Le « porcine respiratory disease complex » (PRDC) est un trouble multifactoriel dû à une infection simultanée ou séquentielle de divers micro-organismes pouvant intensifier ou prolonger les signes cliniques des porcs. On retrouve dans ce complexe Mycoplasma hyopneumoniae, un des agents initiateurs du PRDC et agent primaire de la pneumonie enzootique (EP) chez les porcs. Streptococcus suis est l’un des agents pathogènes secondaires du PRDC, c’est également un agent pathogène important induisant principalement des méningites, des septicémies et la mort subite des porcelets post-sevrés. Mycoplasma hyorhinis est également l’un des agents pathogènes secondaires du PRDC, et va induire des inflammations sérofibrineuses chez les porcelets. Comme ces trois pathogènes sont retrouvés au sein du PRDC et au niveau des voies respiratoires supérieures des porcs, il pourrait exister un effet positif des mycoplasmes sur la pathogénèse de S. suis. C’est pourquoi différentes expériences in vitro ont été réalisées avec les cellules épithéliales porcines (NPTr), les macrophages alvéolaires porcins (PAMs) et les cellules dendritiques porcines (BM-DCs) qui ont été pré-infectés par les mycoplasmes puis infectés avec S. suis. Il a été observé que la cytotoxicité et l’inflammation des cellules porcines ont été significativement augmentées lorsqu’elles ont été pré-infectées par les mycoplasmes puis infectées par S. suis. Cependant, la pré-infection des cellules n’a pas joué de rôle sur l’adhésion et l’invasion de S. suis, sur la phagocytose et la survie intracellulaire de la bactérie. Cette étude semble montrer que la pré-infection des mycoplasmes pourraient induire un contexte inflammatoire favorisant la pathogenèse de S. suis. / Porcine respiratory disease complex (PRDC) is a multifactorial disorder due to simultaneous or sequential infection with various microorganisms that can intensify or prolong clinical signs in pigs. Included in this complex is Mycoplasma hyopneumoniae, one of the initiating agents of PRDC and the primary agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs. Streptococcus suis is one of the secondary pathogens of PRDC and is also an important pathogen, mainly causing meningitis, septicemia, and sudden death in post-weaned piglets. Mycoplasma hyorhinis is also one of the secondary pathogens of PRDC and will also induce serofibrinous inflammation in piglets. As all three pathogens are found in the PRDC and in the upper respiratory tract of pigs there may be a positive effect of mycoplasma on the pathogenesis of S. suis. Therefore, different in vitro experiments were performed with newborn pig tracheal cells (NPTr), primary porcine alveolar macrophages (PAMs) and porcine bone-marrow-derived dendritic cells (BM-DCs) that were pre-infected with mycoplasma and then infected with S. suis. It was observed that cytotoxicity and inflammation of pig cells were significantly increased when they were pre-infected with mycoplasma and then infected with S. suis. However, pre-infection of the cells did not play a role in the adhesion and invasion of S. suis and in the phagocytosis and intracellular survival of the bacteria. This study suggests that pre-infection with mycoplasma may induce an inflammatory context favoring the pathogenesis of S. suis.

L'interleukine 7 (IL-7) est une cytokine indispensable au développement et à l'homéostasie des lymphocytes T. Le récepteur à l'IL-7 (IL-7R) est composé de la chaîne alpha (ou CD127) partagée avec le récepteur au TSLP et de la chaîne commune gamma c (ou CD132) partagée avec plusieurs récepteurs de cytokines gamma. L'expression de son récepteur a été décrite dans les lymphocytes T, mais n'a pas été clairement démontrée dans les cellules présentatrices d'antigène (CPA). Cependant, l'expression de CD127 et des récepteurs aux cytokines gamma ont été décrits sur ces cellules suggérant l'expression d'un IL-7R fonctionnel par les CPA. De façon intéressante, la chaîne CD127 existe également sous différentes formes solubles (CD127s) résultant d'épissages alternatifs de l'ARN messager. Toutefois, l'expression et la régulation de l'expression des isoformes de CD127 ont été peu étudiées dans les CPA. Par ailleurs, des polymorphismes du gène CD127 ont été identifiés et associés à une forte concentration plasmatique de la forme soluble CD127s ∆6 chez l'Homme et à une plus forte susceptibilité de développer des maladies auto-immunes. Certains de ces polymorphismes ont également été associés à une évolution plus rapide vers le stade SIDA chez les patients HIV. Enfin, sa capacité à lier l'IL-7 suggère un rôle important de cette forme soluble dans la régulation de la réponse à l'IL-7 en agissant sur sa biodisponibilité. Cependant, l'expression de CD127s plasmatique est très controversée chez les patients HIV en phase chronique. De plus, son expression n'est pas connue dans les organes infectés et n'a jamais été décrite en phase aiguë de l'infection. Enfin, son origine et sa fonction ne sont pas encore élucidées. La quantification spécifique de CD127s ∆6 par RT-qPCR chez le macaque rhésus sain révèle une expression minoritaire de CD127s ∆6 dans les PBMC, faible dans les intestins, plus importante dans les ganglions et encore plus importante dans les poumons. De façon plus précise, cette étude met en évidence sur cellules isolées du sang et de la rate de singes sains, une faible expression de CD127 par les monocytes caractérisée néanmoins par une représentation majeure de la forme soluble contrairement aux