Neste trabalho foi desenvolvido um Dot-ELISA capaz de detectar anticorpos anti-Plasmodium vivax, anti-Plasmodium falciparum, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Treponema pallidum, simultaneamente. O teste foi padronizado e aplicado em amostras de pacientes com malária, doença de Chagas e sífilis e comparado com testes de referência. Foi utilizado no estudo 52 amostras de pacientes com doença de Chagas, 43 pacientes com sífilis, 103 indivíduos com infecção presente (primo-infectado e não primo-infectados) ou passada de malária, indivíduos com anticorpos heterólogos, 30 indivíduos com leishmaniose 100 indivíduos saudáveis. O Dot-ELISA-Multi apresentou 100% de especificidade para todos os antígenos nas amostras de indivíduos saudáveis e com anticorpos heterólogos, com exceção do antígeno TESA que obteve 99%. A sensibilidade obtida foi de 100% em indivíduos chagásicos e 88% em pacientes com sífilis. Em indivíduos com malária a sensibilidade obtida foi de 90% para PvMSP119 (antígeno de P. vivax) e 47% para Pf-Zw (antígeno de P. falciparum). A positividade do teste em indivíduos não parasitados com histórico de malária foi de 92%. Nas amostras de malária observou-se que em indivíduos que tinham tido ultimo episódio de P. vivax, associação negativa foi observada entre o tempo passado desde o último episódio e reatividade de Dot-ELISAMulti PvMSP119, e associação positiva entre o número de episódios de malária e reatividade de Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. Indivíduos cujo o último episódio foi por P. falciparum, o Dot-ELISA-Multi Pf-Zw apresentou associação positiva com o número de episódios ocorridos. O comparado com os testes de referência utilizados apresentou um nível muito bom de concordância para TESA, EAE, PvMSP119 e um nível bom de concordância para Pf-Zw / In the present study, a Dot-ELISA was assembled to test antibodies against Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi and Treponema pallidum and was standardized and evaluated in serum samples from patients with malaria, Chagas disease and syphilis, in comparison with reference tests. The study was carried out on serum samples from 52 patients with chronic Chagas disease, 103 individuals with current (parasitemic) or past malaria (aparasitemic), 43 patients with syphilis, 30 with leishmaniosis, 21 individuals with heterologous antibodies and 100 blood donors. The diagnostic performance of Dot-ELISA-Multi for serum samples from patients with heterologous antibodies and from healthy blood donors, an overall 100% specificity was obtained for all antigens but TESA. A 100% sensitivity was observed in serum specimens from chronic-chagasic patients and 88% in serum specimens from syphilis patients. For malaria samples, the positivity was 90% for PvMSP119 and 47% for Pf-Zw antigen. In past malaria individuals, positivity was 92%. Sera from subjects who had had a P. vivax-malaria last episode presented negative association between time elapsed since their last malaria episode and results from Dot-ELISA-Multi PvMSP119; while positive association was observed between number of malaria episodes and results from Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. For individuals who had had a P. falciparum-malaria last episode, Dot-ELISAMulti Pf-Zw results showed positive association with number of malaria episodes only. Altogether, concerning the reactivity of the five antigens of the Dot-ELISAMulti, as compared with their respective reference tests, we have observed a very good level of concordance for TESA, EAE, PvMSP119 and for Tp-Zw and a good level for Pf-Zw

Trypanosoma cruzi é capaz de incorporar histidina, um aminoácido essencial, através de um sistema de transporte saturável, de alta especificidade e dependente de ATP. Uma vez no citoplasma, a histidina amônio-liase (TcHAL), catalisa a deaminação não oxidativa da His a urocanato, quem é convertido pela urocanato hidratase (TcUH) ao intermediário 4-imidazolona-5-propionato. Posteriormente, duas enzimas (imidazolona propionase e formiminoglutamase) atúam para gerar glutamato. TcHAL e TcUH foram caracterizadas cinetica e bioquímicamente. O α-cetoglutarato, produto da deaminação do Glu gerado na degradação de His, ingressa ao ciclo de Krebs e os electrons gerados são capazes de restabelecer o potencial de membrana mitocondrial, promover a síntese de ATP e consumo de oxigênio na mitocôndria. Além disso, His é capaz de estimular a metaciclogênese: estudos metabolômicos mostraram que His é utilizada como fonte energética principalmente no inicio da diferenciação. Nossos dados mostram a relevância da His na bioenergética de T. cruzi, nos estágios presentes no inseto vetor. / Trypanosoma cruzi incorporates histidine, an essential amino acid, through a saturable, highly specific and ATP dependent transport system. Once in the cytoplasm, a histidine ammonia-lyase (TcHAL) catalyzes the non-oxidative deamination of His to urocanate, which is converted by an urocanate hydratase (TcUH) to the intermediate 4-imidazolone-5-propionate. Afterwards, two enzymes (imidazolonepropionase and fomiminoglutamase) complete the glutamate formation. Kinetic and biochemical parameters of TcHAL and TcUH were determined. We observe that His degradation can feed Krebs cycle, and the electrons produced are able to restore the mitochondrial inner membrane potential, promote ATP biosynthesis and oxygen consumption at the mitochondrion. Furthermore, His was able to stimulate metacyclogenesis: a metabolomics approach shows that His is used as an energy source, mainly, in early stages of differentiation. Our data shows the relevance of His in T. cruzi bioenergetics, mainly in insect vector stages.

