Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Cassava (Manihot esculenta Crantz) belongs to the family Euphorbiceae, Manihot genus, which consists of 98 species Manihot esculenta being the only commercially produced. It is usually propagated vegetatively, but several factors such as the process of soil salination can cause serious damage to crops, decreasing the production of cassava. For the maintenance of physiological processes in adverse conditions such as salt stress, plants accumulate amino acids compatible to the cytosol, such as proline, which assists in maintaining the osmotic pressure, keeping the water absorption. micropropagation in vitro seedlings require a number of requirements, such as growth room with artificial light and carbon source, which together with the low survival rate in the acclimatization, more expensive the final product. The use of natural light even in vitro rooting phase, called photoautotrophy, and the decrease in sucrose concentration appears as potential possibilities to improve the acclimatization of plants, helping reduce costs and enabling trade. In Chapter 1, six genotypes were used in the ex vitro salinity experiment: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRSTapioqueira, BRS Kiriris and BRS Formosa. During acclimatization, the seedlings were watered weekly with MS liquid solution, with or without added 4 or 8 g.L-1 NaCl, making three treatments. After 90 days it was found that the cultivars BRS Formosa and BRS Kiriris had higher salt tolerance and proline accumulation was intensified in all varieties from the addition of salt to the substrate. In Chapter 2, the treatments were applied in vitro rooting phase, and with different concentrations of sucrose (10, 20, 30 and 40 g.L-1) for Tapioqueira and Lagoão for 45 days and transferred to the greenhouse. After 60 days were assessed: root number, leaf number, number of tubercle, shoot length, root length, number of buds, shoot dry weight, root dry weight and survival rate. The two genotypes developed better at higher sucrose concentrations. In a second experiment, the treatments sucrose (10, 20 and 30 g.L-1) and light (natural and artificial growth area) were applied at the same stage, and the BRS Formosa, BRS Verdinha and Lagoão. After 45 days under natural light or artificial light, the explants were transferred to the greenhouse. After 60 days, the BRS Formosa and Lagoão performed better under natural light and high sucrose concentrations, as BRS Verdinha had better development under natural light, but with lower carbohydrate concentration. In Chapter 3, explants of Lagoão, BRS Tapioqueira and BRS Verdinha were inoculated in MS medium without growth regulators and with different salt concentrations (0, 25, 50, 75 and 100 mM). After 90 days, BRS Verdinha and BRS Tapioqueira had higher salt tolerance and BRS Tapioqueira showed greater potential to osmoregulation due to its high proline production. / A mandioca (Manihot esculenta Crantz) pertence à família Euphorbiceae, gênero Manihot, que é composto por 98 espécies, sendo a Manihot esculenta a única comercialmente produzida. Geralmente é propagada vegetativamente, porém, vários fatores como o processo de salinização do solo podem ocasionar danos graves às plantações, diminuindo a produção da mandiocultura. Para a manutenção dos processos fisiológicos em situações adversas como estresse salino, as plantas acumulam aminoácidos compatíveis ao citossol, como a prolina, que auxilia na manutenção da pressão osmótica, mantendo a absorção de água. Mudas micropropagadas in vitro demandam uma série de requisitos, como sala de crescimento com luz artificial e fonte de carbono, o que juntamente com a baixa taxa de sobrevivência na aclimatização, encarecem o produto final. O uso de luz natural ainda na fase de enraizamento in vitro, denominado fotoautotrofia, e a diminuição na concentração de sacarose surgem como possibilidades potenciais para melhorar a aclimatização de plantas, auxiliando na redução de custos e viabilizando o comércio. No capítulo 1, seis genótipos foram utilizados no experimento de salinidade ex vitro: Sergipe, Lagoão, BRS Verdinha, BRS Tapioqueira, BRS Kiriris e BRS Formosa. Durante a aclimatização, as mudas foram regadas semanalmente com solução MS líquido, adicionado de 0, 4 e 8 g.L-1 de NaCl, perfazendo três tratamentos. Após 90 dias constatou-se que as cultivares BRS Formosa e BRS Kiriris apresentaram maior tolerância ao estresse salino e o acúmulo de prolina foi intensificado em todos os genótipos a partir da adição de sal ao substrato. No capítulo 2, os tratamentos foram aplicados na fase de enraizamento in vitro, e com diferentes concentrações de sacarose (10; 20; 30 e 40 g.L-1) para BRS Tapioqueira e Lagoão por 45 dias e transferidas para casa de vegetação, onde permaneceram por 60 dias. Foram avaliados o número de raiz, número de folha, número de tubérculo, comprimento da parte aérea, comprimento de raiz, número de gemas, massa seca da parte aérea, massa seca de raiz e taxa de sobrevivência. Os dois genótipos apresentaram melhor desempenho em concentrações mais altas de sacarose. Num segundo experimento, os tratamentos sacarose (10; 20 e 30 g.L-1) e luz (natural e artificial da sala de crescimento) foram aplicados na mesma fase, e para os genótipos BRS Formosa, BRS Verdinha e Lagoão. Após 45 dias sob luz natural ou luz artificial, os explantes foram transferidos para casa de vegetação. Após 60 dias, a BRS Formosa e Lagoão obtiveram melhores resultados sob luz natural e altas concentrações de sacarose e a BRS Verdinha o melhor desenvolvimento sob luz natural, porem na menor concentração. No Capítulo 3, explantes dos genótipos Lagoão, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha foram inoculados em meio MS, sem reguladores de crescimento e com diferentes concentrações salinas (0; 25; 50; 75 e 100 mM). Após 90 dias, BRS Tapioqueira e BRS Verdinha apresentaram maior tolerância ao estresse salino, bem como BRS Tapioqueira maior potencial de osmorregulação devido a sua alta produção de prolina.