lymphocytes T. Ces résultats ont été confirmés par la suite in vitro dans 2 populations immunitaires majoritaires des poumons : les macrophages alvéolaires primaires (MA) issus de lavages broncho-alvéolaires (LBA) de macaque rhésus sains et les cellules épithéliales pulmonaires (CEP) humaines de la lignée NCI-H226. Dans une deuxième partie, la quantification spécifique de CD127s ∆6 par RT-qPCR dans les organes (ganglions et poumons) et le dosage de la protéine CD127s plasmatique en phase aiguë de l'infection SIVmac251 révèlent une augmentation significative de son expression dans les poumons aux temps J7, J10 et J14 post infection et de sa concentration plasmatique à J10 chez les singes infectés. Enfin dans une dernière partie, la charge virale et l'IL-7 endogène ont également été mesurées chez les singes infectés afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'expression de CD127s ∆6 au cours de l'infection par le SIVmac251. De façon surprenante, aucune corrélation n'a été trouvée entre l'expression de CD127s ∆6 et la charge virale ou l'expression d'IL-7 endogène chez les singes infectés et les singes sains après injection d'une dose pharmacologique d'IL-7. Ces données suggèrent un effet indirect de l'IL-7 et du virus sur l'expression de CD127s ∆6 et un rôle des facteurs de l'inflammation dans la régulation de son expression. Dans l'objectif de mieux définir ces mécanismes de régulation, les transcrits codant pour la forme soluble ont été quantifiés dans les MA et les CEP in vitro après 6H de stimulation ou non sous IL-7 ou TSLP (ligands de CD127) seul ou couplé au TNFα (cytokine pro inflammatoire). (...) / Interleukin-7 (IL-7) is a crucial cytokine for T-cell development and peripheral T-cell homeostasis. The IL-7 receptor (IL-7R) is composed by the alpha chain (or CD127) shared with the TSLP receptor and the common gamma chain (or CD132) shared with several receptors of gamma cytokines. IL-7R expression was described in T lymphocytes but was not clearly demonstrated in antigen presenting cells (APC). However, CD127 chain and gamma cytokine receptors were described in these cells suggesting a functional IL-7R expression in APC. Interestingly, the CD127 chain also exists under various soluble forms (CD127s) resulting in alternative splicing of CD127 mRNA. However, the expression and the regulation of CD127 isoforms expression have been barely studied in APC. Moreover, polymorphisms in CD127 gene were identified and associated with a strong plasmatic concentration of the soluble form CD127s ∆6 in Humans and a stronger susceptibility to develop autoimmune diseases. Some of these polymorphisms are also associated with a faster evolution to the AIDS stage for HIV patients. Finally, the capacity of this soluble form to bound IL-7 suggests an important role of CD127s ∆6 to regulate IL-7 response by acting on his availability. However, the plasmatic CD127s expression is very controversial in HIV patients in chronic phase of infection. Moreover it expression was not known in infected organs and has never been described in acute phase of infection. Finally, nobody defines its origin and its function yet. The specific quantification of CD127s ∆6 by RT-qPCR revealed a minority expression of CD127s ∆6 in PBMC, weak in gut, more important in ganglions and even more in lung. More precisely, this study highlight on isolated cells from healthy monkey’s blood and spleen, a weak expression of CD127 by monocytes characterized by a majority expression of the soluble form contrary to T lymphocytes. Afterwards, we confirmed these results in vitro in two major immune populations in lung: in primary alveolar macrophages (AM) isolated from broncho-alveolar lavages (BAL) from healthy rhesus monkey and in the NCI-H226 lineage of human lung epithelial cells (LEC). In a second part, the specific quantification of CD127s Δ6 by RT-qPCR in organs (ganglions and lung) and the determination of the CD127s plasmatic protein at the acute phase of SIVmac251 infection revealed a significant up-regulation of this expression in lung in times D7, D10 and D14 post infection and its plasmatic concentration at D10 in infected monkeys. Finally, in the last part, we also quantified the viral load and IL-7 expression from infected monkeys to understand mechanisms implicated in regulation of CD127 expression during SIVmac251 infection. Surprisingly, we found none correlation between CD127s ∆6 expression and viral load or IL-7 expression from infected monkeys and healthy monkeys after injection of a pharmacological dose of IL-7. These data suggest an indirect effect of IL-7 and virus on CD127s ∆6 expression and a role of inflammation factors in regulation of his expression. In order to better define these mechanisms of regulation, the transcripts coding for the soluble form were quantified on AM and LEC in vitro after 6H of stimulation with or without IL-7 or TSLP (ligands of CD127) alone or combined with TNFα (pro inflammatory cytokine). Surprisingly, contrary to T lymphocytes, IL-7 do not induces down regulation of CD127 expression on AM and LEC. Nevertheless, CD127s ∆6 expression is upregulated upon TNFα by AM in a dose dependent manner. Moreover, the costimulation (IL-7 + TNFα) induces CD127s ∆6 expression by LEC revealing a synergic effect of IL-7 and TNFα. Finally the polarization of macrophages derived from human monocytes (hMDM) show that activated state of macrophages impact not only expression but also regulation of CD127 expression by these cytokines. (...)