Introdução: O pênfigo foliáceo endêmico (PFE) ou Fogo Selvagem (FS) é uma dermatose bolhosa autoimune com auto-anticorpos IgG patogênicos, principalmente da subclasse IgG4, direcionados contra epítopos da desmogleína 1 (Dsg1), uma glicoproteína desmossômica que desempenha papel na adesão celular da epiderme. Os auto-anticorpos ligam-se a domínios específicos da Dsg1, gerando acantólise (perda da adesão celular) através de mecanismos diversos, tais como sinalização intracelular de moléculas e impedimento estérico. A etiopatogenia do FS é multifatorial, apresentando interações entre fatores imunológicos, genéticos e ambientais. Em algumas regiões do Brasil, detectou-se alta prevalência de FS (3%), sugerindo importante participação de fatores ambientais como desencadeantes da resposta autoimune. Indivíduos saudáveis de áreas endêmicas de FS reconhecem epítopos não-patogênicos da Dsg1, e exposição a insetos hematófagos é um fator de risco para FS. FS e doença de Chagas compartilham algumas regiões geográficas, e anticorpos anti- Dsg1 foram detectados em doentes de Chagas. Na reserva indígena Terena (Limão Verde), onde a prevalência de FS é alta, a população está exposta a picadas de simulídeos, cimecídeos e reduvídeos. Estes insetos podem atuar como vetores de doenças, bem como na imunomodulação do processo autoimune do FS. Objetivos: Nosso estudo teve como objetivos: 1- avaliar a frequência de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi em doentes de FS e na população saudável da área de alto risco para FS, habitantes da aldeia indígena de Limão Verde, Mato Grosso do Sul, Brasil; 2- avaliar a reatividade concomitante contra Dsg1 e T. cruzi nessa população de alto risco para FS. Métodos: Realizamos ensaio sorológico de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) para reatividade contra Dsg1 e contra T. cruzi em 40 doentes de FS e em 150 indivíduos saudáveis da reserva indígena Terena. Adicionalmente, todos os soros foram analisados através da técnica de imunofluorescência indireta (IFI) para doença de Chagas. Nas reações positivas por ELISA e IFI para Chagas, TESA (trypomastigoste extracted/secreted antigens) immunobloting foi realizado como teste confirmatório para doença de Chagas. Resultados: A forma indeterminada da doença de Chagas foi identificada através da reação contra o T. cruzi por ELISA, IFI e TESA-BLOT em cinco indivíduos de Limão Verde, que não apresentavam FS. Nenhum doente de FS da região estudada apresentou reatividade contra T. cruzi. O perfil de anticorpos anti-Dsg1 evidenciou resultado positivo em 15 dos 40 doentes de FS e em 33 dos 150 soros de indivíduos saudáveis da região endêmica de FS. Não se observou reação cruzada entre doença de Chagas e FS. Conclusões: 1-Nosso estudo revelou pela primeira vez a ocorrência de doença de Chagas, forma indeterminada, em uma população ameríndia Terena da aldeia de Limão Verde, uma área endêmica de fogo selvagem; 2-Nenhum doente de fogo selvagem da reserva indígena Terena de Limão Verde, Aquidauana (MS) apresentou reatividade contra o Trypanosoma cruzi; 3-A resposta antidesmogleína 1 nos doentes de fogo selvagem foi encontrada em 37,5% (15/40) dos pacientes. Auto-anticorpos anti-desmogleína 1 nos indivíduos sadios (sem fogo selvagem) foram encontrados em 22% (33/150) dos casos. 4-Não houve concomitância de doença de Chagas e fogo selvagem na amostra populacional estudada de Limão Verde / Introduction: Endemic pemphigus foliaceus (EPF) or Fogo Selvagem (FS) is an autoimmune blistering disorder with pathogenic IgG autoantibodies, mainly of the IgG4 subclass, that recognize desmoglein 1 (Dsg1), a desmossomal glycoprotein that plays a role in epidermal cell adhesion. Autoantibodies binding to specific domains of Dsg1 lead to acantholysis through different mechanisms, such as intracellular molecular signaling and steric hindrance. Etiopathogenesis of FS is multifactorial, with the interaction of immunological, genetic and environmental factors. In certain settlements of Brazil, a high prevalence of FS (3%) is reported, suggesting an important role for environmental factors as triggers of the autoimmune response. Healthy individuals from endemic areas recognize non-pathogenic epitopes of Dsg1, and exposure to hematophagous insects is a risk factor for FS. Interestingly, FS and Chagas disease share some geographic sites, and anti- Dsg1 has been detected in Chagas patients. In the Terena reservation of Limao Verde, where FS prevalence is high, the population is prone to insect bites (Simulium, Cimex and Triatoma). Those insects may play a role as disease vectors or exert modulation of the autoimmune