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This study aims to contribute to the improvement and conservation of orchids with distribution in the Brazilian Cerrado. Selfcompatibility was evaluated for seven species: Cohniella cepula, Cyrtopodium eugenii, C. saintlegerianum, Epidendrum densiflorum, Epidendrum nocturnum, Epidendrum secundum e Lockhartia goyazensis. Only three were autocompatible: Epidendrum nocturnum, Epidendrum secundum and Lockhartia goyazensis. Interspecific compatibility was assessed for Cyrtopodium and Epidendrum genera, using reciprocal crosses. Just E. nocturnum and C. eugenii produced viable seeds. For early in vitro floral induction 20 different treatments were used through nutritional changes and use of cytokinin (BAP) in modified MS medium. Only C. cepula showed positive responses to treatment with formation of 46% floral stems. The effect of BAP was evident in the results. Cryopreservation was tested by vitrification of seeds of seven species of orchids, obtained from outcrossing. The responses to cryopreservation were partially different for each species. Most seeds tested showed any significant differences between freezing in liquid nitrogen without cryoprotectants and control without freezing. The freezing without cryoprotectant was successful to maintaining seed viability for all species, C. cepula 63%, C. eugenii 59%, C. sainttlegerianum 70%, E. densiflorum 42%, E. nocturnum 31%, E. secundum 69% and L. goyazensis 52%. Only E .nocturnum and C. cepula showed a significant reduction in viability when submitted to freezing in liquid nitrogen. The results presented here are useful for the development of breeding programs for orchids and conservation of these species. / A grande maioria das espécies de orquídeas é polinizada por insetos, principalmente abelhas, borboletas e mariposas. A família Orchidaceae é, em geral, considerada alógama, mas informações sobre o tipo de reprodução não são conhecidas para a maioria das espécies. Pouca informação existe sobre orquídeas do Cerrado, o que prejudica o melhoramento destas espécies e adia sua utilização no desenvolvimento de novas cultivares para o mercado de ornamentais. Métodos recentes de biotecnologia vegetal podem auxiliar tanto o melhoramento quanto a conservação destas espécies, como a indução a floração precoce in vitro, técnica importante principalmente para espécies de ciclo longo, e a criopreservação, como ferramenta para o desenvolvimento de bancos de germoplasma, essenciais tanto para o melhoramento quanto para a conservação da variabilidade genética. Este trabalho teve como objetivos contribuir para o melhoramento e conservação de orquídeas com distribuição no Cerrado Brasileiro. Foi avaliada a autocompatibilidade para sete espécies: Cohniella cepula, Cyrtopodium eugenii, Cyrtopodium saintlegerianum, Epidendrum densiflorum, Epidendrum nocturnum, Epidendrum secundum e Lockhartia goyazensis. Apenas três foram autocompatíveis: E. nocturnum, E. secundum e L. goyazensis. Foi avaliada a compatibilidade interespecífica dentro dos gêneros Cyrtopodium e Epidedrum utilizando cruzamentos recíprocos. Apenas C. eugenii e E. nocturnum produziram sementes viáveis. Para a indução floral precoce in vitro foram testadas diferentes composições nutricionais e concentrações de benzilaminopurina (BAP) no meio MS modificado. Apenas C. cepula apresentou respostas positivas aos tratamentos, com formação de até 46% de hastes florais. O efeito do BAP ficou evidente nos resultados dos tratamentos. Foi testada a criopreservação por vitrificação de sementes das sete espécies de orquídeas, obtidas de cápsulas originadas de fecundação cruzada. As respostas aos crioprotetores foram parcialmente distintas para os tratamentos de criopreservação avaliados, dependendo da espécie. A maioria das sementes testadas não apresentou diferenças significativas entre o congelamento em nitrogênio líquido e o controle sem o crioprotetor e sem o congelamento. O congelamento sem crioprotetor foi bem sucedido para todas as espécies mantendo a viabilidade das sementes, para C. cepula em 63%, C. eugenii em 59%, C. sainttlegerianum 70%, E. densiflorum 42%, E. nocturnum 31%, E. secundum 69% e L. goyazensis em 52%. Apenas E. nocturnum e C. cepula apresentaram redução significativa da viabilidade quando submetidas ao congelamento direto em nitrogênio líquido, sem crioprotetor. Os resultados apresentados neste trabalho são úteis ao desenvolvimento de programas de melhoramento para orquídeas e para conservação destas espécies.