L'interleukine 7 (IL-7) est une cytokine indispensable au développement et à l'homéostasie des lymphocytes T. Le récepteur à l'IL-7 (IL-7R) est composé de la chaîne alpha (ou CD127) partagée avec le récepteur au TSLP et de la chaîne commune gamma c (ou CD132) partagée avec plusieurs récepteurs de cytokines gamma. L'expression de son récepteur a été décrite dans les lymphocytes T, mais n'a pas été clairement démontrée dans les cellules présentatrices d'antigène (CPA). Cependant, l'expression de CD127 et des récepteurs aux cytokines gamma ont été décrits sur ces cellules suggérant l'expression d'un IL-7R fonctionnel par les CPA. De façon intéressante, la chaîne CD127 existe également sous différentes formes solubles (CD127s) résultant d'épissages alternatifs de l'ARN messager. Toutefois, l'expression et la régulation de l'expression des isoformes de CD127 ont été peu étudiées dans les CPA. Par ailleurs, des polymorphismes du gène CD127 ont été identifiés et associés à une forte concentration plasmatique de la forme soluble CD127s ∆6 chez l'Homme et à une plus forte susceptibilité de développer des maladies auto-immunes. Certains de ces polymorphismes ont également été associés à une évolution plus rapide vers le stade SIDA chez les patients HIV. Enfin, sa capacité à lier l'IL-7 suggère un rôle important de cette forme soluble dans la régulation de la réponse à l'IL-7 en agissant sur sa biodisponibilité. Cependant, l'expression de CD127s plasmatique est très controversée chez les patients HIV en phase chronique. De plus, son expression n'est pas connue dans les organes infectés et n'a jamais été décrite en phase aiguë de l'infection. Enfin, son origine et sa fonction ne sont pas encore élucidées. La quantification spécifique de CD127s ∆6 par RT-qPCR chez le macaque rhésus sain révèle une expression minoritaire de CD127s ∆6 dans les PBMC, faible dans les intestins, plus importante dans les ganglions et encore plus importante dans les poumons. De façon plus précise, cette étude met en évidence sur cellules isolées du sang et de la rate de singes sains, une faible expression de CD127 par les monocytes caractérisée néanmoins par une représentation majeure de la forme soluble contrairement aux lymphocytes T. Ces résultats ont été confirmés par la suite in vitro dans 2 populations immunitaires majoritaires des poumons : les macrophages alvéolaires primaires (MA) issus de lavages broncho-alvéolaires (LBA) de macaque rhésus sains et les cellules épithéliales pulmonaires (CEP) humaines de la lignée NCI-H226. Dans une deuxième partie, la quantification spécifique de CD127s ∆6 par RT-qPCR dans les organes (ganglions et poumons) et le dosage de la protéine CD127s plasmatique en phase aiguë de l'infection SIVmac251 révèlent une augmentation significative de son expression dans les poumons aux temps J7, J10 et J14 post infection et de sa concentration plasmatique à J10 chez les singes infectés. Enfin dans une dernière partie, la charge virale et l'IL-7 endogène ont également été mesurées chez les singes infectés afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'expression de CD127s ∆6 au cours de l'infection par le SIVmac251. De façon surprenante, aucune corrélation n'a été trouvée entre l'expression de CD127s ∆6 et la charge virale ou l'expression d'IL-7 endogène chez les singes infectés et les singes sains après injection d'une dose pharmacologique d'IL-7. Ces données suggèrent un effet indirect de l'IL-7 et du virus sur l'expression de CD127s ∆6 et un rôle des facteurs de l'inflammation dans la régulation de son expression. Dans l'objectif de mieux définir ces mécanismes de régulation, les transcrits codant pour la forme soluble ont été quantifiés dans les MA et les CEP in vitro après 6H de stimulation ou non sous IL-7 ou TSLP (ligands de CD127) seul ou couplé au TNFα (cytokine pro inflammatoire). (...) / Interleukin-7 (IL-7) is a crucial cytokine for T-cell development and peripheral T-cell homeostasis. The IL-7 receptor (IL-7R) is composed by the alpha chain (or CD127) shared with the TSLP receptor and the common gamma chain (or CD132) shared with several receptors of gamma cytokines. IL-7R expression was described in T lymphocytes but was not clearly demonstrated in antigen presenting cells (APC). However, CD127 chain and gamma cytokine receptors were described in these cells suggesting a functional IL-7R expression in APC. Interestingly, the CD127 chain also exists under various soluble forms (CD127s) resulting in alternative splicing of CD127 mRNA. However, the expression and the regulation of CD127 isoforms expression have been barely studied in APC. Moreover, polymorphisms in CD127 gene were identified and associated with a strong plasmatic concentration of the soluble form CD127s ∆6 in Humans and a stronger susceptibility to develop autoimmune diseases. Some of these polymorphisms are also associated with a faster evolution to the AIDS stage for HIV patients. Finally, the capacity of this soluble form to bound IL-7 suggests an important role of CD127s ∆6 to regulate IL-7 response by acting on his availability. However, the plasmatic CD127s expression is very controversial in HIV patients in chronic phase of infection. Moreover it expression was not known in infected organs and has never been described in acute phase of infection. Finally, nobody defines its origin and its function yet. The specific quantification of CD127s ∆6 by RT-qPCR revealed a minority expression of CD127s ∆6 in PBMC, weak in gut, more important in ganglions and even more in lung. More precisely, this study highlight on isolated cells from healthy monkey’s blood and spleen, a