process in FS. Aims: Our study aimed: 1-To evaluate the frequency of antibodies anti- Trypanosoma cruzi in FS patients and in a healthy population living in a highrisk area for FS, a native Brazilian reservation of Limão Verde, Mato Grosso, Brazil; 2-.To analyze the concomitant reactivity against Dsg1 and T. cruzi in a high-risk population for FS. Methods: We performed ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) for Dsg1 and T. cruzi in forty FS patients and 150 healthy individuals living in the Terena reservation. All sera were also analyzed by indirect immunofluorescence (IIF) for Chagas disease. In those seropositive reactions for T. cruzi, TESA (trypomastigoste extracted/secreted antigens) immunoblotting was performed as a confirmatory test for Chagas disease. Results: Indeterminate Chagas disease was identified utilizing ELISA, IIF and TESA-BLOT for T. cruzi in five non-FS individuals from Limão Verde. In counterpart, none of the FS patients living in the same geographic region showed reactivity against Trypanosoma cruzi. Anti-Dsg1 antibodies were present in 15 out of 40 FS sera and in 33 out of 150 sera from healthy individuals from endemic FS site. No cross-reactivity between Chagas disease and FS was observed. Conclusions: 1- Our study revealed, for the first time, the occurrence of indetermined Chagas disease in an Amerindian Terena population of Limão Verde, Aquidauana, an endemic area of Fogo Selvagem; 2-None of the FS patients from the present endemic focus of Limao Verde, Aquidauana (MS) showed reactivity against Trypanosoma cruzi; 3-The anti-Dsg1 response in FS patients of this focus was detected in 37.5% (15/40) of the patients. In non-FS controls, autoantibodies anti-Dsg 1 were detected in 22% (33/150) of the sera; 4-There was no concomitance of Chagas disease and fogo selvagem in the analyzed population of Limão Verde

A doença de Chagas é uma infecção causada pelo protozoário intracelular Trypanosoma cruzi. Atualmente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas, e há 25 milhões de pessoas em áreas de risco de contaminação. A cada ano ocorrem 56.000 novos casos e, aproximadamente, 12.000 mortes por complicações oriundas da doença. É endêmica em 21 países da América do Sul, e pode ser encontrada, também, na América do Norte e Europa devido a processos migratórios. Somente dois fármacos estão disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, o nifurtimox e o benznidazol, que são ativos somente na fase aguda e causam sérios efeitos adversos. Diante deste panorama, é eminente a necessidade de novos antichagásicos. A enzima cruzaína é a principal cisteíno-protease presente no T. cruzi, é importante para a sobrevivência, diferenciação e entrada do parasita no hospedeiro, se apresentando como um excelente alvo biológico na busca de novos quimioterápicos. Derivados de semicarbazona, tais como o nitrofural e o hidroximetilnitrofural demonstraram atividade inibitória da cruzaína, sendo considerados protótipos na busca de antichagásicos. Utilizando estratégias modernas de planejamento de fármacos por meio da integração entre técnicas computacionais, modelagem molecular e docking, e experimentais, síntese e ensaios biológicos, realizou-se neste trabalho o planejamento, síntese e avaliação biológica de bioisósteros do nitrofural como candidatos à antichagásicos. Aplicou-se estudos de modelagem molecular e docking para 10 compostos derivados de aminoguanidina, semi e tiossemicarbazona; observamos nesses estudos que os compostos contendo tiossemicarbazona apresentaram resultados mais favoráveis ao mecanismo de ação proposto, o qual sugere-se um ataque nucleofílico do resíduo de Cys25 presente no sítio catalítico da enzima cruzaína à tiocarbonila presente nesses compostos. Obtiveram-se através da síntese, 6 compostos caracterizados por RMN 1H e 13C. Tais compostos foram submetidos a ensaios de inibição da cruzaína, sendo que os derivados 6, 9 e 10, apresentaram um perfil de inibição favorável em dose de 100 µM, com valores entre 70 e 75% de inibição. Em ensaio de inibição de crescimento celular em formas epimastigotas do T. cruzi o composto 9 apresentou um IC50 de 19,8 µM, sendo o melhor protótipo para desenvolvimento de um novo agente antichagásico. De uma maneira geral os resultados obtidos nos ensaios biológicos corroboram com os dados apresentados na modelagem molecular, uma vez que os compostos contendo a cadeia lateral tiossemicarbazona mostraram melhores resultados em ambos os testes, demonstrando que a integração entre técnicas computacionais e experimentais se apresenta como uma excelente estratégia na busca de novos