A Cryptomeria japonica D. Don. "elegans" é uma conífera pertencente à família Taxodiaceae, que apresenta crescimento rápido e boas respostas à fertilização. Dez variações nas concentrações de nitrato e amônio presentes no meio de cultura MS foram realizadas no cultivo 'in vitro' de brotações obtidas a partir de explantes primários de ápices caulinares durante 90 dias. A cada 30 dias foram avaliados, a taxa de crescimento relativo e o incremento em massa vegetal seca. Ao final de 90 dias, foram realizadas análises dos teores de proteínas solúveis totais, aminoácidos solúveis totais, carboidratos não-estruturais totais e eletroforese de proteínas totais em gel de poliacrilamida. Os tratamentos que exibiram resultados mais satisfatórios foram utilizados em um experimento com diferentes relações auxina/citocinina, onde foram avaliadas a produção de brotações e a altura média das mesmas aos 30, 60 e 90 dias de cultivo. As concentrações de nitrato e amônio entre 25 e 31mmol.L -1 e até 5mmol.L -1, respectivamente, foram as mais efetivas para o crescimento e desenvolvimento do material vegetal cultivado 'in vitro'. Durante o experimento com diferentes concentrações de ANA e BAP, foi possível observar que a produção de brotações, etapa essecial para um processo de micropropagação eficiente, foi superior quando as combinações entre nitrato e amônio foram 22,5 + 2,5mmol.L -1 e 25,0 + 5,0mmol.L -1. / Cryptomeria japonica D. Don. "elegans" is a fast-growing tree belonging to the Taxodiaceae and it is considered a responsive species 'in vitro'. The aim of this work was to evaluate the effect of ten different concentrations of nitrate and ammonium in morphogenesis 'in vitro' of Cryptomeria japonica D. Don. "elegans" explants. Analysis of relative growth rate, total soluble proteins, total soluble aminoacids, total non structural carbohydrates and electrophoresis of total proteins was performed in order to observe the role of different nitrogen sources on the growth and development of the explants cultivated 'in vitro'. The concentratios of nitrate and ammonium that showed the best results were selected and used in an experiment with different concentrations of NAA and BAP to observe the shoot production. Each experiment was analised at the 30 th , 60 th and 90 th days of culture. The biochemical analysis was performed only at 90 th day of cultive. Concentrations from 26 to 31mmol.L -1 of NO3 - and lower than 5mmol.L -1 of NH4 + were the most effective for growth and development of the explants. However, the experiment with different concentrations of NNA and BAP showed that the best shoot production was achieved on 22,5mmol.L -1 of NO3- + 2,5mmol.L -1 of NH4 + and on 25,0mmol.L -1 of NO3 - + 5,0mmol.L -1 of NH4 + and with 2,0mg.L -1 of BAP + 1,0mg.L -1 of NNA.