weak expression of CD127 by monocytes characterized by a majority expression of the soluble form contrary to T lymphocytes. Afterwards, we confirmed these results in vitro in two major immune populations in lung: in primary alveolar macrophages (AM) isolated from broncho-alveolar lavages (BAL) from healthy rhesus monkey and in the NCI-H226 lineage of human lung epithelial cells (LEC). In a second part, the specific quantification of CD127s Δ6 by RT-qPCR in organs (ganglions and lung) and the determination of the CD127s plasmatic protein at the acute phase of SIVmac251 infection revealed a significant up-regulation of this expression in lung in times D7, D10 and D14 post infection and its plasmatic concentration at D10 in infected monkeys. Finally, in the last part, we also quantified the viral load and IL-7 expression from infected monkeys to understand mechanisms implicated in regulation of CD127 expression during SIVmac251 infection. Surprisingly, we found none correlation between CD127s ∆6 expression and viral load or IL-7 expression from infected monkeys and healthy monkeys after injection of a pharmacological dose of IL-7. These data suggest an indirect effect of IL-7 and virus on CD127s ∆6 expression and a role of inflammation factors in regulation of his expression. In order to better define these mechanisms of regulation, the transcripts coding for the soluble form were quantified on AM and LEC in vitro after 6H of stimulation with or without IL-7 or TSLP (ligands of CD127) alone or combined with TNFα (pro inflammatory cytokine). Surprisingly, contrary to T lymphocytes, IL-7 do not induces down regulation of CD127 expression on AM and LEC. Nevertheless, CD127s ∆6 expression is upregulated upon TNFα by AM in a dose dependent manner. Moreover, the costimulation (IL-7 + TNFα) induces CD127s ∆6 expression by LEC revealing a synergic effect of IL-7 and TNFα. Finally the polarization of macrophages derived from human monocytes (hMDM) show that activated state of macrophages impact not only expression but also regulation of CD127 expression by these cytokines. (...)

Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit. / The epithelial sodium channel (ENaC) expressed in alveolar epithelial cells plays a major role for lung liquid clearance at birth and lung edema resorption in adulthood. The expression and activity of ENaC are inhibited by many pathophysiological stress that could have an impact in the clinical outcome of acute respiratory distress syndrome (ARDS). Pulmonary inflammation is an important factor in this inhibition that may promote or sustain pulmonary edema. We have previously shown that pro-inflammatory cytokines and lipopolysaccharide (LPS) from Pseudomonas aeruginosa inhibit αENaC mRNA expression by transcriptional and post-transcriptional mechanisms, suggesting that a modulation of αENaC mRNA stability could play a role in this process. The main objective of the present work was to characterize how different pathophysiological stress affect αENaC mRNA expression in alveolar epithelial cells and determine whether this modulation could be explained in part by regulating the stability of the transcript. Our study shows that LPS and cycloheximide decrease the level of αENaC mRNA with a similar time course and via the activation of the MAPK ERK1/2 and p38 signaling pathways. Despite similarities, there were important differences in the mechanisms involved in the modulation of αENaC mRNA expression. While LPS repress αENaC mRNA transcription, cycloheximide triggers post-transcriptional mechanisms involving the 3' untranslated region (3'UTR) of αENaC mRNA. To further study the role of αENaC 3'UTR in this process, we developed a Tet-Off model that allows us to measure the half-life of αENaC mRNA regardless of the use of a transcription inhibitor such as actinomycin D (Act. D). Using this system, we showed a 100 min half-life for αENaC mRNA, a much shorter time then the one reported for this mRNA using Act. D. We showed that Act. D has an important stabilizing effect on αENaC mRNA and cannot be used to assess the stability of the transcript. Using deletion mutants of the αENaC 3'UTR region, we determined how different portions of 3'UTR were important in modulating stability of the transcript. We found that the 3'UTR has dual functions, with portions important to promote stabilization (proximal 3'UTR) and others that strongly destabilize (distal 3'UTR) the transcript. Our system also allowed us to confirm that the decreased expression of αENaC mRNA induced by TNF-α results in part by a decreased stability of the mRNA. Finally, we identified several RNA-binding proteins that interact specifically with αENaC 3'UTR and determined if these proteins had an impact on transcript stability. Surexpression of two of these proteins in alveolar epithelial cells, DHX36 and TIAL1 was able to decrease the level of αENaC mRNA via a downregulation of mRNA stability. The work presented here shows the complexity of the signal transduction pathways elicited by different pathological stress conditions in alveolar epithelial cells and is the first to show that αENaC mRNA stability elicited by sequences in 3’UTR plays an important role in modulating the level of the transcript. The Tet-Off model that we developed allows to accurately estimate the half-life of αENaC mRNA and shows that the 3’UTR portion of the mRNA plays a complex role in the modulation of transcript stability in basal and pro-inflammatory conditions. Finally, we identified two putative RNA-binding proteins able to specifically recognize αENaC 3’UTR and modulate the transcript stability.