agentes antichagásicos. / Chagas disease is an infection caused by the intracellular protozoan Trypanosoma cruzi. Currently 7 million to 8 million people are infected, and there are 25 million people in areas at risk of contamination, with 56,000 new cases each year and roughly 12,000 deaths are related to Chagas complications. It is endemic in 21 countries in South America, and can also be found in North America and Europe due to migration processes. Only two drugs are available for treatment of Chagas disease, nifurtimox and benznidazole, which are active only in the acute phase and cause serious adverse effects. Against this background, it is imminent need for new antichagasic. The enzyme cruzain is the major cysteine protease present in the T. cruzi, is important for the survival, differentiation and entry of the parasite in the host, presenting itself as an excellent biological target in the search for new chemotherapeutic agents. Semicarbazone derivatives, such as nitrofurazone and hydroxymethylnitrofurazone showed inhibitory activity cruzain being considered prototypes in search antichagasic. Using modern drug design strategies through the integration of computational techniques, molecular modeling and docking, and experimental synthesis and biological assays. In this work were performed design, synthesis and biological evaluation of the bioisosters nitrofurazone as candidates for antichagasic. Were applied molecular modeling and docking studies for ten derivatives compounds of aminoguanidine, semi and thiosemicarbazone. In these studies thiosemicarbazone derivatives compounds showed more favorable for the mechanism of action proposed, that suggest a nucleophilic attack of the Cys25 residue present in the catalytic site of the enzyme cruzain in the thiocarbonyl group. Six compounds were synthesized and characterized by 1H and 13C NMR. These compounds were tested for inhibition of cruzain, and derivatives 6, 9 and 10 showed favorable enzyme inhibition at single dose of 100 µM, with values between 70 and 75%. In the inhibition assay of cell growth in epimastigotes forms of T. cruzi, the compound 9 showed an IC50 of 19.8 µM, the best prototype for the development of a new antichagasic agent. In general the results obtained by biological assay corroborate the data presented in molecular modeling, since compounds containing side chain thiosemicarbazone showed better results in both tests, showing that the integration of experimental and computational techniques is presented as a excellent strategy in the search for new agents antichagasic

A proteína recombinante B13 contém repetições seriadas de 12 aminoácidos e corresponde a uma região do antígeno imunodominante de 140-116 KDa encontrado na superfície da forma tripomastigota de T. cruzi (cepa Y). A proteína B13 apresenta elevada sensibilidade e especificidade no diagnóstico sorológico da Doença de Chagas. A análise da distribuição de subclasses de IgG anti-B13 em soros de pacientes chagásicos cardiopatas (SCC) e de assintomáticos (SCI) mostrou o mesmo padrão: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. No entanto, a média de reatividade a B13 foi maior no grupo SCC do que no grupo SCI. Dados anteriores de nosso grupo indicam que a resposta de célula Ta B13 é restrita ao grupo HLA de classe II (HLA- DQA1*0501, DRB1*0101 and DRB5*0101 - denominado grupo HLA+). Por outro lado, dados da literatura sugerem que antígenos repetitivos de protozoários são antígenos T-independentes. Analisamos por ELISA a reatividade a B13 em soros de pacientes HLA+ e HLA- (portadores de outros alelos). Os resultados obtidos indicam que a média de reatividade a B13 é semelhante nos dois grupos de soros, sugerindo que no grupo HLA- a resposta de anticorpos anti-B13 pode ser T-independente. Utilizando peptídeos sintéticos derivados da seqüência de B13 concluímos que o epitopo imunodominante está contido na seqüência FGQAAAGDK. Visando mapear o epitopo responsável pela resposta anti-B13 e analisar uma possível correlação entre estrutura e atividade antigênica, três peptídeos sintéticos contendo o centro do epitopo AAAGDK (pB13 - GDKPSLFGQAAAGDKPSPLF; S4 -FGQAAAGDK e S5 -QAAAGDKPS) foram analisados quanto à sua capacidade de inibir a reatividade de soros de chagásicos à proteína recombinante B13. Os resultados mostram haver uma hierarquia na atividade antigênica inibitória dos peptídeos (pB13>S4>S5), que poderia estar relacionada com a capacidade distinta dos peptídeos em assumir uma estrutura secundária ordenada. As propriedades estruturais dos peptídeos foram analisadas por DC e RNM e indicam que os peptídeos apresentam uma