Pelas qualidades silviculturais e da madeira, o Eucalyptus citriodora apresenta-se como uma excelente espécie para usos múltiplos, destacando-se a extração de óleo essencial para indústria de perfumaria e desinfetantes. Entre as espécies de eucalipto é a que apresenta madeira de alta densidade, dependendo das condições edafoclimáticas e procedência. Porém, as limitações referentes à disponibilidade de sementes e dificuldades de enraizamento de estacas e miniestacas inviabilizam sua multiplicação comercial. Sendo assim, a utilização da micropropagação objetiva acelerar os métodos convencionais de clonagem, de genótipos selecionados. Brotações com uma a três gemas de aproximadamente 1,5cm, foram transferidas para três diferentes meios básicos de cultura, MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), WPM (LLOYD; MCCOWN, 1980) e JADS (CORREIA et al., 1995), suplementados a cada subcultivo com concentrações combinadas e crescentes de benzilaminopurina (BAP- 0,025; 0,05 e 0,50mg L-1) e ácido naftalenoacético (ANA) (0,0025; 0,005 e 0,050mg L-1), sendo que para a maior concentração de ambos os fitorreguladores foram realizados 4 subcultivos, totalizando 6 subcultivos. Vinte repetições de cada tratamento foram separadas para avaliação dos parâmetros fisiológicos (peso da matéria fresca, peso da matéria seca e número de brotos por cepa), avaliação da aparência por nota e análise química do teor nutricional. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial (3x3x3x3), testando-se três clones, três meios de cultura, três concentrações de BAP combinadas com três concentrações de ANA. Os resultados inferiram que as respostas aos diferentes meios de cultura são genótipo-dependentes em relação às concentrações salinas, relacionando as exigências nutricionais do material genético e a relação auxina/citocinina à produção de matéria seca. A multiplicação das microcepas é influenciada por fatores epigenéticos, que atuam no aumento do vigor, tamanho das folhas, número e homogeneidade das brotações / By its silvicultural qualities, Eucalyptus citriodora presents itself as an excellent species for multiple uses, especially the essential oil extraction for fragrance and disinfectants industry. Among Eucalyptus species, this has high wood density, depending on environmental conditions and provenance. However, limitations related to seed available and difficulties with cuttings rooting make unfeasible its commercial multiplication. Thus, the use of micropropagation aims to accelerate conventional methods of selected genotypes cloning. Shoots with one to three buds with about 1.5 cm length were transferred to three different basic culture media, MS (Murashige and Skoog, 1962), WPM (Lloyd and McCown 1980) and JADS (Correia et al. 1995), supplemented to each subculture with combined increasing concentrations of benzylaminopurine (BAP- 0, 025, 0.05, and 0.50 mg L-1) and naphthaleneacetic acid (NAA) (0.0025, 0.005 and 0.050 mg L-1), and the highest concentration of both regulators were performed during four subcultures, totaling 6 subcultures. Twenty replicates of each treatment were separated for assessment of physiological parameters (fresh weight, dry oven weight and number of shoots per microstumps), appearance evaluation by note and chemical analysis of mineral nutrient content. The experiment was conducted in a completely randomized factorial design (3x3x3x3), testing three clones, three culture media, three concentrations of BAP combined with three concentrations of NAA. The results inferred that the response to the different culture media are genotype-dependent to salt concentrations, relating the nutritional requirements of the genetic material and the relationship auxin/cytokinin production of dry matter. The multiplication of microstumps is influenced by epigenetic factors, which act to increase the strength, size of leaves, number and homogeneity of shoots.