La détection et la caractérisation des nanoparticules manufacturées (NPM) est l’une des premières étapes pour contrôler et diminuer leurs risques potentiels sur la santé humaine et l’environnement. Différents systèmes d’échantillonnage dans l’air existent pour l’évaluation d’une exposition aux NPM. Cependant, ils ne mesurent pas le risque potentiel de cette exposition à la santé humaine ni les mécanismes cellulaires qui en seraient responsables. Nos objectifs de recherche sont 1) Évaluer les effets de différents types de nanoparticules sur des cellules pulmonaires humaines et 2) Identifier de nouveaux mécanismes intracellulaires activés lors de l’exposition à divers types de NPM. Méthodologie: La lignée de cellules A549 a été utilisée. Trois types de NPM ont été étudiés (différentes concentrations et temps d’exposition): les nanoparticules de dioxyde de titane de type anatase (TiO2), les nanotubes de carbone simple paroi (NTCSP) et les nanoparticules de noir de carbone (NC). La viabilité cellulaire a été mesurée par le test MTS, le test PrestoBlue et le test d’exclusion du bleu de Trypan (uniquement pour les NTCSP). La mesure du stress oxydatif a été déterminée par la mesure des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) en utilisant l’essai DCFH-DA. L’activation d’une réponse anti-oxydative a été déterminée par la mesure de la forme réduite (GSH) et oxydée (GSSG) du glutathion, ainsi que du ratio GSH/GSSG (seulement avec NTCSP et TiO2). Résultats: Les trois nanoparticules ne semblent pas être toxiques pour les cellules A549 car il y a une diminution significative mais minime de la viabilité cellulaire. Cependant, elles induisent une augmentation du contenu intracellulaire en ROS qui est à la fois dépendante du temps et de la concentration. Aucun changement dans les concentrations de GSH et GSSG n’a été observé. En conclusion, nos données indiquent que la mesure de la viabilité n’est pas un critère suffisant pour conclure à la toxicité des NPM. La production de ROS est un critère intéressant, cependant il faudra démontrer l’activation de systèmes anti-oxydatifs pour expliquer l’absence de mortalité cellulaire suite à l’exposition aux NPM. / Detection and characterization of manufactured nanoparticles (NPs) is one of the first steps to control and reduce potential risks to human health and the environment. Various sampling schemes in air exist for the evaluation of exposure to NPs. However, they do not measure the potential risk of this exposure to the human health and the cellular mechanisms that are responsible. Our research objectives are 1) To evaluate the effects of different types of nanoparticles on human lung cells and 2) Identify new intracellular mechanisms activated during exposure to various types of NPs. Methodology: The cell line A549 was used. Three types of NPs were studied (different concentrations and exposure time): titanium dioxide nanoparticles of anatase (TiO2), the simple wall carbon nanotubes (SWCN) and black carbon nanoparticles (BC). Cell viability was measured by the MTS assay, the PrestoBlue assay and the Trypan blue due exclusion test (only for the SWCN). To investigate whether the NPs stimulated ROS generation in A549 cels, the intracellular ROS level was measured using the DCFH-DA assay. The potential induction of oxidative stress responses in cells when exposed to TiO2 and SWCN was determined by the quantification of the extracellular levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) forms. Results: The three nanoparticles do not appear to be toxic to A549 cells because there is a significant but small decrease in cell viability. However, they induce ROS production which is both time and concentration dependent. No change in the concentrations of GSH and GSSG were observed. In conclusion, our data indicate that measuring the cell viability is not a sufficient criterion for concluding if the NPs are toxic. ROS production is an interesting criterion, however, we have to demonstrate the activation of anti-oxidative systems to explain the absence of cell death following exposure to the NPs.