hierarquia pB13>S4>S5 quanto à capacidade de adquirir uma conformação em hélice. Dados anteriores indicam que soros de pacientes chagásicos da América Central e do Sul apresentam diferenças na mediana de reatividade à proteína B13 em testes de ELISA: por ex. Argentina MD=1.79; Brasil MD=1.51; Honduras MD=0.91. Investigamos alguns parâmetros sorológicos que pudessem explicar as diferenças observadas. Soros de 224 indivíduos chagásicos da Argentina, Brasil, Bolívia, Colômbia, El Salvador, Honduras e Venezuela foram analisados com relação à subclasse de IgG responsável pelo reconhecimento de B13. Os dados mostram igual distribuição das subclasses com a seguinte ordem decrescente de reatividade: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. Também concluímos que os soros em questão reconhecem o mesmo epitopo imunodominante da proteína B13. Uma alternativa para explicar variações na resposta imune do hospedeiro a B13 seria a heterogeneidade molecular do antígeno correspondente a B13 nas cepas de T. cruzi. Primeiramente investigamos a massa molecular deste antígeno em sete cepas do parasita derivadas de diferentes regiões geográficas em ensaios de Western blot com soro anti-proteína recombinante B13. Observamos que a massa molecular deste antígeno varia de 100 a 190 KDa e que em várias cepas o soro anti-B13 reage com dois polipeptídeos. Com base nestes resultados investigamos a organização deste gene de cópia única no genoma das cepas. Concluímos que este gene está localizado em uma banda cromossômica única que apresenta variação de tamanho entre as cepas (1,25 a 0,9 Mpb). Análise por Southern blot indicou que o gene B13 apresenta arranjo diferente no genoma das cepas. Investigamos também o tamanho da região que contém as repetições seriadas no gene B13. A partir de dados da seqüência deste gene da cepa CA-1 desenhamos um par de oligonucleotídeos que flanqueiam esta região. DNA genômico de 23 cepas foi submetido a PCR com este par de iniciadores, detectando-se produtos de amplificações com tamanho variando de 2,1 a 3,5 Kb em 11 cepas. Após seqüenciamento da região a 3\' das repetições seriadas do gene B13 da cepa Y, foi desenhado um segundo par de oligonucleotídeos iniciadores. Amplificação foi obtida em quatro cepas adicionais. Em 73% das cepas houve amplificação de um único fragmento enquanto nas demais dois produtos foram obtidos. Os dois produtos podem corresponder a diferenças no tamanho da região das repetições dos dois alelos do gene B13. Também analisamos a seqüência de nucleotídeos de 83 unidades repetitivas em cinco cepas de T. cruzi. Concluiu-se que o epitopo imunodominante (FGQAAAGDK) é altamente conservado nas unidades das cepas embora algumas variações de aminoácidos foram observadas em algumas unidades. Tomados em conjunto os dados indicam haver polimorfismo do gene de B13 em cepas de T. cruzi quanto a: (a) grande variação no número de unidades repetitivas (de 58 a 97 unidades); (b) baixa variação na seqüência que flanqueia a região repetitiva; (c) certa variação na seqüência codificadora de aminoácidos da região imunodominante. Como conseqüência destas observações, sugere-se que as diferenças observadas no número de unidades repetitivas e na estrutura de algumas destas repetições no antígeno B13 de cepas de T. cruzi podem ter implicações na indução da resposta humoral e celular do hospedeiro e poderiam explicar, em conjunto com diferenças genéticas do indivíduo, a variação da resposta imune a B13 observada em soros de pacientes chagásicos. Que seja de nosso conhecimento este é o primeiro estudo que analisa a estrutura geral de um gene de antígeno que apresenta domínios repetitivos em cepas de T. cruzi. / The recombinant protein B13 contains 12 amino acid tandem repeats and corresponds to the immunodominant region of the 140/116 KDa surface antigen of T. cruzi trypomastigotes of the Y strain. B13 protein shows high sensitivity and specificity in the serological diagnosis of Chagas disease. The analysis of anti-B13 IgG subclass distribution in sera of chronic chagas disease cardiopathy patients (CCC) and asymptomatic patients (ASY) showed the same pattern: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. However, the mean of reactivity to B13 was higher in the CCC group as compared with ASY. Previous data from our laboratory indicate that T cell response to B13 protein is MHC class II-restricted (HLADQA1*0501, DRB1*0101 and DRB5*0101 - named as group HLA+). On the other hand, data from the literature suggest that repetitive antigens from protozoa are T-independent antigens. Reactivity to B13 was analyzed by ELISA in sera of patients HLA+ and HLA-(presenting the other alleles). Similar mean ODs values were obtained for the two groups of sera suggesting that at least in the HLA- group the humoral response to B13 could be T-independent. Competitive ELISA employing synthetic peptides derived from B13 sequence allowed concluding that the immunodominant epitope is included in the FGQAAAGDK sequence. To define the minimum epitope responsible for the anti-B13 response and to analyze a possible correlation between structural features and antigenic activity three synthetic peptides bearing the core (AAAGDK) of the immunodominant epitope (pB13 -GDKPSLFGQAAAGDKPSPLF; S4 -FGQAAAGDK e S5 -QAAAGDKPS) were assayed regarding their ability to inhibit chagasic sera reactivity to B13. A hierarchy in the inhibitory antigenic activity was observed (pB13>S4>S5), that could reflect the distinct capacity of the polypeptides to assume an ordered secondary structure. This feature was investigated by CD and NMR. Data are suggestive that the three peptides have the some hierarchy regarding their capacity to acquire a helical conformation (pB13>S4>S5). Previous analyses of chagasic sera from nine countries of Central and South America showed variations in the mean O.D. values of B13-ELISA according to the country (eg Argentina, MD=1.79; Brazil, MD=1.51; Honduras, MD=0.91). We investigated some serological parameters that could explain the observed variation. 224 chagasic sera from Argentina, Brazil, Bolívia, Colombia, EI Salvador, Honduras and Venezuela were investigated concerning the IgG subclass reactive to B13. Data indicate that all the sera displayed the some subclass distribution: IgG1»IgG3>IgG2>IgG4. It was also concluded that the some immunodominant epitope of B13 protein was recognized by the sera. As an alternative to explain variations in the host immune response to B13 we investigated the molecular heterogeneity of the native B13 antigen in different T. cruzi strains. Firstly we analyzed the molecular mass of this antigen in seven stocks derived from different hosts and geographic regions. Western blot experiments employing anti-recombinant protein B13 serum showed variations in the molecular mass of B13 antigen ranging from 100 to 190 KDa. In most of the stocks, anti-B13 serum reacted with two polypeptides. Based on these results we investigated the organization of the B13 single copy gene in the genome of the strains. It was concluded that the gene is localized in a single chromosomal band presenting size variation among the strains (1,25 to 0,9 Mbp). Southern blot analysis indicated that B13 gene has different genomic arrangement. We have also investigated the size of the region that contains the tandem repeats. Based on the sequence of a B13-homologous gene of the CA-1 strain we designed a pair of oligonucleotide primers flanking the repetitive region. Genomic DNA of 23 parasite strains was submitted to PCR with these primers. Amplification products ranging from 2.1 to 3.5 Kb were observed in 11 stocks. After sequencing of a region located at the 3\' end of the repetitive portion of B13 gene of the Y strain, a second pair of primers was designed. PCR amplification was obtained in four additional strains. Most of stocks (73%) originated only one amplified band while two products were detected in the remaining strains. The two products could derive from the independent amplification of the repetitive regions of the two alleles of B13 gene. We have also analyzed the nucleotide sequence of 83 repetitive units of f ive T. cruzi strains. It is concluded that the immunodominant epitope (FGQAAAGDK) is highly conserved among the units and the various parasite strains, although few amino acid variations were detected in some units. Taken together these data indicate polymorphism of B13 gene among T. cruzi strains regarding: (a) high degree of heterogeneity in the number of repetitive units (it is estimated that this number varies form 58 to 97 units); (b) discrete sequence variation upstream and downstream of the repetitive region; (c) minor variations in the codified amino acid of some repetitive units. Differences in the number of repetitive immunodominant units and in the structure of some of these repeats may have implications on the induction of humoral and cellular responses of the host to B13 antigen. These parameters in conjunction with genetic characteristics of the individuais could explain the variation of reactivity to B13 observed in sera of chagasic patients. To our knowledge this is the first report that describes the general structure of an antigen gene bearing repetitive domains in T. cruzi strains.