A hibridação somática via fusão de protoplastos é um método de combinação genética que agrega integralmente os dois genomas genitores, assim como suas respectivas organelas citoplasmáticas, sendo uma ferramenta alternativa aos métodos convencionais de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de híbridos somáticos interespecíficos de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) \'Pêra\' e \'Westin\' com a tangerina \'Fremont\' (C. clementina hort. ex Tan. x C. reticulata Blanco), \'Thomas\' (C. reticulata Blanco) e \'Nules\' (C. clementina hort. ex Tan), e o tangelo \'Nova\' (C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.) visando à produção de genitores tetraplóides com características agronômicas desejáveis. Como fontes de protoplastos foram utilizados calos embriogênicos de laranja e folhas jovens de tangerina e tangelo, coletadas de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Para o isolamento dos protoplastos, as células de ambas as fontes foram imersas em solução enzimática e incubadas no escuro por 14 horas, sob agitação. Após o isolamento, os protoplastos isolados de calos foram fundidos quimicamente (polietilenoglicol - PEG) com protoplastos não embriogênicos, isolados de mesofilo foliar. Em seguida, os protoplastos foram plaqueados nos meios de cultura líquido BH3, EME e BH3 + EME, e incubados em ausência de luz, sob temperatura de 27 ºC. Após 20 dias de incubação, foram iniciados subcultivos sequenciais para nutrição e redução do potencial osmótico do meio de cultura. Os microcalos desenvolvidos foram transferidos para meio de cultura EME + maltose (13 g.L-1) para a indução da embriogênese somática. Os embriões desenvolvidos foram transferidos para meio de cultura EME + sacarose (25 g.L-1) e em seguida para o meio de cultura 1500 (1,5 g.L-1 de extrato de malte) e finalmente para o meio B+ para desenvolvimento e germinação. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-devegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, determinação da ploidia, por citometria de fluxo e análise do DNA com marcadores moleculares do tipo SSR e RAPD. Foram obtidos híbridos somáticos de três combinações (Pêra + Fremont, Pêra + Nules e Pêra + Nova) os quais serão avaliados para utilização diretamente como copa ou como genitor tetraplóide em programas de melhoramento de citros. / Somatic hybridization by protoplasts fusion is a method of genetic combination of two parental genomes, and their cytoplasmic organelles. It is an alternative tool to conventional breeding methods. The objective of this work was to obtain interspecific somatic hybrids of \'Pera\' and \'Westin\' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) with \'Fremont\' (C. clementina hort. ex Tan. x C. reticulata Blanco), \'Thomas\' (C. reticulata Blanco) and \'Nules\' (C. clementina hort. ex Tan) mandarins and Nova tangelo (C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.) to produce tetraploid parents with desirable agronomic characteristics. The sources of protoplasts were sweet orange embryogenic callus and mandarin and tangelo young leaves, collected from plants cultivated in screenhouses. For protoplasts isolation, cells from both sources were immersed in enzyme solution and incubated in the dark for 14 hours (40 rpm). After isolation, the protoplasts isolated from callus were fused chemically (polyethylene glycol - PEG) with non embryogenic protoplasts, isolated from leaf mesophyll. The protoplasts were cultivated in BH3, BH3 + EME and EME liquid culture media and incubated in the dark, under temperature of 27 ºC. After 20 days of incubation, subcultures were initiated in order to reduce the osmotic potential of culture medium. The microcalus developed were transferred to EME medium supplemented with maltose (13 g.L-1) to induce somatic embryogenesis. The developed embryos were transferred into EME + sucrose (25 g.L- 1), culture medium 1500 (1.5 g.L-1 of malt extract) or B+ culture medium for development and germination. The regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimatized in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, ploidy determination by flow cytometry and molecular analysis by SSR and RAPD markers. Somatic hybrids were obtained of the three combinations (Pera + Fremont, Pêra + Nules and Pêra + Nova) which will be evaluated for direct are as scion or as a tetraploid parent in citrus breeding programs.

A transformação genética possibilita a introdução de genes de interesse agronômico no genoma das plantas e pode ser empregada na tentativa de obter plantas resistentes a doenças. No entanto, para se obter uma planta transgênica é necessário primeiramente estabelecer um procotolo eficiente de regeneração de plantas in vitro. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a organogênese in vitro e a transformação genética de limão Volkameriano e laranja azeda com um fragmento do gene da capa protéica do CTV. Para a organogênese in vitro utilizou-se, como explante, segmento internodal, obtido de planta cultivada em casa-de-vegetação, segmento de epicótilo, coletado de plântula cultivada in vitro e segmento de cotilédone associado ao hipocótilo obtido de semente introduzida in vitro. Esses explantes foram mantidos em meio de cultura EME suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L- 1), sendo incubados sob fotoperíodo de 16 h de luz ou em condições de escuro por 30 dias e então transferidos para fotoperíodo de 16 h de luz. A avaliação foi realizada após 45 dias de cultivo, determinando-se o número de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A