimento e multiplica??o in vitro de gen?tipos de maracujazeiro. Prepara??es citol?gicas foram submetidas ? an?lise convencional, dupla colora??o com os fluorocromos CMA3/DAPI, FISH utilizando como sonda DNAr 5S/45S e GISH. O DNA gen?mico de P. edulis e P. cincinnata foram utilizados como sondas gen?micas na GISH. Foram utilizados 20 primers ISSR na caracteriza??o por marcadores moleculares. Para o estabelecimento do cultivo in vitro, segmentos nodais de P. cincinnata, P. laurifolia, P. setacea e P. luetzelburgii foram coletados e avaliados em meio de cultura WPM, DKW e MS, para a multiplica??o in vitro, os explantes foram inoculados em meio DKW sob diferentes concentra??es de citocininas BAP, KIN e 2iP. Os resultados mostraram 2n = 18 cromossomos para as esp?cies e h?bridos, al?m de meiose regular, um par de s?tios de DNAr 5S e dois a tr?s pares de s?tios de DNAr 45S que co-localizaram as bandas CMA3+/DAPI-, sendo o primeiro registro de contagem para P. luetzelburgii. Na GISH foi observada a forma??o de tr?s grupos cromoss?micos distintos. A origem h?brida e a rela??o com as esp?cies parentais foram tamb?m confirmadas pelo uso dos marcadores ISSR. No cultivo in vitro, o meio DKW proporcionou melhor desenvolvimento dos explantes, em rela??o aos gen?tipos, P. cincinnata CPE16 mostrou melhor resposta morfog?nica in vitro e KIN mostrou-se mais eficiente para obten??o de brota??es com maiores comprimentos.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.