CAPA-related peptides belong to a family of neuropeptides localized to the central nervous system that can function in diverse roles in the regulation of water and salt homeostasis in insects. These peptides are known to stimulate fluid secretion by Malpighian tubules (MTs) in Dipteran species, thus serving a diuretic function. In contrast, this thesis demonstrates that members of this family of peptides in Rhodnius prolixus serve an anti-diuretic role and have multiple tissue targets, whereby they oppose the activity of diuretic hormones such as serotonin (5-Hydroxytryptamine hydrochloride; 5-HT). I have identified two genes each encoding three peptides in R. prolixus, suggesting this insect is capable of producing a greater number of CAPA-peptides compared to other insects that contain only a single CAPA gene. Interestingly, while the second peptide encoded in each R. prolixus gene (RhoprCAPA-α2/-β2) inhibits the stimulatory effects of serotonin on tissues such as the anterior midgut and Malpighian tubules, it appears the other CAPA-related and pyrokinin-related peptides do not play a major role in inhibiting the effects of serotonin on these tissues. More specifically, serotonin-stimulated fluid secretion by MTs and fluid absorption by the anterior midgut are reduced by the anti-diuretic peptide, RhoprCAPA-α2. In addition, I have also identified a G protein-coupled receptor which likely mediates the anti-diuretic effect associated with RhoprCAPA-α2 and have functionally characterized this receptor in Chinese hamster ovary cells. Spatial transcript expression analysis in fifth-instars reveals a wide distribution of the receptor in tissues associated with the rapid post-gorging diuresis. Thus, my findings suggest that numerous tissues are regulated by the CAPA peptides in R. prolixus. Gene structure and phylogenetic analyses demonstrate that this receptor is the orthologue of the D. melanogaster capa receptor (CG14575) with homologs in other insects. Taken together, my thesis demonstrates that the RhoprCAPA peptides play an integral role in the coordination and maintenance of anti-diuresis in R. prolixus. This mechanism is necessary following the rapid diuresis associated with blood-feeding by this medically-important insect.

CAPA-related peptides belong to a family of neuropeptides localized to the central nervous system that can function in diverse roles in the regulation of water and salt homeostasis in insects. These peptides are known to stimulate fluid secretion by Malpighian tubules (MTs) in Dipteran species, thus serving a diuretic function. In contrast, this thesis demonstrates that members of this family of peptides in Rhodnius prolixus serve an anti-diuretic role and have multiple tissue targets, whereby they oppose the activity of diuretic hormones such as serotonin (5-Hydroxytryptamine hydrochloride; 5-HT). I have identified two genes each encoding three peptides in R. prolixus, suggesting this insect is capable of producing a greater number of CAPA-peptides compared to other insects that contain only a single CAPA gene. Interestingly, while the second peptide encoded in each R. prolixus gene (RhoprCAPA-α2/-β2) inhibits the stimulatory effects of serotonin on tissues such as the anterior midgut and Malpighian tubules, it appears the other CAPA-related and pyrokinin-related peptides do not play a major role in inhibiting the effects of serotonin on these tissues. More specifically, serotonin-stimulated fluid secretion by MTs and fluid absorption by the anterior midgut are reduced by the anti-diuretic peptide, RhoprCAPA-α2. In addition, I have also identified a G protein-coupled receptor which likely mediates the anti-diuretic effect associated with RhoprCAPA-α2 and have functionally characterized this receptor in Chinese hamster ovary cells. Spatial transcript expression analysis in fifth-instars reveals a wide distribution of the receptor in tissues associated with the rapid post-gorging diuresis. Thus, my findings suggest that numerous tissues are regulated by the CAPA peptides in R. prolixus. Gene structure and phylogenetic analyses demonstrate that this receptor is the orthologue of the D. melanogaster capa receptor (CG14575) with homologs in other insects. Taken together, my thesis demonstrates that the RhoprCAPA peptides play an integral role in the coordination and maintenance of anti-diuresis in R. prolixus. This mechanism is necessary following the rapid diuresis associated with blood-feeding by this medically-important insect.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Orientador: Paulo Câmara Marques Pereira / Resumo: A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ainda é considerada como um problema de saúde pública em muitos países da América Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que entre seis a sete milhões de pessoas no mundo estejam infectadas. Indivíduos na fase crônica da doença podem ser classificados como assintomáticos ou sintomáticos (estes, desenvolvendo as formas clínicas cardíaca, digestiva ou mista). Os assintomáticos correspondem a 70% dos indivíduos nessa fase e, embora apresentem sorologia positiva para anticorpos anti T-cruzi, não desenvolvem manifestações clínicas da doença. O motivo pelo qual alguns pacientes permanecem assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido. Fatores genéticos do hospedeiro são bastante relevantes e podem explicar a heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas endêmicas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no gene TNF-α (rs1800629) e ACAT-1 (rs1044925) em indivíduos com DC crônica e verificar se os mesmos estão relacionados com a susceptibilidade para manifestação de formas clínicas sintomáticas com uso da técnica PCR-RFLP. Foram genotipadas 124 amostras para o gene TNF-α e 135 para o gene ACAT-1. Foi observada associação significativa da presença do alelo A do gene TNF- α em indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045). Também houve associação si... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is still considered a public health problem in many Latin America countries. According to the World Health Organization, it is estimated that between six and seven million people worldwide are infected. Disease’s chronic phase individuals may be classified as asymptomatic or symptomatic (these, developing as clinical cardiac, digestive or mixed forms). Asymptomatic individuals account for 70% of the patients at this stage and, although they have positive serology for anti-T-cruzi antibodies, they do not develop it’s clinical manifestations. The reason why some patients remain asymptomatic, and others develop severe symptoms, is still unknown. Host’s genetic factors are quite relevant and may explain the heterogeneity found in patients living with the disease in endemic areas. The objective of this study was to evaluate SNPs in the TNF-α (rs1800629) and ACAT-1 (rs1044925) genes in individuals with chronic CD and to verify if the polymorphisms are related to the susceptibility to manifestation of symptomatic clinical forms using the PCR-RFLP technique. Were genotyped 124 samples for the TNF-α gene and 135 for the ACAT-1 gene. Significant association for the presence of the A allele of the TNF-α gene was observed for symptomatic individuals in relation to the asymptomatic ones (p = 0.045). There was also a significant association between the G allele (p = 0.008) and the GG genotype (p = 0.001) of the TNF-... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-01-31T13:25:05Z No. of bitstreams: 1 MaressaLRS_DISSERT.pdf: 3021577 bytes, checksum: 40cf7f2dc4b6c4875e71426f5e937747 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T13:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MaressaLRS_DISSERT.pdf: 3021577 bytes, checksum: 40cf7f2dc4b6c4875e71426f5e937747 (MD5) Previous issue date: 2015-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Due to its prevalence and the severity of its manifestations Chagas disease is still today a major public health problem in affected countries. Knowing the importance of an active, participatory and permanent surveillance involving community participation for the success of prevention and harm reduction the present study aimed to evaluate the knowledge of the vector of Chagas disease living in rural communities with a history of triatomine capture the city of Natal, Rio Grande do Norte - Brazil, and to verify the presence and association of environmental indicators of risk for infestation of insects in these communities. For this, we used a semi-structured questionnaire administered to the resident responsible for the residence containing questions about their socioeconomic profile and also issues related to the vector of Chagas disease. For assessment of environmental risk indicators, we used a structured interview. It was observed lack of knowledge of the residents on issues related to the life cycle of the insects and on the time of day and the time of year when more appear and how are born. In addition, lack of guidance was detected in the population as to what action to take when a vector is found at his residence. It was an observed association between socioeconomic profile and knowledge of residents about the triatomine. In 10.75% of the homes visited were captured triatomine and association was observed between the catch and the presence of risk factors for the presence of these insects. Among the indicators are present the structure of households, peridomicile characteristics and the presence of wild animals (p<0.05). In this study, it is evident the need for greater disclosure of information related to the vector of the disease, in order to prevent its spread in the studied areas. The observed association between the capture of insects and the presence of environmental risk indicators in the communities emphasize the importance of early identification of these factors in order to improve prevention and control / Devido a sua prevalência e a gravidade de suas manifestações a doença de Chagas consiste, ainda hoje, um grave problema de saúde pública nos países afetados. Sabendo-se da importância de uma vigilância epidemiológica atuante, participativa e permanente envolvendo a participação da comunidade para o sucesso da prevenção e redução do agravo a presente pesquisa objetivou avaliar o conhecimento sobre o vetor da doença de Chagas de moradores de comunidades rurais com histórico de captura de triatomíneos no município de Mossoró, Rio Grande do Norte, além de verificar a presença e associação de indicadores ambientais de risco para infestação de triatomíneos, nessas comunidades. Para isso utilizou-se um questionário semiestruturado aplicado ao morador responsável pela residência contendo perguntas sobre seu perfil socioeconômico e também questões relacionadas ao vetor da doença de Chagas. Para avaliação dos indicadores ambientais de risco foi utilizado um roteiro estruturado.. Foi observada falta de conhecimento dos moradores sobre questões relacionadas ao ciclo biológico dos triatomíneos, assim como sobre o horário do dia e o período do ano em que mais aparecem e como nascem. Além disso, foi detectada falta de orientação para a população a respeito de que atitude tomar quando um vetor é encontrado em sua residência. Foi observada associação entre o perfil socioeconômico e os conhecimentos dos moradores sobre os triatomíneos. Em 10,75 % das casas visitadas foram capturados triatomíneos e foi observada associação entre a captura e a presença de indicadores de risco para a presença desses insetos. Dentre os indicadores presentes estão à estrutura das residências, características do peridomicílio e presença de animais silvestres (p < 0,05). Com esse estudo, torna-se evidente a necessidade de maior divulgação sobre informações relacionadas ao vetor da doença, a fim de se evitar a sua disseminação nas áreas estudadas. A associação observada entre a captura de triatomíneos e a presença de indicadores ambientais de risco nas comunidades ressalta-se a importância da identificação prévia desses fatores com o objetivo de melhorar as ações de prevenção e controle / 2017-01-30