caracterização anatômica do processo de regeneração foi realizada por meio de cortes histológicos. Pela análise dos dados foi possível verificar que a organogênese in vitro ocorreu a partir dos três tipos de explantes testados, sendo que, nas duas espécies em estudo, os melhores resultados foram obtidos com o cultivo de segmento de cotilédone associado ao hipocótilo. As concentrações de BAP que estimularam as melhores taxas de regeneração foram de 1,0 e 1,5 mg L-1, para limão Volkameriano, e 0,5 e 1,0 mg L-1 para laranja azeda. A incubação dos explantes em ausência de luz favoreceu a regeneração in vitro. Pela análise histológica foi possível observar que o processo de regeneração, a partir dos três tipos de explantes testados, ocorreu por meio de organogênese indireta. O protocolo de desenvolvimento estabelecido durante os experimentos de organogênese in vitro foi utilizado para a transformação genética dessas espécies via Agrobacterium, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201, com um fragmento do gene da capa protéida do CTV, em uma construção gênica do tipo hairpin. As gemas de limão Volkameriano e laranja azeda identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS foram enxertadas in vitro em citrange Carrizo. A confirmação da transformação genética foi realizada pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento de 671 pb, correspondente a parte do gene amplificada. / Genetic transformation permits the introduction of agronomically important genes in plant genome and can be utilized in order to produce disease resistant plants. However for the recovery of transgenic plants is required to establish an efficient in vitro plant regeneration protocol. In this work the aim was to study an in vitro organogenesis and the genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with a sequence of the CTV coat protein gene. For in vitro organogenesis explant internodal segments collected from plants cultivated in greenhouse, epicotyl segments obtained from in vitro cultivated seedlings and cotyledon fragment with hypocotyl attached obtained from in vitro germinated seed were used as explant. These explants were cultured in EME medium supplemented with benzilaminopurine (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L-1). Cultures were maintained under a 16 h photoperiod or in the dark for 10 d and then transferred to a 16 h photoperiod. The evaluation was performed 45 d after the incubation determining the number of responsive explant and the number of buds per explant. The anatomical characterization of in vitro regeneration process was carried out through histological analyses. The in vitro organogenesis occurred in the three types of explant tested, however cotyledon fragment with hypocotyl attached showed higher morphogenetic potential in both species. The best responses of regeneration were obtained when the medium was supplementation with 1,0 e 1,5 mg L-1 BAP for the Volkamer lemon and 0,5 e 1,0 mg L-1 BAP for the sour orange. The incubation in darkness favored the in vitro regeneration. The histological analyses showed that the regeneration process occurred through indirect organogenesis in the three types of explants tested. The developed protocol was use for genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with Agrobacterium, containing pCAMBIA 2201 plasmid with a sequence of CTV coat protein gene, in a hairpin construction. Volkamer lemon and sour orange shoots identified as transgenic by histochemical test GUS were micrografted into Carrizo citrange. PCR analysis were performed after micrografted showing the presence of the 671 pb fragment of the transgene.

O crescimento de plantas, órgãos, tecidos e células in vitro depende do desenvolvimento de meios de cultura otimizados para a perfeita interação de componentes essenciais como fitorreguladores, fonte de carbono e nutrientes minerais. Os fatores que limitam o crescimento de órgãos ou tecido in vitro são similares a aqueles que limitam o crescimento in vivo. Com o objetivo de testar a influência do estado nutricional de plantas matrizes de cenoura Daucus carota Link em potássio na morfogênese in vitro, plantas obtidas de sementes germinadas em substrato e cultivadas em vasos com areia em condições de casa de vegetação, foram submetidas a tratamentos com soluções nutritivas contendo variáveis níveis de potássio. Decorridos 30 e 60 dias de tratamento, explantes dessas plantas (internódios) foram coletados, desinfetados e inoculados em meio de cultura sólido de MS contendo também diferentes concentrações de potássio e acrescido de 0,1mg.L -1 da auxina 2,4-D buscando indução de calogênese na ausência de luz. Diferenciação celular via embriogênese somática foi conseguida em ausência de auxina em condições de fotoperíodo de 16/8 horas (claro/escuro). A avaliação da calogênese foi feita aos 60 dias após a inoculação, com base na massa de matéria fresca e seca dos calos formados por explante. A avaliação da diferenciação celular (número de plantas/explante) e taxa de diferenciação celular (número de plantas/g de matéria seca de calos) foi realizada após 30 dias de cultivo em condições de luz. A indução de calogênese e crescimento celular nos explantes de matrizes tratadas foi influenciada pelo tratamento pelos níveis de K + na solução nutritiva e pela duração dos tratamentos. Explantes de matrizes tratadas com alta concentração de K + resultaram em indução e crescimento de calos em matéria fresca e seca inversamente proporcional à concentração de K + no meio de cultura tanto para tratamento