Les cellules dendritiques présentes dans les muqueuses comme les cellules de Langerhans, sont capables de présenter le Virus d'Immunodéficience Humaine (VIH) aux lymphocytes T CD4+, aboutissant à l'infection par le VIH lors de contacts hétérosexuels non protégés. Le recrutement des cellules de Langerhans dans la muqueuse vaginale est assuré par la chimiokine Quimiocin C-C motif ligant 20 (CCL20) produite par les cellules épithéliales de la muqueuse. L'objectif de ce travail a été d’étudier la capacité du plasma séminal, de la salive et de la sécrétion vaginale à stimuler la production de CCL20 par les cellules de l’épithélium endocervical (cellules HEC-1A), et de corréler cette production avec la présence de la lactoferrine (LF) et de ses produits de clivage dans ces différents fluides biologiques. Des cellules HEC-1A ont été cultivées avec les plasmas séminaux, les salives et les sécrétions vaginales de patients séronégatifs et séropositifs pour le VIH, et la production de CCL20 a été mesurée dans les surnageants cellulaires en ELISA. Le dosage de la Lf par ELISA a été réalisé sur tous les échantillons. La présence d’un petide de clivage de la Lf (G-12-I) a été analysée en western blot. Les résultats obtenus montrent que les plasmas séminaux des patients séropositifs ont une plus grande capacité à stimuler la sécrétion de CCL20 que les patients séronégatifs pour le VIH. La concentration de la Lf dans le plasma séminal est corrélée à la stimulation de cette sécrétion par les cellules HEC-1A. Il semble que les échantillons ayant la plus grande capacité à stimuler la sécrétion de CCL20 possèdent une plus forte concentration en petide de clivage de la Lf (G-12-I), bien que ce résultat, obtenu en western blot. La salive est également capable de stimuler de la production de CCL20 par les cellules HEC-1A, mais cette stimulation n'est pas corrélée avec sa concentration en Lf. Nous concluons que la sécrétion de CCL20 par l’épithélium génital féminin induite par le plasma séminal est corrélée à la présence de la Lf dans ce fluide. Bien que les mécanismes puissent être différents, la salive peut également induire la production de CCL20 par les cellules épithéliales de la muqueuse génitale féminine / Dendritic cells, among them Langerhans cells, are recognized as presenters of Human Immunodeficiency Virus (HIV) to CD4 + T lymphocytes. The recruitment of Langerhans cells in the vaginal mucosa is modulated by Chemokine CC motif ligand 20 (CCL20) produced by epithelial cells of the female genital mucosa. The aim of this study was to evaluated the capacity of seminal plasma, saliva and vaginal secretions to induce the production of CCL20 by monostratified endocervical epithelium cells culture (HEC-1A), also, the relation of this production with the presence of lactoferrin and its cleavage products (G- 12-I) in seminal plasma and saliva. Cultures of HEC-1A cells were stimulated with seminal plasma, saliva and vaginal secretions of HIV-seronegative and HIV-seropositive participants, and the CCL20 production measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in its cellular supernatant. ELISA for Lf was performed on all samples, and the peptide cleavage Lf (G-12-I) observed in the samples which more and less induced the CCL20 secretion on western blot. We observed that the seminal plasma of seropositive participants were responsible for a higher stimulation of CCL20 production by HEC-1A cells, when compared to the seminal plasma of HIV-seronegative participants. Lf concentration in seminal plasma was positively related to the CCL20 production by HEC-1A cells, the higher production of CCL20 was also more associated with Lf peptide cleavage Lf (G-12-I), on western blot. Saliva stimulated CCL20 production by HEC-1A cells, and such stimulation was not correlated to Lf concentration. In conclusion, the presence of Lf in seminal plasma positively related to the production of CCL20 by HEC-1A cells, and saliva may induce the production of CCL20 in the female genital mucosa / As células dentríticas, dentre elas as células de Langerhans, são capazes de apresentar o vírus da imunodeficiência humana (HIV) aos linfócitos T CD4+, cujo processo culmina com a infecção por esse vírus. O recrutamento das células de Langerhans na mucosa vaginal é modulada pela Quimiocin C-C motif ligant 20 (CCL20), produzida pelas células epiteliais da mucosa genital feminina. O objetivo desse trabalho foi estudar a capacidade do plasma seminal, da saliva e do conteúdo vaginal de induzir a produção de CCL20 pela cultura de células do epitélio monoestratificado endocervical (HEC-1A), relacionando tal produção com a presença da lactoferrina (Lf) e de seu produto de clivagem (G-12-I) nestes fluidos. Culturas de células HEC-1A foram estimuladas com plasmas seminais, salivas e conteúdos vaginais de participantes soronegativos e soropositivos para o HIV, visando avaliar a produção de CCL20, a qual foi mensurada utilizando-se o Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). A dosagem de Lf (ELISA) foi realizada em todas as amostras estudadas e a presença do peptídeo de clivagem da Lf (G-12-I) observada nas amostras que mais e que menos induziram a secreção de CCL20 pelas células HEC-1A por Western blot. Verificou-se que os plasmas seminais de participantes soropositivos foram responsáveis por maior estimulação da produção de CCL20 pelas células HEC-1A, quando comparados aos plasmas seminais de participantes soronegativos para o HIV. A concentração de Lf no plasma seminal associou-se à indução na produção de CCL20 pelas células HEC-1A, assim como as amostras que mais induziram a produção de CCL20 apresentaram presenças mais evidentes do peptídeo de clivagem da Lf (G-12-I). A saliva foi responsável pela estimulação na produção de CCL20 pelas células HEC-1A, no entanto, tal estimulação não se associou à concentração de Lf salivar. Concluímos que a presença de Lf no plasma seminal esteve correlacionada à produção de CCL20 pelas células HEC-1A, e que a saliva pode induzir a produção da CCL20 pelas células epiteliais endocervicais