por 30 dias como para 60 dias. Tratamentos de curta duração (30 dias) com altos níveis de K + nas soluções nutritivas e baixos níveis de K + no meio de cultura influenciaram negativamente a regeneração de plantas (nº plantas/explante) nos calos dos explantes das matrizes tratadas. No entanto, taxas mais altas de diferenciação celular (nº plantas/g de matéria seca de calos) ocorreram nos calos de explantes de matrizes tratadas por 30 dias com solução nutritiva contendo maiores níveis de potássio e inoculados em meio de cultura contendo concentrações iguais ou maiores de que a do meio MS. / The growth of plants, organs, tissues and cells in vitro culture depends on the development of optimized culture medium for the perfect interaction among essential components such as phytoregulators, carbon source and minerals nutrients. The factors limiting the growth of organs or tissues in vitro conditions are similar to those limiting growth in vivo conditions. The objective of this work was aimed at studying the influence of the potassium nutritional status of matrixes plants of carrot Daucus carota Link on the in vitro morphogenesis. Matrixes plants were obtained from seeds germinated in organic substratum and cultivated in plastic pots containing washed sand in greenhouse conditions. The matrixes plants were then submitted to treatments with nutrients solutions containing variable potassium levels. After 30 and 60 days treatment, explants (internodes) were collected, disinfested and inoculated in solid culture medium of Murashige and Skoog (MS) containing different potassium concentrations and supplemented with 0,1mg.L -1 of 2,4-D for callogenesis induction in dark conditions. Cell differentiation by somatic embryogenesis was pursued by culturing the calli in auxina-free same culture medium in growth room under photoperiod of 16/8 hours (light/dark). The evaluation of the callogenesis induction and cell growth was carried out 60 days after explants inoculation, based on the mass of fresh and dry matter accumulation on each explant. The evaluation of cell differentiation (plant formed/explant) and of cell differentiation rate (number of plants formed/g of dry matter of callus) was carried after 30 days of culturing under light conditions. Callogenesis induction and cell growth on the explants of treated matrixes plants were affected by the potassium treatment levels in the nutrient solution and by the duration of the treatments. Explants from treated plants with the higher K + concentrations showed callus induction and growth inversely proportional to the concentration of K + in the culture medium for both (30 and 60 days) treatment duration. However the callogenesis accumulated after 60 days treatment was twice as much as that of 30 days treatments. Short time treatments duration (30 days) with higher levels of K + in the nutrient solutions and low concentrations of K + in the culture medium influenced the cell differentiation negatively (nº plants/explant) in the callus of the explants from treated plants. Cells from calli induced on explants from matrixes plants for 30 days were more morphogenic than the cells in the 60 days treatment where high callogenesis was observed. Also better cell differentiation rate was observed on calli induced on explants from treated matrixes plants with nutrient solutions containing the highest potassium levels and inoculated on MS culture medium containing highest potassium concentrations.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.

A cana-de-açúcar é um dos cultivos mais importantes no Brasil. Estima-se que uma parte do nitrogênio total de algumas variedades de cana-de-açúcar seja obtida pela interação com microrganismos endofíticos diazotróficos. Na maior parte de sua vida, os endofíticos habitam o interior de plantas sem causar nenhum sintoma aparente de doença. O estudo de interação microrganismos/plantas foi realizado utilizando-se co-culturas entre bactérias endofíticas diazotróficas e calos de cana-de-açúcar. Em presença do calo: Enterobacter sp. ICB113, ICB117 e ICB481 foram estimuladas e mantidas em elevadas populações; Klebsiella sp. ICB375 e Pseudomonas sp. ICB383 tiveram seu número reduzido e mantiveram-se em números estáveis; e Pantoea sp. ICB409 foi totalmente eliminada, demonstrando, assim, que a planta exerce um controle sobre os microrganismos. O modelo calo de cana-de-açúcar/bactéria endofítica diazotrófica foi capaz de evidenciar diferentes interações entre vegetal e bactéria, assim como, diferentes níveis de resposta de defesa da célula vegetal. / The sugarcane is one of the most important crops in Brazil. It is estimated that a portion of the total nitrogen of some varieties of sugarcane is obtained by interaction with diazotrophic endophytic microorganisms. In most of his life, the endophytes inhabit the interior of plants without causing any obvious signs of disease. The interaction study microorganisms/plants was performed using co-cultures among endophytic diazotrophic bacteria and sugarcane calluses. In the presence of callus : Enterobacter sp . ICB113 , ICB117 and ICB481 were stimulated and maintained in large populations ; Klebsiella sp . ICB375 and Pseudomonas sp. ICB383 had their numbers reduced and remained in stable numbers, and Pantoea sp. ICB409 was completely eliminated, thus demonstrating that the plant has a control over microorganisms. The model sugarcane callus/endophytic diazotrophic bacteria was able to show different interactions between plants and bacteria , as well as different levels of defense response of the plant cell.

O cultivo in vitro de plantas possibilita o controle de fatores ambientais e nutricionais, facilitando o estudo da interação planta-bactéria e a interpretação de eventuais alterações morfofisiológicas nas microplantas, decorrentes dessa interação. Entretanto, a presença de bactérias endofíticas na micropropagação é quase sempre caracterizada como contaminação microbiana prejudicial, sendo prontamente eliminada com o uso de quimioterápicos. Essa abordagem desconsidera os efeitos benéficos que bactérias endofíticas podem trazer ao desenvolvimento vegetal, aniquilando a possibilidade de se explorar esse potencial no ambiente in vitro. Em geral, devido a sua baixa culturabilidade, as comunidades bacterianas endofíticas requerem o uso de técnicas independentes de cultivo para seu estudo. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal comprovar a presença de uma comunidade bacteriana endofítica em microplantas de abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel consideradas axênicas e os efeitos dessa comunidade na morfofisiologia vegetal após antibioticoterapia. Para tanto, técnicas de PCR-DGGE, PCR-ARISA, clonagem, sequenciamento, análises estruturais e ultraestruturais foram utilizadas. Os resultados evidenciaram que existe uma comunidade bacteriana endofítica composta por membros de Alfa, Beta, gama -proteobactérias, actinobactérias e cianobactérias, que coloniza as microplantas. Os resultados convergentes de PCR-DGGE e PCR-ARISA mostraram que essa comunidade apresentou alteração na sua estrutura e diversidade de acordo com seu nicho de colonização e com o período de cultivo da planta hospedeira, sem renovação de meio de cultura. A ação da antibioticoterapia influenciou a estrutura da comunidade bacteriana, promovendo impactos diferenciados em cada grupo bacteriano avaliado. A antibioticoterapia não promoveu a total eliminação das bactérias endofíticas. Contudo, os tratamentos ocasionaram alterações na comunidade bacteriana, resultando na redução do crescimento de raízes e outras alterações histológicas no sistema radicular das microplantas. As análises ultraestruturais comprovaram a presença de bactérias endofíticas colonizando intracelularmente o mesofilo foliar e o córtex de raízes, mesmo após a antibioticoterapia. Dessa forma, conclui-se que em microplantas de abacaxizeiro assintomáticas existe uma comunidade bacteriana endofítica intracelular, rompendo o principal paradigma da cultura de tecidos vegetais, no qual microplantas são obrigatoriamente axênicas. / The in vitro culture of plants by the control of environmental and nutritional factors, allows the study of the plant-bacteria interaction and the interpretation of possible morphophysiological changes in the microplants, from such interaction. However, the presence of endophytic bacteria in micropropagation is often characterized as harmful microbial contamination, which is promptly eliminated by the use of chemotherapeutics. This approach does not take into account the beneficial effects that endophytic bacteria can bring to the plant development, and annihilates the possibility of exploiting this potential in the in vitro environment. In general, due to its low culturability, endophytic bacterial communities require the use of culture-independent techniques for their study. In this context, this work aimed to prove the presence of bacterial endophytes in pineapple (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel microplants considered axenics, and the effects of these in plant morphophysiology after antibiotictherapy. For this, PCR-DGGE, ARISA-PCR, cloning, sequencing, structural and ultrastructural analysis were used. The results showed that there is an endophytic bacterial community, composed of members of , , -proteobacteria, actinobacteria and cyanobacteria, which colonizes the microplants. The converging results of PCR-DGGE and ARISA-PCR showed that this community changed in its structure and diversity according to its niche of colonization and the period of cultivation of the host plant, without renewal of culture medium. The action of antibiotics influenced the bacterial community structure, promoting differential impacts on each bacterial group evaluated. Antibiotictherapy did not promote the total elimination of endophytic bacteria. However, the treatments caused changes in bacterial community, resulting in reduced growth of roots and other histological changes in the root system of the microplants. The ultrastructural analysis confirmed the presence of endophytic bacteria colonizing the intracellularly the leaf mesophyll and the cortex of roots, even after antibiotictherapy. Thus, it is concluded that in asymptomatic pineapple microplants there is an intracellular endophytic bacterial community, breaking the main paradigm of plant tissue culture, in which axenic microplants are mandatory.