Le cancer de la prostate est la forme de cancer la plus fréquente et la troisième cause de décès par cancer chez l’homme dans les sociétés occidentales. Alors que la plupart des cancers de la prostate localisés sont éradiqués chirurgicalement, la plupart des tumeurs métastatiques répondant initialement aux thérapies par privation d’androgènes deviennent résistantes au traitement, causant généralement le décès du patient. Les gènes suppresseurs de tumeur PTEN et p53 étant fréquemment mutés dans les cancers de la prostate métastatiques et résistants à la castration, le laboratoire d’accueil a généré des modèles murins dans lesquels Pten et/ou Trp53 sont sélectivement invalidés à l’âge adulte dans les cellules épithéliales prostatiques dans le but de déterminer les évènements clés conduisant à la progression du cancer de la prostate. Notre étude révèle que l’invalidation de PTEN stimule la prolifération des cellules épithéliales prostatiques et conduit à des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux en quelques mois. Cette hyper-prolifération induit un stress réplicatif et une réponse aux dommages de l’ADN qui va conduire à un arrêt progressif de la croissance cellulaire et une entrée en sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent de nombreuses cytokines et de chimiokines, et peuvent accumuler des mutations contribuant ainsi à la progression de la tumeur. Il est notable qu’en l’absence de Trp53, les épithéliums prostatiques dépourvus de Pten développent des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux entrant en sénescence. Cependant, la formation d’adénocarcinomes est accélérée et des tumeurs sarcomatoïdes pouvant générer à long terme des métastases apparaissent. En l’absence de Pten, certaines cellules épithéliales prostatiques perdent leur identité moléculaire en exprimant des marqueurs caractéristiques de cellules souches et différenciation neuroendocrinienne. Nous avons également mis en évidence des cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN et p53 résistantes à la castration exprimant à la fois des marqueurs de cellules basales et luminales. En conclusion, nos travaux ont permis une avancée dans la compréhension des mécanismes conduisant à des formes incurables de cancer de la prostate. Les traitements actuels ayant des effets secondaires importants et pouvant générer des résistances, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’élimination des cellules sénescentes mais aussi des cellules épithéliales prostatiques exprimant des marqueurs de cellules basales et luminales dans les lésions précancéreuses représente des perspectives intéressantes pour traiter le cancer de la prostate. / Prostate cancer (PCa) is a leading cause of male cancer death worldwide. While most locally PCa are curable, metastatic tumors initially respond to androgen deprivation therapy but ultimately relapse to castration-resistant prostate cancer (CRPC), which is a lethal disease. Since the tumor suppressor genes PTEN and p53 are frequently mutated in metastatic and CRPC, the host laboratory generated mouse models in which Pten and/or Trp53 are selectively ablated in adult prostatic epithelial cells (PECs) in order to unravel the key events leading to prostate cancer progression. Our study reveals that Pten ablation stimulates PECs proliferation forming prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) within a few months. This hyper-proliferation induces replicative stress and a DNA damage response (DDR), which in turn leads to a progressive growth arrest with characteristics of cell senescence. As senescent cells secrete a large number of cytokines and chemokines, and can accumulate other mutations, they might contribute to tumor progression. Importantly, in the absence of Trp53, most Pten-null PECs develop PINs that enter senescence. However partial loss of PECs identity is detected as we show enhanced stemness and focal neuroendocrine differentiation of luminal Pten-null PECs. In some cases, adenocarcinoma and sarcomatoid tumors are formed, and more than one-third of the latter develop metastases. Strikingly, we also show formation of a castrate-resistant cell entity of both Pten and Pten/Trp53-null PECs sharing luminal and basal markers. Taken together, as current treaments lead to side effects and resistance, the development of therapeutic strategies to eliminate senescent cells/and or PECs expressing luminal and basal/stem progenitor in pre- cancerous lesions represents promising option for prostate cancer treatment.

L'interleukine 7 (IL-7) est une cytokine indispensable au développement et à l'homéostasie des lymphocytes T. Le récepteur à l'IL-7 (IL-7R) est composé de la chaîne alpha (ou CD127) partagée avec le récepteur au TSLP et de la chaîne commune gamma c (ou CD132) partagée avec plusieurs récepteurs de cytokines gamma. L'expression de son récepteur a été décrite dans les lymphocytes T, mais n'a pas été clairement démontrée dans les cellules présentatrices d'antigène (CPA). Cependant, l'expression de CD127 et des récepteurs aux cytokines gamma ont été décrits sur ces cellules suggérant l'expression d'un IL-7R fonctionnel par les CPA. De façon intéressante, la chaîne CD127 existe également sous différentes formes solubles (CD127s) résultant d'épissages alternatifs de l'ARN messager. Toutefois, l'expression et la régulation de l'expression des isoformes de CD127 ont été peu étudiées dans les CPA. Par ailleurs, des polymorphismes du gène CD127 ont été identifiés et associés à une forte concentration plasmatique de la forme soluble CD127s ∆6 chez l'Homme et à une plus forte susceptibilité de développer des maladies auto-immunes. Certains de ces polymorphismes ont également été associés à une évolution plus rapide vers le stade SIDA chez les patients HIV. Enfin, sa capacité à lier l'IL-7 suggère un rôle important de cette forme soluble dans la régulation de la réponse à l'IL-7 en agissant sur sa biodisponibilité. Cependant, l'expression de CD127s plasmatique est très controversée chez les patients HIV en phase chronique. De plus, son expression n'est pas connue dans les organes infectés et n'a jamais été décrite en phase aiguë de l'infection. Enfin, son origine et sa fonction ne sont pas encore élucidées. La quantification spécifique de CD127s ∆6 par RT-qPCR chez le macaque rhésus sain révèle une expression minoritaire de CD127s ∆6 dans les PBMC, faible dans les intestins, plus importante dans les ganglions et encore plus importante dans les poumons. De façon plus précise, cette étude met en évidence sur cellules isolées du sang et de la rate de singes sains, une faible expression de CD127 par les monocytes caractérisée néanmoins par une représentation majeure de la forme soluble contrairement aux lymphocytes T. Ces résultats ont été confirmés par la suite in vitro dans 2 populations immunitaires majoritaires des poumons : les macrophages alvéolaires primaires (MA) issus de lavages broncho-alvéolaires (LBA) de macaque rhésus sains et les cellules épithéliales pulmonaires (CEP) humaines de la lignée NCI-H226. Dans une deuxième partie, la quantification spécifique de CD127s ∆6 par RT-qPCR dans les organes (ganglions et poumons) et le dosage de la protéine CD127s plasmatique en phase aiguë de l'infection SIVmac251 révèlent une augmentation significative de son expression dans les poumons aux temps J7, J10 et J14 post infection et de sa concentration plasmatique à J10 chez les singes infectés. Enfin dans une dernière partie, la charge virale et l'IL-7 endogène ont également été mesurées chez les singes infectés afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'expression de CD127s ∆6 au cours de l'infection par le SIVmac251. De façon surprenante, aucune corrélation n'a été trouvée entre l'expression de CD127s ∆6 et la charge virale ou l'expression d'IL-7 endogène chez les singes infectés et les singes sains après injection d'une dose pharmacologique d'IL-7. Ces données suggèrent un effet indirect de l'IL-7 et du virus sur l'expression de CD127s ∆6 et un rôle des facteurs de l'inflammation dans la régulation de son expression. Dans l'objectif de mieux définir ces mécanismes de régulation, les transcrits codant pour la forme soluble ont été quantifiés dans les MA et les CEP in vitro après 6H de stimulation ou non sous IL-7 ou TSLP (ligands de CD127) seul ou couplé au TNFα (cytokine pro inflammatoire). (...) / Interleukin-7 (IL-7) is a crucial cytokine for T-cell development and peripheral T-cell homeostasis. The IL-7 receptor (IL-7R) is composed by the alpha chain (or CD127) shared with the TSLP receptor and the common gamma chain (or CD132) shared with several receptors of gamma cytokines. IL-7R expression was described in T lymphocytes but was not clearly demonstrated in antigen presenting cells (APC). However, CD127 chain and gamma cytokine receptors were described in these cells suggesting a functional IL-7R expression in APC. Interestingly, the CD127 chain also exists under various soluble forms (CD127s) resulting in alternative splicing of CD127 mRNA. However, the expression and the regulation of CD127 isoforms expression have been barely studied in APC. Moreover, polymorphisms in CD127 gene were identified and associated with a strong plasmatic concentration of the soluble form CD127s ∆6 in Humans and a stronger susceptibility to develop autoimmune diseases. Some of these polymorphisms are also associated with a faster evolution to the AIDS stage for HIV patients. Finally, the capacity of this soluble form to bound IL-7 suggests an important role of CD127s ∆6 to regulate IL-7 response by acting on his availability. However, the plasmatic CD127s expression is very controversial in HIV patients in chronic phase of infection. Moreover it expression was not known in infected organs and has never been described in acute phase of infection. Finally, nobody defines its origin and its function yet. The specific quantification of CD127s ∆6 by RT-qPCR revealed a minority expression of CD127s ∆6 in PBMC, weak in gut, more important in ganglions and even more in lung. More precisely, this study highlight on isolated cells from healthy monkey’s blood and spleen, a weak expression of CD127 by monocytes characterized by a majority expression of the soluble form contrary to T lymphocytes. Afterwards, we confirmed these results in vitro in two major immune populations in lung: in primary alveolar macrophages (AM) isolated from broncho-alveolar lavages (BAL) from healthy rhesus monkey and in the NCI-H226 lineage of human lung epithelial cells (LEC). In a second part, the specific quantification of CD127s Δ6 by RT-qPCR in organs (ganglions and lung) and the determination of the CD127s plasmatic protein at the acute phase of SIVmac251 infection revealed a significant up-regulation of this expression in lung in times D7, D10 and D14 post infection and its plasmatic concentration at D10 in infected monkeys. Finally, in the last part, we also quantified the viral load and IL-7 expression from infected monkeys to understand mechanisms implicated in regulation of CD127 expression during SIVmac251 infection. Surprisingly, we found none correlation between CD127s ∆6 expression and viral load or IL-7 expression from infected monkeys and healthy monkeys after injection of a pharmacological dose of IL-7. These data suggest an indirect effect of IL-7 and virus on CD127s ∆6 expression and a role of inflammation factors in regulation of his expression. In order to better define these mechanisms of regulation, the transcripts coding for the soluble form were quantified on AM and LEC in vitro after 6H of stimulation with or without IL-7 or TSLP (ligands of CD127) alone or combined with TNFα (pro inflammatory cytokine). Surprisingly, contrary to T lymphocytes, IL-7 do not induces down regulation of CD127 expression on AM and LEC. Nevertheless, CD127s ∆6 expression is upregulated upon TNFα by AM in a dose dependent manner. Moreover, the costimulation (IL-7 + TNFα) induces CD127s ∆6 expression by LEC revealing a synergic effect of IL-7 and TNFα. Finally the polarization of macrophages derived from human monocytes (hMDM) show that activated state of macrophages impact not only expression but also regulation of CD127 expression by these cytokines. (...)

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